Expresión y purificación de Proteínas de Fusión Genética Molecular 2011.
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Expresión y purificación de Proteínas de Fusión Genética Molecular 2011
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Expresión y purificaciónde Proteínas de Fusión
Genética Molecular 2011
¿Qué es una proteína de fusión?
Es a combinación de una proteína de interés fusionada a otra proteína o péptido conocidos, denominados Tags. Los Tags pueden estar en el NH2 o COOH.
Básicamente, un mRNA con un marco abierto de lectura (open reading frame, ORF) de codones cualquiera, sin STOPs, puede ser traducido a proteína. Las proteínas de fusión se basan en esta premisa.
Codón de inicio: ATG (Met)Codones STOP: TAG, TGA TAA
Tag Mi Proteína TagMi Proteína
¿Qué herramienta biológica de la síntesis de proteínas se utiliza para crear una proteína de fusión?
ADN recombinante bacterias mucha proteína (o cel. eucariota)
Fusión de secuencia del gen de interés con secuencia del Tag
Introducción del ADN recombinante en
bacterias o línea celular dondese expresa la proteína de fusión
¿Por qué son importantes las proteínas de fusión?
Las técnicas de ADN recombinante revolucionaron la producción y purificación de proteínas. Permite la purificación de la proteína en pocos pasos, y evita purificar proteínas endógenas.
Clonado de gen de interés en
marco con la secuencia del Tag
¿Qué sistema elegirían para expresar proteínas recombinantes y tener mucha proteína?
Lo más común es usar Escherichia coli
Ventajas:
Se obtiene mucha cantidad de proteína, es fácil de crecer, de inducir y de purificar la proteína de fusión.
Desventajas:
No realizan modificaciones post-traduccionales, necesarias para el correcto plegamiento y/o actividad de ciertas proteínas. Es posible que no haya un correcto plegamiento de la proteína y haya que pasar a otro sistema (células de mamífero, de insecto, levaduras…).
¿Cuando se debe inducir la expresión de una proteína en bacterias?
Fase exponencial (o Log): máxima tasa de división celular; maquinaria transcripcionaly traduccional muy activa.
Vectores inducibles de expresión en procariotas: se basan en el sistema del operon lac (requerido para el transporte y metabolismo de la lactosa en E. coli)
En la práctica:situaciones derepresión y activación de la transcripción del gen de interés
Sistema pET: doble sistema de inducción; disminuye la expresión “leaky”
Cuerpos de inclusión: problema o ventaja?
Son agregados insolubles de proteína desnaturalizada.Su formación depende de la naturaleza de la proteína y su nivel de expresión.Son fácilmente purificables (casi todo proteína recombinante), pero para obtener la proteína hay que hacerlo en condiciones desnaturalizantes (urea 8M).
Cuerpos de inclusión de β-lactamasa en E. coli.
Las fusiones permiten:
• Fácil y rápida purificación de la proteína expresada en bacterias, basada en las propiedades del Tag (cromatografía de afinidad, anticuerpos).
M: markerL: lisado de bacteriasF: percoladoE: eluído
• Localización de proteínas en células eucariotas por fusión a proteínas o Tags fluorescentes (microscopía de fluorescencia) o Tags contra los que hay anticuerpos comerciales (inmunofluorescencia).
Las fusiones permiten:
• Direccionar la localización de proteínas de fusión en bacterias:
Periplasma: fácil purificación, pocas proteínas contaminantes, ambiente favorable para el buen plegamiento y la formación de puentes disulfuro.
Secreción al medio: pocas proteínas contaminantes, fácil purificación.
• Aumentar la solubilidad de las proteínas de fusión.
• Caracterización de proteínas (principalmente en interacciones proteína:proteína; ensayo de doble hibrido, GST-pull down, co-inmunoprecipitación).
Clasificación de Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
De purificación
Por afinidad a un ligando (GST)
GST (Glutathione S-Transferase): 26 kDa, originalmente clonada del parásito Schistosoma japonicum. Muy fácil purificación. GST aumenta la solubilidad de la proteína.
Ventajas: Elución suaveBuen rendimientoÚnico paso de purificación
La proteína de fusión se purifica por
cromatografía de afinidad usando
glutation inmobilizado sobre agarosa.
De purificación
Desventaja: solo puede realizarse en condiciones nativas
O HNH
NH
NH2
C O2H
OS
O
O
E
Glutathione
S -transferase
and electrophile E(toxic products)
O HNH
NH
NH2
C O2H
OH
O
O
Glutathione (GSH)
Clasificación de los Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
De purificación
Por afinidad a un ligando (GST)
Por características químicas del Tag (His-Tag).
His-Tag:
Tag lineal que contiene 4, 6 o 10 Histidinas consecutivas.
Se purifican por IMAC(Immobilized-metal affinity chromatography)El His-Tag se une a cationes divalentes (el más usado es Ni2+) inmobilizados en la resina.Se eluye compitiendo las histidinas con Imidazol (residuo de la histidina )
Es muy pequeño (menor a 1kDa).
Permite la purificación aún en condiciones desnaturalizantes (Urea 8M).
Se obtiene buen rendimiento de purificación. Único paso de purificación.
El Tag no interfiere con el plegamiento ni con la función de la proteína.
De purificación
Purificación en condiciones desnaturalizantes:
La proteína expresada se aglutina en “cuerpos de inclusión”. Son agregados insolubles que mayormente contienen la proteína de interés. Pueden ser disueltos usando detergentes suaves y UREA 8M, con la consecuente desnaturalización de las proteínas.
Esto puede ocurrir por:
Expresión muy alta de la proteína de interés y que esta no se llegue a plegar bien.
Proteínas muy poco solubles, no solubles o que tengan pasos transmembrana hidrofóbicos.
Proteínas que necesiten modificaciones post-traduccionales para su correcto plegamiento.
His-Tag:
Esquema de purificación:
Muy usado en expresión en bacterias.
Las resinas son reusables.
Alto rendimiento.
De purificación
Clasificación de los Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
De purificación
Por afinidad a un ligando (GST)
Por características químicas del Tag (His-Tag).
Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)
Purificación por anticuerpos comerciales sobre tags cortos:
T7-Tag: derivado del gen 10 del fago T7 que es la proteína más abundante del fago. Secuencia: MASTGGQQMG
Todos estos Tags pueden usarse para purificar las proteínas tanto de bacteriascomo de células eucariotas transfectadas, usando anticuerpos comerciales. No es lo más recomendable en bacterias en el caso de poder usar fusiones a GST o HIS-Tag.
FLAG: péptido comercial muy inmunogénico. Secuencia: DYKDDDDK
HA-Tag: residuos 98-106 del la hemaglutinina del virus de influenza humano.Secuencia: YPYDVPDYA
C-Myc: residuos 408-439 del producto del oncogen c-myc humano.
Clasificación de los Tags (muchos Tags cumplen más de una función)
De purificación
Por afinidad a un ligando (GST)
Por características químicas del Tag (His-Tag).
Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)
De localización en bacterias Secuencias de localización periplásmica(mejora el plegamiento por favorecer formación de S-S).Secuencias que permiten la secreción al medio de cultivo (fácil purificación).
De aumento de solubilidad NusA. Es una de las proteínas más solublesconocidas.
Localización de proteínas GFP, DsRed. Anticuerpos comerciales contra Tags (FLAG, HA, c-Myc, T7) por inmunofluorescencia.
GFP (Green Fluorescent Protein):
Provenie de la medusa Aequorea victoria.
La fluorescencia de GFP es independiente de la especie que la expresa, nonecesita cofactores, sustratos u otros productos génicos de A. victoria.
Hay variantes de GFP logradas por mutaciones puntuales.
GFP es una proteína muy estable de 238 aa. Cuando se expresa en células eucariotas o procariotas, y es iluminada por luz azul o UV, emite fluorescencia verde brillante(energía de una fuente lumínica es absorbida y reemitida).
Localización de proteínas
Ampliamente usada como proteína de fusión o gen reportero.
GFP (Green Fluorescent Protein):
Puede usarse para ”taguear” proteínas individuales en células vivas, y hasta 2o más proteínas distintas en una misma célula con las variantes de GFP.
Usada en todos los organismos, desde levaduras hasta mamíferos.
Proteína de fusiónexpresada en levaduras
Ratones que expresan GFP en todas sus células
No modifica la localización de su proteína “partner”.
Localización de proteínas
Localización de proteínas
DsRed (Proteína Roja Fluorescente):
• Proviene del coral de arrecife Discosoma sp.• Muy usado últimamente como marcador de células y como tag de fusión.• Comparte las mismas características con GFP.• A través de mutaciones en la secuencia de AA se han podido crear variantesde absorción y emisión muy útiles para usar más de un tag por célula.
mHoneydew mBanana mOrange tdTomato mTangerine mStrawberry mCherry
Tags cortos contra los que existen anticuerpos comerciales:
FLAG, HA, c-Myc, T7
1°. Anticuerpo primarios (mAb)2°. Anticuerpo secundarios conjugados a fluoróforos
Permiten ver localización subcelular de proteínas fusionadas a estos Tags(solo en células fijadas = MUERTAS); los anticuerpos deben ser introducidos dentro de las células).
Localización de proteínas
Inmunofluorescencia indirecta:
Volviendo a las proteínas recombinantes...
Muchas veces se necesita eliminar el Tag de la proteína de interés
Corte de los Tags secuencia de clivaje por proteasas incluída
Obtención de la estructura primaria nativa de la proteína por corte con una proteasa. Secuencia de clivaje entre el Tag y la proteína de interés.
TAG PDI
Esquema de obtención de proteínas nativas clivadas del Tag
Por hoy ya es suficiente…
