EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE METABOLITOS ...

EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE Amanita muscaria CON

ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA FRENTE A HONGOS CAUSANTES DE DERMATOMICOSIS

WILLIAM ANDRÉS DUEÑAS RIVERA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA, DC

JULIO DE 2008




TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al titulo de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL



JULIO DE 2008




TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al titulo de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTORA Maria Ximena Rodríguez Ph.D.

CODIRECTORA

Claudia Marcela Parra Giraldo M.Sc.

ASESOR Jorge Robles Ph.D.



JULIO DE 2008

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por

sus alumnos en sus trabajos de tesis, solo velará por que no se publique

nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no

contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea

en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”




APROBADO:

Maria Ximena Rodríguez Ph.D. DIRECTORA

Natalia Vargas Julio Pedrozo Jurado 1 Jurado 2




APROBADO:

INGRID SCHULER Ph.D. JANETH ARIAS M.Sc.

Decana Académica Directora de Carrera

Pinxit Virgilius Neptunum, pinxit Homerus;

Dum maris undisoni per vada flectic equos.

Mente quidem vates illum conspexit uterque,

Vincius ast oculis; tereque vincit eos.

Vasari

AGRADECIMIENTOS

A mis padres y hermanos, por brindarme la oportunidad de desarrollarme

como persona y profesional, brindándome todo su apoyo y colaboración.

Por todos las colectas que fueron una excusa para pasar tiempo juntos de

otra forma.

A Maria Ximena Rodríguez y Claudia Marcela Parra, por darme la

oportunidad de aprender a su lado, por la paciencia y tiempo dedicado a

ayudar y guiar mi proceso y sobre todo por la infinidad de enseñanzas

que me otorgaron sin interés diferente al de mi formación académica y

personal.

A Jorge Robles, Gisella Castrillon, Paola Velasco y Diego Herrera por su

asesoría.

A todo el personal de monitoria y material, por la paciencia y colaboración

en todos los momentos a pesar de las dificultades.

A todos los tesistas del laboratorio 131 (Lina, Ivan, Pablo, Daniel, Ruth,

Carolina, Angélica), por su compañía y colaboración, demostraron ser

más que compañeros de trabajo.

A todos los que a pesar de no estar en estas líneas, estuvieron presentes

de una u otra manera en el proceso muchas gracias, sin ustedes las

cosas hubieran sido más difíciles y sobre todo menos divertidas.

I

TABLA DE CONTENIDO RESUMEN 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................01 2. MARCO TEORICO .....................................................................................03

2.1HISTORIA DE LOS HONGOS......................................................03

2.2REINO FUNGI ..............................................................................05

2.2.1CLASIFICACION DE LOS HONGOS .......................06

2.2.2DIVISIÓN BASIDIOMYCOTA...................................07

2.2.3COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES

.........................................................................................10

2.2.4 CARACTERÍSTICAS ECOLOGICAS Y ZONAS DE

MUESTREO PARA AGARICALES DE LA FAMILIA

Amanitaceae.....................................................................12

2.3.5 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE

AGARICALES...................................................................13

2.3.5.1 Características Macroscópicas..............13

2.3.5.2 Características Microscópicas...............15

2.3.6 METABOLITOS DE Amanita muscaria....................18

2.3 IMPORTANCIA DE LOS DERMATOFITOS ................................19

2.3.1 PATOLOGIAS GENERADAS POR LOS GÉNEROS

Trichophyton, Microsporum y Fusarium ...........................20

2.3.1.1 Tiña corporal, tiña crural o dermatofitosis

(Trichophyton) ...................................................21

2.3.1.2 Tiña Cefálica o tiña del cabello

(Microsporum y Trichophyton)...........................21

2.3.1.3 Micosis localizada (Fusarium) ...............23

II

2.3.2 TRATAMIENTO VETERINARIO PARA

DERMATOMICOSIS ........................................................22

2.3.3 IMPORTANCIA ECONOMICA DEL CONTROL DE

DERMATOMICOSIS ........................................................23

2.5.4 MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN

DERMATOFITOS DEL GÉNERO Trichophyton,

Microsporum y Fusarium ..................................................23

2.5.4.1 Trichophyton..........................................23

2.5.4.2 Microsporum..........................................24

2.5.4.3 Fusarium ...............................................25

2.4. BIOCOMPUESTOS (NUEVOS DESARROLLOS PARA

IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS) ....27

2.5. ANTIFÚNGICOS (Importancia y nuevos desarrollos).................30

2.5.1 CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIFÚNGICOS...........31

2.5.2 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS

ANTIFÚNGICOS ..............................................................32

2.5.2.1 Acción del antifúngico sobre membrana

celular del hongo ...............................................32

2.5.2.2 Antifúngicos que actúan sobre la pared

celular del hongo ...............................................33

2.5.2.3 Antifúngicos que actúan sobre el núcleo

de la célula fúngica............................................34

2.5.4 RELACIÓN ESTRUCTURA FUNCIÓN EN

ANTIFÚNGICOS .......................................................34

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN............................35 4. OBJETIVOS ...............................................................................................37

4.1 OBJETIVO GENERAL.................................................................37

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................37

III

5. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................38 5.1 METODOLOGIA..........................................................................38

5.1.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES

EN CUNDINAMARCA ......................................................38

5.1.1.1 Características y zonas de muestreo ....38

5.1.1.2 Recolección de Agaricales ...................39

5.1.1.3 Caracterización morfológica (microscópica

y microscópica) .................................................40

5.1.2 OBTENCIÓN DE MICELIO DE AGARICALES

COLECTADOS EN CAMPO (medio sólido y líquido) Y

CONSERVACIÓN EN BANCO......................................... 40

5.1.3 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANOLICOS ......41

5.1.4 OBTENCIÓN DE FRACCIONES DEL EXTRACTO

ETANÓLICO.....................................................................41

5.1.5 SCREENING DE GRUPOS FUNCIUONALES EN

EXTRACTOS ETANOLICOS Y FRACCIONES................42

5.1.5.1 Cumarinas .............................................42

5.1.5.2 Quinonas ...............................................43

5.1.5.3 Saponinas .............................................43

5.1.5.4 Flavonoides ...........................................44

5.1.5.5 Glucósidos.............................................44

5.1.5.6 Terpenoides ..........................................44

5.1.5.7 Alcaloides ..............................................45

5.1.6 CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA ..............45

5.1.7 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA............47

5.1.7.1 Aislamiento de hongos dermatofitos......47

5.1.7.2 Suspensión de conidios de dermatofitos

..........................................................................48

5.1.5.3 Bioautografía .........................................48

5.1.5.4 Difusión en placas de agar ....................48

IV

5.2 FLUJOGRAMA DE METODOLOGÍA ..........................................51

6. RESULTADOS ...........................................................................................52 6.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES EN

CUNDINAMARCA ............................................................52

6.1.1 Características y zonas de muestreo ......................52

6.1.2 Colección de Agaricales ..........................................55

6.1.3 Caracterización morfológica macroscópica y

microscópica.....................................................................55

6.1.3.1 Características morfológicas macroscópica

..........................................................................55

6.1.3.2 Características morfológicas microscópica

..........................................................................59

6.2 OBTENCIÓN DE MICELIO DE A. muscaria COLECTADA (medio

sólido y líquido) Y CONCERVACIÓN EN BANCO ...........60

6.2.1 Obtención de micelio en medio sólido .....................60

6.2.2 Obtención de micelio en medio líquido....................61

6.2.3 Conservación en banco de papel filtro, agua y aceite

mineral..............................................................................62

6.3 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANOLICOS ..........................64

6.4 OBTENCIÓN DE FRACCIONES DEL EXTRACTO ETANOLICO

..........................................................................................................64

6.5 SCREENING DE GRUPOS FUNCIONALES EN EXTRACTOS

ETANOLICOS Y FRACCIONES........................................................65

6.6 CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA ..................................67

6.7 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA................................74

6.7.1 Aislamiento de hongos dermatofitos........................74

6.7.2 Suspensión de conidios de hongos dermatofitos ....77

6.7.3 Bioautografía ...........................................................78

6.7.4 Difusión en placas de agar ......................................80

V

6.7.4.1 Análisis estadístico prueba difusión en

placa..................................................................84

7. DISCUSIÓN................................................................................................95 7.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES DE LA

FAMILIA Amanitaceae.......................................................................95

7.1.1 Características y zonas de muestreo ......................95

7.1.2 Caracterización morfológica, macroscópica y

microscópica.....................................................................97

7.2 OBTENCIÓN DE MICELIO DE A. muscaria COLECTADA (medio

sólido y líquido).................................................................98

7.3 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANOLICOS ..........................99


...................................................................................... 100

7.5 SCREENING DE GRUPOS FUNCIONALES EN EXTRACTOS

ETANOLICOS Y FRACCIONES..................................................... 100

7.5.1 Pruebas químicas preliminares ............................ 100

7.5.2 Cromatografía en capa delgada .......................... 100

7.6 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA............................. 104

7.6.1 Sensibilidad de dermatofitos frente a Anfotericina B

...................................................................................... 104

7.6.2 Difusión en placa de agar y análisis estadístico ... 107

7.6.3 Bioautografía ........................................................ 109

7.7 CORRELACIÓN DE PRUEBAS ............................................... 110

7.7.1 Pruebas químicas preliminares y cromatografía de

capa delgada................................................................. 110

7.7.2 Bioensayos difusión en placa y bioautografía....... 112

8. CONCLUSIONES .................................................................................... 114

VI

9. RECOMENDACIONES............................................................................ 116 10. REFERENCIAS ..................................................................................... 118 11. ANEXOS................................................................................................ 131 ANEXO 1 Morfología de Agaricales, Boletales y algunos Polyporales ........ 131

ANEXO 2 Descripción detallada de morfología macroscópica de Agaricales

..................................................................................................................... 132

ANEXO 3 Estructura basidio y basidiospora ............................................... 138

ANEXO 4 Descripción de morfología microscópica de Agaricales .............. 139

ANEXO 5 Datos de campo .......................................................................... 141

ANEXO 6 Caracterización microscópica específica para miembros de la familia

Amanitaceae ................................................................................................ 142

ANEXO 7 Caracterización microscópica ..................................................... 143

ANEXO 8 Hojas de vida Dermatofitos ......................................................... 144

ANEXO 9 Medios de cultivo ........................................................................ 151

ANEXO 10 Preparación de reveladores ...................................................... 153

ANEXO 11 Control de contaminación e inhibición anfotericina B................ 154

ANEXO 12 Matriz de contaminación 1er metodología................................. 155

ANEXO 13 Caracterización corrida cromatografía (prueba de fases móviles)

..................................................................................................................... 157

ANEXO 14 Cromatografía en capa delgada (descripción de bandas)......... 168

VII

ÍNDICE DE TABLA Tabla 2.1. Listado de especies de la familia Amanitaceae reportados en

Colombia, colección de referencia ..................................................................12

Tabla 2.2. Compuestos con actividad antibiótica producidos por

basidiomycetes ...............................................................................................30

Tabla 2.3. Clasificación de los antifúngicos por estructura.............................31

Tabla 2.4. Clasificación antifúngicos por sitio de acción.................................31

Tabla 5.1. Zonas de muestreo para familia Amanitaceae en Cundinamarca .39

Tabla 5.2. Visualización y fundamento de reveladores utilizados para

identificación de compuestos..........................................................................46

Tabla 5.3. Dermatofitos aislados y origen de la lesión ...................................47

Tabla 6.1. Distribución de zonas de muestreo permanentes..........................52

Tabla 6.2. Distribución de zonas de muestreo no permanentes.....................53

Tabla 6.3. Fechas de colección, zonas, hongo identificado y cantidad de

cuerpo fructífero colectado .............................................................................54

Tabla 6.4. Características de crecimiento de micelio de Amanita muscaria ...61

Tabla 6.5. Características de crecimiento de micelio en medio líquido para A.

muscaria y cantidades de micelio obtenido ....................................................61

Tabla 6.6. Tipos de conservación de micelio y pruebas de viabilidad ............62

Tabla 6.7. Montaje para preparación de fracciones a partir del extracto de

trabajo.............................................................................................................64

Tabla 6.8. Resultados de pruebas químicas preliminares para extracto 1 y 2 de

A. muscaria .....................................................................................................66

Tabla 6.9. Combinaciones y proporciones de solventes probados para corrida de

cromatografía en capa delgada ......................................................................68

Tabla 6.10. Cálculos de RF para la corrida cromatografía de los extractos 1 y 2

de A. muscaria sin proceso de revelado .........................................................69

VIII

Tabla 6.11. Cálculos de RF para cada una de las bandas generadas después

del proceso de revelado para el extracto 1 y 2 de A. muscaria .....................70

Tabla 6.12. Lectura de esterilidad de fracciones ............................................81

Tabla 6.13. Resultados de halo de inhibición de crecimiento para Candida

parasilopsis frente a diferentes concentraciones de Anfotericina B................83

Tabla 6.14. Análisis estadístico general .........................................................84

Tabla 6.15. Agrupación de Duncan para Fusarium sp. Cepa 108..................87




Tabla 6.19. Porcentaje de inhibición de crecimiento para la relación extracto,

cepa y fracción................................................................................................92

Tabla 7.1. Relación entre metabolitos encontrados en pruebas químicas

preliminares y cromatografía en capa delgada. ........................................... 112

Tabla 7.2. Relación entre resultados de inhibición encontrados en prueba de

difusión en placa y bioautografía ................................................................. 113

IX

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 2.1. Ciclo de vida de división Basidiomycota ......................................08

Figura 2.2. Microscopia de esporas y Algunas formas de esporas ................15

Figura 2.3. Basidios característicos de hongos agaricales ............................16

Figura 2.4. Formación de fíbula .....................................................................16

Figura 2.5. Microscopia de cistidios ...............................................................17

Figura 2.6. Microscopia pileipellis ..................................................................18

Figura 2.7. Macroscopía y Microscopia de Trichophyton ...............................24

Figura 2.8. Macroscopía y Microscopia de Microsporum ...............................25

Figura 2.9. Macroscopía y Microscopia de Fusarium.....................................26

Figura 5.1. Distribución de prueba difusión en placas de agar ......................50

Figura 6.1. Mapa político del departamento de Cundinamarca con ubicación

de puntos de muestreo ...................................................................................53

Figura 6.2. Características generales de punto de muestreo.........................54

Figura 6.3. Sustrato de A. muscaria...............................................................56

Figura 6.4. Sustrato de A. fuligineodisca........................................................58

Figura 6.5. Sustrato de A. xylinivolva .............................................................59

Figura 6.6. Microscopia de A. muscaria .........................................................60

Figura 6.7. Montaje de extractos etanólicos...................................................63

Figura 6.8. Fraccionamiento...........................................................................64

Figura 6.9. Color de fracciones por ciclo........................................................65

Figura 6.10. Pruebas químicas preliminares..................................................66

Figura 6.11. Cromatografías de capa delgada sin revelado...........................69

Figura 6.12. Cromatografías reveladas..........................................................74

Figura 6.13. Macroscopia de dermatofitos utilizados en medio Sabouraud ...77

Figura 6.14. Bioautografia sin aspersión, placa de HPTLC servida en banda

con un equivalente a 1g de peso fresco .........................................................78

Figura 6.15. Bioautografia con aspersión de Fusarium sp ............................79

X

Figura 6.16. Prueba de difusión en placa.......................................................82

Figura 6.17. Prueba de difusión en placa con Candida parsilopsis vs.

Anfotericina B..................................................................................................83

Figura 6.18. Crecimiento radial evidenciado para la cepa 108, días de

muestreo (3, 5 y 8)..........................................................................................88


muestreo (3, 5 y 8)..........................................................................................89


muestreo (3, 5 y 8)..........................................................................................90


muestreo (3, 5 y 8)..........................................................................................91

XI

INDICE DE GRÁFICAS

Gráfica 6.1. Características de crecimiento de T. mentagrophytes en

diferentes medios de cultivo y temperaturas de incubación............................75

Gráfica 6.2. Características de crecimiento de T. rubrum en diferentes medios

de cultivo y temperaturas de incubación.........................................................75

Gráfica 6.3. Características de crecimiento de M. gypseum en diferentes

medios de cultivo y temperaturas de incubación ............................................76

Gráfica 6.4. Características de crecimiento de M. canis en diferentes medios


Gráfica 6.5. Características de crecimiento de M. cookei en diferentes medios


Gráfica 6.6. Crecimiento general de las cepas de Fusarium relacionado con

las fracciones de extracto 1 de A. muscaria utilizadas....................................85

Gráfica 6.7. Crecimiento general de las cepas de Fusarium relacionado con

las fracciones de extracto 2 de A. muscaria utilizadas....................................85

Gráfica 6.8. Comportamiento de Fusarium sp. Cepa 108 frente a las

fracciones vs. Tiempo de crecimiento.............................................................87







Gráfica 6.12. Comparación de crecimiento de las cepas de Fusarium sp. frente

a la fracción de bencina de petróleo vs. Tiempo de crecimiento.....................93


a la fracción de diclorometano vs. Tiempo de crecimiento .............................93

XII


a la fracción de acetato de etilo vs. Tiempo de crecimiento............................93


a la fracción hidroalcohólica vs. Tiempo de crecimiento .................................94


a la fracción de extracto crudo vs. Tiempo de crecimiento .............................94

Gráfica 6.17. Comparación de crecimiento de las cepas de Fusarium sp.

control vs. Tiempo de crecimiento ..................................................................94

RESUMEN

Se evaluaron propiedades antifúngicas de extractos obtenidos a partir de

cuerpos fructíferos de hongos de la familia Amanitaceae, específicamente de

Amanita muscaria, colectados en el departamento de Cundinamarca, frente a

agentes causantes de dermatomicosis (Trichophyton, Microsporum y

Fusarium), aislados de lesiones superficiales de animales domésticos. Los

extractos fueron obtenidos por maceración, extracción en etanol al 96% y

fraccionamiento liquido-liquido con solventes de diferente polaridad. A su vez

fueron sometidos a pruebas químicas preliminares (Colorimétricas) y

caracterizados por medio de cromatografía en capa delgada (TLC). Por

último se realizaron pruebas de actividad antimicrobiana de difusión en placa

de agar y bioautografía. Se encontraron indicios importantes sobre la

actividad de algunos de los metabolitos presentes en los extractos de

cuerpos fructíferos contra agentes causantes de dermatomicosis,

principalmente sobre los aislamientos de Fusarium 121, 155 y 160 frente a

los extractos de la fracción de bencina de petróleo, fracción hidroalcohólica y

diclorometano. Para los aislamientos de Trichophyton y Microsporum se

encontraron problemas para el proceso de estandarización de técnicas para

evaluar susceptibilidad frente a potenciales agentes antifúngicos. Los

resultados positivos para actividad antifúngica fueron obtenidos a partir de las

pruebas de inhibición de crecimiento radial y corroborados a partir de la

bioautografía. Los metabolitos antifúngicos presentes en las diferentes

fracciones tienen propiedades y características heterogéneas, por lo que se

evaluaron posibles relaciones de sinergismos y solapamiento en el proceso

de inhibición del desarrollo fúngico.

Palabras clave: antifúngico, bioautografía, cromatografía de capa delgada,

cuerpo fructífero, dermatomicosis, polaridad.

ABSTRACT

Antifungal properties of extracts obtained from fruiting bodies of fungi

belonging from Amanitaceae family, specifically Amanita muscaria (collected

in Cundinamarca), were evaluated against dermatomycosis causal agents

(Trichophyton, Microsporum and Fusarium), isolated from superficial lesions

in domestic animals. The extracts were obtained by maceration, extraction in

ethanol 96% and liquid-liquid fractioning with solvents of different polarity.

These extracts were submitted to colorimetric preliminary tests and

characterized by thin layer chromatography (HPTLC). Finally, antimicrobial

activity assays, agar plate diffusion and bioautography, were performed.

Antimicrobial activity of some fruiting body metabolites were observed with

Fusarium isolates (121, 155 and 160), in petroleum bencine, dichloromethane

and hydroalcoholic fractions. About Trichophyton and Microsporum isolates, it

was not possible to evaluate extracts antifungal activity due to inconvenients

for the tests standardization process. The antifungal metabolites, present in

different fractions, have heterogeneous properties and characteristics, due to

possible synergism and overlapping relations in the fungal inhibition

development process.

Key words: antifungal, bioautography, thin layer chromatography, fruiting

body, dermatomycosis, polarity.

NOTA DE AUTOR

De acuerdo con investigaciones realizadas en el área de biología

molecular para clasificación de hongos y su nomenclatura. Se ha

generado una discusión sobre la situación en el taxón de rango de la

familia Amanitaceae donde algunos autores proponen que los géneros

como Amanita de esta familia están más relacionados con la familia

Pluteaceae. Al inicio de esta investigación y de acuerdo con la bibliografía

para el desarrollo teórico, aun no se había generado el cambio de familia

para este género.

El Index fungorum aplico los cambios de nomenclatura en el 2008, estos

deben ser tenidos en cuenta para posteriores investigaciones. La

información relacionada con la nueva nomenclatura se encuentra en

(http://www.indexfungorum.org). Para profundizar en las investigaciones y

resultados de estas las cuales dieron origen al cambio se debe consultar

(Dictionary of the fungi X, 2008).

1

1. INTRODUCCIÓN Colombia como país tropical y dada su geografía en Suramérica, tiene una

constelación de ecosistemas variados. Lo cual está definido por lo que se

conoce como las grandes regiones geográficas continentales. Estas

características establecen factores como el clima, diversidad en flora y fauna,

entre otras; las cuales favorecen el desarrollo de diversos hongos

macromicetos. Sin embargo, a pesar de las posibilidades que esta diversidad

representa, no son muchos los estudios que se han realizado en Colombia

sobre las propiedades de los metabolitos presentes en hongos

macromicetos. Existe la referencia de investigaciones donde se ha mostrado

la actividad antifúngica y antibacteriana de algunos extractos crudos de

Basidiomycetos nativos del Brasil (Barbisan, 2003; Lindequist, 2005) y

propiedades antitumorales e inmunomoduladoras (Lull, 2005). Estos

antecedentes permiten abrir la posibilidad de estudios similares relacionados

con los extractos de hongos de la familia Amanitaceae, presentes en el

departamento de Cundinamarca, y en especial de Amanita muscaria que por

ser un hongo de carácter tóxico puede presentar una diversidad importante

de metabolitos secundarios de interés diverso.

Las infecciones por microorganismos generadores de micosis superficiales

en animales domésticos como perros, gatos, caballos y otros, se han

presentado permanentemente a lo largo del tiempo, sin embargo el aumento

de estas afecciones se ha disparado principalmente por el aumento de la

población de estos animales y por la falta de tratamiento adecuado, referente

a antifúngicos especializados para uso veterinario. Los principales hongos

relacionados con dermatomicosis superficial se encuentran en los géneros

Trichophyton y Microsporum, además, de otros del género Fusarium

(Cotteler, 1987; Cutsem, 1991; Sarkisov, 1983). No existe un ente encargado

2

en el país que aporte cifras, datos epidemiológicos o incidencia nacional de

las enfermedades generadas por estos, principalmente porque estas

enfermedades no son consideradas de vigilancia obligatoria; por esta misma

razón no existen estudios donde se presenten alternativas para el tratamiento

de estas enfermedades producidas por hongos de los géneros Microsporum,

Trichophyton o Fusarium. Actualmente se aplica un tratamiento igual al

utilizado con seres humanos, por lo que es considerado un procedimiento

económicamente no viable a nivel veterinario. Es de gran importancia

abordar esta problemática para generar alternativas de control de

dermatomicosis, especialmente para su aplicación en sectores que utilizan

animales como fuente de negocio; es el caso de la ganadería donde se

reportan pérdidas significativas por problemas en la piel de bovinos

(http://portal.fedegan.org.co).

La problemática definida anteriormente generó la finalidad de este trabajo,

donde se hizo una búsqueda e identificación de hongos Basidiomycetos de la

familia Amanitaceae, de los cuales se obtuvieron extractos etanólicos y

fraccionados, que se caracterizaron por medio de pruebas químicas

preliminares y cromatografía en capa delgada, además se determinó su

actividad antifúngica frente a hongos aislados de lesiones en animales

domésticos.

Este trabajo hace parte del proyecto de investigación: “Búsqueda de hongos

agaricales productores de metabolitos con actividad antifúngica frente a

dermatofitos de los géneros Microsporum y Trichophyton, aislados de micosis

cutáneas en bovinos”, el cual se encuentra inscrito y dirigido por el grupo de

investigación UNIDIA (Unidad de Investigaciones Agropecuarias), en la línea

de investigación de microorganismos de interés agropecuario y fue apoyado

económicamente por la Vicerrectoría Académica de la Pontificia Universidad

Javeriana, por medio de la convocatoria interna 2006.

3

2. MARCO TEORICO

2.1 HISTORIA DE LOS HONGOS

Los hongos han estado presentes en la vida del hombre desde el inicio de los

tiempos, son innumerables los reportes relacionados con la utilización de

estos organismos en diferentes culturas y periodos de la historia. Los

egipcios producían pan y cerveza en cuyos procesos de fermentación

intervenían hongos microscópicos. Algunos recipientes encontrados en las

tumbas de los faraones, contenían polvos, que al ser analizados

exhaustivamente en los años 60, demostraron que se trataba de mezclas de

distintos hongos molidos no venenosos y todos con propiedades curativas.

Se supone que fueron colocados en las tumbas debido al conocimiento de

este pueblo de las propiedades de éstos como medicina para el viaje del

difunto hacia la otra vida (Ruiz, 2001).

Nuestros antepasados, recolectores y cazadores, no pudieron dejar pasar

inadvertida la aparición de tan suculentos y a la vez peligrosos organismos.

Así lo demuestra el que el hombre primitivo hallado recientemente congelado

en los Alpes Suizos, llevara en su bolsa un hongo yesquero. En el otro lado

del océano, las culturas Precolombinas de Centroamérica utilizaban hongos

alucinógenos para sus ritos religiosos 3000 años a.C., como lo demuestra el

hallazgo de diversas estatuas de ídolos-seta encontradas en los actuales

Guatemala y México (Benítez, 1969; Ruiz, 2001).

Diversas tribus del norte de Europa han utilizado también como embriagante

uno de los hongos más estudiados por sus propiedades alucinógenas,

Amanita. Con respecto a este hongo y en un contexto histórico, los romanos

conocían y utilizaban diversas clases de hongos comestibles como las trufas

4

o Amanita cesarea. Es muy famosa la anécdota que cuenta como Agripina

mató a su marido, el emperador Claudio, con un plato de hongos venenosos

(probablemente Amanita phalloides), para que su hijo Nerón accediera al

trono (Mommsen, 1965; Scullard, 1959).

Durante la Edad Media ocurrió, como en todas las facetas de la ciencia, que

el conocimiento acumulado por naturalistas griegos y romanos como

Teofrasto, Plinio el Viejo y Dioscórides pasó al olvido, y no se produjo ningún

avance significativo en el conocimiento de este Reino. En el Renacimiento es

cuando comienza a progresar el conocimiento sobre los hongos. La aparición

de la imprenta ayudó a su difusión con obras como "Theatrum fungurum" y

"Fungus in Pannonis abservatorum brevis Historia". Durante los siglos XVIII y

XIX es cuando la Micología adquiere la categoría de auténtica disciplina

científica y aparecen los sistemas de clasificación, que con diversas

modificaciones, se utilizan aún en la actualidad (Beltrán, 1995; Bertrán,

1946).

Pero no es hasta el siglo XX cuando el estudio de los hongos alcanza su

mayor desarrollo, no sólo por el mayor número de medios de los que dispone

el investigador, sino por la importancia que han adquirido en gran número de

campos como la alimentación, la medicina y la degradación de residuos

orgánicos, entre otros. Pero aún hoy día se están descubriendo

continuamente nuevas especies y poco a poco se va profundizando en la

comprensión de la compleja biología de estos organismos, así como su

relación con otros seres vivos. Actualmente la extracción de compuestos

bioactivos a partir de diferentes microorganismos, y en especial de hongos,

es cada vez más elevada, las posibilidades de utilidad médica, biotecnológica

e industrial son innumerables y abren un espectro de investigación amplio y

aún poco explorado (Grabley & Thiericke, 2000).

5

2.2 REINO FUNGI Los hongos presentan una historia interesante debido que durante mucho

tiempo se ubicaron en un reino que no les pertenecían y fueron estudiados

bajo parámetros que confundían e impedían obtener información valiosa, sin

embargo, hoy día estos ocupan un papel importante dentro de la

investigación y tienen un espacio propio. En 1969, Whittaker propuso un

sistema de clasificación de los seres vivos en 5 reinos. En la base figuraba el

reino Monera, donde se incluían todos los organismos procariotas, es decir,

sin núcleo celular: bacterias, actinomicetos, micoplasmas, algas azules, entre

otros. Los otros reinos estaban integrados por organismos eucariotas con:

células complejas, que presentan núcleo, mitocondrias, entre otros. Los

eucariotas más sencillos, de cuerpos menos complejos, se incluían en el

reino Protista. Los eucariotas complejos se separaban en 3 reinos: Plantae

(vegetales), que realizan fotosíntesis; Animalia (animales), que se alimentan

por ingestión y Fungi (hongos), que se alimentan mediante absorción

(Dictionary of the Fungi VII, 1983), a partir de esta clasificación el estudio de

los hongos como un reino se ha desarrollado hasta nuestros días con

modificaciones posteriores reportadas en las diferentes ediciones del

Dictionary of the Fungi. Aunque las características de los hongos difieren entre si a simple vista,

como en el caso de las levaduras que son unicelulares relacionado con los

otros filamentosos y multicelulares, existen características que nos permiten

agruparlos y estudiarlos. Una de las definiciones generales para los hongos

es: “organismos con núcleo, portadores de esporas, aclorófilos, que por lo

general se reproducen sexual o asexualmente, y cuyas estructuras

somáticas, por lo común son filamentosas y ramificadas, están típicamente

rodeadas por una pared celular que contiene celulosa o quitina o ambas”

(Alexopoulos, 1979). La pared de los hongos está compuesta principalmente

6

por quitina el cual es un polisacárido que no se encuentra en las plantas,

pero si hace parte de exoesqueleto de los insectos y artrópodos, a su vez, los

hongos son organismos inmóviles durante todo su ciclo de vida y utilizan las

esporas para colonizar nuevas fuentes de alimento, el crecimiento de estos

organismos es relativamente corto dependiendo de la especie y presentan

una localización variada en un ecosistema. Todos los hongos son

heterótrofos, ya sean saprófitos o parásitos, se encuentran en contacto con

diversas fuentes de nutrientes separados únicamente por una delgada pared

celular. La forma de obtener su alimento es la degradación externa del

sustrato y su posterior absorción. Esta característica le confiere propiedades

importantes, similares a las de bacterias, al presentar una amplia producción

de compuestos degradadores de materia orgánica. Por último, el papel de los

hongos en la historia presenta tanto aspectos negativos (generación de

enfermedades) como aspectos positivos (fuente de alimentos, medicina)

(Curtis, 1994).

2.2.1 CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS

La comparación de diversas moléculas como el ARN ribosomal ha permitido

trazar árboles filogenéticos bastante precisos entre seres vivos. En muchos

casos, han confirmado las teorías de los taxónomos clásicos, mientras que

en otras han supuesto auténticas sorpresas. Una de ellas es que el sistema

de cinco reinos es demasiado simple. Actualmente se considera que los

seres vivos deben agruparse en tres dominios, más que en cinco reinos

(Dictionary of the fungi VIII, 1995), no se han incluido modificaciones

significativas a la clasificación de los hongos (Dictionay of the fungi X, 2008).

Dentro de las nuevas teorías generadas a partir de estudios moleculares se

ha descubierto que los hongos, no constituyen un grupo monofilético

(descienden todos de un ancestro común), sino polifilético (descienden de

7

ancestros diferentes; las semejanzas se deben a convergencia evolutiva, no

a un origen común). Se definió entonces el Reino Fungi como los hongos

verdaderos, con paredes celulares de quitina y glucanos, los cueles están

más emparentados con los animales que con las plantas.

Se incluyen cinco divisiones en el reino Fungí. Los hongos imperfectos o

mitospóricos (asexuales) ya no constituyen un grupo aparte, sino que se

conectan con grupos ya existentes:

División Chytridiomycota. Es el único grupo de hongos verdaderos que

presenta esporas flageladas. Se definen como el grupo más primitivo.

División Glomeromycota se caracterizan por carecer de cualquier tipo de

reproducción sexual y ser simbiontes obligados de plantas terrestres.

División Zygomycota. Presentan micelio cenocítico (sin tabiques). Aquí

pueden hallarse hongos tan frecuentes como el moho negro del pan.

División Ascomycota. Es el grupo con mayor número de especies. Entre

ellas destacan muchos hongos fitopatógenos (oídios, cornezuelo, grafiosis

del olmo, etc.), parásitos en humanos (candidiasis, pie de atleta, etc.) y

comestibles (trufas, colmenillas, etc.).

División Basidiomycota. Aquí pueden hallarse los hongos más conocidos,

como las típicas setas o los yesqueros, y algunos fitopatógenos de enorme

importancia (royas y carbones). En esta división se encuentra Amanita

muscaria.

2.2.2 DIVISIÓN BASIDIOMYCOTA

La división Basidiomycota incluye a los hongos de mayor complejidad

morfológica, entre los que figuran las setas, yesqueros, cuescos de lobo,

hongos gelatinosos, royas, carbones, etc. Su papel en la naturaleza es

esencial, sobre todo los descomponedores; capaces de degradar la lignina.

8

Otros, como royas y carbones, son peligrosos fitoparásitos. Por otro lado, el

micelio de muchas setas forma ectomicorrizas con árboles, representando un

papel para la supervivencia de los bosques. Finalmente, muchos de estos

hongos son cultivados para obtener setas comestibles.

La característica común a los basidiomicetos es la presencia de basidios,

células especializadas que tras cariogamia y meiosis producen cuatro

basidiosporas en su parte exterior. El ciclo vital de un basidiomiceto típico es

simple. Aunque hay especies levaduriformes, lo más corriente es que las

basidiosporas (haploides) germinen y den lugar a un micelio primario,

monocariótico. Esta fase suele ser corta, ya que pronto ocurre la

somatogamia o fusión de hifas y se obtiene un micelio secundario,

dicariótico, que crece mediante fíbulas. Este micelio es el más abundante en

la naturaleza (Figura 2.1). En algunos casos de hongos micorrizógenos,

pueden ocupar varias hectáreas, pesar toneladas y tener una edad de varios

milenios. Los septos son complejos, ya que presentan un poro central

(doliporo) rodeado de una serie de membranas (parentosoma). En

ocasiones, el micelio puede formar cordones o rizomorfos. También se dan

casos en que el micelio es diploide (Alexopoulos, 1976; Miles, 1993).

Figura 2.1. Ciclo de vida de división Basidiomycota. Tomado de: Purves, 2004

9

Aunque no es tan corriente como la somatogamia, el micelio secundario

puede originarse por un proceso de espermatización. Algunos hongos

producen oídios en unas hifas especiales, los oidióforos. Estos oídios están

rodeados de una gota de mucus, para su dispersión por el agua o los

insectos. Los oídios hacen contacto con una hifa compatible y ocurre la

dicariotización, este proceso solo ocurre en hongos del orden uredinales y

royas (Alexopoulos, 1976; Miles, 1993; Rubio, 2005).

En cuanto a la compatibilidad sexual, las especies homotálicas son raras, y

las heterotálicas abundan. De estas últimas, casi el 25% regulan el tipo de

apareamiento mediante alelos en un único locus (heterotalismo unifactorial o

bipolar). Es el caso de royas, casi todos los carbones y algunos yesqueros y

levaduras. En cambio, la mayoría de basidiomicetos regulan el tipo de

apareamiento mediante más de un par de genes, localizados en diferentes

cromosomas (heterotalismo bifactorial o tetrapolar, aunque a pesar de lo que

indica el nombre, puede implicar a más de dos pares de genes)

(Alexopoulos, 1976; Miles, 1993; Moore, 1996).

El micelio secundario puede reproducirse asexualmente por medio de

conidios (este evento no es común), por gemación (en levaduras y

carbones), por esporas especiales (en royas), e incluso mediante

esclerocios. Como en otros hongos, la fragmentación del micelio es un

método de dispersión frecuente. Sin embargo, lo más típico es la

reproducción sexual (aunque existen especies que no la presentan). El

micelio secundario puede agruparse en "tejidos" especializados

plectenquimáticos, aún dicarióticos, y el micelio se denomina entonces

terciario. Da lugar a cuerpos fructíferos, los basidiocarpos o basidiomas,

algunos de los cuales son grandes, llamativos y comestibles: las conocidas

setas. En el campo es frecuente encontrar grupos de setas dispuestas en

anillo (coros o anillos de brujas), debido al crecimiento en todas direcciones

10

del micelio y la aparición de basidiocarpos en la periferia. En cambio, otros

basidiocarpos son muy diferentes a las setas: leñosos, gelatinosos e

inconspicuos (Miles, 1993; Moore, 1996).

Los basidios se disponen sobre o dentro del basidiocarpo, a menudo en una

capa fértil, el himenio. Entre los basidios pueden existir estructuras estériles,

como los basidiolos (recuerdan a los basidios, pero que no producen

esporas) o los cistidios, de mayor tamaño y muy útiles como carácter

taxonómico. Cada basidio da lugar a cuatro basidiosporas externas (pero

pueden ser 2, 8 ó más) (Alexopoulos, 1976; Miles, 1993).

En un basidio se distinguen las siguientes partes: probasidio, o lugar donde

ocurre la cariogamia; metabasidio, o lugar donde ocurre la meiosis; y

esterigmas, los pedúnculos sobre los que se disponen las esporas. Con

frecuencia, probasidio y metabasidio coinciden en la misma célula; es el caso

de los holobasidios, que no presentan septos. En otros casos se presentan

septos primarios (asociados a la meiosis), tanto longitudinales como

transversales, y se habla de fragmobasidios. Por último, hay basidios de

forma bastante curiosa, como los basidios en diapasón de ciertos hongos

gelatinosos. El término heterobasidio se ha usado para referirse, en general,

a los basidios diferentes a los típicos holobasidios (Alexopoulos, 1976; Miles,

1993; Moore, 1996).

2.2.3 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES

La identificación de Agaricales ha sido estudiada y definida ampliamente por

botánicos, debido a que los hongos fueron caracterizados y clasificados

inicialmente como parte del reino de las plantas. Por esto la mayoría de las

divisiones y clasificaciones actuales están basadas en la aplicación de la

botánica clásica para la identificación morfológica macroscopía o

11

microscópica. Actualmente se han desarrollado métodos químicos y de

identificación microscópica que permiten la obtención datos específicos

llegando a la determinación de especie (Comunicación personal. Franco,

2006).

Para la colección e identificación de hongos macromicetos en general se

deben tener en cuenta factores como geografía y vegetación. Cada hongo

tiene un hábitat definido y está dado a partir de zonas climáticas específicas

y la vegetación, la cual cumple una función nutricional muy importante. Al

mismo tiempo, la sucesión es otro factor clave, este hace referencia a los

periodos de fructificación propios de cada especie. Los hongos presentan

periodos de latencia prolongados sin generar cuerpos fructíferos, a pesar de

estar presentes en forma de micelio en el suelo, la sucesión es el resultado

de la interacción de los factores anteriormente mencionados, estos permiten

que el organismo se desarrolle y genere estructuras visibles (Lodge, 1995).

Después de definir el hábitat específico que requiere el hongo de interés se

deben tener una serie de herramientas que permitan que el trabajo de

colección e identificación se efectúe exitosamente, estas herramientas son: el

equipamiento, en el que se incluyen todos los instrumentos necesarios para

realizar la colección adecuada del hongo. La documentación es otra

herramienta, con la cual se busca tener de forma ordenada y clara todos los

datos de colección donde encontramos: la descripción de morfologías y

características especiales como sustrato de crecimiento, tipo de crecimiento

y tipo de agrupación. Por último se debe hacer una conservación de la

muestra colectada, la cual está basada en las normas y protocolos de

conservación botánica (Lodge, 1995).

12

2.2.4 CARACTERÍSTICAS ECOLÓGICAS Y ZONAS DE MUESTREO

PARA AGARICLAES DE LA FAMILIA Amanitaceae

El crecimiento de Agaricales de la familia Amanitaceae está relacionado

intrínsecamente con la presencia de bosques abedulares, hayedos,

melojares, robledales, encinares, alcornocales, castañares, pinares, bosques

de rivera, praderas, estiércol y horveras. Amanita crece sobre el suelo de

este tipo de bosques. En Colombia se ha encontrado y reportado el género

Amanita en los departamentos de Antioquia y Cundinamarca (Franco &

Uribe, 2000). Sin embargo, se debe aclarar que este es un hongo

cosmopolita, relacionado como micorrizante del pino y roble principalmente,

por lo que su introducción al país está relacionada directamente con el cultivo

de estas coníferas (Pulido, 1983). En el país se han reportado 16 especies

de Amanita (Tabla 2.1), sin embargo, la sistemática de reportes de especies

aun no está completamente actualizada (Franco, 2000), es decir que aun no

se han comparado las especies colectadas con otras ya reportadas e

identificadas para que hagan parte de catálogos internacionales y realizar el

proceso de clasificación y sistemática de nuevas especies encontradas en

nuestro territorio.

Tabla 2.1. Listado de especies de la familia Amanitaceae reportados en Colombia, colección de referencia. Tomado de: Franco 2000.

Taxón Departamento Referencia Colección de referencia

Amanita advena Antioquia Halling et al. 1992 Ovredo 2547 (HUA NY): Tipo

Amanita arocheae Antioquia Halling et al. 1992 Halling 5071 (HUA): Tipo

Amanita aureomonile Valle del Cauca Halling et al. 1992 Franco-Molano 156 (CUVC): Tipo

Amanita brunneolocularis Antioquia Halling et al. 1992 Ovredo 2506 (HUA):

Tipo

Amanita colombiana Antioquia Halling et al. 1992 Ovredo 2425 (HUA): Tipo

13

Taxón Departamento Referencia Colección de referencia

Amanita flavoconia var. Inquinata Antioquia Halling et al. 1992 Halling 5067 (HUA):

Tipo Amanita flavoconia

var. Sinapicolor Antioquia Halling et al. 1992 GMM 2850 (F)

Amanita fuligineodisca Antioquia Halling et al. 1992 Halling 5022 (HUA

NY): Tipo

Amanita gemmata Cundinamarca Gusman & Varela 1978 Guzman 4627 (COL)

Amanita humboltii Cundinamarca Singer 1963 Singer B3527 (BAFC)

Amanita inaurata Antioquia Cundinamarca Singer 1963 Singer B3596

(BAFC)

Amanita muscaria Antioquia Pulido 1983 Pulido et al 382 (COL)

Amanita picea Antioquia Cundinamarca Halling et al. 1992 Halling 5250 (HUA):

Tipo

Amanita sororcula Antioquia Halling et al. 1992 Ovredo 2507 (HUA): Tipo

Amanita xylinivolva Antioquia Halling et al. 1992 Ovredo 2487 (HUA): Tipo

2.2.5 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE AGARICLAES.

2.2.5.1 Características macroscópicas

Dentro de las características que se estudian en cuanto a la macroscopía de

hongos macromicetos se toman características de: píleo, himenio y estípite.

El píleo, puede ser sésil o pedicelado, si tiene pie esta parte se llama

comúnmente sombrero, y si no lo tiene píleo. De esta caracterización se

puede describir lo más extenso posible la forma del mismo según el proceso

evolutivo del hongo. La cutícula es la piel o membrana que recubre el

sombrero o píleo, y puede presentar una morfología muy variada,

aterciopelada, hirsuta, escamosa, con mechas, fibrillosa, pubescente, lisa,

seca, viscosa, glutinosa y de colores muy variados. El margen también puede

14

aportar información no menos importante en cuanto a la forma del mismo

(Franco & Vasco, 2005; Phillips, 1978).

El himenoforo está situado en la parte inferior del píleo, y es el lugar donde

se forman las esporas; así mismo también es una de las partes del hongo

donde se encuentra la mayor proporción de la información macro y

microscópica (Franco & Vasco, 2005; Phillips, 1978).

El estípite (pie) equivalente al tronco de un árbol en su función: elevar, nutrir

y sostener la ramificación reproductora, en este caso el pileo con el himenio.

Generalmente sólido cuando joven y ligeramente hueco en su madurez, está

formado por dos conjuntos de células de distinta conformación: las del tejido

interno y las de la superficie. Estas últimas se alargan formando estructuras

similares a pelos. Estos tienen como función absorber la humedad del

ambiente, proveen agua a las células del hongo (Franco & Vasco, 2005;

Phillips, 1978).

La trama o carne, está formada por una variedad de células, compuesto por

hasta tres tipos distintos de hifas, recibiendo el calificativo según la variedad

de las células constructivas que lo compone, entre las que siempre están

presentes las hifas generativas, a veces las esqueléticas y más raramente

las conjuntivas o envolventes, llamándose sistema monomítico, dimítico o

trimítico, según cuente con un solo tipo de células, dos o tres. La carne o

trama, puede ser blanda, coriácea, suberosa, elástica, etc., de color variado

incluso a veces múltiple, y tener sabores y olores muy diversos, aunque este

punto es subjetivo y variado según el colector (Franco & Vasco, 2005;

Phillips, 1978;).

La descripción de la morfología macroscópica de agaricales se especifica en

el Anexo 1 y 2.

15

2.2.5.2 Características Microscópicas

Esta es una de las partes fundamentales para el estudio correcto de los

hongos. Se debe tener en cuenta que mientras el estudio macroscópico está

sujeto a cambios fisiológicos, por distintos motivos bien sean climatológicos o

de crecimiento, el estudio microscópico está sujeto a unas características

menos alterables y más estables en todas las especies.

Dentro de las estructuras a observar e identificar se encuentran las esporas

(Figura 2.2). Para observar correctamente el color de las esporas, es

necesario hacer una esporada. Las esporas presentan una morfología

variada: lisas, verrucosas, redondas, cilíndricas, elipsoides, entre otras.

Además de las formas, algunas cuentan con otras características muy

peculiares, como por ejemplo poro germinativo, que puede ser central, apical,

o marginal. Por otra parte sus medidas son inalterables, por lo que al

cotejarlas con las de la misma especie nos aporta datos muy exactos,

debemos saber que es lo que queremos observar y según sea esto, saber

que técnica se debe seguir (claves de identificación). Por otra parte, se

puede observar en el interior si tienen gotas "lipídicas u holeiféricas", así

como las dimensiones de la pared, fina o gruesa, y las distintas reacciones

microquímicas de las mismas (Franco & Vasco, 2005; Largent & Jonson,

1973).

Figura 2.2. a. Microscopia de esporas; b. Algunas formas de esporas. Tomado de: www.conganat.org/.../557-scedosp_3.jpg; ficus.pntic.mec.es

a b

16

Otra estructura son los basidios (Figura 2.3). Existen muchas formas de

basidios, sin embargo los más comunes en los órdenes relacionados con la

familia Amanitaceae son generalmente claviformes y más o menos

cilíndricos. Se debe contar el número de "esterigmas", pueden tener sólo

uno, dos, tres o cuatro incluso más de seis como en el género Botriobasidium

denominándose, monospóricos, bispóricos y tetraspóricos respectivamente.

Es imprescindible examinar este carácter sobre basidios maduros, así como

su tamaño y no confundirlos con los basidiolos que son los basidios

inmaduros. Es importante observar en la base, la presencia o no de fíbulas

(Figura 2.4) (Largent & Jonson, 1973).

Figura 2.3. Basidios caraterísticos de hongos agaricales. a. Basidio con cuatro esterigmas. b. Basidio con dos esterigmas. Tomado de: www.micologia.net/monograficos/russulas/basid.htm

Figura 2.4. Formación de fíbula. Tomado de: docencia.udea.edu.co/.../fotrmacionfibulas.jpg

a b

17

Los cistidios (Figura 2.5) son unas células estériles con que cuentan muchos

basidiomycetes, estos suelen tener formas muy variadas, cuya función

aunque no está muy estudiada, en algunos casos, parece ser el órgano

responsable de la eliminación de los residuos de la alimentación del hongo.

Existen algunos cistidios especiales con cristalizaciones de "oxalato cálcico",

que pueden ser solubles con productos alcalinos, por lo que hay que actuar

con precaución pues se pueden disolver las cristalizaciones con los reactivos

empleados. La identificación de esta estructura permite evitar confusiones en

la identificación (Largent & Jonson 1973).

Figura 2.5. Microscopía de cistidios. Tomado de: webs.uvigo.es/.../images/micro-cistidios.jpg

Dentro de la microscopía de agaricales es importante el estudio del pileipellis

(Figura 2.6). Esta es la membrana superficial del píleo o sombrero,

microscópicamente bastante distinta a la trama de la carne. En algunas,

aunque raras ocasiones, está formado por dos capas, la superior llamada

"suprapellis" y la inferior "subpellis” (Largent & Jonson, 1973).

18

Figura 2.6. Microscopía pileipellis. Tomado de: www.ne.jp/.../rubrotinctus-pileipellis.jpg

La descripción de morfología microscópica de agaricales se encuentra en los

Anexos 3 y 4.

2.2.6 METABOLITOS DE Amanita muscaria.

Las propiedades antimicrobianas, antiinflamatorias, antitumorales e

inmunoestimuladoras, entre otras, son bien conocidas en esta familia, se

reporta el uso de extractos alcohólicos en Rusia, Bulgaria y Ucrania, donde

se utiliza Amanita muscaris suspendida en Vodka para aliviar dolores

reumatoidales y para evitar la picadura de insectos u otras plagas en

cuerpos. Así mismo, se destacan las propiedades alucinógenas de esta

familia en manuscritos de los Vedas (India), americanos precolombinos

(México) y literatura moderna (Alicia en el país de las maravillas) (Chen Li,

2005; Wasson, 1968). Los hongos de la familia Amanitaceae poseen sustancias como muscarina,

bufoteína, muscinol, ácido iboténico y muscazona en el caso de Amanita

muscaria. Estas sustancias producen confusión, disturbios visuales,

desorientación en posición y tiempo. La ingestión de un carpóforo es más

que suficiente para inducir estos síntomas. Muchas de estas sustancias son

utilizadas desde hace algún tiempo en la industria de alimentos como el

19

muscinol que se utiliza como agente aromático en algunas fermentaciones

(Pulido, 1982).

Las amatoxinas son alcaloides, metabolitos definidos para la familia

Amanitaceae. Estas toxinas son: amanitinas o amatoxinas, octapéptidos de

estructura bicíclica, cuyo peso molecular oscila entre 900 y 1000 Da. Se

aislaron por vez primera en Amanita phalloides, junto a otros dos grupos de

toxinas, las falotoxinas y las falolisinas. Aunque se ha estudiado el posible

papel de las falotoxinas (heptapéptidos cíclicos) en la fase gastrointestinal, se

ha confirmado de manera clara que son únicamente las amatoxinas las

responsables de todas las intoxicaciones en los humanos. Se estima que las

toxinas contenidas en unos 25 a 50 gramos de setas constituyen una dosis

potencialmente mortal para un adulto (Chen Li, 2005; Pulido, 1982).

Para el género Amanita se reportan las toxinas: amatoxina, phalotoxina y

virotoxina. La phalotoxina y virotoxina atacan más rápidamente, mientras que

la amatoxina es más lenta, genera efectos visibles 15 horas después del

consumo, sin embargo esta toxina es considerada como la más importante

ya que es la responsable de la letalidad cuando se presenta consumo en

humanos (Chen Li, 2005). No se encuentran reportes sobre metabolitos con

actividad antifúngica o antibacteriana en Amanita únicamente reportes sobre

la actividad y efectos de las sustancias de tipo tóxico presentes en este

género (Festi, 2000; Hatanaka, 1994; Lorangert, 1985) y sobre algunas

investigaciones sobre actividad antitumoral y antiinflamatoria (Gedimidas,

2007; Tadashi, 1992).

2.3 IMPORTANCIA DE LOS DERMATOFITOS Los dermatofitos son hongos que pertenecen a los ascomicetos mitospóricos,

invaden sólo el tejido queratinizado superficialmente (piel, cabello, plumas,

20

cuernos, pesuñas y uñas) y no tejidos más profundos. La mayor parte de los

dermatofitos son de amplia diseminación mundial en su distribución, sin

embargo algunas regiones presentan mayor incidencia que otras. Los

dermatofitos causan patologías tanto en humanos como en animales, por

este motivo es posible que el hongo pase de un portador a otro de forma

indistinta dependiendo del género (Biberstein, 1994; Cutsem, 1991; Jawetz,

1996). Ecológicamente los dermatofitos son clasificados en tres grupos,

antropofílicos, zoofílicos y geofílicos, los cuales cumplen un ciclo de vida en

el suelo y raramente se ven involucrados en procesos patológicos de seres

humanos o animales (Kane, 1997). Los dermatofitos son sensibles a

diferentes desinfectantes, en especial los que contienen cresol, yodo y cloro

sin embargo el uso de estas sustancias en animales no es posible

(Biberstein, 1994).

2.3.1 PATOLOGIAS GENERADAS POR EL GÉNERO Trichophyton,

Microsporum y Fusarium

En rumiantes domésticos las dermatomicosis reportadas en Europa son

causadas principalmente por Trichosporum verrucosum y algunas otras por

Trichosporum mentagrophytes y en raros casos Microsporum canis (Cutsem,

1991), son poco reportadas las micosis superficiales generadas por Fusarium

aunque se encuentra como generador de micosis superficial tanto en

animales domésticos como en el hombre. Fusarium no es considerado un

dermatofito para la micología clínica, sin embargo, genera dermatomicosis

denominadas enfermedades localizadas y enfermedades sistémicas

(Cutsem, 1991; Negroni, 1997). Fusarium presenta más importancia como

fitopatógeno.

En animales pequeños y bovinos las lesiones por dermatomicosis se

localizan en la cabeza y cuello, y en ocasiones en miembros posteriores y

21

anteriores y región escrotal, también en zonas altamente queratinizadas

como las patas. Dichas lesiones se presentan como placas de tendencia

circular, de color blanco-grisáceo, secas y bien delimitadas. En los terneros

es común la costra periocular, peribucal y en las orejas. Estas lesiones

dificultan la succión de leche o la prehensión de los alimentos y les producen

escozor. Las lesiones producen un aspecto quebradizo del pelo, seguido de

la costra. En la descripción clínica se plantea que primero surge un nódulo

oculto entre los pelos que a simple vista resulta imposible de diagnosticar,

estos nódulos se cubren de escaras (exudados y células inflamatorias) y

posteriormente se convierten en gruesas costras de color grisáceo, los pelos

aparecen sin brillo, frágiles y las costras que son removibles dejan una

superficie sangrante y húmeda. Esta sana lentamente, apareciendo un área

depilada, seca sobre la que crece nuevamente el pelo (Chamizo, 1997).

2.3.1.1 Tiña corporal, tiña crural o dermatofitosis (Trichophyton)

La tiña es una dermatofitosis de la piel sin pelo del cuerpo del humano o

animal, que se origina de modo común como lesiones anulares, con el centro

limpio y claro, lleno de escamas, con un borde rojizo creciente que

frecuentemente presenta vesículas. Los dermatofitos solo se desarrollan en

el tejido queratinizado muerto. Los productos metabólicos del hongo se

difunden a través de la capa malpigiana provocando eritema, formación de

vesículas y prurito. A medida que las hifas envejecen y se fragmentan en

artrosporas, las células que las contienen son expulsadas, lo cual es

explicación del centro claro de la lesión anular (Arenas, 1993; Jwetz, 1996).

2.3.1.2 Tiña cefálica o tiña del cabello (Microsporum y Trichophyton)

La infección comienza sobre el cuero cabelludo, con desarrollo subsiguiente

del dermatofito hacia abajo de la pared queratinizada de folículo piloso,

22

asciende por encima de la raíz del pelo, de esta forma la infección se lleva a

cabo y se expresa de forma visible. El hongo continúa creciendo por abajo

sobre la diáfisis del pelo en desarrollo. Las especies de Microsporum se

desarrollan primordialmente como una vaina alrededor del cabello (ectotrix),

mientras que las especies de Trichophyton varían en sus patrones de

desarrollo; algunas invaden la diáfisis del pelo (endotrix), vuelve el pelo frágil

y quebradizo desde el folículo “punto negro de la tiña” (Arenas, 1993; Jwetz,

1996).

2.3.1.3 Micosis localizada (Fusarium)

Las infecciones o micosis localizada producidas por hongos del género

Fusarium pueden se producen habitualmente como consecuencia de

lesiones traumáticas o quirúrgicas, así como por la infección secundaria de

quemaduras. Las manifestaciones más frecuentes son: queratitis, úlceras

traumáticas de la piel, micetomas eumicóticos, osteomielitis y osteoartritis.

Debido a que estos microorganismos pueden ser también simples

colonizadores de heridas y por caracterisiticas metabolicas de tipo

queratinolitico. El diagnóstico sólo podrá afirmarse en estos casos cuando se

compruebe, por estudios histopatológicos, la penetración de las hifas en los

tejidos (Negroni, 1997; Quinn, 2000; Carter, 1989).

2.3.2 TRATAMIENTO VETERINARIO PARA DERMATOMICOSIS

El empleo de antifúngicos especialmente griseofulvina y ketoconazol se ha

recomendado en dosis variables, según las especies y categorías; en general

para los bovinos es de 25g/50Kg de peso corporal, por vía oral, mezclado

con el pienso, diariamente por un período que puede fluctuar entre 2 a 4

semanas, lo cual se hace muy costoso y prolongado, particularmente en

animales mayores (Baquero, 1994; Biberstein, 1994; Bofill, 1996; Schrag,

23

1991). Este tratamiento es igual al que se recomienda para los humanos, lo

que hace que sea un procedimiento lento y costoso para ser utilizado en

animales, por este motivo, también se utilizan a nivel tópico diferentes

pomadas, entre ellas lanolina anhidra y 10% de ácido nítrico fumante, ácido

nítrico al 5%, 10% de ácido salicílico; se obtienen buenos resultados en

algunos animales. También obran bien la tintura de yodo y la pomada de

creolina al 10%. Algunos utilizan los preparados de azufre o el dióxido de

azufre, pero no se han observado resultados manifiestos con ellos en la tiña

con alopecia. 2.3.3 IMPORTANCIA ECONOMICA DEL CONTROL DE

DERMATOMICOSIS

Las dermatomicosis son enfermedades que pueden alcanzar el grado de

epizootias, producidas por agentes causantes de dermatomicosis, que

provocan lesiones en la piel, pelos y tegumentos cornificados. En animales

domésticos, las dermatomicosis son extremadamente molestas y en ellas se

emplean millones de dólares anuales en su tratamiento; se producen

pérdidas considerables por el retraso del crecimiento, se detiene el flujo

zootécnico, calidad de vida, etc. (Bofill, 1996; González, 1990; Khorsravi,

1994; Korstanje & Staats, 1994; Lopes, 1994; Mitchell, 1983; Proenca, 1990).

2.3.4 MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN DE AGENATES CAUSALES DE

DERMATOMICOSIS DE LOS GÉNEROS Trichophyton, Microsporum y

Fusarium

2.3.4.1 Trichophyton

Los microconidios constituyen el tipo de propágulo predominante. Los

macroconidios con forma de lápiz, de pared lisa con extremos romos, son

24

menos frecuentes. Cada especie varía en su morfología de colonia y

pigmentación (Figura 2.7). La formación de conidios puede variar según la

cepa observada. El medio en el cual se desarrollan estos hongos influye en

las características macroscópicas. Es recomendable el uso de varios medios

de cultivo para realizar una descripción de especie más confiable. En el

cultivo de T. mentagrophytes, uno de los hongos característicos de la micosis

en ganado bovino, las colonias pasan de granulosos a polvosas y, por lo

general, revelan abundantes racimos, como uvas, de macroconidios

subesféricos sobre ramas terminales (Figura 2.7). Algunas cepas

algodonosas desarrollan únicamente microconidios en forma de lágrima a lo

largo de la hifa (Cutsem, 1991; González 1987; Jwetz 1996).

Figura 2.7. Macroscopía a. Trichophyton mentagrophytes; b. Trichophyton verrucosum; Microscopia; c. Trichophyton rubrum; d. Trichophyton verrucosum. Tomado de: (Cutsem, 1991; www.medmicro.wisc.edu/resources/imagelib/myco) 2.3.4.2 Microsporum

Los macroconidios constituyen la forma predominante de propágulo. Son

grandes, de pared rugosa, multicelular y fusiforme, se forman a los extremos

a. b.

d.c.

25

de la hifa (Figura 2.8). Los microconidios no son usados como medio para

diferenciar las especies de Microsporum. Microsporum canis aislado

frecuentemente de ganado bovino, forma numerosos macroconidios de pared

gruesa con 8 a 15 células que suelen tener puntas espinosas, ganchosas o

curvas; habitualmente desarrollan un pigmento de color amarillo (Figura 2.8).

Los pelos infectados presentan fluorescencia de un color verde brillante bajo

luz de Wood. Microsporum gypseum presenta abundantes macroconidios de

pared delgada, con 4 a 6 células y forma colonias de color pardo (Jwetz,

1996; Quinn, 2000).

Figura 2.8. Macroscopía a. Microsporum canis; b. Microsporum gypseum; Microscopia; c. Microsporum canis; d. Microsporum sp. Tomado de: (Cutsem, 1991; www.doctorfungus.org/thefungi/img/mcanis.jpg; www.mycology.adelaide.edu.au/gallery/photos/M)

2.3.4.3 Fusarium

La forma y tamaño de las esporas es la característica principal para el

reconocimiento de Fusarium. Las esporas están dispersas en el micelio

a. b.

c. d.

26

aéreo. Los macroconidios son curvados, pluriseptados, con una célula apical

ligeramente puntiaguda y en muchas especies con una célula basal en forma

de pie. Los microconidios son comúnmente unicelulares, elipsoidales,

fusiformes, claviformes, piriformes o subglobosos, similares en ancho a los

macroconidios, con una base redondeada o truncada, por lo general

formando cabezuelas mucosas, pero en algunas especies en cadenas

basípetalas. Los conidióforos del micelio aéreo en algunos casos sólo

constan de una célula conidiógena, en otros están ramificados, a veces en

verticilos. Las monofiálides producen conidios desde una sola abertura y en

las polifiálides surgen las esporas desde más de una abertura en la misma

célula (Booth, 1971) (Figura 2.9). Las colonias de Fusarium crecen moderada

a profusamente, tienen diversos colores (blanco, rosado pálido, rojo,

anaranjado, púrpura, celeste, verde aceituna o pardo), especialmente en el

reverso de la colonia, excepto pardo obscuro o negro. El micelio es ligero o

denso, ya sea algodonoso, como un fieltro o con una zona central de

funículos, pero en algunos casos es limoso (Figura 2.9).

Figura 2.9. Macroscopía a. Fusarium sp. Microscopía b. Hifas y macroconidias c. Conidios; d. Macroconidias. Tomado de: http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Fusarium

a. b.

d. c.

27

2.4 BIOCOMPUESTOS (NUEVOS DESARROLLOS PARA IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS) Los medicamentos de origen natural (fúngico, bacteriano, vegetal o animal)

ocupan la mayoría del mercado para tratamientos en salud humana.

Ejemplos como ciclosporina y lovastatina claramente demuestran el potencial

innovador de los productos naturales y su impacto en el progreso del

descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos (Grabley & Thiericke, 2000).

Aunque los nuevos enfoques en el descubrimiento de fármacos, como la

química combinatoria y los diseños de modelación computacional, han

ganado un mayor protagonismo en los últimos años, los productos naturales

continúan siendo la mayor fuente de moléculas bioactivas (Cragg, 1997;

Gräfe, 2000).

Tradicionalmente una de las fuentes naturales más estudiadas en el campo

del desarrollo de nuevos fármacos son las plantas (fitofarmacología). Sin

embargo, el uso de microorganismos como fuente de moléculas bioactivas

también ha sido ampliamente explorado y desarrollado (antibióticos). Ambas

fuentes ofrecen sus propias ventajas en cuanto a la naturaleza química de

las moléculas, en plantas las rutas metabólicas de los terpenoides y

fenilpropanoides son predominantes, mientras que en microorganismos lo

son las rutas de las policetonas (Verpoorte, 1998). En contraste con las

plantas, en el trabajo con microorganismos es más sencillo obtener mayor

cantidad de biomasa para el aislamiento de los metabolitos, además de ser

más viable la inducción de su biosíntesis. En el campo de los

antimicrobianos, los actimomycetes han sido y permanecen siendo una de

las mayores fuentes de nuevos compuestos (Horan, 1994 citado en Cragg,

1997).

En cuanto a la actividad biológica en plantas, se han desarrollado

investigaciones frente a propiedades antifúngicas y antibacterianas en

28

extractos etanólicos. Se destacan investigaciones con plantas nativas del

Brasil, relacionadas con propiedades antilesmaniasis y antifúngica (Braga,

2007; Cruz, 2006). A su vez, se han desarrollado compuestos contra

fitopatógenos a partir de plantas de Flourencia spp, planta nativa de México.

Por último, se ha reportado actividad antidermatofítica de extractos etanólicos

de Cassia fistul, contra dermatofitos del género Trichophyton y Microspurum

(Duraipandiyan, 2007).

Aunque la extracción de compuestos bioactivos a partir de diferentes hongos

tiene una larga historia, hasta hace poco tiempo se han desarrollado estudios

donde se evidencia la diversidad y el uso de los metabolitos secundarios

generados por hongos diferentes a los producidos por los hongos

mitospóricos (Grabley & Thiericke, 2000). En cuanto a hongos macromicetos,

desde la antigüedad, civilizaciones como la mesopotámica y aztecas los

usaban para fines terapéuticos (Ruiz, 2001). Actualmente los hongos

basidiomicetos están siendo objeto de interés en el campo de la farmacología

gracias a las propiedades inmunomoduladoras de sus metabolitos (Lull,

2005). Debido a que no se encuentran muchos compuestos naturales puros

para ser sometidos a pruebas para determinar actividad biológica, se usan

extractos de fuentes naturales; pero estos pueden presentar problemas a

nivel experimental, como el solapamiento del efecto biológico por mayores

concentraciones de otros metabolitos sin función biológica o falsos positivos

por sinergismo entre varios compuestos. Por esta razón, es necesario

realizar un fraccionamiento de los extractos de origen natural. Este enfoque

es también empleado en los programas de pruebas de tecnología de punta

(“High throughput screening”) para los desarrollos más avanzados en

farmacología (Schmid, 1999).

A los protocolos para compuestos con actividad biológica también se han

sumado estrategias sencillas de caracterización química de extractos, que

29

han sido de gran utilidad para orientar la búsqueda de estos compuestos.

Este concepto de pruebas químicas “Chemical screening” se basa en el

análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) de extractos microbianos,

en el que se determina un patrón de metabolitos secundarios de un

microorganismo por su reacción con tinciones para determinación de grupos

funcionales (Bach, 1993; Göhrt, 1996).

Muchas de las especies de basidiomicetos producen variedad de metabolitos

secundarios con actividad biológica (Tabla 2.2). Dentro de los primeros

trabajos realizados con estos hongos fueron los presentados por Florey en

1949 (citado por Brizuela, 1998), basados en las investigaciones realizadas

por Anchel Hervey y Wilkins en 1941, donde se estudiaron extractos crudos

de los cuerpos fructíferos de Cyathus y Crinepellis, identificándose

compuestos con actividad antimicrobiana. El compuesto fue identificado

como pleuromutilin, diterpeno con actividad frente al micoplasma en ganado

vacuno. Sin embargo, las características particulares para el aislamiento y

cultivo de los basidiomicetos disminuyeron el interés por estos hongos

(Brizuela 1998). En estudios recientes, realizados con extractos de

basidiocarpos de Agaricus blazei se han descrito compuestos con actividad

anticancerígena (Barbisan, 2003). En otros estudios, a partir de Lactarius se

han aislado sustancias con actividad antimicrobiana y que son

aparentemente los responsables de la protección de algunas plantas

(Lindequist, 2005). También se han obtenido antibióticos como onfalona de

Lentinellus omphalode (Anke, 1989). Igualmente a nivel de sanidad vegetal

se han utilizado metabolitos secundarios como las estroburilinas, aisladas de

Agaricus, para la preparación de fungicidas. Estos compuestos presentan

una alta actividad antifúngica frente a saprófitos y fitopatógenos (Anke,

1997).

30

Tabla. 2.2. Compuestos con actividad antibiótica producidos por basidiomycetes. Tomado de: Berdey, 1989. Naturaleza Química Organismos Actividad Biológica Producto Sesquiterpenos y compuestos relacionados

Merilius, marasmius, Naematoloma, Pleurotellus, Lentinelus, Panaelus

antimicrobiana antifúngica antibacteriana citotóxica mutagénica

Merulidial Naematolin Naematolon Hynophilin Leinafulveno Pleurotellon Ácido pleurotélico Omphalone Fulvoferruginin

Diterpenoides Cyathus, Crinipellis citotóxica antifúngica antibacteriana

Estriatin Pleuromutilin Cavipetin

Acetilenos Marasmius, Clitocybe, Coprinus, Pleurotas, Merulius

antibacteriana antifúngica citotóxica

Escorodonin

Glicolípidos Ustilago, Schizonella antimicrobiana citotóxica

Schizonellina

Policetonas Marulius, phlebia antimicrobiana hemolítica

Ácido merulínico

Nucleósidos Clitocybe, Lentinus antibacteriana antiviral

Nebularin

Sales de diazonio Agaricus xanthodermus

antibacteriana citotóxica

Agaridin

2.5 ANTIFUNGICOS (Importancia y nuevos Desarrollos)

El concepto de agente antifúngico o antimicótico comprende cualquier

sustancia capaz de producir una alteración tal de las estructuras de una

célula fúngica que consiga inhibir su desarrollo, alterando su viabilidad o

capacidad de supervivencia, bien directa o indirectamente, lo que facilita el

funcionamiento de los sistemas de defensa del hospedero (Gregori, 2005).

La cantidad, potencia y otros factores de los antifúngicos aun es muy poca y

la incidencia de enfermedades generadas por hongos aumenta

considerablemente y los tratamientos convencionales ya no son efectivos,

además los antifúngicos desarrollados durante el siglo XX están perdiendo

capacidad de control frente a estas enfermedades (Bidarth, 2004; Espinel,

1998; Quereda, 2004).

31

2.5.1 CLASIFICACIÓN DE LOS ANTIFUNGICOS

Los antifúngicos incluyen una amplia variedad de sustancias con diferentes

estructuras químicas y mecanismos de acción. La clasificación se realiza

según criterios convencionales que atienden a su estructura en: polienos,

azoles, alilaminas, entre otros (Tabla 2.3); de acuerdo con su origen en

sustancias producidas por organismos vivos o derivados de síntesis química;

de acuerdo con su espectro de acción en: amplio o restringido y de acuerdo

con el sitio de acción (Tabla 2.4) (Diomedi, 2004; Hasselberg, 2008; Lister,

1996; Wasan, 1998). Tabla 2.3. Clasificación de los antifúngicos por estructura. Tomado de: Gregori, 2005.

ESTRUCTURA ANTIFÚNGICOS Polienos Nistatina, natamicina, amfotericina B

Imidazol: miconazol, clotrimazol Triazoles: fluconazol, itraconazol, ketoconazol

Azoles

Triazoles de segunda generación: voriconazol, ravuconazol, posaconazol

Alilaminas Terbinafina, naftifina Papulacandinas Triterpenos glicosilados

Lipopéptidos

Equinocandinas: caspofungina, anidulofungina, micafungina

Pirimidinas fluoradas Flucitosina Otros Yoduro de potasio, ciclopirox, tolnaftato, griseofulvin

Tabla 2.4. Clasificación antifúngicos por sitio de acción. Tomado de: Gregori, 2005

SITIO DE ACCIÓN ANTIFUNGICO

Antifúngico interactuando en pared celular Lipopéptidos Antifúngico interactuando en membrana celular Polienos, Azoles, Alilaminas Antifúngico interactuando en núcleo Pirimidinas fluoradas

32

2.5.2 MECANISMOS DE ACCIÓN DE ANTIFUNGICOS

La gran similitud entre las células mamíferas y fúngicas resulta un problema

a la hora de diseñar la molécula antifúngica, pues esta debe ser selectiva de

la célula patógena y no de la célula humana sana. El mecanismo de acción

de los medicamentos que inhiben el crecimiento de hongos, depende del

lugar en el que actúen, lo cual está relacionado con la estructura química del

antifúngico. Donde se describen la acción sobre membrana celular, pared

celular y núcleo de los hongos (Aveñanos, 1993; Wong, 1998)

2.5.2.1 Acción del antifúngico sobre la membrana celular del hongo

La membrana celular de la célula humana o animal así como la de los

hongos, desempeña una importante función en la división celular y en el

metabolismo. Las complejas partículas lipídicas llamadas esterolatos, son

aproximadamente el 25% de la membrana celular. Sin embargo, el contenido

de esterol de la célula fúngica y mamífera es diferente. En las células de los

mamíferos el colesterol es el esterol que predomina y en las células fúngicas

el primario es el ergosterol. La diferencia del contenido de esteroles ha sido

explotada como blanco de acción en los medicamentos antifúngicos. Dentro

de ellos se tiene a los polienos, azoles y alilaminas (Garnacho, 1998).

Polienos: los medicamentos que se encuentran en este grupo, se unen al

ergosterol presente en la membrana celular fúngica, donde se forman poros

que alteran la permeabilidad de la membrana lo que permite una pérdida de

proteínas, glúcidos y cationes monovalentes y divalentes, causas de la

muerte celular.

Azoles: estos inhiben a la citocromo P-450-3-A de la célula fúngica, a través

de la inactivación de la enzima C-14-a-dimetilasa, con lo cual se interrumpe

33

la síntesis del ergosterol en la membrana celular. Debido a la falta de

ergosterol se comienzan a acumular esteroles tóxicos intermedios, aumenta

la permeabilidad de la membrana y se interrumpe el crecimiento del hongo

(Hiemenz, 1996).

Alilaminas: trabajan de forma similar a los azoles, conceptualmente ellas

inhiben la síntesis del ergosterol. Sin embargo, este grupo actúa en un paso

temprano de la síntesis del ergosterol. Las alilaminas inhiben a la enzima

escualeno epoxidasa, de esta forma disminuye la concentración de

ergosterol, aumentan los niveles de escualeno, aumenta la permeabilidad de

la membrana celular, se interrumpe la organización celular y disminuye el

crecimiento del hongo.

2.5.2.2 Antifúngicos que actúan sobre la pared celular del hongo

La pared celular del hongo es fundamental en su viabilidad y patogenicidad.

Esta sirve como cubierta protectora, le provee morfología celular, facilita

intercambio de iones, la filtración de proteínas y participa en metabolismo y

catabolismo de nutrientes complejos. La ausencia de pared celular es otro de

los blancos de acción en la terapia antifúngica. Desde el punto de vista

estructural, la pared celular de los hongos está compuesta de un complejo

proteico y polisacáridos cuya composición varía en dependencia de la

especie de hongo. La distribución de estas proteínas y carbohidratos en la

matriz está en relación con la función de la pared celular y los procesos de

osmosis y lisis. Polipéptidos antifúngicos que actúan sobre ella lo hacen

inhibiendo la síntesis de los glucanos a través de la inactivación de la enzima

1,3-β-glucano sintetasa. La falta de glucanos en la pared celular la vuelve

débil e incapaz de soportar el estrés osmótico, por lo que la célula muere.

34

2.5.2.3 Antifúngicos que actúan sobre el núcleo de la célula fúngica

Un clásico antifúngico es la fluocitosina o 5-fluorocitosina. Este fármaco es

transportado por la citosina permeasa en el citoplasma de la célula fúngica,

donde se convierte en 5- fluorouracil (5-FU) por la citosina diaminasa. El 5-

FU es fosforilado e incorporado dentro del RNA convirtiéndose en el

dexosinucleotido, el cual inhibe a la timidilato sintetasa y de esta forma

impide la síntesis de proteínas de la célula. También inhibe la síntesis de la

proteína fúngica, reemplazando el uracil con 5-FU en el ARN fúngico.

Agentes misceláneos, en esta clase se encuentra el griseofulvin, el cual

inhibe la mitosis, al destruir el huso mitótico, necesario para efectuar la

división celular.

2.5.3 RELACIÓN ESTRUCTURA FUNCIÓN EN ANTIFUNGICOS

Las estructuras de los antifúngicos tienen gran variedad pero la presencia de

ciclos de 5 átomos en los cuales el nitrógeno o azufre forman parte del ciclo,

pudiera considerarse un grupo farmacóforo, pues en ausencia de este las

moléculas se pierden su actividad biológica contra los hongos. En muchos

casos la aparición de anillos bencénicos con sustituyentes halogenados

como cloro o flúor, cercanos al anillo de imidazol o triazol, ayudan a

aumentar la respuesta biológica de la molécula, pues le confieren lipofilia y

mayor eficiencia frente a infecciones fúngicas, ejemplo que se aprecia en los

azoles. Las pirimidinas constituyen otro grupo con actividad antifúngica a

partir del cual se pudieran diseñar muchos fármacos de igual actividad

farmacológica. Las estructuras que forman ciclos en los cuales se repite el

grupo amida también le confieren a la molécula actividad antifúngica, tal es el

caso de los lipopéptidos. Otra estructura que ha servido para el diseño de

moléculas antifúngicas es aquella que contiene planos ortogonales, llamadas

espirocompuestos, y un ejemplo de ello lo es la griseofulvina (Lyman, 1992).

35

3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Colombia por su ubicación geográfica, variedad en su vegetación, clima y

otros factores favorece el desarrollo de una gran diversidad de hongos

macromicetos. Franco & Uribe (2000) publicaron un catálogo de la diversidad

colombiana de los taxones agaricales, cantharellales, russulales, cortinariales

y boletales; sin embargo, se encuentran pocas publicaciones donde se

evalúen las propiedades medicinales de estos hongos y reportes en la

evaluación de extractos de hongos nativos con efectos antifúngicos. Estudios

realizados con macromicetos nativos del Brasil encontraron actividad

antifúngica y antibacteriana en extractos crudos de estos basiodiomycetes

(Rosa, 2003). Otras investigaciones relacionan actividad antitumoral e

inmunomoduladora de extractos de diferentes especies pertenecientes al

orden de los agaricales (Daba & Ezeronye, 2003; Lull, 2005; Yi-Lu, 2004).

Teniendo en cuenta el efecto antitumoral y actividad antimicrobiana

(bacterias y levaduras) de extractos de agaricales, se considera a este como

un grupo de interés en el campo del estudio de nuevos antifúngicos.

Paralelamente, la incidencia de dermatomicosis en animales domésticos está

aumentando considerablemente, debido al aumento de población de

animales desprotegidos lo que genera un nuevo problema de salubridad en

ciudades principales como Bogotá, Medellín y Cali (Asociación de protectores

de la fauna colombiana y del medio ambiente APROFAC; Asociación

defensora de animales y medio ambiente ADA). Por otro lado Colombia es un

país en el que parte de su economía se basa en la ganadería, donde la

dermatomicosis en bovinos es un problema que causa gran morbilidad en

estos animales y pérdidas económicas a la industria (Chamizo, 1997; Peraza,

1980; Proenca, 1990). De igual manera existen pocos estudios que den

alternativas de tratamiento frente a estos patógenos (Ramírez & Antúnez,

1999). Los tratamientos para controlar estas dermatomicosis en animales son

36

los mismos aplicados a seres humanos, lo que implica un elevado costo en el

manejo de estas micosis. Esta problemática nos lleva a formular una

propuesta cuyo objetivo es la búsqueda e identificación de hongos agaricales

de la familia Amanitaceae, en el departamento de Cundinamarca, la

obtención de extractos a partir de los cuerpos fructíferos para caracterización

química y detección de metabolitos con actividad antifúngica frente a agentes

causales de dermatomicosis de los géneros Microsporum, Trichophyton y

Fusarium, aislados de lesiones en animales domésticos.

37

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Realizar una búsqueda y caracterización química de metabolitos de hongos

agaricales de la familia Amanitaceae, en Cundinamarca, con actividad

antifúngica frente a agentes causales de dermatomicosis en animales

domésticos.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Recolectar hongos macromicetos Agaricales de la familia

Amanitaceae en el departamento de Cundinamarca e identificarlos

taxonómicamente mediante caracteres morfológicos, microscópicos y

macroscópicos.

• Obtener extractos etanólicos y fracciones de diferente polaridad a

partir de los cuerpos fructíferos de los Agaricales colectados e

identificados.

• Caracterizar químicamente los extractos, a nivel de grupo funcional,

por medio de pruebas químicas preliminares y cromatografía de capa

delgada.

• Evaluar la actividad antifúngica de los extractos, frente a hongos

aislados de micosis cutáneas en animales domésticos, por medio de

las técnicas de bioutografía y difusión en placa.

38

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 METODOLOGÍA

5.1.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES EN

CUNDINAMARCA

5.1.1.1 Características y zonas de muestreo

El lugar de muestreo definido para la colección de hongos de la familia

Amanitaceae fue el departamento de Cundinamarca, que cuenta con una

extensión de 24.210 Km² en los cuales se encuentran 116 municipios en 15

provincias que ascienden desde 300 a más de 3.000m, sobre el nivel del

mar. El clima del departamento es variado, cálido y seco en el valle del

Magdalena, cálido y húmedo en el piedemonte llanero y presenta una

variedad de climas fríos, templados y de páramo en las diferentes vertientes

de la cordillera de los Andes. Estos factores geográficos y climáticos son

característicos del hábitat de los hongos macromicetos, lo que permite definir

esta zona como la más indicada para realizar la colecta de los hongos de la

familia Amanitaceae. Se plantea una hoja de caracterización para adjuntar

toda la información de la zona de muestreo (Anexo 5).

Las zonas definidas para la recolección de los hongos se centraron en la

presencia de reservas naturales que cuenten con características como:

temperatura 4–18ºC, humedad elevada y con temporada de lluvias; y

características de vegetación definidas como bosques de pino y roble. A

partir de estos parámetros se seleccionaron seis zonas de muestreo (Tabla

5.1).

39

Tabla 5.1. Zonas de muestreo para familia Amanitaceae en Cundinamarca

Provincia Lugar Distrito Capital Cerros Nororientales

Cantón Norte Provincia Sabana Centro Chía Cerros de Yerbabuena

San José de Guausa Provincia Ubaté Embalse del Neusa Distrito Capital Cerros Nororientales

Gimnasio Femenino Provincia Sabana Centro Zipaquirá Pantano redondo

Alto del Águila Provincia del Tequendama San Antonio Tequendama

Parque Chicaque

5.1.1.2 Recolección de Agaricales

La colección de hongos se realizó por medio de notas de campo, numeradas,

documento visual de cada espécimen recolectado (fotografía), debido a que

el transporte y secado de los hongos genera pérdidas que pueden ser

recuperadas por una imagen en campo, además facilita obtener datos que se

pueden omitir en la identificación de campo.

Para realizar la colecta se tomaron muestras de cuerpo fructífero del hongo

completo (píleo y estípite); si el hongo crecía en un sustrato especial se retiró

parte del mismo junto con el hongo y definió las características del mismo. Se

colectaron especímenes jóvenes y adultos para evidenciar cambios de

crecimiento. El tiempo entre la colecta y la identificación macroscópica fue

inferior a 4 horas, ya que estos poseen estructuras sensibles y con altos

índices de degradación. Por último, se realizó una esporada en papel blanco

y/o negro, el cual se adjuntó a la “colección tipo” seca para posteriores

identificaciones internas (Franco & Vasco, 2005)

40

5.1.1.3 Caracterización morfológica (macroscópica y microscópica).

La caracterización morfológica de los especímenes recolectados a partir de

las diferentes salidas de campo se realizó por medio de diferentes claves de

identificación macroscópicas (Phillips, 1978) y microscópicas (Largent &

Jonson, 1973). Para obtener los datos que se cotejaron con las claves, se

desarrollaron hojas de colección para datos de campo (Anexo 5); para

características macroscópicas (Anexo 3 - 6); y para características

microscópicas (Anexo 7). Estas hojas de recolección permitieron obtener la

mayor cantidad de información para la identificación. Por otra parte se tiene

soporte gráfico (fotografía) que fue anexado a la hoja de datos de campo,

características macroscópicas y microscópicas (Anexo 5).

5.1.2 OBTENCION DE MICELIO DE AGARICALES COLECTADOS EN

CAMPO (medio sólido y líquido) Y CONSERVACION EN BANCO

Del material colectado se reservó un cuerpo fructífero y se realizaron cortes

de contexto de píleo y estípite, los cuales se sembraron en medio Sabouraud

con adición de cloranfenicol y se incubó a temperatura ambiente. Se

identificó crecimiento de micelio característico y se realizaron pases hasta

obtener micelio puro. Posteriormente, se realizaron siembras en medio

Sabouraud sin adición de cloranfenicol y se preparó un banco en aceite

mineral, agua y papel de filtro, el cual se conservó en refrigeración a 4ºC +/-

2ºC. A partir de las cajas crecidas con micelio se tomaron 16 discos de

micelio, sin agar, y se cultivó en medio líquido Sabouraud y extracto de malta

a concentración completa y a media concentración, en agitación y

temperatura ambiente. Se realizaron mediciones de cantidad en gramos de

micelio producido. Este procedimiento se llevó a cabo para evaluar la

posibilidad de producción de biomasa en cultivo líquido para futuras

41

extracciones y comparación del perfil de metabolitos con las extracciones a

partir de cuerpos fructíferos.

5.1.3 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANÓLICOS

El material colectado (totalidad del cuerpo fructifero) en fresco (500g aprox.)

se secó en horno de convección a una temperatura de 30 +/- 5ºC, y a

temperatura ambiente, hasta obtener la máxima deshidratación posible con el

propósito de eliminar la mayor cantidad de agua que pueda obstaculizar una

buena extracción de los metabolitos presentes en la muestra. Posteriormente

se trituró en una licuadora con etanol al 96% v/v y se procedió a extracción

con el mismo solvente durante 96 horas por el método de maceración el cual

se realiza en frío y bajo agitación, en dos ciclos de extracción, primer ciclo de

48 horas y segundo ciclo de 48 horas. Luego de cada ciclo, el extracto se

filtró (Anexo 10) y se llevó al rota-evaporador para concentrar hasta el

mínimo volumen o sequedad a presión reducida, logrando de esta forma un

extracto etanólico total (extracto crudo) (Domínguez, 1985; Harborne, 1980).

5.1.4 OBTENCIÓN DE FRACCIONES DEL EXTRACTO ETANOLICO

A partir del extracto etanólico total se tomó una porción proporcional a 300g

de biomasa fresca y se redisolvió a un volumen total de 100mL con etanol al

50% v/v (porción hidroalcohólica) y se sometió a separación discontinua

líquido-liquido con 50mL de bencina de petróleo por 3 repeticiones. En este

paso se obtiene la fracción de compuestos más apolares, grasas y aceites,

que se denominó fracción petrol. Esta fracción se llevó a sequedad en el

rota-evaporador a presión reducida. Seguidamente, la porción hidroalcohólica

se sometió a fraccionamiento líquido-líquido con 50mL de diclorometano

(CH2Cl2), igualmente con 3 repeticiones y se obtuvo la fracción

diclorometano, que también se llevó a sequedad en el rota-evaporador a

42

presión reducida. Finalmente, la porción hidroalcohólica se sometió a

extracción discontinua líquido-líquido con 50mL de acetato de etilo (AcOEt)

con 3 repeticiones y se obtuvo la fracción AcOEt que se llevó a sequedad en

el rota-evaporador a presión reducida. La porción hidroalcohólica se

concentró en el rota-evaporador a presión reducida hasta el mínimo volumen.

De esta forma el extracto etanólico total y cada una de las fracciones se

prepararon para ser sometidas a los diferentes bioensayos, pruebas

químicas preliminares y TLC (Domínguez, 1985; Harborne, 1980).

5.1.5 SCREENING DE GRUPOS FUNCIONALES EN EXTRACTOS

ETANÓLICOS Y FRACCIONES

Cada una de las fracciones obtenidas anteriormente fue sometida a pruebas

químicas preliminares específicas para determinar la presencia o ausencia

de ciertos grupos de compuestos químicos, esta caracterización permite

agrupar los compuestos de acuerdo a parámetros estructurales generales

como grupos funcionales, sistema aromático, sistema anular esteroidal,

sistema espirostánico, entre otros (Domínguez, 1985). Los compuestos

seleccionados han sido reportados ampliamente con actividad antifúngica o

antibacteriana, aislados principalmente de plantas.

Para el desarrollo de todas las pruebas químicas preliminares se utilizó una

alícuota de extracto crudo o fracción equivalente a 1g de biomasa fresca, y

posteriormente esta alícuota se diluyó al volumen de muestra requerido para

cada prueba.

5.1.5.1 Cumarinas

Para la detección de cumarinas se evaluó fluorescencia azul con luz

ultravioleta de longitud de onda larga (Domínguez, 1985). 100µL de

43

extractoetanólico, fracción hidroalcohólica y fracciones de bencina de

petróleo, diclorometano y acetato de etilo en un tubo de ensayo, se diluyeron

hasta un volumen de 1mL con etanol al 96%. El tubo de ensayo se tapó con

papel filtro impregnado previamente con una solución diluída de NaOH al

10%; luego se llevó a baño termostatado a temperatura de ebullición (97ºC

aprox.), durante 15 minutos tiempo necesario para llevar a ebullición el

extracto, y lograr que el vapor hiciera contacto con el papel filtro. Se removió

el papel filtro y observó fluorescencia azul bajo luz UV de longitud de onda

larga (Catedra, 2001; Domínguez, 1985).

5.1.5.2 Quinonas

En la identificación de quinonas se adicionaron 100µl del extracto crudo y

fracciones en tubos de ensayo, posteriormente se realizó una dilución de la

misma 1/10 con etanol 96%, y se alcalizó la muestra adicionando 200µl de

una solución de NaOH 5%. Un cambio de color de amarillo traslucido a rojo o

café se considero como positivo para quinonas (Domínguez, 1985).

5.1.5.3 Saponinas

Para la identificación de saponinas se utilizó la prueba de Rosenthaler, la

cual consistió en adicionar 100µL del extracto crudo y fracciones, en un tubo

de ensayo, luego se diluyeron las muestras hasta un volumen de 1mL con

etanol al 96% y se adicionaron 0.5mL del reactivo de Rosenthaler y 0.5mL de

ácido sulfúrico concentrado, donde la presencia de coloración azul, marrón

azulado o violeta se consideró como positivo para saponinas (Domínguez,

1985).

44

5.1.5.4 Flavonoides

En tubos de ensayo se adicionó 1cm de cinta de magnesio y 1mL de la

dilución 1:10 de extracto crudo y fracciones en etanol al 96%, posteriormente

se adiciono 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado, “Prueba de Shinoda”.

La presencia de una coloración se definió como positiva de acuerdo a:

naranja, flavonas; roja, flavononas; roja azulosa, flavonoles; y violeta,

xantonas (Domínguez, 1985).

5.1.5.5 Glucósidos

Se tomaron 100µL del extracto crudo y fracciones en tubos de ensayo y se

diluyó en etanol al 96% hasta un volumen de 1mL. Posteriormente se

adicionó 1mL de H2SO4 2M y se calentó hasta 100 ºC, luego se añadieron 2

mL de reactivo de antrona frío, se agitó y colocó en baño termostatado

durante 10 minutos a ebullición, y se enfrió inmediatamente después. Se

tomó como positivo la presencia de color verde azul o negro en el tubo y

como negativo se tomo un color verde oliva traslúcido (Domínguez, 1985).

5.1.5.6 Terpenoides

Se tomaron 100µL de extracto crudo y fracciones en tubos de ensayo y se

diluyeron con etanol al 96% hasta un volumen de 1mL. Se adicionaron ácido

pícrico al 1 % (p/v) e hidróxido de sodio al 10% (p/v) en volúmenes iguales.

Se reportó presencia de terpenoides al observar coloración naranja o roja

oscura con precipitación (Domínguez, 1985).

45

5.1.5.7 Alcaloides

Se tomaron 100µL de extracto etanólico, fracción hidroalcohólica y fracciones

de bencina de petróleo, diclorometano y acetato de etilo en tubos de ensayo,

y se diluyó en etanol al 96% hasta un volumen de 1mL, luego se adicionaron

1mL de reactivo de Dragendorff y Mayer. Una leve turbidez o precipitado

(rojo a naranja, blanco a crema y marrón) se reportó como la posible

presencia de alcaloides (Domínguez, 1973).

5.1.6 CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA

Alícuotas de los extractos etanólicos y fracciones, equivalentes a 0.1g de

biomasa fresca, se sembraron sobre placas TLC de sílica-gel 60 F254

(Machery-Nagel) como líneas de 8mm de ancho y espacios entre muestras

de 1cm. Para la fase móvil se probaron diferentes combinaciones de

solventes (cloroformo, acetato de etilo, etanol, metanol, ácido acético, ácido

fórmico y agua) hasta obtener la mejor resolución de bandas. La detección

de los compuestos se realizó por fluorescencia bajo luz ultravioleta (254nm y

366nm) y por tinción con reactivos para detección de diferentes tipos

estructurales (Sherma, 1996). Los reactivos para tinción de TLC se

seleccionaron basándose en grupos funcionales y las posibles estructuras

básicas en los que se han reportado metabolitos con actividad

antimicrobiana. De este modo se probaron reveladores genéricos (Anexo 10)

como Vainillina en (H2SO4) y reveladores específicos como cloruro de

antimonio III (terpenoides), reactivo de Neu – ácido difenilborico-2-aminoetil

ester (flavoniodes), hidróxido de potasio (coumarinas), hidroxilamina – cloruro

férrico (lactonas), 2,4- dinitrofenil hidracina (cetonas) y DPPH difenil picril

hidrazil (antioxidantes) (Cork, 1990; Geissmann & Griffin, 1971; Merk, 1980).

Los grupos funcionales que se pueden obtener a partir de estas pruebas se

encuentran en la Tabla 5.2.

46

Tabla 5.2. Visualización y fundamento de reveladores utilizados para identificación de compuestos.

Revelador Visualización Fundamento Grupo funcional identificado

Vanillina (H2SO4) Luz visible Revelador genérico Alcoholes Fenoles Esteroides Aceites esenciales

Cloruro de antimonio (III)

Luz UV de onda larga. Las bandas se observan de color amarillo-rojizo a azul-violeta.

El cloruro de antimonio (III) forma complejos P (coloreados) con los sistemas de dobles enlaces.

Terpenoides

Reactivo de Neu Luz UV de onda larga. Las bandas se observan de color amarillo a rojo. *Si hay cumarinas, estas se observan como bandas azules.

El ácido difenilbórico 2-aminoetil ester reacciona para formar complejos con las 3-hydroxyflavonas, cambiando la longitud de onda de máxima absorción.

Flavonoides Cumarinas

Hidróxido de potasio

Luz visible y luz UV de onda larga.

Cumarinas

Hidroxilamina cloruro férrico

Luz visible Lactosas

Dinitrofenil hidrazina

Luz visible. Los aldehídos se observan como bandas de color verde olivo y las cetonas azules.

La 2,4-dinitrofenil hidrazina reacciona con las aldosas y cetosas generando zonas coloreadas.

Aldehidos libres Cetonas

Anisaldehído (modificado para glucósidos)

Luz visible y luz UV de onda larga.

Los cationes ciclopentenílicos de los glocósidos se condensan con el anisaldehído y forman compuestos coloreados.

Glucosidos

Difenil picril hidrazil

Luz visible. Los compuestos con actividad antioxidante se observan como bandas claras (blanco-amarillo) en un fondo rosado.

Antioxidantes

47

5.1.7 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA

5.1.7.1 Aislamiento de hongos causantes de dermatomicosis

Los aislamientos de los géneros Trichophyton, Microsporum y Fusarium

(Tabla 5.3), utilizados en las pruebas de actividad antifúngica se obtuvieron

del Laboratorio de Micología de la Pontificia Universidad Javeriana. Los

hongos fueron aislados de micosis cutáneas en animales domésticos y

humanos (Anexo 8). Se incluyeron aislamientos de humanos por su carácter

zoofílico Las cepas se cultivaron y mantuvieron en medio Sabouraud con

adición de cicloheximida para inhibir hongos saprofitos y cloranfenicol para

inhibir crecimiento de bacterias (Anexo 9). Se incubaron por 7-14 días a 22

+/- 5ºC. Posteriormente se observó crecimiento y conidiación en medio PDA,

arroz y harina de avena (Anexo 9), donde se evaluó la temperatura y el

medio cultivo en el que se obtiene la mayor conidiación en el menor tiempo

(Cutsem, 1991).

Tabla 5.3. Dermatofitos aislados y origen de la lesión

Dermatofito Origen de aislamiento

Microsporum canis Perro

Microsporum canis Perro

Microsporum canis Gallo

Trichophyton mentagrophytes Humano*

Trichophyton mentagrophytes Vaca

Trichophyton rubrum Humano*

Fusarium sp. Cepa 108 Vaca

Fusarium sp. Cepa 121 Perro



* Zoofílico.

48

5.1.7.2 Suspensión de conidios de hongos patógenos

Posterior a la reconstitución de cada uno de los hongos, en el medio

seleccionado para inducción de producción de conidios, se recuperaron los

conidios por la técnica de perlas de vidrio y tween 80, en caldo FSM (Anexo

9) o solución salina dependiendo del bioensayo. Paralelo a este proceso se

confirmó la germinación de conidios en medio FSM sólido.

5.1.7.3 Bioautografía

Alícuotas de los extractos etanólicos y fracciones, equivalentes a 1g de

biomasa fresca, se sembraron sobre placas de TLC de sílica-gel 60 F254

(Merck) en bandas de 0.8cm y espacios entre banda de 1cm. Las muestras

se corrieron en el sistema de solvente seleccionado en el punto anterior

(5.1.6). El solvente orgánico fue evaporado y posteriormente las placas de

TLC se asperjaron con una suspensión de conidios de (104 conidios/mL) en

una solución de sales básales y sucrosa (FSM) (Cooper, 1975). Las placas

se incubaron durante 5-8 días en una cámara húmeda a 28ºC, temperatura

óptima de crecimiento de dermatofitos, en oscuridad. La lectura de zonas de

inhibición del crecimiento (micelio) en la placa indica actividad antifúngica.

Teniendo en cuenta que los dermatofitos presentan micelio hialino, las zonas

de inhibición de crecimiento se revelaron sometiendo las placas a vapores de

yodo (Hadacek & Greger, 2000).

5.1.7.4 Difusión en placas de agar

La prueba se realizó en medio Müller Hinton con adición de azul de metileno

(Anexo 9) para el primer ensayo. Se realizaron tres pozos con capacidad de

100 a 150µL, sobre una capa previa de agar ubicados en forma de triangulo

equilátero y con una distancia de 2.5cm de cada uno de los vértices al

49

extremo de la caja (Figura 5.1). El montaje de la prueba consistió en

adicionar 100µL de extracto etanólico, fracción hidroalcohólica y fracciones

de bencina de petróleo, diclorometano y acetato de etilo con un equivalente

en peso fresco de 1 y 2g, en dos de los pozos y un control de solvente. Se

dejó difundir durante una noche en refrigeración y se realizó siembra masiva

de una suspensión de dermatofitos de 104 unidades propagativas (conidios e

hifas)/mL de Microsporum canis, Trichophyton rubrum y Trichophyton

mentagrophytes. Se incubó a 28ºC durante 24 días, con lecturas a las 12, 24

y 48 horas iniciales para evidenciar contaminación con bacterias. La lectura

de la inhibición de crecimiento micelial se realizo a los 24 días.

La segunda prueba se realizó en medio sabouraud con adición de

cloranfenicol. Consistió en realizar una siembra masiva de las fracciones en

el medio con un equivalente a 1g de biomasa fresca, se dejo difundir la

muestra en la placa durante una noche en refrigeración. Posteriormente se

tomaron discos de agar colonizados con micelio de los aislamientos de

Fusarium y se ubicaron en el centro del montaje (Istifadah, 2006). Se

realizaron lecturas cada 24 horas del crecimiento radial del micelio sembrado

por 8 días, comparados con un control del hongo sin solvente y con solvente,

incubados bajo las mismas condiciones de temperatura que la metodología

anterior.

Por otra parte se realizó una prueba de inhibición de crecimiento utilizando

Anfotericina B bajo el mismo esquema de la prueba con las fracciones en

difusión en pozo, únicamente para los dermatofitos utilizados en el primer

ensayo, con 10 diluciones de un stock del antifúngico, realizadas en DMSO,

con una cepa de referencia ATCC Nº 22019 de Candida parasilopsis, la cual

es la referencia para calcular la efectividad de antifúngico en pruebas de

microdilución. Con el fin de poder calcular cualitativamente halos de

inhibición y compararlos con los halos que se generarían a partir de las

50

fracciones en estudio frente a la anfotericina B y realizar un control al

antifúngico (Figura 5.1).

Figura 5.1. Distribución de prueba difusión en placas de agar; a. Fracciones prueba difusión en pozo; b. Anfotericina B, c. Fracciones inhibición de crecimiento radial.

Dilución Anfotericina

Control DMSO

Equivalente 1g Equivalente 2g

Control de solvente

a. b.

Masivo equivalente 1g

Disco con micelio

c.

51

5.2 RESUMEN ESTRATEGIA METODOLOGICA

52

6. RESULTADOS 6.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES EN CUNDINAMARCA

6.1.1 CARACTERÍSTICAS Y ZONAS DE MUESTREO

Se utilizó el sistema GPS (Global Position System) con el fin de tener una

ubicación precisa sobre el lugar de colección de las diferentes especies de

Amanita dentro del departamento de Cundinamarca (Figura 6.1), para definir

lugares de muestreo continuo. Dentro de las seis zonas en las que se

realizaron búsquedas y muestreos se definieron tres, las cuales cumplieron

con las características de clima, sustrato, humedad (Figura 6.2) y con la

presencia de cuerpos fructíferos de especies de Amanita en cantidad

suficiente (Tabla 6.1).

Tabla 6.1. Distribución de zonas de muestreo permanentes.

Provincia Lugar Ubicación GPS Distrito Capital (1) Cerros Nororientales

Cantón Norte Latitud: 4º40’56.88’’N Longitud: 74º1’42.12’’O

Provincia Sabana Centro (2) Chía Cerros de Yerbabuena San José de Guausa

Latitud: 4º51’19.14’’N Longitud: 74º1’20.30’'O

Provincia Ubaté (3) Embalse del Neusa Latitud: 5º4’4.04’’N Longitud: 73º58’0.97’’O

Las tres zonas que no se definieron como lugar de muestreo regular

cumplieron con las características definidos para le crecimiento de Amanita;

sin embargo, la presencia de cuerpos fructíferos no era suficiente para el

desarrollo de las pruebas (Tabla 6.2).

53

Tabla 6.2. Distribución de zonas de muestreo no permanentes.

Provincia Lugar Ubicación GPS Distrito Capital (4) Cerros Nororientales

Gimnasio Femenino Latitud: 4º40’56.88’’N Longitud: 74º1’42.12’’O

Provincia Sabana Centro (5) Zipaquirá Pantano redondo Alto del Águila

Latitud: 5º02’51.15’’N Longitud: 73º43’53.38’’O

Provincia del Tequendama (6)

San Antonio Tequendama Parque Chicaque

Latitud: 4º35’45.18’’N Longitud: 74º20’24.97’’O

Figura 6.1. Mapa político del departamento de Cundinamarca con ubicación de puntos de muestreo. Tomado de: http://www.planeacion.cundinamarca.gov.co

54

Figura 6.2. a. Características generales punto de muestreo (Neusa); b. Bosque de pino característico; c. Tipo de suelo (sustrato); d. Micelio A. muscaria presente en suelo.

Los muestreos se llevaron a cabo durante un periodo de 11 meses, entre

diciembre de 2006 y octubre de 2007, dividida en 23 salidas (Tabla 6.3)

Tabla 6.3. Fechas de colección, zona, hongo identificado y cantidad de cuerpo fructífero colectado.

Fecha Lugar Hongo Identificado Cantidad peso (g) 18 12 2006 CANTON A. muscaria 2000 15 01 2007 CANTON A. muscaria 50 10 02 2007 CHICAQUE * * 12 02 2007 SOPO * * 15 03 2007 NEUSA A. muscaria / A. fuligineodisca 1200/1500 13 05 2007 CANTON A. muscaria 50 02 06 2007 CHIA A. muscaria / A. fuligineodisca 100/40 25 06 2007 CANTON A. muscaria 150 14 07 2007 FEMENINO A. muscaria / A. xylinivolva 500 29 07 2007 CHIA * * 11 08 207 NEUSA A. muscaria 50 18 08 2007 NEUSA * * 15 09 2007 CANTON * * 22 09 2007 CANTON * * 29 09 2007 ZIPAQUIRA * * 06 10 2007 NEUSA * *

a.

d.

b.

c.

55

Fecha Lugar Hongo Identificado Cantidad peso (g) 13 10 2007 NEUSA * * 17 10 2007 FEMENINO * * 21 10 2007 NEUSA A. fuligineodisca 2500 22 10 2007 CANTO A. muscaria 150 23 10 2007 CHIA * * 27 10 2007 CANTON A. muscaria 1000 30 10 2007 CHIA A. muscaria 50

* No se encontraron hongos característicos o no se encontró el peso suficiente definido en la metodología (500g).

6.1.2 COLECCIÓN DE AGARICALES

La recolección de los hongos se realizó a partir de las zonas que presentaron

crecimiento constante del hongo y una cantidad suficiente del mismo. Se

tomaron los datos de campo de las zonas de colección, y la mayor cantidad

de datos adicionales que permitieron una buena identificación, de acuerdo

con características de hábitat, datos climáticos, sustratos de crecimiento y

hábito de crecimiento (Anexo 5).

De cada hongo característico se tomaron como mínimo 600g de peso fresco,

(Tabla 6.3). Sin embargo, en algunas recolecciones se tomaron pesos

superiores como reserva o cantidades inferiores para la realización de la

“colección tipo” de cada hongo encontrado.

6.1.3 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA (MACROSCÓPICA Y

MICROSCÓPICA)

6.1.3.1 Características morfológicas macroscópicas

Píleo de 4 a 25 cm de diámetro, de forma hemisférica a plana cuando

madura, con superficie pegajosa y húmeda en periodos de lluvia o pegajosa

seca en temporadas de sol, de color rojo carmín brillante o naranja oscuro

56

debido a decoloración por lluvia. Presencia de escamas y velo universal

abundante de color blanco o crema. No presenta olor ni sabor característico

o distintivo. Las lámelas se encuentran libres en posición cercana o apretada

de color blanco a crema. El estípite presenta una longitud promedio de 4 a 18

cm con un diámetro entre 0.5 y 4.5cm en ubicación cercana al ápice es

bulboso, con superficie fibrosa o escamosa de color blanco o crema pálido; el

estípite es generalmente hueco. Presenta anillo superior colgante

dependiendo de la edad, de color blanco. La volva se presenta en forma de

anillos al rededor de la base del estípite. Presenta esporada de color blanco

a crema (Figura 6.3).

Figura 6.3. a. Sustrato de A. muscaria; b. anillo característico de A. muscaria; c. tres estadios de crecimiento de A. muscaria; d. píleo y lámelas características de A. muscaria.

Estas características concuerdan con la caracterización de Amanita muscaria

por claves taxonómicas macroscópicas y microscópicas (Largent & Jonson,

1973; Franco & Vasco, 2005). Por otro lado se realizó identificación utilizando

un software de identificación taxonómica “matchmaker” (Kendrick, 2006), con

un resultado de 99% de probabilidad de Amanita muscaria, a pesar que esta

herramienta fue definida para dar resultados a partir de una zona geográfica

diferente como lo es la costa pacífica de Norte América, podemos utilizarla

a.

c. d.

b.

57

para la identificación de Amanita ya que estos hongos son cosmopolitas

relacionados con relaciones migratorias y de cultivo de bosque de coníferas,

además, presentan las mismas características de crecimiento que las

definidas por el programa.

Para el caso de las otras especies de Amanita colectadas se presentaron las

siguientes observaciones:

Amanita fuligineodisca píleo de 1.2 a 8cm de diámetro, convexo plano con

presencia de un pequeño umbo; superficie viscosa con humedad, de color

café a crema oscuro, casi negro en el centro; margen del píleo estriado no

apendiculado. Contexto de 0.2 a 0.6cm de grosor, blanco, sin cambios al

cortarse. Con olor suave. Las lámelas libres a ligeramente adnadas,

cercanas y de color blanco. Estípite de 7 a 15cm de longitud, de posición

central, subbulboso, superficie fibrosa, de color blanco a crema claro, no

presenta anillo. La volva saceliforme, blanca a café crema (Figura 6.4). De

acuerdo con el software de identificación taxonómica “matchmaker” esta

descripción corresponde a Amanita fulva con un resultado de 91%, de

acuerdo con búsqueda bibliografíca se encontró que existen algunas

diferencias en el nombre del hongo de acuerdo a los investigadores que lo

reportan; así, Schaeff en 1974 la define como Amanita fulva y Tulloss,

Ovrebo & Halling en el 1992 la definen como Amanita fuligineodisca

(http://www.cybertruffle.org.uk/cgi-bin/nome.pl?organism=2375&glo=esp).

El trabajo con Amanita fuligineodisca no se pudo llevar a cabo debido a que

durante el proceso de secado larvas presentes en el cuerpo fructífero que no

se pudieron retirar en su totalidad en el lavado empezaron a crecer y

consumirlo, debido principalmente a que la recolección se llevó a cavo en un

periodo de lluvia lo que genera condiciones de humedad propicias para que

insectos dejen sus huevos dentro de las lámelas del hongo. Después se

58

realizó otra colecta de la cual se pudo obtener extracto crudo, sin embargo,

debido a problemas de tiempo no se alcanzaron a realizar las pruebas.

Figura 6.4. a. Sustrato A. fuligineodisca; b. Colecta A. fuligineodisca; c. Estadio inicial de A. fuligineodisca; d. Colección tipo A. fuligineodisca.

Para Amaita xylinivolva las características observadas fueron píleo de 1.5 a

7cm de diámetro, hemisférico a convexo, plano depreso a concavo con la

edad; superficie viscosa, opaca en condiciones de poca humedad, de color

amarillo pálido a amarillo crema, presenta escamas remanentes de velo

universal dispersos o agrupados en el centro; presenta margen surcado,

tuberculazo-surcado a peptinado. Contexto de 0.2 a 0.5cm de grosor, de

color blanco a amarillo claro sin cambios al ser cortado, con un ligero olor a

tierra. Las lamelas son libres, subdistantes a distantes de color blanco o

crema, margen ligeramente fimbriado. Estípite de 4 a 11cm de longitud,

posición centrada, bulboso, de superficie blanca, crema o amarilla clara,

fibroso. Presenta anillo superior cuando joven, de color blanco y algodonoso

y volva submembranosa (Figura 6.5).

a. b.

d. c.

59

No se prepararon estractos con Amanita xylinivolva debido a que no se logró

conseguir la cantidad suficiente de biomasa fresca en ninguna zona de

muestreo.

Figura 6.5. a. Sustrato A. fuligineodisca; b. Colecta A. fuligineodisca; c. Estadio inicial de A.

fuligineodisca; d. Colección tipo A. fuligineodisca.

6.1.3.2 Características morfológicas microscópicas

Amanita muscaria presenta esporas de forma ovoide sin ornamentos (lisas),

amiloides en reactivo de Melzer, no presenta diferencia particulares en KOH

o Rojo Congo. Presenta basidios de dos a cuatro esterigmas, es decir dos o

cuatro esporas por basidio. La organización o trama del contexto tanto de

píleo como estípite no es fácil diferenciar por microscopia óptica ya que se

requiere experiencia en este tipo de observaciones, se utilizan sistemas

como microscopia electrónica que permite hacer una verdadera

diferenciación entre los diferentes tejidos de trama presentes en Amanita

muscaria (Figura 6.6).

a. a.

c. d.

60

Amanita fuligineodisca presenta esporas de color blanco, globosas a

subglobosas, lisas, inamiloides en reactivo de Melzer, y Amanita xylinivolva

presenta esporas de color blanco, globosas a elipsoides u ovaladas, lisas e

inamiloides en reactivo de Melzer.

Figura 6.6. Microscopia A. muscaria a. Organización de lámelas en reactivo de Melzer; b. Corte trasversal de lámela separada y esporas reactivo de Melzer; c. Basidio, esterigmas y esporas de Amanita muscaria en reactivo de Melzer; d. Reacción de esporas en reactivo de melzer (amiloides). 6.2 OBTENCION DE MICELIO DE A. muscaria COLECTADA (medio sólido y líquido) Y CONCERVACION EN BANCO 6.2.1 OBTENCIÓN DE MICELIO EN MEDIO SÓLIDO

Los resultados de la obtención de micelio a partir de contexto de píleo y

estípite de Amanita muscaria, Amanita fuligineodisca y Amanita xylinivolva,

en medio sabouraud con adición inicial de cloranfenicol y sin adición de

a.

d. c.

b.

61

cloranfenicol a temperatura ambiente 18-23 ºC, se presentan en la (Tabla

6.4). Tabla 6.4. Características de crecimiento de micelio de Amanita colectadas.

Hongo Características Amanita muscaria Macroscópica: micelio blanco crema claro

algodonoso, con pigmentación al reverso café claro de micelio joven y café oscuro en micelio viejo (punto de siembra). Microscópica: micelio hialino septado y grueso, con presencia de fíbulas.

Amanita fuligineodisca No se obtuvo micelio Amanita xylinivolva No se obtuvo micelio

6.2.2 OBTENCIÓN DE MICELIO EN MEDIO LÍQUIDO

En el desarrollo de la metodología para obtención de micelio de agaricales a

partir de contexto de píleo y estípite de Amanita muscaria se obtuvieron los

siguientes resultados en un periodo de 11 días a 26 ºC y agitación a 100rpm

(Tabla 6.5). El medio que presenta mayor producción de micelio es

Sabouraud con respecto a Malta. Por otra parte la concentración de

componentes del medio no presenta diferencia significativas con respecto al

la producción final de micelio, aunque en los dos medios evaluados se

evidencia una producción mayor en la concentración completa. Tabla 6.5. Características de crecimiento de micelio en medio liquido para A. muscaria y cantidades de micelio obtenido.

MEDIO CULTIVO SABOURAUD MEDIO CULTIVO MALTA Concentración

completo (55/200mL) Media concentración

(27.5/200mL) Concentración

completo (60/200mL) Media concentración

(30/200mL) 5.03* 4.35* 3.23* 2.83* 5.30* 4.68* 3.72* 2.67* 10.33* 9.03* 6.95* 5.50*

Total: 19.36* Total: 12.45* Observaciones: micelio en forma de agregados esféricos con diámetro aproximado de 1.5 a 2cm, de color blanco crema claro de aspecto algodonoso, a media concentración el agregado o pelet es de un diámetro menor. El medio se mantiene traslucido al paso del cultivo.

Observaciones: micelio en forma de agregados esféricos de diámetro aproximado de 1 a 1.5cm, de color blanco crema oscuro con el centro café de aspecto algodonoso, a media concentración el agregado o pellet es de un diámetro menor. El medio se mantiene translúcido a lo largo del cultivo.

* El peso corresponde a peso seco por filtración en vació

62

La obtención de micelio en medio líquido de Amanita fuligineodisca y

Amanita xylinivolva no se llevó a cabo debido a que no se logró recuperar

micelio característico en medio sólido.

6.2.3 CONSERVACIÓN EN BANCO DE PAPEL FILTRO, AGUA Y ACEITE

MINERAL

Posterior a la obtención de micelio purificado de cada uno de los hongos, se

procedió a realizar la conservación del mismo en tres medios para su uso en

posteriores metodologías o investigaciones y para evaluar su viabilidad a lo

largo del tiempo (Tabla 6.6).

Tabla 6.6. Tipos de conservación de micelio y pruebas de viabilidad.

Método de conservación (Nº de

unidades)

Viabilidad (meses) HONGO

Agua Aceite Papel 2 4 6 8 Amanita muscaria 30 30 40 O O O O O O X O X X X X

Amanita fuligineodisca 0 0 0 X X X X X X X X X X X X

Amanita xylinivolva 0 0 0 X X X X X X X X X X X X

Microsporum Canis 30 30 30 O O O O O O O O O O O O

Microsporum gypseum 30 30 30 O O O O O O O O O O O O

Microsporum cookei 30 30 30 O O O O O O O O O O O O

Trichophyton mentagrophytes 30 30 30 O O O O O O O O O O O O

Trichophyton rubrum 30 30 30 O O O O O O O O O O O O

Convenciones O Viable X No Viable * La lectura de viabilidad de los meses 6 y 8 para Amanita muscaria no presentó resultado debido a un problema de almacenamiento que género la inactivación del micelio.

63

6.3 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANÓLICOS La preparación de los extractos etanólicos se llevó a cabo de acuerdo con la

metodología descrita en el numeral 5.1.3, por medio de dos ciclos de 48

horas cada uno y se obtuvieron los volúmenes de trabajo que posteriormente

fueron rota-evaporados para concentrarlos y obtener el extracto crudo de

trabajo (Figura 6.7). Los extractos obtenidos fueron caracterizados con

respecto al color tanto del primer como del segundo ciclo

Figura 6.7. Montaje de extractos etanolicos a. Secado del hongo antes de realizar el extracto; b. Agitación en refrigeración del extracto crudo; c. Filtración del extracto crudo; d. Extractos de los dos ciclos; e y f. Rota-evaporación de extracto crudo.

Los extractos etanólicos concentrados se dividieron en alícuotas con el fin de

tener unos volúmenes de trabajo para el desarrollo de las metodologías

propuestas y otros de reserva. Los equivalentes a 200g de peso fresco son

a.

d. c.

e. f.

b. a.

64

los extractos de reserva y los equivalentes a 300g son los extractos se

utilizaron para el desarrollo de las pruebas (fraccionamiento, caracterización

química y bioensayos).

6.4 OBTENCIÓN DE FRACCIONES DEL EXTRACTO ETANOLICO Los extractos etanólicos concentrados fueron diluidos con etanol – agua (1:1)

para el proceso de fraccionamiento con tres solventes de diferente polaridad:

bencina de petróleo, diclorometano y acetato de etilo (Tabla 6.7).

Tabla 6.7. Montaje para preparación de fracciones a partir del extracto de trabajo.

Volumen extracto (mL) Etanol Agua (1:1) (mL) Extracto 1 Amanita muscaria (mL) 100 20

Volumen extracto (mL) Etanol Agua (1:1) (mL) Extracto 2 Amanita muscaria (mL) 87 13

El fraccionamiento con los tres solventes se realizó de acuerdo con la

metodología propuesta en tres ciclos por solvente de forma seriada, con un

volumen aproximado de 50mL. Sin embargo, se aumentaron los volúmenes

en algunos debido a la dificultad para la separación de las fases y la

obtención de cada fracción (Figura 6.8 y 6.9).

Figura 6.8. Fraccionamiento a. Bencina de petróleo; b. Diclorometano; c. Acetato de etilo.

a. b. c.

65

Figura 6.9. Color de fracciones por ciclo a. Bencina de petróleo; b. Diclorometano;c. Acetato de etilo.

Posterior a la obtención de las fracciones se procedió a la concentración de

las mismas por medio de rota-evaporación con presión reducida, hasta

obtener el menor volumen posible del solvente dentro de cada una de las

fracciones. Se obtuvieron diferentes volúmenes y se procedió a la obtención

de alícuotas equivalentes a 1g y 2g de peso fresco de cada una de las

fracciones y el extracto crudo, las cuales fueron utilizadas para las pruebas

de cromatografía, bioautografía y difusión en placa de agar.

6.5 SCREENING DE GRUPOS FUNCIONALES EN EXTRACTOS ETANÓLICOS Y FRACCIONES Las fracciones fueron sometidas a pruebas químicas preliminares de acuerdo

con la metodología descrita a partir de las alícuotas de 1g de peso fresco

equivalentes a 100µL. Los resultados obtenidos se encuentran en la Tabla

6.8, dentro de las pruebas preliminares que aportaron un resultado positivo

se encuentran saponinas y terpenoides para fracción de bencina de petróleo,

fracción hidroalcohólica y extracto crudo; glucósidos para extracto crudo,

fracción hidroalcohólica y bencina de petróleo y alcaloides para todas las

fracciones analizadas (se realizó esta prueba preliminar como confirmatoria)

(Figura 6.10).

I II III

BP DC AE

III III II II I I

a. c. b.

66

Figura 6.10. Pruebas químicas preliminares a. Dragendorff para alcaloides; b. Rosenthaler para saponinas; c. Antrona para glucósidos; d. Ácido pícrico para terpenoides. Tabla 6.8. Resultados de pruebas químicas preliminares para extracto 1 y 2 de A. muscaria. Extracto 1 Amanita muscaria

PRUEBAS QUIMICAS PRELIMINARES Fracción Réplica Cumarinas Quinonas Saponinas Flavonoides Glucosidos Terpeniodes Alcaloides

1 - - + - - + + 2 - - + - - + + BP 3 - - + - - + + 1 - - - - - - + 2 - - - - - - + DC 3 - - - - - - + 1 - - - - - - + 2 - - - - - - + AE 3 - - - - - - + 1 - - + - + + + 2 - - + - + + + EC 3 - - + - + + + 1 - - + - + + + 2 - - + - + + + HA 3 - - + - + + +

BP

BP DC

BP DC

DC AE

AE

AE

EC HA

C+

C-

EC

EC

C+

C+

C-

C-

HA

HA

Alcaloides

Saponinas

Terpenoides

a.

b.

d.

BP DC AE EC C+ HA

c. Glucósidos

C-

67

Extracto 2 Amanita muscaria PRUEBAS QUIMICAS PRELIMINARES Fracción Réplica

Cumarinas Quinonas Saponinas Flavonoides Glucosidos Terpeniodes Alcaloides

1 - - + - - + + 2 - - + - - + + BP 3 - - + - - + + 1 - - - - - - + 2 - - - - - - + DC 3 - - - - - - + 1 - - - - - - + 2 - - - - - - + AE 3 - - - - - - + 1 - - + - + + + 2 - - + - + + + EC 3 - - + - + + + 1 - - + - + + + 2 - - + - + + + HA 3 - - + - + + +

Los resultados negativos no indican ausencia de los compuestos, ya que las

pruebas colorimétricas presentan poca sensibilidad a bajas concentraciones

del compuesto y pueden arrojar falsos negativos, a su vez el extracto 1 y 2 se

comportaron de la misma forma para cada una de las pruebas. La tabla

completa con las observaciones particulares de coloración previa y posterior

a la realización de la prueba para cada uno de los compuestos se encuentra

en el Anexo 12.

6.6 CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA Para el desarrollo de la cromatografía en capa delgada se realizó la

búsqueda de una combinación apropiada de solventes que permitieran una

separación adecuada de los diferentes metabolitos obtenidos de cada una de

las fracciones. Se probaron 23 combinaciones de fases móviles (Tabla 6.9)

de las cuales se definió como la mezcla de solventes apropiada para correr la

cromatografía el Nº 20, compuesta por bencina de petróleo y acetato de etilo

en proporción 9:1. Se determinó como solvente de corrida bajo el criterio de

68

definición y separación de bandas. Las pruebas y resultados de cada una de

las corridas se encuentran en el Anexo 12.

Tabla 6.9. Combinaciones y proporción de solventes probados para corrida de cromatografía en capa delgada. Nº Solventes Proporción Referencia 1 Cloroformo: Acetato de etilo: Acido fórmico 30:55:10 Barazani & Friedman, 19992 Cloroformo: Acetato de etilo: Metanol 2:02:01 Rodríguez, 2002 3 Cloroformo: Acetato de etilo: Acido acético 50:30:20 Torres et al, 2004 4 Cloroformo: Acetato de etilo: Acido acético 60:40:05 Metzger, 1980 5 Etanol: Agua 7:03 Sherma, 1996 6 Cloroformo: Agua: Acetato de etilo 28:01:01 Sherma, 1996 7 Cloroformo: Acetato de etilo 29:03:00 Sherma, 1996 8 Acetato de etilo: Metanol: Acido acético 100:50:05 Sherma, 1996 9 Acetato de etilo: Acido acético: Agua 3:01:01 Sherma, 1996 10 Metanol: Cloroformo 1:01 Sherma, 1996 11 Cloroformo: Etanol: Acido acético 100:50:75 Sherma, 1996 12 Cloroformo: Acido acético: Agua 3:06:01 Sherma, 1996 13 Cloroformo: Acetato de etilo: Metanol: Agua 15:40:22:10 Sherma, 1996 14 Cloroformo: Metanol: Agua 11:09:02 Sherma, 1996 15 Metanol: Cloroformo: Agua 12:08:02 Jork et al, 1990 16 Cloroformo: Metanol 3:01 Sherma, 1996 17 Cloroformo: Metanol: Acido acético 45:04:01 Sherma, 1996 18 Cloroformo: Metanol: Acido acético 18:02:01 Sherma, 1996 19 Bencina de petróleo 1 * 20 Bencina de petróleo: Acetato de etilo 9:01 * 21 Bencina de petróleo: Acetato de etilo 7:03 * 22 Cloroformo: Acetato de etilo 1:01 * 23 Cloroformo: Acetato de etilo 7:03 *

* El solvente fue desarrollado a partir del resultado obtenido por los solventes 1 al 18 y hace parte de una modificación que no se encuentra en bibliografía.

La cromatografía de los dos extractos en el solvente Nº 20 generó una serie

de bandas autofluorescentes (Figura 6.11), estas bandas se tienen en cuenta

después del proceso de revelado ya que pueden ser interferentes y no tiene

relación con las bandas generadas por los compuestos que se buscan y con

el fundamento de cada revelador utilizado. Sin embargo, estos pueden ser

69

generados por compuestos de interés y no se descartan. Estas bandas

fueron descritas en el Anexo 13.

Figura 6.11. Cromatografía de capa delgada sin revelado a. Observación bajo lus UV de longitud de onda corta para el extracto Nº1; b. Observación bajo luz UV de longitud de onda corta para extracto Nº2; c. Observación bajo luz UV de longitud de onda larga para extracto Nº1; d. Observación bajo luz UN de longitud de onda larga para extracto Nº2.

Los RF obtenidos para cada una de estas bandas se encuentran en la Tabla

6.10 y fueron comparados con los RF obtenidos después de revelar para

observar si estas bandas se expresan con el revelador. Tabla 6.10. Cálculos de RF para la corrida cromatografía de los extractos 1 y 2 de A. muscaria sin proceso de revelado.

LONGITUD DE ONDA

BENCINA DE PETROLEO

DICLOROME-TANO

ACETATO DE ETILO

HIDROALCO-HÓLICA

EXTRACTO CRUDO

CORTA

3 bandas

• 0.14 • 0.34 • 0.87

2 bandas

• 0.37 • 0.87

2 bandas

• 0.37 • 0.87

2 bandas

• 0.14 • 0.38

1 banda

• 0.38

LARGA

3 bandas

• 0.14 • 0.30 • 0.84

2 bandas

• 0.28 • 0.84

1 banda

• 0.84

1 banda

• 0.28

0 bandas

BP DC AE HA EC

Ext. 1

DCBP AE HA EC

Ext. 2

BP DC AE HA EC

Ext. 1

BP DC AE HA EC

Ext. 2

a.

d.

b.

c.

70

Posterior a la corrida en el solvente se pasó al proceso de revelado de cada

una de las placas de HPTLC con 8 reveladores para compuestos diferentes

de acuerdo con el fundamento de cada uno (Anexo 10).

Las bandas obtenidas después de revelar fueron caracterizadas de acuerdo

con coloración y características de corrida (Anexo 13) y el cálculo de los RF

de cada una de las bandas las cuales se encuentran en la Tabla 6.11.

Tabla 6.11. Cálculo de RF para cada una de las bandas generadas después del proceso de revelado para el extracto 1 y 2 de A. muscaria. Extracto 1 Amanita muscaria

FRACCION REVELADOR

BENCINA DE PETROLEO

DICLOROME-TANO

ACETATO DE ETILO

HIDROALCO-HÓLICA

EXTRACTO CRUDO

VAINILLINA

0.13 0.57 0.71 0.81 0.88 0.91

0.10 0.14 0.67 0.88 0.93

0.91 0.14 0.67 0.81

CLORURO DE ANTIMONIO

0.14 0.27 0.50 0.57 0.83 0.94 0.97

0.14 0.92 0.97

0.93 0.97

0.16 0.28 0.92

REACTIVO DE NEU

0.16 0.31 0.51 0.81

0.28 0.86

0.86 0.27

HIDROXIDO DE POTASIO

0.18 0.24 0.86

0.18 0.86

0.86 0.13 0.26

HIDROXAMINA CLORURO

FERRICO

DINITROFENIL HIDRAZINA

0.14 0.33

0.14 0.14

ANISALDEHIDO(modificado para glucósidos)

0.16 0.58 0.71 0.81 0.90

0.14 0.66 0.90

0.90 0.14 0.44 0.67 0.80 0.90

DIFENIL PICRIL HIDRAZIL

0.14 0.34 0.84

0.73 0.81

0.14

RF relacionados con auto fluorescencia en espectro luz UV de onda corta y larga.

71

Extracto 2 Amanita muscaria

FRACCION REVELADOR

BENCIAN DE PETROLEO

DICLOROME-TANO

ACETATO DE ETILO

HIDROALCO-HÓLICA

EXTRACTO CRUDO

VAINILLINA

0.16 0.56 0.73 0.81 0.88 0.93

0.16 0.18 0.70 0.91 0.94

0.91

0.16 0.71 0.83

CLORURO DE ANTIMONIO

0.16 0.33 0.50 0.81 0.98

0.14 0.34 0.98

0.98 0.98

0.08 0.14 0.28 0.94

REACTIVO DE NUE

0.14 0.31 0.50 0.83

0.27 0.83

0.83 0.28


0.10 0.17 0.84

0.17 0.86

0.86 0.13 0.26

HIDROXAMINA CLORURO

FERRICO


0.13 0.14 0.14


0.16 0.54 0.70 0.81 0.91

0.14 0.70 0.91

0.93 0.14 0.47 0.70 0.81 0.91


0.14 0.86

0.76 0.83

0.13

RF relacionados con auto fluorescencia en espectro luz UV de onda corta y larga.

Teniendo en cuenta los fundamentos de cada uno de los reveladores

utilizados se presentaron una serie de bandas las cuales pueden o no ser

características a un compuesto específico (Anexo 10). Dentro de los

resultados obtenidos encontramos; la placa revelada con vainillina al tratarse

de un revelador genérico podemos decir que todas las bandas presentes

pueden estar relacionadas de una forma inespecífica para: alcoholes,

fenoles, esteroides y aceites esenciales (Figura 6.12 a-b). Para la placa

revelada con cloruro de antimonio III podemos decir que existe la presencia

de terpenoides en las fracciones de bencina de petróleo, hidroalcohólica y

extracto crudo (Figura 6.12 c-d). Por otro lado en la placa revelada con

reactivo de Neu, encontramos presencia de cumarinas para las tres

fracciones apolares y posiblemente para flavonoides para fracción de

bencina de petróleo e hidroalcohólica, ya que no es muy clara la definición de

72

color en la banda (Figura 6.12 e-f). Con el revelador de hidróxido de potasio

se presentan bandas características de cumarinas, en las tres fracciones

apolares (Figura 6.12 o-p). En hidroxilamina – cloruro férrico no se

observaron bandas características para lactonas (Figura 6.12 k-l). En el caso

de dinitrofenil hidrazina, presencia de bandas características de aldehídos

libres infracciones de bencina de petróleo e hidroalcohólica, más no para

cetonas (Figura 6.12 g-h). Para las placas reveladas con anisaldehído

modificado para glucósidos encontramos bandas en todas las fracciones

menos en la de extracto crudo (Figura 6.12 i-j). Por último, con el revelador

difenil picril hidrazil (DPPH), encontramos bandas características para

antioxidantes en todas las fracciones menos en la de extracto crudo (Figura

6.12 m-n).

Ext. 1 Ext. 2

BP DC AE HA EC BP DC AE HA EC

a. b.

Ext. 1 Ext. 2

BP BPDC DC AE AEHA HA EC EC

c. d.

73

Ext. 1 Ext. 2

BP BP DC DC AE AE HA HA EC EC

e. f.

Ext. 1 Ext. 2


g. h.

Ext. 1 Ext. 2


i. j.

Ext. 1

BP DC DCAE AEHA HA EC EC

Ext. 2 k. l.

BP

74

Figura 6.12. Cromatografías reveladas a y b. Vanillina; c y d. Cloruro de antimonio III; e y f. Reactivo de Neu; g y h. Dinitrofenil hidrazina; i y j. Anisaldehído modificado para glucósidos; k y l. Hidoxilamina cloruro ferrico: m y n. Difenil picril hidrazil (DPPH); o y p. Hidróxido de potasio.

6.7 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA

6.7.1 HONGOS AISLADOS DE LESIONES DÉRMICAS EN ANIMALES

Los dermatofitos fueron aislados de dermatomicosis de animales pequeños

tal como se definió en la metodología, para el desarrollo de la prueba de

difusión en placa y se utilizaron adicionalmente cuatro cepas de Fusarium

para la segunda metodología y para la bioautografía.

La definición del medio de cultivo y temperatura de crecimiento óptima para

los aislamientos y obtención de macroconidios de los diferentes dermatofitos

se llevó a cabo mediante una comparación del crecimiento radial del

BP DC AEAE DC BPHA HA EC EC

Ext. 1 Ext. 2 m. n.

Ext. 1 Ext. 2

BP BPDC DCAE AEHA HA EC EC

o. p.

75

dermatofito en diferentes medios de cultivo, para conocer el que generara

una mayor cantidad de conidios, menos cantidad de micelio y menor tiempo

de crecimiento. Para este fin se realizaron curvas de crecimiento donde se

evaluó el medio de cultivo PDA y Müller Hinton y la temperatura de

crecimiento de ambiente, 28 y 35ºC (Gráficas 6.1 – 6.5). Se definió que el

dermatofito crecía normalmente en medio Müller Hinton, aunque con una

taza de crecimiento lenta. Gráfica 6.1. Características de crecimiento de T. mentagrophytes en diferentes medios de cultivo y temperaturas de incubación.

Trichophyton mentagrophytes

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120 140

Tiempo (horas)

Cre

cim

ient

o R

adia

l (m

m)

PDA T. ambiente MH T.ambiente PDA 28 ºC MH 28º C PDA 35ºC MH 35ºC

Gráfica 6.2. Características de crecimiento de T. rubrum en diferentes medios de cultivo y temperaturas de incubación.

Trichophyton rubrum

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60 80 100 120

Tiempo (horas)

Crec

imie

nto

Radi

al (m

m)

PDA T.ambiente MH T.ambiente PDA 28ºC MH 28ºC PDA 35ºC MH 35ºC

76

Gráfica 6.3. Características de crecimiento de M. gypseum en diferentes medios de cultivo y temperaturas de incubación.

Microsporum gypseum

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 20 40 60 80 100 120 140

Tiempo (horas)

Cre

cim

ient

o R

adia

l (m

m)


Gráfica 6.4. Características de crecimiento de M. canis en diferentes medios de cultivo y temperaturas de incubación.

Microsporum canis

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60 80 100 120 140

Tiempo (horas)

Crec

imie

nto

Radi

a (m

m)


Gráfica 6.5. Características de crecimiento de M. cookei en diferentes medios de cultivo y temperaturas de incubación.

Microsporum cookei

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Tiempo (horas)

Cre

cim

inet

o R

adia

(mm

)


77

6.7.2 SUSPENSIÓN DE CONIDIOS DE HONGOS ASOCIADOS

DERMATOMICOSIS

La suspensión de conidios se realizó por medio de la técnica de perlas de

vidrio y solución salina. La caracterización de los dermatofitos se realizó por

macroscopía y microscopia (Figura 6.13), además, de la revisión de las hojas

de vida presentadas por el cepario de micología (Anexo 8).

Figura 6.13. Macroscopía de agentes de dermatomicosis utilizados en medio Sabouraud a. Microsporum canis; b. Trichophyton mentagrophytes; c. Trichophyton rubrum; d. Fusarium sp. Cepa108; e. Fusarium sp. Cepa 121; f. Fusarium sp. Cepa 155; g. Furarium sp. Cepa 160.

f.

d.

b. a.

c.

e.

g.

78

6.7.3 BIOAUTOGRAFÍA

Dentro de los resultados obtenidos observamos que las áreas donde no se

presentó crecimiento de los hongos, son las mismas donde se presentan

bandas en barrido para la placa que se sirvieron con el equivalente a 1g de

biomasa fresca, y que se observaron antes de ser asperjadas con la

suspensión de conidios en luz de onda corta y onda larga (Figura 6.14), lo

que nos indica que existe algún tipo de actividad antifúngica. Teniendo en

cuenta que de acuerdo con los resultados obtenidos para la cromatografía en

capa delgada, la fracción que presentó mayor cantidad de compuestos fue la

de bencina de petróleo, seguida de la fracción hidroalcohólica, la de

diclorometano, acetato de etilo y por último la de extracto crudo. Era de

esperarse que en la bioautografía se presentaran zonas de no crecimiento

mayores en la fracción bencina de petróleo y fracción hidroalcohólica, como

efectivamente se evidenció claramente en las cepas Nº 121 y 160 para la

fracción de bencina de petróleo (Figura 6.15), la poca visualización de las

bandas, puede explicarse por la naturaleza apolar del solvente y la presencia

de compuestos polares de la muestra que impiden la migración de

compuestos apolar, puede ser que queden “atrapados” en la línea e siembra.

Figura 6.14. Bioautografía sin aspersión, placa de HPTLC servida en banda con un equivalente a 1g de peso fresco a. lectura en luz UV de onda corta; b. lectura en luz UV de onda larga.

BP DC AE HA EC

Ext. 1

BP DC AE HA EC

Ext. 1a. b.

79

Figura 6.15. Bioautografía con aspersión de Fusarium sp a. Extracto 1 vs. cepa 108; b. Extracto 2 vs. cepa 108; c. Extracto 1 vs. cepa 121; d. Extracto 2 vs. cepa 121; e. Extracto 1 vs. cepa 155; f. Extracto 2 vs. cepa 155; g. Extracto 1 vs. cepa 160; h. Extracto 2 vs. cepa 160.


Ext. 1 Ext. 2 108 108 a. b.


Ext. 1 Ext. 2 121 121 c. d.


Ext. 1 Ext. 2 155 155 e. f.

80

Figura 6.15. Bioautografía con aspersión de Fusarium sp a. Extracto 1 vs. cepa 108; b. Extracto 2 vs. cepa 108; c. Extracto 1 vs. cepa 121; d. Extracto 2 vs. cepa 121; e. Extracto 1 vs. cepa 155; f. Extracto 2 vs. cepa 155; g. Extracto 1 vs. cepa 160; h. Extracto 2 vs. cepa 160.

La finalidad de hacer evaluación de las fracciones y el extracto crudo en la

misma placa están encaminadas a determinar si existen relaciones de

solapamiento o sinergismo entre los diferentes compuestos presentes en los

extractos. La presencia del área de no crecimiento en la fracción de bencina

de petróleo no nos aclara la existencia de relaciones sinérgicas o de

solapamiento, ya que existe una gran cantidad de compuestos presentes en

esta fracción y relacionados con la corrida en la placa de TLC saturada con

equivalente a 1g de peso fresco, así como puede ser un solo compuesto el

responsable de la inhibición, también puede ser un conjunto de estos, sin

embargo al compararlo con la corrida e inhibición de crecimiento en el

extracto crudo podemos decir que algún o algunos compuestos presentes en

el extracto crudo concentrado impiden la actividad de inhibición de

crecimiento y estos no se separaron en la fracción de bencina de petróleo.

6.7.4 DIFUSIÓN EN PLACAS DE AGAR

Los resultados obtenidos de la primera metodología para difusión en placa

presentaron problemas de contaminación con bacterias, debido a que

algunas de las fracciones presentaban contaminantes (Tabla 6.12). También,


Ext. 1 Ext. 2 160 160 h. g.

81

el crecimiento de los dermatofitos es lento, de acuerdo con las curvas de

crecimiento (Gráfica 6.1 - 6.5); por otro lado la técnica presenta un alto grado

de manipulación por lo cual es complicado mantener la esterilidad de los

medios de cultivo, aunque estos fueron sometidos a luz ultravioleta antes de

adicionar las fracciones en los pozos.

Tabla 6.12. Lectura de esterilidad de fracciones.

EXTRACTO 1 Amanita muscaria FRACCIÓN

Bencina de Petróleo Diclorometano Acetato de Etilo Hidroalcohólica Extracto Crudo

Bacilos largos Gram. positivos

Sin microorganismos

Sin microorganismos

Sin microorganismos

Bacilos cortos Gram. positivos y negativos

EXTRACTO 2 Amanita muscaria FRACCIÓN

Bencina de Petróleo Diclorometano Acetato de Etilo Hidroalcohólica Extracto Crudo

Bacilos largos Gram. positivos y Bacilos cortos Gram. positivos y negativos

Sin microorganismos

Sin microorganismos

Sin microorganismos

Bacilos cortos Gram. positivos y negativos

Se realizaron las lecturas de actividad, donde se observó posible actividad de

inhibición en la fracción de bencina de petróleo, diclorometano, acetato de

etilo, fracción hidroalcohólica y extracto crudo. Sin embargo algunos

resultados no presentaban concordancia con las réplicas, por lo que es

imposible definir la actividad antifúngica, la cual puede ser una relación

cruzada por los metabolitos generados por las bacterias contaminantes

(Figura 6.16).

82

Figura 6.16 Prueba de difusión en placa a. Montaje de Microsporum canis fracción bencina de petróleo; b. Montaje de Trichophyton mentagrophytes fracción diclorometano; c. Trichophyton rubrum fracción acetato de etilo.

Dentro de la primera metodología y bajo las mismas condiciones que la

prueba diseñada para las fracciones se realizó una prueba de sensibilidad

frente a Anfotericina B, que presentó la misma contaminación indicada para

la prueba con dermatofitos (Tabla 6.2).

Teniendo en cuenta el uso actual de este antifúngico en tratamientos

veterinarios frente a hongos sistémicos, más no para agentes causantes de

dermatomicosis (Lister, 1996), como era de esperarse los dermatofitos no

presentaron ningún tipo de sensibilidad frente al antifúngico, ni en las

diluciones más concentradas. Con el fin de corroborar que el uso de la

Anfotericina B se llevó a cabo correctamente en la prueba, se realizo un

control simultáneo de inhibición con una cepa de referencia ATCC Nº 22019

de Candida parasilopsis, donde se obtuvieron halos de inhibición (Tabla 13).

a.

b.

c.

83

Los resultados esperados para esta prueba no se cumplieron según los

reportes, teniendo en cuenta que una cepa de referencia para evaluar la

actividad antifúngica de la Anfotericina B es Candida parasilopsis, los halos

de inhibición de crecimiento son muy pequeños, aún en las concentraciones

de 4, 8, 16 y 32 µg/mL. Por otro lado no existió una concordancia entre

réplicas que permitieran hacer una interpretación acertada (Figura 6.17).

Tabla 13. Resultados de halos de inhibición de crecimiento para Candida parasilopsis frente a diferentes concentraciones de anfotericina B.

Concentración Anfotericina B (µg/mL) Réplica 0.06 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32

1 0.6 0.35 0.75 0.65 0.2 0.55 0 0.3 1.5 0 2

Diámetro halo (mm) 0.65 0.55 0 0.75 0.3 0.7 0 1 1.65 0

Figura 6.17 Prueba de difusión en placa con Candida parasilopsis vs. Anfotericina B a. Concentración 0.06 y 0.125µg/mL; b. Concentración 0.25 y 0.5µg/mL; c. Concentración 1 y 2µg/mL; d. Concentración 4 y 8µg/mL; e. Concentración 16 y 32µg/mL.

Por los inconvenientes presentados en el diseño experimental de difusión en

placa por pozos, se buscó otra metodología similar que nos permitiera

evidenciar la inhibición del crecimiento de los hongos patógenos y se decidió

cambiar los hongos dermatofitos por Fusarium, ya que estos también son

causantes de dermatomicosis superficiales en animales pequeños, aunque

no son definidos como dermatofitos; además presentan una tasa de

crecimiento mayor en periodos de tiempo cortos. Por otro lado, los

aislamientos de Fusarium se utilizaron para la prueba de bioautografía por

generar micelio pigmentado lo cual permite visualizar mejor los resultados.

También, se decidió utilizar una técnica de crecimiento radial por disco de

agar en medio sabouraud con cloranfenicol con siembra en masivo de

a. b. c. d. e.

84

fracciones. De esta metodología se realizó todo el análisis estadístico que se

presenta en el siguiente numeral.

6.7.4.1 Análisis estadístico de la prueba difusión en placa

Para obtener la mayor cantidad de información relacionada con los

resultados de la metodología de crecimiento radial en medios con siembra

masiva de las fracciones se decidió hacer un manejo estadístico de los datos

obtenidos. El primer paso era definir el modelo. Las variables que se tienen

en cuenta para ajustarlo son los extractos de Amanita muscaria, las cepas de

Fusarium, las fracciones y réplicas (1, 2, 3). Inicialmente se ajustó un modelo con todas las variables y sus interacciones

para identificar cuales factores se deben dejar en el modelo y cuales no son

significativos y ser eliminados, al ser variables redundantes para el modelo.

De acuerdo a los resultados se observó que el factor extracto no es

representativo en el modelo al igual que las interacciones asociadas a este,

es decir que el comportamiento de los dos extractos es significativamente

similar, por lo que hacer una relación entre estos no es importante y se utilizó

como una réplica (Gráfica 6.6 y 6.7). Se decide entonces eliminar esta

variable al igual que la variable réplica (Tabla 6.14).

Tabla 6.14. Análisis estadístico general a. Área debajo de la curva y relación de probabilidad para las diferentes variable; b. Diámetro de crecimiento y relación de probabilidad para las diferentes variable.

a. b. Área Bajo la Curva Diámetro de Crecimiento

Pr ≥ F ≤ 0,0001 Pr ≥ F ≤ 00639 CEPA MEDIA DUNCAN CEPA MEDIA DUNCAN

160 27,636 A 160 3,958 A 121 25,449 AB 121 3,797 AB 155 24,106 B 155 3,416 B 108 20,767 C 108 2,944 C

85

Área Bajo la Curva Diámetro de Crecimiento Pr ≥ F ≤ 0,0001 Pr ≥ F ≤ 0,0001 FRACCIÓN MEDIA DUNCAN FRACCIÓN MEDIA DUNCAN

C 32,174 A C 4,784 A AE 29,504 AB AE 4,178 AB EC 28,092 BC EC 4,046 BC DC 26,081 C DC 3,696 C AH 21,079 D AH 3,04 D BP 10,007 E BP 1,416 E

Pr ≥ F 0,9128 Pr ≥ F 0,9128 REPLICA MEDIA DUNCAN REPLICA MEDIA DUNCAN

1 24,756 A 1 24,756 A 2 24,444 A 2 24,444 A 3 24,269 A 3 24,269 A

Gráfica 6.6. Crecimiento general de las cepas de Fusarium relacionado con las fracciones utilizadas.

Crecimiento Total Fusarium (Extracto 1)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Diá

met

ro (c

m)

Bencina de petroleo Diclorometano Acetato de Etilo

Hidroalcoholica Extracto crudo Control

Gráfica 6.7. Crecimiento general de las cepas de Fusarium relacionado con las fracciones utilizadas.


0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Diá

met

ro (c

m)

Bencina de Petróleo Diclorometano Acetato de EtiloHidroalcoholica Extracto crudo Control

86

Se realizó un análisis de varianza (ANOVA), hay que tener en cuenta que en

este caso la tabla de ANOVA que se tomó en cuenta es la que corresponde a

las sumas de cuadrados Tipo III.

Vemos que el modelo ajustado explica bien la variabilidad de la información

ya que tiene un R2 de 0.825946 para el análisis de diámetros y 0.669862

para área bajo la curva, además los factores incluidos en el modelo son

significativos, esto se concluye observando el p-valor (Tabla 6.23), el cual

ayuda a verificar la hipótesis nula, no hay diferencia significativa entre los

factores. Si rechazamos la hipótesis nula estamos diciendo que el factor es

diferente de cero es decir que es significativo en el modelo. El criterio de

decisión dice que si el p-valor es menor a 0.05 entonces se rechaza la

hipótesis nula.

Ya con el modelo seleccionado y ajustado se realizan las comparaciones de

medias y sus correspondientes test para verificar los resultados.

Las comparaciones de medias del diámetro y área bajo la curva de las

diferentes cepas de Fusarium arrojan algunas diferencias significativas entre

ellos para el agrupamiento general de DUNCAN (Tabla 6.15). Las diferencias

entre estos hongos son aproximadamente de un centímetro entre ellos en el

caso del análisis para diámetro. Por otra parte el comportamiento de las

fracciones en el análisis general indica que existen diferencias entre las

fracciones y se evidencian diferencias significativas para la fracción bencina

de petróleo e hidroalcohólica referente al poder que tienen para inhibir el

crecimiento de las cepas de Fusarium utilizadas.

Los resultados anteriores son del análisis general, pero vale la pena ahora

mirar las diferencias entre las fracciones para cada cepa de Fusarium.

87

Para Fusarium sp. cepa108 se tienen las siguientes diferencias entre

fracciones (Tabla 6.15), (Figura 6.18).

Tabla 6.15. Agrupación de Duncan para Fusarium sp. Cepa 108.

Fusarium cepa 108 Extracto 1

Pr ≥ F0,0426 Extracto 2

Pr ≥ F0,1618

FRACCIÓN MEDIA DUNCAN FRACCIÓN MEDIA DUNCAN DC 26,394 A HA 25,022 A AE 24,839 AB AE 21,456 AB BP 19,105 BC DC 20,922 AB C 18,989 BC EC 19,322 AB

HA 18,539 BC C 18,989 AB EC 17,9 C BP 17,728 B

Para esta cepa de Fusarium sp. podemos observar que existen diferencias

entre el comportamiento de las fracciones en relación con los extractos y el

control de crecimiento, que no se comporta de forma clara, se supone que

este debería crecer más que las cepas expuestas al tratamiento (Gráfica

6.8).

Gráfica 6.8. Comportamiento de Fusarium sp. Cepa 108 frente a las fracciones vs. tiempo de crecimiento.

Fusarium cepa 108

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)

Bencina Petroleo Diclorometano Acetato EtiloHidroalcoholica Extracto Crudo Control

88

Figura 6.18. Crecimiento radial evidenciado para la cepa 108, días de muestreo (3, 5 y 8).

Para Fusarium cepa 121 se tienen las siguientes diferencias entre fracciones

(Tabla 6.16), (Figura 6.19).



Pr ≥ F≤ 0,0001 Extracto 2

Pr ≥ F≤ 0,0001

FRACCIÓN MEDIA DUNCAN FRACCIÓN MEDIA DUNCAN C 36,100 A C 36,1 A

DC 32,900 A AE 32,067 AB AE 31,183 A DC 28,578 BC EC 28,967 A EC 27,772 BC HA 14,722 B HA 22,583 C BP 6,737 C BP 7,684 D

En este caso vemos que las fracciones si causan un efecto reductor en el

crecimiento ya que ninguna de las medidas llegan a ser tan altas como las

del control y la relación entre le extracto 1 y 2 es similar salvo diferencias

para la fracción diclorometano y acetato de etilo. Sin embargo esta diferencia

no es significativa (Gráfica 6.9).

a. c. b.

89

Gráfica 6.9. Comportamiento de Fusarium sp. Cepa 121 frente a las fracciones Vs. tiempo de crecimiento.

Fusarium cepa 121

0,001,002,003,004,005,006,007,008,009,00

10,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)

Bencina Petroleo Diclormetano Avetato EtiloHidroalcoholica Extracto Crudo Control


Para Fusarium cepa 155 se tienen las siguientes diferencias entre fracciones

(Tabla 6.17), (Figura 6.20). Tabla 6.17. Agrupación de Duncan para Fusarium sp. Cepa 155.



Pr ≥ F≤ 0,0001


EC 32,589 B AE 28,517 B AE 30,128 C EC 26,167 BC HA 19,333 D DC 23,767 BC DC 19,267 D HA 21,617 C BP 7,794 E BP 9,445 D

a. c. b.

90

Para esta cepa se presentan las mismas diferencias que para la cepa 121

con algunas variaciones en cuanto al área bajo la curva para las fracciones

de extracto crudo y acetato de etilo, y para hidroalcohólica y diclorometano.

La fracción de bencina de petróleo continúo siendo la fracción con mayor

resultado de inhibición (Gráfica 6.10).


Fusarium cepa 155

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)

Bencina Petroleo Diclorometano Acetato EtiloHidroalcoholica Extracto Crudo Control


Finalmente para Fusarium cepa 160 se tienen las siguientes diferencias entre

fracciones (Tabla 6.18), (Figura 6.21).

a. c. b.

91




Pr ≥ F≤ 0,0001


EC 35,911 AB EC 36,111 A AE 33,333 B AE 35,511 AB HA 26,294 C DC 31,228 B DC 25,594 C HA 20,522 C BP 6,967 D BP 4,595 D

Esta cepa se comportó de la misma manera que la cepa 155 sin la diferencia

entre las fracciones de extracto crudo y acetato de etilo. Nuevamente la

fracción de bencina de petróleo arroja el área bajo la curva más baja (Gráfica

6.11).


Fusarium cepa 160

0,001,002,003,004,005,006,007,008,009,00

10,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)

Bencina Petroleo Diclormetano Acetato EtiloHidroalcoholica Extracto Crudo Control


a. c. b.

92

Teniendo en cuenta los resultados para cada una de las capas utilizadas se

calculó el porcentaje de inhibición (Tabla 6.19, Gráfica 6.12 – 6.17), con el fin

de tener una proporción sobre la actividad de cada uno de los extractos

analizados por medio de la formula de porcentaje de Inhibición:

%Inhibición = Crecimiento libre – Crecimiento Influenciado

Crecimiento libre x 100 Tabla 6.19. Porcentaje de inhibición de crecimiento para la relación extracto, cepa y fracción.

Fusarium sp. FRACCIÓN Extracto 1 %

Inhibición FRACCIÓN Extracto 2 % Inhibición

EC 17,90 5,74 BP 17,73 6,64 HA 18,54 2,37 C 18,99 0 BP 19,11 0 EC 19,32 0 C 18,99 0 DC 20,92 0

AE 24,84 0 AE 21,46 0

108

DC 26,39 0 HA 25,02 0 BP 6,74 81,33 BP 7,68 78,73 HA 14,72 59,22 HA 22,58 37,45 EC 28,97 19,75 EC 27,77 23,07 AE 31,18 13,63 DC 28,58 20,83 DC 32,90 8,86 AE 32,07 11,16

121

C 36,10 0 C 36,10 0 BP 7,79 78,11 BP 9,44 73,27 DC 19,27 45,86 HA 21,62 38,79 HA 19,33 45,69 DC 23,77 32,70 AE 30,13 15,34 EC 26,17 25,91 EC 32,59 8,43 AE 28,52 19,25

155

C 35,59 0 C 35,32 0 BP 6,97 81,79 BP 4,59 88,01 DC 25,59 33,15 HA 20,52 46,39 HA 26,29 31,32 DC 31,23 18,42 AE 33,33 12,93 AE 34,51 9,85 EC 35,91 6,19 EC 36,11 5,67

160

C 38,28 0 C 38,28 0

93

Gráfica 6.12. Comparación de crecimiento de las cepas de Fusarium frente a la fracción Bencina de petróleo vs. tiempo de crecimiento.

Gráfica 6.13. Comparación de crecimiento de las cepas frente a la fracción Diclorometano vs. tiempo de crecimiento.

Gráfica 6.14. Comparación de crecimiento de las cepas frente a la fracción Acetato de Etilo vs. tiempo de crecimiento.

Acetato Etilo Vs Fusarium

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)

Cepa 108 Cepa 121 Cepa 155 Cepa 160

Diclorometano Vs Fusarium

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)


Bencina Petroleo Vs Fusarium

0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)


94

Gráfica 6.15. Comparación de crecimiento de las cepas frente a la fracción Hidroalcohólica vs. tiempo de crecimiento.

Gráfica 6.16. Comparación de crecimiento de las cepas frente a la fracción Extracto Crudo vs. tiempo de crecimiento.

Gráfica 6.17. Comparación de crecimiento de las cepas control vs. tiempo de crecimiento.

Control Crecimiento Fusarium

0,001,002,003,004,005,006,007,008,009,00

10,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)


Extracto Crudo Vs Fusarium

0,001,002,003,004,005,006,007,008,009,00

10,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)


Hidroalcoholica Vs Fusarium

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)

Dia

met

ro (c

m)


95

7. DISCUSIÓN

7.1 COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES DE LA FALIMIA AMANITACEAE

7.1.1 CARACTERÍSTICAS Y ZONAS DE MUESTREO

Amanita muscaria se puede encontrar en casi cualquier hábitat, desde las

regiones más bajas a los bosques límites de la vegetación, desde las

latitudes más meridionales hasta latitudes septentrionales. Crece

mayoritariamente dentro de la estación micológica (otoño-invierno), que para

el caso de un país como el nuestro está relacionado a los periodos

comprendidos entre una estación lluviosa no muy fuerte y un periodo de

sequía cálido o húmedo. Amanita muscaria es un hongo que necesita

periodos de humedad o lluviosidad significativos, mas no agresivos (Galvis,

2006; Sawyer, 2001; Tsujikawa, 2006).

Para el caso de nuestra investigación, el periodo de muestreo fue largo

debido principalmente a fenómenos climáticos como el fenómeno del niño,

caracterizado por periodos de lluvia prolongados, lo que generó una

concentración de agua elevada en los suelos, aunque para el caso de los

bosques de pino muestreados pareciera no ser significativo por la capacidad

de retención y absorción que presentan estos suelos, por estar compuestos

de capas de hojarasca superiores a los 40cm. Estos periodos si influyeron, la

humedad excesiva generó que los cuerpos fructíferos no fueran fácilmente

colectables, presentaban procesos de deterioro acelerado después de la

colecta lo que impedía un proceso de secado eficiente y cuerpos fructíferos

muy pequeños. Por otro lado se presentó el fenómeno de la niña que se

caracteriza por periodos de calor y sequía intensos. Inicialmente este periodo

96

fue propicio para el proceso de colección ya que la humedad retenida por el

suelo se pierde y genera un medio calido y húmedo contrastado con noches

frías características de la región cundiboyasence, lo que favorecía la

presencia de cuerpos fructíferos carnosos, fuertes de buen tamaño y con

periodos de descomposición más largos. Sin embargo, al presentarse este

fenómeno que no es controlables en cuento a su aparición y que se prolongo

por un periodo de aproximadamente 5 meses, generó que las colecciones

siguientes fueran problemáticas ya que el suelo se secó por completo y las

condiciones de humedad se perdieron generando ausencia de Amanita

muscaria y otras especies.

Los periodos de presencia o no de cuerpos fructíferos de Amanita muscaria,

están ligados directamente a las relaciones climáticas anteriormente

descritas. Por otro lado, estas sucesiones ecológicas tienen una finalidad

específica en un ecosistema, para nuestro trabajo encontramos que los

periodos de exceso de humedad se relacionan con la presencia superior de

cuerpos fructíferos de hongos de la familia Boletaceae, los cuales presentan

una gran permeabilidad y capacidad para crecer un medio saturado de

humedad. Adicionalmente, en los periodos de sequía se presentan hongos

de la familia Tricholomataceae, los cuales por sus características de

crecimiento pueden desarrollarse bien en medios secos como piedras,

troncos de árboles y suelo.

En una ecosistema tan variado que no presenta ciclos climáticos definidos,

como las estaciones, los periodos de sucesión de hongos macromicetos son

variados. Sin embargo, a pesar que existan las condiciones ideales de

crecimiento de hongos como A. muscaria, encontramos que esta puede

presentar latencias anormales, es decir, podemos encontrar micelio

característico al interior de los capas de hojarasca, mas no evidenciar la

presencia de cuerpos fructíferos (Lodge, 1995).

97

7.1.2 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA, MACROSCÓPICA Y

MICROSCÓPICA

Para el proceso de identificación de Amanita muscaria debemos tener en

cuenta que dentro del estudio de hongos Agaricales, A. muscaria es un

modelo recurrente debido principalmente a su característica tóxica, lo que

hizo que esta estuviera dentro de un interés particular. La identificación de

este hongo es de alguna manera simple, sus características morfológicas son

inconfundibles, sin embargo se presentan confusiones significativas si

tenemos varias especies de Amanita como Amanita phalloides, A.

Bisporigera, A. verna, A. vinosa, A. ocreata, A. temifolia y A. suballiacea, las

cuales presentan características similares y específicamente su toxicidad

(Michelot, 2003; Satora, 2005)

Para nuestro estudio se contó con claves taxonomicas, guías de campo

desarrolladas para hongos macromicetos reportadas en el país (Franco,

2000), lo que nos dió una garantía, ya que no se sabía si las características

reportadas en regiones como Europa y América del norte se presentarían de

la misma manera en una zona subtropicale como la nuestra. Encontramos

que Amanita muscaria y otras especies de Amanita no nativas de nuestra

región, presentan las mismas características de crecimiento con algunas

variaciones como el tamaño y su macroscopía en periodos de madurez

relacionado a deformaciones por humedad (Geml, 2008). Al mismo tiempo, al

confirmar que su comportamiento es normal dentro de nuestra región,

también se trabajó con el programa “matchmaker”, desarrollado como

herramienta de identificación de hongos de América del Norte y Europa. El

programa arrojó una probabilidad de 99% para A. muscaria. Se realizaron

todos los protocolos de clasificación morfológica tanto macro como

microscópicos donde se tiene completa certeza que se trabajó con A.

muscaria.

98

Las otras dos especies colectadas se reportaron como Amanita

fuligineodisca y Amanita xylinivolva, según el seguimiento de claves

taxonómicas (Franco, 2000). Sin embargo como se reportó en los resultados,

las cantidades encontradas no fueron suficientes para le trabajo de

identificación química y pruebas biológicas. La identificación con el programa

matchmaker arrojó una probabilidad de 78% para A. fulva para el espécimen

clasificado como A. fuligineodisca, por claves taxonómicas. Para el

espécimen clasificado como A. xylinivolva, el programa no arrojó resultados,

posiblemente debido a que el programa solitita información especifica,

referente a estructuras como esporas y sus dimensiones y otras estructuras

que solo se pueden observar con equipo especializado con los cuales no se

contó. Por otro lado a pasar de existen reportes donde se evidencia que el

cambio genético y por ende de características generales de estos hongos

que son cosmopolitas no varia, si existen diferencias en cuanto a su otras

características como pigmentación y dimensiones debido a las diferencias de

suelo (Musso, 1979; Terradas, 1991; Vetter, 2004). El programa es una

herramienta útil para llegar al género, o para identificar especie cuando se

cuenta con una descripción detallada o la especie presenta una amplia y

reconocida distribución como Amanita muscaria, sin embargo, no puede ser

utilizado como unica herramienta de identificación.

7.2 OBTENCIÓN DE MICELIO DE A. muscaria COLECTADA (medio sólido y líquido).

Después de la identificación se procedió a realizar una recuperación de

micelio en medio sólido y posteriormente en medio líquido, cabe aclarar que

se ha demostrado que Amanita muscaria a diferencia de otras especies de

Amanita no es cultivable (http://www.gratisweb.com/delysid/abiologia.html),

es decir que no se obtiene cuerpo fructífero de un cultivo simulado ya que se

a encontrado que esta especie en particular presenta relaciones o

99

asociaciones estrechas con las raíces de diferentes árboles como el roble y

el pino (Nehls, 2007), por lo cual se realiza un intercambio de sales minerales

y agua por sustancias orgánicas que no se encuentran fácilmente en la

hojarasca del suelo, sin embargo no es una asociación exclusiva.

La finalidad de realizar el cultivo de micelio en medio líquido es buscar si la

producción de compuestos antifúngicos está ligada únicamente al cuerpo

fructífero o también a micelio primario.

Inicialmente el estudio estaba encaminado a realizar una comparación de

diferentes especies de Amanita, sin embargo encontramos que la distribución

de varias especies de Amanita en la región de Cundinamarca no es muy

amplia. Se logró identificar dos especies más, A. flugineodisca y A.

xilinivolba, sin embargo la cantidad de cuerpo fructífero no nos permitió

realizar un estudio con estas especies. Es clara la dominación en la dinámica

poblacional de A. muscaria dentro de las seis zonas de muestreo reportadas.

No existen reportes sobre la prevalencia de cada una de las especies de

Amanita en el país, algunos trabajos hacen referencia a una población mayor

de Amanita muscaria en Boyacá (Galvis, 2006), sin embargo en estudios

realizados en Latinoamérica específicamente en México presentan una

amplia distribución (Villanueva, 2006; Pérez, 2006).

7.3 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANOLICOS

La obtención de los extractos etanólicos no presentó ningún tipo de

complicación, a pesar que no se logró obtener el equipo necesario para

realizar el secado de los cuerpos fructíferos (liofilizador u horno de

convección con vacío), el realizar el secado al ambiente generó que se

presentaran un alto contenido de agua por lo que se decidió modificar la

proporción de agua y etanol en el proceso de la realización de la fracción

hidroalcohólica. Por otro, lado la cantidad de 500g de biomasa fresca

100

necesitó volúmenes elevados de etanol para la realización del extracto y un

aumento en los tiempos de rota-evaporación para la obtención del extracto

crudo concentrado. Como se realizaron dos extractos con dos colectas en

lugares diferentes de A. muscaria, se evaluaron posibles diferencias con

respecto los extractos, se observó que no existió diferencia de color u olor en

los dos extractos obtenidos.


Dentro del desarrollo de la metodología de fraccionamiento con solventes de

diferente polaridad se decidió hacer un fraccionamiento seriado, lo que

generó que la fracción de bencina de petróleo, es decir la fracción más apolar

barriera la mayoría de los compuesto presentes en el extracto crudo. Esto se

pudo evidenciar por la intensidad de color de las diferentes fracciones antes

del proceso de concentrado. Por otro lado, la fracción de bencina de petróleo

presentó la mayor dificultad de separación debido a la formación de una

interfase oleosa que se debió centrifugar para separar la fracción éter. La

fracción diclorometano y acetato de etilo también presentaron la fase oleosa,

pero no tan grande, y con periodos de reposo largos era fácil su separación

sin necesidad de centrifugar.

7.5 SCREENING DE GRUPOS FUNCIONALES EN EXTRACTOS ETANOLICOS Y FRACCIONES

7.5.1 PRUEBAS QUÍMICAS PRELIMINARES

Las fracciones concentradas fueron sometidas a pruebas calorimétricas para

identificar algunos grupos funcionales. Como se mostró en los resultados se

obtuvieron positivos para saponinas, las cuales se presentaron en la fracción

de bencina de petróleo, extracto crudo y fracción hidroalcohólica, a pesar que

101

la afinidad de las saponinas no está relacionada con solventes tan apolares.

Terpenides se presentaron en la fracción de bencina de petróleo lo cual era

de esperarse por su afinidad a solventes de baja polaridad y en las

fracciones de extracto crudo e hidroalcohólica, este resultado debido

posiblemente a que pueden estar asociados a glucósidos polares. En el

extracto crudo y fracción hidroalcohólica se presentaron glucósidos, lo cual

es de esperarse debido a que los glucósidos son compuestos altamente

polares. Se confirmó la presencia de alcaloides, pues era de esperarse ya

que Amanita se caracteriza por ser alucinógena (Chen Li, 2005; Michelot,

2003); por otro lado el resultado positivo para todas las fracciones analizadas

está relacionado con lo heterogéneo de los alcaloides y su polaridad

(Domínguez, 1985; Calderón, 1963). La prueba de alcaloides se utilizo para

generar un control positivo; sin embargo las pruebas calorimétricas no son

suficientes ni determinativas para descartar o afirmar la presencia de un

compuesto, debido principalmente a que existe la posibilidad de interferencia

por estructuras similares y debido a la dificultad que se presenta al realizar

una valoración relacionada con reacciones de color, donde la intensidad y

fuerza de la reacción es directamente proporcional a la concentración del

compuesto por lo que podemos generar falsos positivos o falsos negativos.

7.5.2 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

Dentro de los resultados obtenidos para la prueba de cromatografía en placa

delgada es clara la diversidad de metabolitos secundarios presentes en el

cuerpo fructífero de Amanita muscaria, esta diversidad es ya bien conocida

en hongos tanto macromicetos como micromicetos (Lindesquist, 2005). Para

el propósito del trabajo nos interesa la actividad antifúngica de estos

compuestos encontrados y sus interacciones dentro de un sistema inhibitorio

de crecimiento fúngico. No todos los compuestos encontrados presentan

actividad antifúngica.

102

Para el caso de los compuestos encontrados podemos hablar de activadad

antifúngica, antimicrobiana y anti-inflamatoria de saponinas aisladas de

plantas de quinua, agapanto y yuca contra hongos como Botrytis cinerea,

Trychophyton mentagrophytes, Sporothrix schenekii, Candida albicans y

Cryptococcus neoformans. (Singh, 2008; Stuardo, 2008; Zhang, 2008); para

el caso terpenos estos presentan reportes sobre actividad antifúngica frente a

Candida albicans, Rhizopus stolonifer, Cladosporium cucumerinum, B.

cinerea y Mucor sp (Braga, 2008; Gata-Gonçalves, 2003; Leon, 2004),

antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus (Bharate, 2005), anti-tumoral

e inmunosupresora, estas actividades y posibles usos se han referenciado

principalmente a partir de plantas (Barrero, 1999). Para el caso de las

cumarinas, se presenta actividad antifúngica frente a Cryptococcus

neoformans, Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum, Trichophyton

mentagrophytes Aspergillus niger, Aspergillus flavus y Cladosporium como

antimicrobiana frente a Leishmania, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella Typha

(Gangadhar, 2008; Ahua, 2004; Ojala, 2000; Sardoni, 1999; Stein, 2006),

dentro de este grupo la escopoletina ha presentado importantes resultados

(Valle, 1997) y se está estudiando para el desarrollo de anti-cuagulantes y

medicamentos preventivos para el cancer, también aislados a partir de

plantas y sus frutos (Monti, 2007; Thati, 2007). A su vez, compuestos

fenólicos obtenidos del olivo y en específico de la alcaparra presentan

actividad antimicrobial frente a Gram positivos (Bacillus cereus, Bacillus

subtilis y Staphylococcus aureus), Gram negativos (Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae) y hongos (Candida

albicans y Cryptococcus neoformans) (Sousa, 2006). También se habla de

estudios realizados a partir de plantas, en los que se reporta actividad

antifúngica asociada a glucósidos contra F. oxysporum, R. solani y B. fabae.

Además actividad de aldehídos frente a Tricophyton mentagrophytes,

103

Microsporum canis y Candida spp (Abbassy, 2007; Battinelli, 2006). Así

flavonoides presentan actividad antifúngica frente a Trichoderma koningii,

Fusarium solani y Cladosporium herbarum (Bernini, 2008).

Compuestos como antioxidantes que no presentan una actividad antifúngica

o antibacteriana si presentan una serie de beneficios para el desarrollo de

medicamentos relacionados con procesos de deterioro y envejecimiento de

las células el aislamientos de estas sustancias de plantas esta muy extendido

(Karagözler, 2008; Obeid, 2008; Takao, 1994), actualmente estos

compuestos se están aislado en hongos macromicetos como Agarucus sp,

Lactarius deterrimus, Suillus collitinus, Boletus edulis, Xerocomus

chrysenteron, Agaricus blazer, Agrocybe cylindracea y Lentinula edodes

conocido como Shiitake (Barros, 2008; Jayakumar, 2006; Moradali, 2007;

Ribeiro, 2008;Sarikurkcu, 2008; Sorane, 2007; Tsai, 2007).

Dentro del estudio de compuestos con algún tipo de actividad biológica,

existen numerosos estudios a partir de hongos Ascomycetes y de plantas,

más no se encuentran gran número de estudios relacionados con la

identificación de compuestos producidos a partir de cuerpos fructíferos de

hongos Basidiomycetes. Las referencias sobre actividad de estos hongos

están basadas en su gran mayoría con procesos de biorremediación de

suelos y aguas por su actividad lignolítica, es el caso de Trametes versicolor

y trogii, Phanerochaete y diferentes especies de Pleurotus, sin embargo

estos estudios no se realizan con cuerpo fructífero sino con cultivos de

micelio primario del hongo (Da Re, 2008; Mohammandi, 2008; Santoyo,

2008).

Dentro de la producción de metabolitos secundarios se tienen en cuenta la

relación de factores de carácter biótico, como predadores; y abiótico como

disponibilidad de nutrientes, temperatura y humedad, que generan

104

reacciones de estrés que desencadenan respuestas de protección en los

organismos. Estas respuestas pueden ser físicas o químicas, para el caso de

compuestos de protección como toxinas (Amanita muscaria “hongo mata

moscas”); así mismo, estas respuestas pueden ser estrategias evolutivas. En

el caso de A. muscaria se conoce que genera sustancias asociadas

directamente a su relación simbiótica con árboles de pino y roble (Koukol,

2008; Nehls, 2007)

La técnica de cromatografía en capa delgada nos permite hacer una

diferenciación de algunos de los compuestos presentes en los extractos de

Amanita muscaria, en términos de grupos funcionales. Sin embargo esta

técnica no permite confirmar la naturaleza antimicrobiana de los metabolitos,

por lo cual se planteó la metodología de bioautografía, que permite asociar

actividad antimicrobiana y naturaleza química del metabolito que está

inhibiendo el crecimiento del microorganismo a evaluar

7.6 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA

7.6.1 SENSIBILIDAD DE DERMATOFITOS FRENTE A ANFOTERICINA B

Dentro del desarrollo de esta investigación se realizaron pruebas de control y

referencia para evaluar la actividad inhibitoria de los extractos obtenidos a

partir de los cuerpos fructíferos de Amanita muscaria, frente a agentes

causantes de dermatomicosis del género Trichophyton y Microsporum.

Utilizando una cepa de referencia ATCC de Candida parapsilosis Nº 22019

teniendo en cuenta que no se han desarrollado los protocolos necesarios

para la evaluación de la sensibilidad de hongos dermatofitos, se utilizó el

protocolo de la National Comite for Clinical Laboratory Standards NCCLS

M38-A para hongos filamentosos bajo modificaciones descritas en la

metodología.

105

Dentro de los resultados esperados para la prueba, teniendo en cuenta que

Candida parapsilopsis es una especie para control de la efectividad de

inhibición de antifungicos como la Anfotericina B, se esperaba que esta

presentara diferentes halos de inhibición de acuerdo a las concentraciones

utilizadas de Anfotericina B, sin embargo esto no se presentó aun en las

concentraciones más altas. Las causas de estos resultados pueden ser

múltiples, donde encontramos que la Anfotericina B es un antifúngico de

características altamente sensibles a manipulación, donde los periodos de

refrigeración deben ser controlados estrictamente. No se contó con

instrumentos que permitieran mantener las condiciones de temperatura

constantes en el momento de realizar las diluciones, se trató de mantener las

temperaturas con baño de hielo. Por otro lado, las placas que contenían las

diluciones fueron mantenidas en refrigeración por 32 horas, no por 12 horas

como se tenía previsto debido principalmente a la cantidad de placas de agar

que se trabajaron. Otro factor que pudo estar relacionado con los resultados

obtenidos a partir del control de anfotericina B con Candida parapsilosis está

relacionado con la cepa utilizada. Se trabajó con una cepa ATCC Nº 22019

del Cepario de Micología de la Pontificia Universidad Javeriana, sin embargo

no se contó con una hoja de vida de la cepa, donde pudiéramos evidenciar

su estado en el momento de realizar la prueba, además en el momento de

reconstituir la cepa para la prueba se presentaron algunos problemas,

relacionados con lentitud en el crecimiento. Estos factores pueden ser los

causantes de los resultados obtenidos.

Para la prueba realizada con Anfotericina B y los dermatofitos era de

esperarse que estos no presentaran ningún tipo de inhibición frente al

antifúngico ya que este está reportado como antifúngico sistémico y los

dermatofitos no son hongos generadores de patologías de carácter sistémico

(Arikan 1999; Fica 2004; Lozano, 2006; Olsen, 1991).

106

Actualmente, el tratamiento de dermatofitos se realiza con antifúngicos

tópicos. Como las dermatofitosis tienden a ser crónicas (las pautas de

tratamiento suelen ser prolongadas) y la terapia disponible es poco efectiva,

el consumo de antifúngicos y por tanto el gasto sanitario se ven

incrementados. Por ejemplo, en España el consumo anual de antifúngicos

tópicos genera un gasto aproximado de 36 millones de euros y el de

antifúngicos sistémicos genera un gasto que puede superar los 27.000 euros

(Fernandez, 2005). Como se mencionó, el numero de antifúngicos usados

para el control de las micosis cutáneas o dermatomicosis es muy elevado y

no se presentan reportes claros sobre su efectividad (Tabla Nº 00) (Lozano,

2006).

Las últimas investigaciones realizadas para le control de los dermatofitos

arrojan que los tratamientos más efectivos se presentan con sertaconazol,

voriconazol y fluconazol para una gran número de dermatofitos, sin embargo

aun no se tienen datos concretos para definirlos como los más efectivos

(Lozano, 1990; Odds, 1986;Quindós, 2007).

Por otro lado, en la mayoría de los estudios sobre antifúngicos se hace

claridad que el manual M38-A y el M38-P del NCCLS presentan serias

inconsistencias relacionadas principalmente con medios de cultivo y

temperaturas de incubación (Giusiano, 2005; Morera, 2005).

Actualmente se están evaluando otro tipo de sustancias para el control de los

dermatofitos donde encontramos el uso de aceite de girasol ozonizado,

comercializado como Oleozon®. De esta combinación se producen

aldehídos, ácidos carboxílicos, hidroperóxidos, ozonidos y otras especies

peroxídicas. El Oleozon® ha sido registrado en Cuba para el tratamiento de

la tinia pedis. Este producto tiene un marcado poder germicida y su efecto

107

antimicrobiano ha sido demostrado contra bacterias, virus y hongos. También

en el tratamiento de infecciones producidas por cepas de organismos

resistentes, lo cual ha sido demostrado tanto in vivo como in vitro (Zamora,

2007). Por último, el cloruro de benzalconio, compuesto de amonio

cuaternario, es utilizado como desinfectante y antiséptico de acción

bactericida y viricida principalmente, sin considerar su propiedad fungicida,

específicamente sobre los géneros Trichophyton, Epidermophyton y Candida

(Benzada, 2004; Litter, 1992; Merianos, 1991).

7.6.2 DIFUSIÓN EN PLACAS DE AGAR Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para la difusión en placa, inicialmente en la primera técnica utilizada, se

presentaron problemas de contaminación que impidieron emitir resultados

concretos. Las placas presentaron inhibición en la fracciones de bencina de

petróleo y extracto crudo con una buena relación entre réplicas e inhibición

en las otras fracciones, pero sin relación de réplica. La presencia de

bacterias Gram. positivas y Gram. negativas hizo pensar que posiblemente

existió una inhibición del dermatofito debido a metabolitos generados por las

bacterias y no por la actividad de los extractos, también por la velocidad de

crecimiento de las bacterias que pueden ejercer un papel competitivo por

alimento y por el espacio, lo que no permitió el desarrollo de los dermatofitos.

Al cambiarse la metodología, se buscó un hongo que generara micosis

superficial al igual que los dermatofitos y que presentara una tasa de

crecimiento mayor, por este motivo se definió a Fusarium como

microorganismo de prueba, aunque este no es catalogado dentro de las

micologías clínicas como un hongo dermatofito, si tiene la capacidad de

generar micosis superficiales en animales pequeños como microorganismo

oportunista (Cutsem, 1991; Jawetz, 2000). Se evidenció claramente que la

fracción de bencina de petróleo presentó la mayor actividad inhibitoria, en las

cuatro cepas, sin embargo la cepa de Fusarium sp. 108 presentó diferencias

108

de comportamiento frente a las otras cepas trabajadas, aun en el cultivo

control. Seguido a la fracción con mayor actividad, las fracciones de

diclorometano e hidroalcohólica presentaron actividad intercalada entre las

cepas, mientras que el extracto crudo y la fracción acetato de etilo

presentaron los más bajos niveles de inhibición. Estos resultados

presentaron diferencias entre las cepas, se demostró que la cepas de

Fusarium más susceptibles a la acción de las fracciones fueron 160, 121 y

151 con porcentajes entre el 70 y el 90% de inhibición, mientras que la cepa

108 solo llegó a un 7% de inhibición. Debemos tener en cuenta que cada

especie de Fusarium presenta características diferentes de respuesta y

acción frente a sustancias que ponen en peligro su supervivencia, estas

relaciones están dadas por características adquiridas individualmente, por

procesos de modificación genética donde las cepas adquieren mecanismos

de resistencia específicos y que pueden ser o no compartidos entre

diferentes especies. Se debe recordar también, que Fusarium es un hongo

que principalmente es catalogado como fitopatógeno y que dentro de sus

características se encuentran la producción de toxinas de una gran variedad,

esta característica puede estar relacionada la capacidad de tolerar las que él

produce y otras (Carrillo, 2003). Por otro lado, como se dijo anteriormente,

Fusarium es un hongo fitopatógeno el cual se ha tratado de controlar por

diverso medios químicos, estos tratamientos han generado que los hongos

desarrollen mecanismos de residencia más elaborados que los hacen poco

susceptibles a antifúngicos de origen químico y biológico dentro de estos

mecanismos están: incapacidad del fármaco para alcanzar la diana dentro de

la célula, que puede ser debida a la existencia de barreras de permeabilidad

o a sistemas de bombeo activo del compuesto al exterior; cambios en la

interacción fármaco-diana (aumento del número de copias de la diana o

modificaciones debido a mutaciones); y modificaciones en las enzimas de las

vías metabólicas. Asimismo, se sabe que muchos de estos mecanismos

pueden coexistir en una misma célula (Mellado, 2000).

109

7.6.3 BIOAUTOGRAFÍA

Los resultados de la bioautografía confirman los resultados obtenidos a partir

de la prueba de difusión en placa, se encuentra inhibición de las diferentes

cepas de Fusarium en las todas las fracciones analizadas, sin embargo la

fracción que presenta mayor inhibición es la de bencina de petróleo. La

relación existente entre los metabolitos y la polaridad del solvente es variada,

es decir que dentro de los compuestos apolares existen gran número de

metabolitos secundarios que pueden estar actuando. De acuerdo con esto

podemos decir que existen relaciones de sinergismos y solapamiento dentro

de los metabolitos extraídos de los cuerpos fructíferos de A. muscaria.

Teniendo en cuenta que el extracto crudo contiene todos los metabolitos sin

ningún tipo de separación, sería de esperarse que este presentara una

actividad mayor que la del la fracción de bencina de petróleo, sin embargo la

inhibición es muy poca, lo que nos indica que exciten relaciones de

solapamiento entre los metabolitos. Por otro lado, no podemos descartar una

relación de sinergismo entre los compuestos presentes en la fracción de

bencina de petróleo ya que la inhibición se presenta en un espectro muy

amplio, es decir que en la cromatografía de capa delgada los RF

relacionados en el área donde no se presentó crecimiento contienen amplio

numero de bandas lo que no nos permite diferenciar cual de todas los

compuestos es el relacionado con la actividad antifúngica.

La técnica de Bioautografía es una herramienta utilizada ampliamente para

evidenciar la actividad biológica de fracciones de extractos de plantas frente

a bacterias y hongos unicelulares (Evans, 2006; Schmourlo, 2005), sin

embargo su uso para determinar actividad antifúngica contra hongos como

Fusarium es reducido, ya que la estandarización de crecimiento de hongos

en la placa de silica aun no está bien reportada. Las investigaciones que se

110

encuentran hacen referencia a la utilización de la técnica por doble capa o

bioutografía directa, es decir que la silica no es el soporte de crecimiento

para el microorganismo, sino un medio agarizado. Los problemas que se

presentaron con esta técnica para los dermatofitos demostraron que es difícil

lograr que el soporte de la silica y un medio líquido complementario como el

FSM permita de forma fácil el crecimiento del los hongos. También se deben

tener en cuenta las tasas de crecimiento del hongo que son claramente más

bajas que las de una bacteria, por este motivo se utilizó un hongo de

crecimiento rápido como Fusarium. Las diferencias de crecimiento de los

hongos presentan problemas al momento de enfrentarse a contaminantes del

medio ambiente, ya que sucede que los hongos contaminantes crecen más

rápido que los hongos de estudio, lo que genera la invalidación de la técnica,

al no poderse trabajar de forma estéril ya que los metabolitos no pueden ser

sometidos a algún proceso de esterilización pues algunos presentan

características termolábiles. Por otro lado el uso de un hongo de micelio

pigmentado como Fusarium facilitan la lectura de zonas de inhibición en la

placa de bioautografía, cuando se utiliza un hongo hialinos como los

dermatofitos el contraste al ser revelados con vapores de yodo no es bueno,

la placa de silica tiende de pigmentarse del mismo color que el micelio

rápidamente.

7.7 CORRELACIÓN DE PRUEBAS 7.7.1 PRUEBAS QUIMICAS PRELIMARES Y CROMATOGRAFIA DE CAPA

DELGADA

Dentro de las pruebas realizadas al extracto crudo y fracciones se encontró

relación entre resultados de pruebas químicas preliminares y cromatografía

en capa delgada donde se encontraron terpenoides en la fracción bencina de

petróleo, hidroalcohólica y extracto crudo. Este mismo resultado se obtuvo en

111

la cromatografía revelada con cloruro de antimonio III, de la misma manera

se encontraron glucósidos en la fracción hidroalcohólica y extracto crudo en

la prueba de antrona, sin embargo, en la cromatografía se evidencia la

presencia de estos menos en el extracto crudo (Jaitak, 2008). Por otra parte

el la pruebas preliminares no se evidenció presencia de cumarinas en la

muestras, sin embargo todas las placas cromatográficas demuestran la

existencia de cumarinas en todas la fracciones con una mayor definición en

bencina de petróleo, diclorometano y acetato de etilo, para la fracción

hidroalcohólica y extracto crudo se ve fluorescencia pero no tan definida

(Tabla 7.1). Los resultados observados demuestran que las pruebas

químicas preliminares son una herramienta útil siempre y cuando se tengan

compuestos puros y en alta concentración, más no para realizar una

búsqueda preliminar donde existen varios compuestos presentes en una

muestra y en concentraciones muy bajas. Por otro lado la cromatografía

permite realizar una búsqueda más completa; sin embargo, se debe contar

con una mezcla de solventes adecuados para separar los metabolitos en la

corrida cromatografica. También es útil realizar pruebas con un patrón del

compuesto que se busca para facilitar la identificación posterior en la

muestra.

En muestras con un número desconocido de compuestos presentes, como

los extractos de Amanita muscaria trabajados, se presentó baja

diferenciación de bandas en algunas de las corridas. Con el fin de disminuir

las dificultades que presentan estas muestras se podría trabajar con

cromatografía bidireccional (Cavazzinni, 2006), aunque esta técnica genera

un amento de costos ya que se deben trabajar las muestras por separado y

no de forma consecutiva como se hizo en esta investigación.

112

Tabla 7.1. Relación entre metabolitos encontrados en pruebas químicas preliminares y cromatografía en capa delgada.

FRACCIONES PREUBA BP DC AE HA EC

Químicas preliminares

Alcaloides Saponinas --- Terpenoides

Alcaloides --- --- ---

Alcaloides --- --- ---

Alcaloides Saponinas Glucósidos Terpenoides

Alcaloides Saponinas Glucósidos Terpenoides

Cromatografía capa delgada

Terpenoides Cuamrinas Flavonoides Glucósido AntioxidantesAldehídos Alcoholes Fenoles Esteroides Aceites esenciales

--- Cumarinas --- Glucósidos Antioxidantes--- Alcoholes Fenoles Esteroides Aceites esenciales

--- Cumarinas --- Glucósidos Antioxidantes--- Alcoholes Fenoles Esteroides Aceites esenciales

Terpenoides --- Flavonoides Glucósidos Antioxidantes Aldehídos Alcoholes Fenoles Esteroides Aceites esenciales

--- --- --- --- --- --- Alcoholes Fenoles Esteroides Aceites esenciales

7.7.2 BIOENSAYOS DIFUSIÓN EN PLACA Y BIOATOGRAFÍA

Existe una relación entre las pruebas para cada una de las cepas. La fracción

de bencina de petróleo presentó los halos de inhibición de crecimiento más

grandes en las placas de bioautografía, de la misma manera esta fracción

generó la mayor inhibición de crecimiento radial en la prueba de difusión en

placa, seguida por la fracción hidroalcohólica, también, se observa la

variación en los resultados de las pruebas en las fracciones de

diclorometano, acetato de etilo y extracto crudo, relacionado con que estas

cambian de posición a entre cepas sin ser diferencias muy marcadas con

respecto al porcentaje de inhibición, de hecho el análisis estadístico

demuestras que son resultados agrupables (Tabla 7.2).

Los resultados obtenidos demuestran que existen relaciones de

solapamiento y sinergismo entre los metabolitos con actividad antifúngica

presentes en Amanita muscaria. Era de esperarse que las muestras de

113

extracto crudo presentaran inhibición de crecimiento similar a la de bencina

de petróleo y a las otras fracciones ya que esta muestra contiene todos los

metabolitos y no fue sometida a fraccionamiento; sin embargo, se evidenció

que los compuestos presentes en ésta generan algún tipo de solapamiento y

se ocultan entre si inactivando su acción antifúngica. Así mismo, entre las

fracciones podríamos hablar de este tipo de relaciones de solapamiento,

relacionadas posiblemente a la polaridad de los metabolitos y la interacción

entre esta característica. La actividad antifúngica del extracto crudo, en

términos de porcentaje de inhibición de crecimiento micelial, se ubicó

generalmente en la mitad comparado con las fracciones. El porcentaje de

inhibición fue superior en la mayoría de las pruebas frente a las fracciones de

acetato de etilo y diclorometano, esto hace referencia a una relación de

sinergismo donde los metabolitos presentes en la fracción de acetato de etilo

y diclorometano no muestran su actividad antifúngica por separado, esto se

posible debido al tipo de fraccionamiento, ya que este fue seriado. No

podemos definir cuales son las relaciones de sinergismo y solapamiento

puntuales entre compuestos específicos ya que aun faltan procesos de

separación más complejos donde podamos definir con certeza cuales son los

compuestos implicados (Hodson, 2007; Radeke, 1992). Tabla 7.2. Relación entre resultados de inhibición encontrados en prueba de difusión en placa y bioautografía.

PREUBA CEPA BP DC AE HA EC Difusión en placa B M B M B Bioautografía

108 B M B M B

Difusión en placa A B B M B Bioautografía

121 A B B B B

Difusión en placa A M B M M Bioautografía

155 B B B B B

Difusión en placa A M B M B Bioautografía

160 A M B B B

Baja inhibición de crecimiento radial o halo de no crecimiento.

Media inhibición de crecimiento radial o halo de no crecimiento.

Alta inhibición de crecimiento radial o halo de no crecimiento.

114

8. CONCLUSIONES

• Se evidenció la diversidad de metabolitos presentes en el género

perteneciente a la familia Amanitaceae, específicamente de Amanita

muscaria. Esta especie representa un potencial importante para el

desarrollo de nuevos compuestos de tipo clínico y biotecnológico. Los

resultados obtenidos a parir de las pruebas químicas preliminares y la

cromatografía demuestran el gran número y diversidad de estos

compuestos, donde encontramos terpenoides, glucósidos, flavonoides,

alcoholes, esteroides, aceites esénciales, saponinas, cumarinas,

aldehídos libres, antioxidantes y alcaloides, a partir de las fracciones

obtenidas de cuerpo fructífero.

• El departamento de Cundinamarca en el cual se enmarco el desarrollo

de la investigación presenta una gran diversidad de flora y fauna, que

son el resultado de la interacción de factores como microclimas, tipos

de suelo, pisos térmicos lo que genera que cuente con todas las

condiciones ambientales para favorecer el desarrollo de hongos como

Amanita muscaria, la explotación de estos recursos de biodiversidad

nativos son de gran importancia económica y pueden ser a mediano o

largo plazo un foco de desarrollo científico importante.

• Dentro de los resultados de los bioensayos con extracto crudo y

fracciones de Amanita muscaria se evidenciaron relaciones de

solapamiento y sinergismo entre los metabolitos con actividad

antifúngica. Se presento actividad antifúngica de las fracciones de

bencina de petróleo, hidroalcohólica y diclorometano frente a Fusarium

sp., donde el porcentaje de inhibición para le caso de bencina de

petróleo es superior al 70%, soportado dentro de un análisis

115

estadístico. Este tipo de resultados evidencia la importancia de realizar

estudios sobre la actividad de los metabolitos de hongos

macromicetos, no solo relacionados con actividad antifúngica si no con

actividad antimicrobiana en general.

• Se presentaron inconvenientes referentes al manejo de hongos

dermatofitos para le desarrollo de pruebas de actividad biológica que

tenían como fin evaluar la efectividad de los extractos de A. muscaria

frente a los causantes de dermatomicosis. Ya que no existen

estandarizaciones sobre el manejo en laboratorio de estos hongos

como: medios de cultivo, temperaturas de incubación y evaluación de

inhibición de crecimiento, un aporte de esta investigación es la

búsqueda, aplicación y evaluación de varios métodos como difusión

en placa, inhibición de crecimiento radial y bioautografía para evaluar

esta actividad; además de la búsqueda de hongos causantes de

dermatomicosis como Fusarium sp. que permiten realizar una lectura

confiable debido a características como altas tasas de crecimiento y

micelio pigmentado.

• La interacción y relación entre los resultados obtenidos a partir de las

pruebas realizadas como cromatografía, bioautografía y difusión en

placa permiten soportar la conclusión principal donde Amanita

muscaria es capaz de sintetizar, en diferentes proporciones,

metabolitos secundarios como cumarinas, terpenoides, flavonoides,

saponinas y glucósidos que poseen actividad antifúngica contra

hongos causantes de dermatomicosis aislados de animales

domésticos.

116

9. RECOMENDACIONES

Como recomendaciones surgidas a partir del desarrollo de este trabajo y

para la realización de futuras investigaciones relacionadas con la actividad

antifúngica de compuestos obtenidos a partir de cuerpos fructíferos de

Amanita muscaria u otros hongos macromicetos. Podemos recomendar:

1. Realizar búsqueda e identificación de otras especies de Amanita

dentro del departamento de Cundinamarca, con el fin de obtener datos

comparativos en cuento a presencia y acción de metabolitos

secundarios de interés biológico, como los antifúngicos.

2. Es importante tener en cuenta los periodos de crecimiento y

fructificación de los hongos con el fin de desarrollar metodologías y

tiempos de colección adecuados de acuerdo con los periodos de

sucesión característicos de cada especie.

3. Para la realización del extracto crudo es importante que los cuerpos

fructíferos se encuentren con la menos cantidad de agua posible, con

el fin de facilitar el proceso de fraccionamiento, debido a la

interferencia que presenta el agua frente a los solventes de

separación.

4. Dentro de la metodología de fraccionamiento se podrían trabajar

fraccionamiento separado por solvente y no seriados, ya que el trabajo

con solvente de baja polaridad como la bencina de petróleo pueden

barrer la mayoría de los compuestos presentes en el extracto, un

fraccionamiento separado permitiría una mejor separación de

compuestos y una comparación más significativa entre fracciones.

117

5. Realizar pruebas a partir de cultivos de micelio en medio líquido con el

fin de evidenciar, si existe algún tipo de relación entre la generación de

cuerpo fructífero y la presencia de metabolitos secundarios

encontrados.

6. Mantenimiento de condiciones apropiadas de las fracciones y

extractos con el fin de evitar aumento de carga microbiana

acompañante o contaminación debido a la imposibilidad de

tratamientos de esterilización por algunas características termolábiles

de los compuestos.

7. Obtener la mayor cantidad de cada una de las fracciones, con el fin de

poder realizar pruebas más específicas que permitan mayor

diferenciación de los compuestos presentes en cada una de las

fracciones analizadas.

8. Realizar un proceso de estandarización que permita trabajar la

bioautografia con hongos con una baja tasa de crecimiento e hialinos

como dermatofitos.

9. Realizar proceso de separación y purificación de metabolitos

obtenidos para evaluación y diferenciar relaciones de sinergismo y

solapamiento de compuestos con actividad antifúngica, con el fin de

evidenciar el comportamiento de las mismas para el desarrollo de

nuevos antifúngicos.

118

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131

11. ANEXOS Anexo 1 Morfología de Agaricales, Boletales y algunos Polyporales (Franco, 2005)

1. Píleo.

2. Fragmentos de velo universal.

3. Contexto del píleo.

4. Himenóforo.

5. Lamelas.

6. Tubos.

7. Anillo.

8. Estípite.

9. Contexto del estípite.

10. Volva.

11. Micelio basal.

132

Anexo 2 Descripción detallada de morfología macroscópica de Agaricales (Franco, 2005)

2.1 Formas de píleo

a. Plano. b. Plano convexo. c. Convexo. d. Hemisférico. e. Parabólico. f. Campanulado.

g. Ampliamente cónico. h. Cónico. i. Cónico truncado. j. Obtusamente cónico. k. Plano cóncavo. l. Cóncavo.

m. Subinfundibuliforme. n. Fuertemente infundibuliforme. o. Ligeramente depreso. p. Depreso en el centro.

2.2 Formas de centro de píleo

a. Subumbilicado. b. Umbilicado. c. Fuertemente umbilicado.

d. Papilado. e. Abrupta. f. Con papila aguda.

g. Subumbonado. h. Embonado.

133

2.3 Ornamentación de superficie de píleo

a. Escuamuloso. b. Escamoso. c. Escuarroso. d. Liso. e. Fibriloso.

f. Reticulado. g. Areolado. h. Villoso. i. Granular. j. Rugoso.

k. Pruinoso. l. Tomentoso. m. Velutinoso. n. Concéntricamente zonado.

2.4 Formas de margen de píleo

a-c. Recto. d. Recurvado. e. Incursado.

f. Enrollado hacia abajo. g. Levantado. h. Enrollado hacia arriba.

i. Proyectado.

134

2.5 Tipos de himenóforos

Lamelado: a. En collar. b. Anastomosado. c. Intervenoso. d. Furcado.

e. Lamelado. Poroide: f. Meruloide o deadoloide. g. Poros irregulares. h. Poros compuestos.

i. Poros alongados. j. Poros angulares. k. Poros circulares. l. Dentado.

2.6 Formas de lamelas y unión a estípite

Forma: a. Lineal. b. Segmentiforme. c. Subventricosa. d. Ventricosa. e. Ampliamente ventricosa. f. Arqueada. g. Triangular.

Unión al estípite: h. Libres. i. Anexas. j. Ligeramente adnadas. k. Adnadas. l. Emarginadas. m. Situadas. n. Adnadas con dientes decurrentes.

o. Emarginadas con dientes decurrentes. p. Ligeramente decurrentes. q. Subdecurrentes. r. Decurrentes.

135

2.7 Espaciamiento entre lamelas

a. Distantes. b. Subdistantes.

c. Cercanas. d. Apretadas.

2.8 Margen de lamelas

a. Entero. b. Serrado.

c. Serrulado. d. Crenado.

e. Fimbriado. f. Erodada.

2.9 Posición del estípite respecto al píleo

a. Lateral. b. Excéntrico.

c. Central. d. Ligeramente excéntrico

136

2.10 Forma del estípite

a. cilíndrico. b. Tapón hacia abajo. c. Tapón hacia arriba. d. Subclavado.

e. Clavado. f. Con rizomorfos. g. Con pseudorriza. h. Subbulboso.

i. Bulboso. j. Abruptamente bulvoso. k. Marginadamente bulvoso.

2.11. Ornamentación del estípite

a. Liso. b. Escabroso. c. Fibriloso. d. Escamosos. e. Escuamulosos.

f. Reticulado. g. Estrigoso. h. Pruinoso. i. Velloso. j. Tomentoso.

k. Pubescente. l. Velutinoso. m. Areolado.

2.12. Tipos de volva

a. Vaina. b. Collar. c. Saco.

d. Desprendible. e. Granular. f. Hendida-partida.

g. Marginada-depresa.

137

2.13. Hábitos de crecimiento

a. Solitario. b. Cespitoso.

c. Gregario. d. Imbricado.

138

Anexo 3 Estructura basidio y basidiospora (Franco, 2005)

1. Basidio.

2. Esterigma.

3. Apéndice hilar.

4. Base (extremo proximal).

5. Poro germinal.

6. Ápice (extremo distal).

139

Anexo 4 Descripción de morfología microscópica de Agaricales (Franco, 2005)

4.1 Formas de esporas

1. Globosa. 2. Subglobosa. 3. Ampliamente elipsoide. 4. Elipsoide. 5. Oblonga. 6. Subcilindrica. 7. Baciliforme. 8. Ovoide. 9. Obovoide. 10. Cuadrangular. 11-12. Ampliamente fisiforme. 13-14. Fusiforme.

15. Oblonga en vista de perfil, triangular en vista frontal, oblonga en vista polar. 16-17.Lacrimoide. 18. Amigdaliforme vista de perfil, elipsoide vista frontal. 19. Amigdaliforme con ápice agudo vista de perfil, ovoide vista frontal. 20. Faseoliforme en vista de perfil, oblonga vista frontal.

21. Alantoide vista perfil, subcilindrica vista frontal. 22. Oblonga vista perfil, hexagonal vista frontal. 23. Subcilindrica vista perfil, hexagonal vista frontal. 24. Elipsoide con constricción parte media. 25. Oblonga con constricción parte media.

140

4.2 Ornamentación de esporas

a. Punteada. b. Verrucosa. c. Espinosa. d. Esteliforme. e. Estriada. f. Apostillada.

g. Costada. h. Falsamente equinulada. i. Reticulada. j. Lacunosa. k. Caliptrada. l. Utriculada.

m. LImoniforme. n. Sigmoide. o. Navicular. p. Cordiforme. q. Nodulosa.

141

Anexo 5 Datos de campo

Hoja Nº Colector:

Fecha

LOCALIZACIÓN

DEPARTAMENTO MUNICIPIO

LOCALIZACIÓN ESPECIFICA (GPS)

HÁBITAT

Tipo de vegetación:

Cobertura del dosel:

Cobertura del suelo:

Sitio expuesto SI NO Humedad SI NO

DATOS CLIMATICOS

Temperatura promedio: Lluvia previa SI NO

SUSTRATO

Tipo de sustrato

Vivo Descomposición

HÁBITO

Solitario

Gregario Fasciculado Cespitoso Imbricado

142

Anexo 6 Caracterización macroscópica especÍfica para miembros de la familia Amanitaceae

Hoja Nº Colector:

Fecha

LOCALIZACIÓN

DEPARTAMENTO MUNICIPIO

LOCALIZACIÓN ESPECIFICA (GPS)

CARACTERISTICAS GENERALES

Color: Olor: Sabor:

Dimensión Pileo (cm):

Dimensión Estípite (cm):

CARACTERISTICAS ESPECÍFICAS

Estípite

Posición Forma

Contenido Superficie

Tipo de Volva Anillo

Pileo

Forma Margen

Lámelas

Unión al estipite Margen

Distribución

143

Anexo 7 Caracterización microscópica

Hoja Nº Colector:

Fecha

BASIDIOSPÒRAS

ESPORAS

Tamaño: Color

Forma:

Ornamentación SI NO Poro Germinal SI NO

BASIDIOS

Forma Nº de esterigmas

REACCIONES QUIMICAS

Reactivo Melzer Amiloide Inamiloide Dextrinoide

Azul de Algodón Cianofílicas Acianofílicas

Azul de Cresyl Metacromática No metacromáticas

144

Anexo 8 Hojas de vida de Dermatofitos

COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA – PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Responsable: Claudia Marcela Parra Giraldo Número CMDM-PUJ M002 Microorganismo Trichophyton mentagrophytes Fuente Donado Dra.

Mary Santaella

Origen: Humano

Dedo meñique de pie derecho.

Almacenamiento Tubos 16x150 con agar PDA

Historial PUJ Cepario desde Junio de 2005.

Nivel de seguridad 2 Conservación Agua destilada Aceite mineral 100%

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura 25°C durante 7-10 días Pruebas biológicas

In vitro: Perfora pelo UREA: POSITIVA

Características morfológicas Características Macroscópicas AGAR PDA: Colonia granular, blanco marfil, tiende a amarillo pálido en algunas ocasiones, algodonosa ó polvorienta, granulosa, plana, centro acuminado. REVERSO DE LA COLONIA: Amarillo pálido, vino ó marrón Características Microscópicas Hifas en raqueta, astas de ciervo, espirales, zarcillos; macroconidias escasos, en habano o salchicha, pared delgada y de 1 a 6 lóbulos; microconidias abundantes, en racimos de uvas y redondos. Formación de telemorfos.

Reacciones atípicas No presenta Identificación de Peligros

Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce

Fomites Persona-persona 7-15 DIAS Infección endotrix u ectotrix en pelo, tinea capitis, onicomicosis.

Tratamiento Griseofulvina Microfotografía

Tomado de: http://www.socalemi.org/atlas_hongos.htm#mcoo

145


Responsable: Número CMDM-PUJ M045 Microorganismo Trichophyton rubrum Fuente Donado:

Origen: Humano

Almacenamiento Tubos 16x150 con Agar PDA

Historial PUJ Cepario desde

Nivel de seguridad 1 Conservación Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante

Pruebas biológicas

Ninguna

Características morfológicas Características Macroscópicas: Crecimiento moderado (14 días); de color blanco con difusión del pigmento; aspecto aterciopelado, algodonoso o granuloso y plano. Se puede observar la colonia de color rojo o café rojizo al reverso Características Microscópicas: micelio peptinadas y con clamidosporas; los microconidios son piriformes en forma de lágrima a los lados del filamento; macroconidios escasos, fusiformes, largos, estrechos, en punta de lapiz. In vitro perfora pelos y produce pigmento en agar papa y "corn meal" (harina de maíz).

Reacciones atípicas No Presenta Identificación de Peligros


Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente

Tratamiento Microfotografía


146


Responsable: Claudia Marcela Parra Giraldo Número CMDM-PUJ M004 Microorganismo Microsporum canis Fuente Laboratorio de

Micología Clínica P.U.J

Origen: Perro

Aislado de perro bebe, callejero.

Almacenamiento Tubos 16x150 con agar Malta y arroz

Historial PUJ Cepario desde Junio de 2004.

Nivel de seguridad 2 Conservación Agua Destilada Aceite mineral 100%

Condiciones de crecimiento Aeróbio estricto. Temperatura 27ºC durante 6 días Pruebas biológicas

In vitro: Perforación de pelo POSITIVA

Características morfológicas Características Macroscópicas: colonia granular, blanco amarillento, sedosa, vellosa gruesa, plana radiada. Coloración amarillo profundo ó naranja. Características Microscópicas: hifas en raqueta con clamidosporas y cuerpos nódulares; macroconidias en huso, extremos afilados es decir, con una perilla asimétrica en el extremo, pared gruesa y con 6 o más lóculos; microconidias ocasionales.

Reacciones atípicas No Presenta Identificación de Peligros


Animales domésticos (gatos, perros)-Humanos Persona- Persona Fomites / Zoonótico 7-10 días Infección endotrix, tinea capitis y corporis

Tratamiento Griseofulvina Microfotografía


147


Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 108 Microorganismo Fusarium sp. Fuente Bovino

Origen: aislado de lesión en ojo de vaca

Fecha de muestreo: 27 Julio de 2007

Almacenamiento Caja de petri medio PDA cloranfenicol

Historial PUJ Cepario desde: 10 Julio de 2007

Nivel de seguridad 1 Conservación

T° Ambiente

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días Pruebas biológicas

Características morfológicas

Características Macroscópicas: colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso, en acumulo de apariencia seca, color hueso. Al reverso color hueso inicialmente y luego se torna café, sin difusión de pigmento al agar

Características Microscópicas: hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas

Reacciones atípicas No presenta Identificación de Peligros


Corrientes de aire / aerosoles 5 – 10 dias, depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas

Microfotografía

Tomado de: Camacho & Gil, 2008

148


Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 121 Microorganismo Fusarium oxysporum Fuente Canino Origen: Isopado de lesión

superficial en lomo, zona anterior, de canino criollo

Fecha de muestreo: 5 Julio de 2007

Almacenamiento Caja Petri con agar sabouraud cloranfenicol

Historial Cepario desde: 19 Julio de 2007

Nivel de seguridad 1 T° Ambiente Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días

Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: colonias con presencia de diámetro de 5 cm a los 5 días. Micelio algodonoso, aéreo, ampliamente esparcido de forma flocosa, blanco con pigmentaciones púrpura, más cercana en la superficie del medio de cultivo. Al reverso, púrpura, sin pigmento difusible al medio

Características Microscópicas: presencia de hifas hialinas septadas, macroconidias en forma de granitos de arroz, con tres y cuatro septos. Presencia de clamidosporas intercalares y terminales. Microconidias redondeadas. Presencia de microconidias a partir de fiálide laterales, agrupadas en falsas. Presencia de macroconidias, septadas, curvadas.

Identificación de Peligros


Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas

Microfotografía


149


Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 155 Microorganismo Fusarium sp. Fuente Canino Origen: pezuña de vaca Fecha de muestreo: Almacenamiento Caja Petri con

agar sabouraud cloranfenicol

Historial Cepario desde:

Nivel de seguridad 1 T° Ambiente Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días

Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: colonia floculada algodonosa, color blanco con pigmento púrpura sobre la zona de la estría inicialmente. Colonias con más de 15 días toman coloración púrpura y solo en la parte externa de la colonia que presenta crecimiento radial se ve micelio algodonoso color blanco. Al reverso, pigmento difusible al medio color amarillo claro

Características Microscópicas: hifas hialinas septadas, con presencia de vesículas internamente, abundantes clamidosporas hialinas intercalares y terminales macro y microconidias.




Microfotografía


150


Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 160 Microorganismo Fusarium sp. Fuente Bovino Origen: Raspado de lesión

cutánea en zona media del lomo de vaca

Fecha de muestreo: 5 agosto de 2007

Almacenamiento Caja Petri con agar sabouraud cloranfenicol

Historial Cepario desde: 9 agosto de 2007

Nivel de seguridad 1

T° Ambiente

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días Pruebas biológicas

Características morfológicas

Características Macroscópicas: Colonia floculada algodonosa color púrpura, con presencia de acumulo, y secciones de color blanquecino inicialmente, en cultivos con más de 15 días las zonas blancas tienden a tomar color ocre. Al reverso, color púrpura. Con pigmento difusible al medio color ocre.

Características Microscópicas: hifas septadas e hialinas, con clamidosporas intercalares, Presencia de macroconidias fusiformes, septadas.




Microfotografía


151

Anexo 9 Medios de cultivo MEDIO SABOURAUD

COMPONENTES Cantidad (g/L) Peatona de caseína 5 Peptona de carne 5 D(+)glucosa 10 Maltosa 10 Agar Agar * 15 Cloranfenicol 0.05(µg/L) Indicaciones: Disolver los componentes del medio en agua destilada y aforar a un litro, calentar hasta ebullición, tapar y autoclavar por 15 minutos a 121ºC. * No adicionar al medio liquido. MEDIO EXTRACTO DE MALTA

COMPONENTES Cantidad (g/L) Extracto de malta 30 D(+)glucosa 10 Peptona 3 Agar Agar * 15 Indicaciones: Disolver los componentes y aforar a un litro con agua destilada calentar hasta ebullición, tapar y autoclavar por 15 minutos a 121ºC. * No adicionar al medio liquido MEDIO HARINA DE AVENA

COMPONENTES Cantidad (g/L) Harina de Avena 10 Agar Agar 15 Indicaciones: Disolver la harina de avena y el agar agar y aforar a un litro con agua destilada calentar hasta ebullición, tapar y autoclavar por 15 minutos a 121ºC. MEDIO FSM (Cooper Word, 1975)

COMPONENTES Cantidad (g/L) Sales macro

Nitrato de sodio anhidro 2 Dihidrogenofosfato de potasio 1 Sulfato de magnesio heptahidratado 0.5

152

Sales micro Sulfato ferroso heptahidratado 0.02 Sulfato de zinc heptahidratado 0.1 Molibdato de sodio heptahidratado 0.002 Sulfato de cobre pentahidratado 0.002 Cloruro de manganeso tetrahidratado 0.002

Otros componentes Sucrosa 1% o 2% (p/v) Agar Agar * 15 Indicaciones: Realizar stock de las sales macro y micro, disolver en 1 litro de agua destilada ajustar pH del medio a 6.5 antes de calentar si el medio contiene agar agar o antes de autocalvar si es medio líquido. Autocalvar por 15 minutos a 121ºC. revisar que el medio no presente precipitación de la sales antes de servir. * No adicionar al medio liquido. MEDIO MULLER HINTON CON AZUL DE METILENO

COMPONENTES Cantidad (g/L) Infusión de carne 2 Caseína hidrolizada 17.5 Almidón 1.5 Agar Agar 17 Indicaciones: Disolver los componentes y aforar a un litro con agua destilada calentar hasta ebullición, tapar y autoclavar por 15 minutos a 121ºC. Posteriormente adicionar 100µL de un Stock de azul de metileno de 5µL/mL

153

Anexo 10 Preparación de reveladores Nº Revelador Preparación Referencia 1 Vanillina (H2SO4) Disolver 1g vanillina en 100mL de

H2SO4 (97%). Merck, 1980

2 Cloruro de antinomio (III)

Disolver 20g de cloruro de antimonio (III) en una mezcla de ácido acético (20mL) y cloroformo (60mL).

Merck, 1980

3 Reactivo de Neu Disolver 1g de ácido difenilbórico 2-aminoetil ester en 100mL de metanol

Jork et al, 1990

4 Hidróxido de potasio Solución de KOH al 5% en metanol.

Merck, 1980

5 Hidroxilamina - cloruro férrico

Sln A: Disolver 20g de hidroxilamina-HCl en 50mL de agua, y llevar la solución a 200mL con etanol. Sln B: Disolver 50g de KOH en la mínima cantidad de agua, y llevar la solución a 500mL con etanol. Sln asperción I: Mezclar sln A y B en proporción 1:2 y filtrar el KOH precipitado. Sln asperción II: Disolver 10g de FeCl3·6H2O en 20mL de HCl (37%) y mezclar con con 200mL de dietil eter. Asperjar con sln I, secar a temperatura ambiente y luego asperjar con sln II.

Jork et al, 1990

6 Dinitrofenil hidrazina Disolver 100mg de 2,4-dinitrofenil hidrazina en una mezcla de 90mL de etanol y 10mL de HCl (37%).

Merck,1980

7 Anisaldehído (modificado para

glucósidos)

Mezclar 0.5mL anisaldehído, 9mL etanol, 0.5mL H2SO4 (97%) y 0.1mL ácido acético.

Merck, 1980

8 Difenil picril hidrazil Disolver 5mg de 1,1-Difenil-2-picril-hidrazil en 100mL metanol.

Jork et al, 1990

154

Anexo 11 Control de contaminación e inhibición Anfotericina B Dermatofito: Microsporum canis Fecha Siembra 28 12 2007 Fecha Lectura 30 12 2007 Control inoculo O

CONCENTRACIÓN ANFOTERICINA B µg/mL REPLICA 0.06 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32

O O O O O O O O O O 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O O O O O O O O O O 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Dermatofito: Trichophyton mentagrophytes Nº 1 Fecha Siembra 04 01 2008 Fecha Lectura 08 01 2008 Control inoculo O


O O O O O O O O O X 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O O O O X X O O O O 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Dermatofito: Trichophyton mentagrophytes Nº 2 Fecha Siembra 04 01 2008 Fecha Lectura 08 01 2008 Control inoculo O


O O O O O O O O O X 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O O O X O O O O X O 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Dermatofito: Trichophyton rubrum Fecha Siembra 07 01 2008 Fecha Lectura 10 01 2008 Control inoculo O


O O O X O O X O O O 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O O X O O O X O O O 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Dermatofito : Candida parasilopsis (control) Fecha Siembra 07 01 2008 Fecha Lectura 10 01 2008 Control inoculo O


O O O O O O O O O O 1 1.1 0.35 1.25 1.15 0.6 1.05 0 0.5 2 0 O O O O O O O O O O 2

1.15 1.05 0 1.25 0.6 1.2 0 1.65 2.65 0 O Sin contaminación X Contaminado

155

Anexo 12 Matriz de contaminación 32 – 48 horas (primera prueba) 1º EXTRACTO Amanita muscaria Hongo Dermatofito Replica Fracción BP DC AE EC EF

1 X O X X X 2 X O X X X

Microsporum canis Nº 1

3

X X X X Fecha siembra 28 12 2007 Fecha lectura 30 12 2007 Control inóculo O

1 O O O O O 2 X O O X O

Trichophyton rubrum

3

O O X X X Fecha siembra 07 01 2008 Fecha lectura 10 01 2008 Control inóculo O

1 X O O X X 2 X O O X X

Trichophyton mentagrophytes Nº 1

3

X O O X X Fecha siembra 04 01 2008 Fecha lectura 08 01 2007 Control inóculo O

1 X O O X X 2 X O O X X


3

X O O X X Fecha siembra 04 01 2008 Fecha lectura 08 01 2008 Control inóculo O O Sin contaminación X Contaminación

156

Matriz de contaminación 32 – 48 horas (primera prueba) 2º EXTRACTO Amanita muscaria Hongo Dermatofito Replica Fracción BP DC AE EC EF

1 O O O O X 2 X X O X O

Microsporum canis Nº 1

3

X X O X O Fecha siembra 28 01 2007 Fecha lectura 30 12 2007 Control inóculo O

1 O O O O O 2 X X O X O

Trichophyton rubrum

3

O O O O X Fecha siembra 07 01 2008 Fecha lectura 10 01 2008 Control inóculo O

1 X O O X X 2 X O O O X


3

X O X X X Fecha siembra 04 01 2008 Fecha lectura 08 01 2008 Control inóculo O

1 X O X O X 2 X O O O X


3

X X O X X Fecha siembra 04 01 2008 Fecha lectura 08 01 2008 Control inóculo O O Sin contaminación X Contaminación

157

Anexo 13 Caracterización de corrida cromatografica (prueba de fases móviles) Solvente Nº 1 Cloroformo:acetato de etilo:acido formico (30:55:10) (Barazani & Friedman, 1999) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN 2 Bandas barrido en EC. Barrido general en BP.

Barrido en frente de corrido para BP no bandas definidas.

1 Banda definida en EC. 5 bandas en BP. 3 bandas en DC. Barrido en frente de corrida para BP.

Solvente Nº 2 Cloroformo:acetato de etilo:metanol (2:2:1) (Rodríguez, 2002) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido en frente de corrida para BP. 1 banda para BP. 1 banda para DC.

Barrido en frente de corrido para BP no bandas definidas.

0 bandas en EC. 3 bandas +/- definidas y barrido en punto de siembra de 1cm. 2 Bandas en DC. Barrido en frente de corrida para BP.

158

Solvente Nº 5 Etanol: Agua (7:3) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido para BP hasta la mitad del frente de corrida.

1 banda barrido para BP. 1 banda EC amarilla en barrido. Barrido hasta la mitad de frente corrida para DC y AE.

1 Banda no clara en EC. 1 banda barrido para BP con coloración en frente de corrida.

Solvente Nº 6 Cloroformo:agua:acetato de etilo (28:1:1) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido para BP. Frente de corrida fluorescente azul. 1 banda en BP. 1 banda en DC 1 banda en EC

Fluorescencia en frente de corrida y en general de color azul-verde.

1 banda barrido para BP con coloración en frente de corrida.

159

Solvente Nº 7 Cloroformo:acetato de etilo (29:3) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido para BP. Frente de corrida fluorescente azul. 1 banda en BP. 1 banda en DC 1 banda en EC

1 banda amarilla para BP, con fluorescencia frente de corrida amarillo. 1 banda tenue para DC en igual RF que BP. 0 bandas en EC y AE.

1 banda barrido para BP con coloración en frente de corrida.

Solvente Nº 8 Acetato de etilo:metanol:acido acético (100:50:5) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Coloración en frente de corrida.

BP y DC con fluorescencia azul hacia el frente de corrida. 1 banda para DC hacia el frente de corrida. Barrido leva para AE. EC barrido fuerte.

BP y DC mancha en el frente de corrida. 1 banda en barrido en punto de siembra para BP y DC.

160

Solvente Nº 9 acetato de etilo:acido acético:água (3:1:1) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN EC barrido general una banda al final de frente de corrida. Barrido y puntos fluorescentes para las tres fracciones BP DC y AE.

BP y DC con fluorescencia azul hacia el frente de corrida. 1 banda para DC hacia el frente de corrida. Barrido leva para AE. EC barrido fuerte. Mas definidas que para solvente Nº 8

3 bandas barrido para BP y DC y mancha en frente de corrida. EC barrido general y banda amarilla hacia frente de corrida.

Solvente Nº 10 metanol:cloroformo (1:1) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN EC barrido general una banda al final de frente de corrida. Barrido y puntos fluorescentes para las tres fracciones BP DC y AE.

BP y DC con fluorescencia azul hacia el frente de corrida. 1 banda para DC hacia el frente de corrida. Barrido leva para AE. EC barrido fuerte. Mas definidas que para solvente Nº 8

3 bandas en barrido para BP y DC mancha en frente de corrida. EC barrido general en 2 sectores.

161

Solvente Nº 11 Cloroformo:etanol:acido acético (100:50:75) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido en frente de corrida para EC. Frente de corrida fluorescente para DC y AE.

BP y DC barrido general y mancha fluorescente en frente de corrida. EC barrido general.

Barrido en frente de corrida para BP y DC, cada uno con tres bandas iguales en barrido. EC barrido.

Solvente Nº 12 Cloroformo:acido acético:água (3:6:1) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Mancha en frente de corrida. DC y AE barrido fluorescente hacia el frente de corrida. EC barrido general.

Barrido en frente de corrida. DC y AE barrido fluorescente hacia el frente de corrida. EC barrido general. AE banda no clara con fluorescencia azul hacia el frente de corrida.

Barrido en el frente de corrida para BP y DC. 3 bandas para EC en barrido.

162

Solvente Nº 13 cloroformo:acetato de etilo:metanol:agua (15:40:22:10) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido en frente de corrida con fluorescencia azul para DC y AE. EC con barrido hasta la mitad del punto de siembra.

Banda no clara para DC amarilla hacia el frente de corrida. EC barrido hasta la mitad del punto de siembra.

Mancha en frente de corrida para BP y DC, con 3 bandas no claras en el mismo RF. EC barrido hasta la mitad del punto de siembra.

Solvente Nº 14 Cloroformo:metanol:água (11:9:2) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN

SIN IMAGEN

Barrido general para BPO y EC. Barrido fluorescente azul en frente de corrida para AE.

EC barrido general. Mancha en frente decorrida para todas las fracciones probadas.

163

Solvente Nº 15 metanol:cloroformo:água (12:8:2) (Jork, 1990) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN 3 bandas en barrido para EC. Banda en mancha azul fluorescentes para AE y DC, en la mitad de la corrida. Mancha para BP en frente de corrida y 3 bandas

EC barrido general 3 bandas barrido, una de ellas con fluorescencia amarilla. DC y AE fluorescencia azul en el mismo RF. BP mancha fluorescente verde en frente de corrida y barrido general.

Banda verde militar en EC. Mancha en frente de corrida en BP en barrido.

Solvente Nº 16 cloroformo:metanol (3:1) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Mancha en frente de corrida fluorescente para AE. 2 bandas barrido para DC. 2 bandas en barrido para BP, con un barrido de 1cm en punto de siembra.

Barrido en frente de corrida. 3 bandas en barrido de tres colores para DC. BP barrido general, 1 banda hacia la mitad y barrido en punto de siembra de 1cm

Barrido en frente de corrida. 8 bandas en barrido para BP y barrido en punto de siembra de 1cm.

164

Solvente Nº 17 cloroformo:metanol:acido acético (45:4:1) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido en frente de corrida fluorescente para AE. 2 bandas barrido para DC. 2 bandas en barrido para BP, con un barrido de 1cm en punto de siembra.

3 bandas en barrido de tres colores para DC. BP barrido general, 1 banda hacia la mitad y barrido en punto de siembra de 1cm. Similar al solvente N° 16 pero con un RF mayor. Mancha fluorescente para BP y DC.

Barrido en frente de corrida. 8 bandas en barrido para BP y barrido en punto de siembra de 1cm. Son menos definidas que en el solvente N° 16.

Solvente Nº 18 Cloroformo:metanol:acido acético (18:2:1) (Sherma, 1996) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido general en frente de corrida con fluorescencia azul-verde en AE. EC barrido hacia la mitad del punto de siembra y frente de corrida.

Barrido en frente de corrida con fluorescencia azul en DC. 1 banda amarilla barrido para DC. 1 banda barrido para BP.

Barrido general en frente de corrida. 2 bandas cerca al punto de siembra para DC.

165

Solvente Nº 19 Bencina de petróleo (Robles, 2008) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido hasta la mitad de frente de corrida para BP. Fluorescencia de color azul al final del barrido de BP. Saturación en punto de siembra sin corrida EC.

Barrido a mitad de frente de corrida para BP. Fluorescencia azul y verde al final del barrido de BP. Fluorescencia verde para punto de siembra de EC, no presento corrida.

Barrido a mitad de frente de corrida en BP. Barrido delgado hasta final de frente de corrida de BP. Bandas poco definidas de color azul petróleo y morado. EC no presento corrida.

Solvente Nº 20 Bencina de petróleo:acetato de etilo (9:1) (Robles, 2008) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido hasta la mitad de frente de corrida para BP. Fluorescencia de color azul al final del barrido de BP. Saturación en punto de siembra corrida 2cm de punto de siembra de EC.

Barrido a mitad de frente de corrida para BP. Fluorescencia verde al final del barrido de y azul hasta punto de siembra de BP. Fluorescencia verde para punto de siembra de EC, no presento corrida.

Barrido a mitad de frente de corrida en BP. 4 bandas hasta final de frente de corrida 2 de color morad y 2 de color azul en BP. EC no presento corrida.

166

Solvente Nº 21 Bencina de petróleo:acetato de etilo (7:3) (Robles, 2008) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido hasta final de frente de corrida para BP. Fluorescencia de color verde al inicio del barrido de BP. Saturación en punto de siembra sin corrida en EC.

Barrido hasta final de frente de corrida para BP. Fluorescencia azul y verde al final del barrido de BP. Fluorescencia verde para punto de siembra de EC, no presento corrida.

Barrido hasta final de frente de corrida en BP. 2 bandas hasta final de frente de corrida 1 de color morad y 1 de color azul en BP. EC no presento corrida.

Solvente Nº 22 Cloroformo:acetato de etilo (1:1) (Robles, 2008) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido al final de frente de corrida para BP. Banda al final de frente de corrida para EC.

Barrido al final de frente de corrida fluorescente de color verde con aura azul para BP. Banda al final de frente de corrida fluorescente azul para EC.

Barrido al final de frente de corrida para BP. 3 bandas poco definidas de color morado claro para BP. Banda de color morado al final del frente de corrido para EC.

167

Solvente Nº 23 Cloroformo:acetato de etilo (7:3) (Robles, 2008) UV 366nm IMAGEN UV 256nm IMAGEN VISIBLE-Vanilina IMAGEN Barrido al final de frente de corrida para BP. Banda al final de frente de corrida para EC.

Barrido al final de frente de corrida fluorescente verde en BP. Bandas fluorescentes de color azul y verde intercaladas desde el punto de siembra para BP. Banda de color azul fluorescente al final de frente de corrida para EC.

Barrido al final de frente de corrida para BP. 3 bandas poco definidas de color morado claro para BP. 1 banda definida cerca al punto de siembra para BP. Banda de color morado al final del frente de corrido para EC.

168

Anexo 14 Cromatografía en capa delgada (descripción de bandas) EXTRACTO 1 Amanita muscaria

FRACCIÓN REVELADOR

BENCINA DE PETROLEO DICLOROMETANO ACETATO DE ETILO EXTRACTO

FRACIONADO EXTRACTO CRUDO

SIN REVELADOR

UV LONGIUD DE ONDA CORTA

1. Banda de color negro claro a 1cm. 2. Banda en barrido a 2.4cm de color negro. 3. Banda de color azul fluorescente a 6.1cm.

1. Banda de color negro difusa a 2.6cm. 2. Banda de color azul fluorescente a 6.1cm.


1. Banda de color negro claro a 1cm. 2. Banda de color negro a 2.7cm.

2. Banda de color negro a 2.7cm.

SIN REVELADOR UV LONGIUD DE ONDA

LARGA

1. Banda de color azul fluorescente a 1cm. 2. Banda en barrido de color verde fluorescente a 2.1cm. 3. Banda de color azul fluorescente a 5.9cm.

1. Banda en barrido de color verde fluorescente a 2cm. 2. Banda de color azul fluorescente a 5.9cm.

1. Banda de color azul fluorescente a 5.9cm.

1. Banda en barrido de color verde fluorescente a 2cm.

Sin Bandas

169

VAINILLINA LUZ VISIBLE

1. Banda en barrido desde el punto de siembra, hasta 0.9cm y un barrido siguiente hasta 3.5cm de color morado claro 2. Banda difusa a los 4cm. De color morado claro 3. Banda de color morado oscuro a los 5cm. 4. Banda difusa a los 5.7cm del mismo color que la 3. 5. Banda de color morado a azul oscura a los 6.2cm. 6. Banda de color azul a los 6.4cm.

1 y 2. Bandas difusas de color morado a los 0.7 y 1cm. 3. Banda difusa de color morad a los 4.7 cm. 4. Banda de color morado a azul oscura a los 6.2cm. 5 Banda de color azul a los 6.5cm.

1. Banda de color azul morado a los 6.4cm.

1. Banda de color morado oscuro a 1cm. 2. Banda de color morado a rojo oscuro a los 4.7cm. 3. Banda de color morado difusa igual a la 2 a los 5.7cm.

Sin Bandas.

CLORURO DE ANTIMONIO LUZ VISIBLE

1. Banda en barrido de color café a verde a 1cm. 2. Banda difusa al final del barrido de la banda 1 con igual color a los 1.9cm. 3 - 6. No se observa en visible.

1 y 2. No se observa en visible.

1. No se observa en visible.

1. banda de color verde a gris claro a los 1.1cm. 2 y 3 No se observa en visible.

Sin Bandas

CLORURO DE ANTIMONIO III

UV LONGITUD DE ONDA LARGA

1. Banda en barrido a 1cm de color verde. 2. Banda de color verde fluorescente a los 1.9cm. 3 y 4 Bandas en barrido de forma irregular (luna) de color verde fluorescente a 3.5 y 4cm.

1. Banda de color verde a 1cm. 2. Banda difuso a 6.5cm. de color verde. 3. Banda a los 6.8cm. de color azul verde fluorescente difusa.

1. Banda difuso a 6.5cm. de color verde. 2. Banda a los 6.8cm. de color azul verde fluorescente difusa.

1. Banda de color verde a 1.1cm. 2. Banda de color verde fluorescente a 2cm. 3. Banda difuso a 6.5cm. de color verde difusa.

Sin Bandas

170



5. Banda difusa a 5.8cm de color verde. 6. Banda difusa de color verde a 6.6cm. 7. Banda a los 6.8cm. de color azul verde fluorescente difusa.

REACTIVO DE NUE

1. Banda de color azul oscuro fluorescente a 1.1cm. 2. Banda de color verde oscuro fluorescente a 2.2cm. 3. Banda de color verde difusa a 3.6cm. 4. Banda de color azul oscuro fluorescente a 5.7cm.

1. Banda de color verde oscuro fluorescente difusa a 2cm. 2. Banda de color azul oscuro fluorescente a 5.8cm.

1 Banda de color azul oscuro fluorescente a 5.8cm.

1. Banda de color verde oscuro fluorescente difusa a 2cm.

Sin Bandas


LUZ VISIBLE

No se observa en visible.




Sin Bandas



1. Banda de color azul oscuro fluorescente difusa a 0.8cm. 2. Banda de color verde fluorescente en barrido a 1.3cm. 3. Banda de color azul oscuro fluorescente en barrido y definida a 6cm.

1. Banda de color verde fluorescente en barrido a 1.3cm. 2. Banda de color azul oscuro fluorescente en barrido y definida a 6cm.

1. Banda de color azul oscuro fluorescente en barrido y definida a 6cm.

1. Banda de color azul fluorescente difusa a 0.9cm. 2. Banda de color verde fluorescente en barrido a 1.9cm.

Sin Bandas

HIDROXAMINA CLORURO FERRICO

LUZ VISIBLE






171


LUZ VISIBLE

1. Banda de color café claro a 1cm. 2. Barrido de color rosado sin banda definida a 2.3cm.

1. Banda no se observa a luz visible en onda larga café clara a 1cm.

Sin Bandas

1. Banda de color café claro a 1cm.

Sin Bandas

ANISALDEHIDO(modific

ado para glucósidos) LUZ VISIBLE

1. Banda en barrido de color azul gris hasta la mitad de la corrida a 1.1cm. con espacios difuminados posibles bandas solapadas. 2. Banda de color café difusa de forma irregular (luna) a 4.1cm. 3. Banda de color café oscuro a gris a 5cm. 4. Banda de color azul gris difusa a 5.7cm. 5. Banda de color azul morado a 6.3cm.

1. banda difusa de color azul gris a 1cm. 2. Banda de color azul gris difusa a 4.6cm. 3. Banda de color azul morado a 6.3cm.

1. banda de color azul morado a 6.4cm.

1. Banda de color azul gris difusa a 1cm. 2. banda en barrido de color blanco difusa a 3.1cm. 3. Banda de color azul gris difusa a 4.7cm. 4. Banda de color azul gris difusa a 5.6cm. 5. Banda de color azul morado a 6.3cm. difusa en visible.

Sin Bandas



1. Banda en barrido de color oscuro (negro) a 1.1cm. 2. Banda de color azul oscuro a 4.1cm. de forma irregular. 3. Banda de color azul negro a 5cm. 4 Banda de color azul negro a 5.7cm. 5. Banda de color azul morado oscuro a 6.3cm.

1. banda difusa de color gris negro a 1cm. 2. Banda de color gris difusa a 4.6cm. 3. Banda de color azul morado oscuro a 6.3cm.

1. Banda de color azul morado oscuro a 6.3cm.

1. Banda de color gris a negreen barrido hacia arriba y abajo a 1cm. 2. Banda de color blanco rosa difusa a 3.1cm. 3. Banda de color gris claro difusa a 4.7cm. 4. Banda de color gris claro a 5.6cm. 5. banda de color azul morado difusa a 6.3cm.

Sin Bandas La banda de siembra toma un color verde fluorescente en los bordes.

172


LUZ VISIBLE

1. Banda en barrido de color blanco a 1cm, hasta 1.9cm. 2. Banda en barrido de color blanco a 2.4 cm. Hasta 4cm. 3. Banda de color blanco a 5.9cm.

1 y 2. Banda de color blanco a 5.1cm y 5.7cm.

Sin Bandas

1. Banda a 1cm. de color banco.

Sin Bandas

173

Cromatografía en capa delgada (descripción de bandas) EXTRACTO 2 Amanita muscaria

FRACCIÓN REVELADOR

BENCIAN DE PETROLEO

DICLOROMETANO ACETATO DE ETILO EXTRACTO FRACIONADO

EXTRACTO CRUDO

SIN REVELADOR

UV LONGIUD DE ONDA CORTA

1. Banda de color negro claro a 1cm. 2. Banda en barrido a 3cm de color negro. 3. Banda de color azul fluorescente a 6.1cm.



1. Banda de color negro claro a 1.9cm. 2. Banda de color negro a 2.5cm.

2. Banda de color negro a 2.6cm.

SIN REVELADOR UV LONGIUD DE ONDA

LARGA

1. Banda en barrido de color verde fluorescente a 2.1cm. 3. Banda de color azul fluorescente a 6cm.

1. Banda en barrido de color verde fluorescente a 2.1cm. 2. Banda de color azul fluorescente a 5.9cm.

1. Banda de color azul fluorescente a 6cm.

1. Banda en barrido de color verde fluorescente a 2cm.

Sin Bandas

VAINILLINA LUZ VISIBLE

1. Banda en barrido desde el punto de siembra, hasta 1.1cm y un barrido siguiente hasta 2.5cm de color morado claro 2. Banda difusa a los 3.9cm. De color morado claro 3. Banda de color morado oscuro a los 5.1cm. 4. Banda difusa a los 5.7cm del mismo color que la 3. 5. Banda de color morado a azul oscura a los 6.2cm. 6. Banda de color azul a los 6.5cm.

1 y 2. Bandas difusas de color morado a los 1.1 y 1.3cm. 3. Banda difusa de color morado claro a los 4.9 cm. 4. Banda de color morado a azul oscura a los 6.4cm. 5 Banda de color azul a los 6.6cm.

1. Banda de color azul morado a los 6.4cm.

1. Banda de color morado oscuro a 1.1cm. 2. Banda de color morado a rojo oscuro a los 5cm. 3. Banda de color morado difusa igual a la 2 a los 5.8cm.

Sin Bandas.

174

CLORURO DE ANTIMONIO III LUZ VISIBLE

1. Banda en barrido de color café a verde a 1.1cm. 2. Banda difusa al final del barrido de la banda 1 con igual color a los 2.3cm. 3 - 6. No se observa en visible.

1 y 2. No se observa en visible.

1. No se observa en visible.

1. Banda de color verde a gris claro a lcm. 2 y 3 No se observa en visible.

Sin Bandas



1. Banda de color verde amarillo fluorescente a los 2.3cm. 2. Banda en barrido a 1.1cm de color verde. 3. Bandas en barrido de color verde fluorescente a 3.5cm. 4. Banda difusa a 5.7cm. de color verde. 5. Banda difusa de color verde a 6.9cm.

1. Banda de color verde a 1cm. 2. Banda difuso a 2.4cm. de color verde oscuro. 3. Banda a los 6.8cm. de color azul verde fluorescente difusa.

1. Banda difuso a 6.5cm. de color verde. 2. Banda a los 6.8cm. de color azul verde fluorescente difusa.

1. Banda de color rojizo a 0.6cm. 2. Banda de color verde difusa 1cm. 3. Banda de color verde a 2cm. 4. 3. Banda difuso a 6.6cm. de color verde difusa.

Sin Bandas

REACTIVO DE NEU


1. Banda de color azul oscuro fluorescente a 1cm. 2. Banda de color verde oscuro fluorescente a 2.2cm. 3. Banda de color verde difusa a 3.5cm. 4. Banda de color azul oscuro fluorescente a 5.8cm.

1. Banda de color verde oscuro fluorescente difusa a 1.9cm. 2. Banda de color azul oscuro fluorescente a 5.8cm.

1 Banda de color azul oscuro fluorescente a 5.8cm.

1. Banda de color verde oscuro fluorescente difusa a 2cm.

Sin Bandas

175

HIDROXIDO DE POTASIO LUZ VISIBLE





Sin Bandas

HIDROXIDO DE POTASIO UV LONGITUD DE ONDA

LARGA

1. Banda de color verde fluorescente en barrido a 1.2cm. 2. Banda de color azul oscuro fluorescente en barrido y definida a 5.9cm.

1. Banda de color verde fluorescente en barrido a 1.2cm. 2. Banda de color azul oscuro fluorescente en barrido y definida a 6cm.

1. Banda de color azul oscuro fluorescente en barrido y definida a 6cm.

1. Banda de color azul fluorescente difusa a 0.9cm. 2. Banda de color verde fluorescente en barrido a 1.8cm.

Sin bandas

HIDROXILAMINA CLORURO FERRICO

LUZ VISIBLE







LUZ VISIBLE

1. banda de color café claro a 0.9cm.

1. Banda no se observa a luz visible en onda larga café clara a 1cm.

Sin Bandas

1. Banda de color café claro a 1cm.

Sin Bandas

ANISALDEHIDO (modificado para

glucósidos) LUZ VISIBLE

1. Banda en barrido de color azul gris a 1.1cm. con espacios difuminados posibles bandas solapadas. 2. banda de color gris difusa a 3.8cm. 3. Banda de color café oscuro a gris a 4.9cm. 4. Banda de color azul gris difusa a 5.7cm. 5. Banda de color azul morado a 6.4cm.

1. banda difusa de color azul gris a 1cm. 2. Banda de color azul gris difusa a 4.9cm. 3. Banda de color azul morado a 6.4cm.

1. banda de color azul morado a 6.5cm.

1. Banda de color azul gris difusa a 1cm. 2. banda en barrido de color blanco difusa a 3.3cm. 3. Banda de color azul gris difusa a 4.9cm. 4. Banda de color azul gris difusa a 5.7cm. 5. Banda de color azul morado a 6.4cm. difusa en visible.

Sin Bandas

176

ANISALDEHIDO (modificado para

glucósidos) UV LONGITUD DE ONDA

LARGA

1. Banda en barrido de color oscuro (negro) a 1.1cm. 2. Banda de color azul oscuro a 3.8 cm. de forma irregular. 3. banda de color azul negro a 4.9cm. 4 Banda de color azul negro a 5.7cm. 5. Banda de color azul morado oscuro a 6.4cm.

1. banda difusa de color gris negro a 1cm. 2. Banda de color gris difusa a 4.9cm. 3. Banda de color azul morado oscuro a 6.4cm.

1. Banda de color azul morado oscuro a 6.5cm.

1. Banda de color gris a negreen barrido hacia arriba y abajo a 1cm. 2. Banda de color blanco rosa difusa a 3.3cm. 3. Banda de color gris claro difusa a 4.9cm. 4. Banda de color gris claro a 5.7cm. 5. banda de color azul morado difusa a 6.4cm. La banda de siembra toma un color verde fluorescente en los bordes.

Sin Bandas La banda de siembra toma un color verde fluorescente en los bordes.

DINITROFENIL PICRIL HIDRAZIL

LUZ VISIBLE

1. Banda en barrido de color blanco a 1cm, hasta 1.5cm. 2. Banda de color blanco a 6cm.

1 y 2. Banda de color blanco a 5.3cm y 5.8cm.

Sin Bandas

1. Banda a 0.9cm. de color banco.

Sin Bandas

EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN QUIMICA DE METABOLITOS SECUNDARIOS CON ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN Amanita

muscaria

EXTRACTION AND CHEMICAL CHARACTERIZATION OF SECONDARY METABOLITES WITH ANTIMICROBIAL ACTIVITY

IN Amanita muscaria

William Andrés Dueñas Rivera Pontificia Universidad Javeriana; Facultad de Ciencias; Microbiología

Industrial [email protected]

RESUMEN Se evaluaron propiedades antifúngicas de extractos obtenidos a partid de cuerpos fructíferos de hongos de la familia Amanitaceae, específicamente de Amanita muscaria, colectados e identificados taxonomicamente en el departamento de Cundinamarca, frente a agente causante de dermatomicosis (Fusarium sp.) aislados de lesiones superficiales de animales domestico. Los extractos fueron obtenidos a partir maceración, extracción en etanol al 96% y fraccionamiento liquido-liquido con solventes de diferente polaridad. A su vez fueron sometidas a pruebas químicas preliminares (calorimétricas) y separados por medio de cromatografía en capa delgada (HPTLC). Por ultimo se realizaron pruebas biológicas de difusión en placa de agar y bioautografía. Se encontraron indicios importantes sobre la actividad de algunos de los metabolitos presentes en los extracto de cuerpos fructíferos contra agentes causantes de dermatomicosis, principalmente sobre los aislamientos de Fusarium 121, 155 y 160 frente a los extractos de la fracción de bencina de petróleo, fracción hidroalcohólica y diclorometano. Estos resultados fueron obtenidos a partir de las prueba de inhibición de crecimiento radial y corroborados a partir de la bioautografía. Los metabolitos identificados como presentes en las diferentes fracciones tienen propiedades y características heterogéneas, por lo que se evaluaron posibles relaciones de sinergismos y solapamiento en el proceso de inhibición del desarrollo fúngico. Palabras clave: antifúngico, bioautografía, cromatografía de capa delgada, cuerpo fructífero, dermatomicosis, polaridad.

ABSTRACT Antifungal properties of extracts obtained from fruiting bodies of fungi belonging from Amanitaceae family, specifically Amanita muscaria (collected in Cundinamarca), were evaluated against dermatomycosis causal agent (Fusarium sp.), isolated from superficial lesions in domestic animals. The extracts were obtained by maceration, extraction in ethanol 96% and liquid-liquid fractioning with solvents of

different polarity. These extracts were submitted to colorimetric preliminary tests and characterized by thin layer chromatography (HPTLC). Finally, antimicrobial activity assays, agar plate diffusion and bioautography, were performed. Antimicrobial activity of some fruiting body metabolites were observed with Fusarium isolates (121, 155 and 160), in petroleum bencine, dichloromethane and hydroalcoholic fractions. The antifungal metabolites, present in different fractions, have heterogeneous properties and characteristics, due to possible synergism and overlapping relations in the fungal inhibition development process. Key words: antifungal, bioautography, thin layer chromatography, fruiting body, dermatomycosis, polarity. INTRODUCCIÓN Colombia como país tropical y dada su geografía en Suramérica, tiene una constelación de ecosistemas variados. Estas características establecen factores como el clima, diversidad en flora y fauna, entre otras; las cuales favorecen el desarrollo de diversos hongos macromicetos. Sin embargo, a pesar de las posibilidades que esta diversidad representa, no son muchos los estudios que se han realizado en Colombia sobre las propiedades de los metabolitos presentes en hongos macromicetos. Existe la referencia de investigaciones donde se ha mostrado la actividad antifúngica y antibacteriana de algunos extractos crudos de Basidiomycetos nativos del Brasil (Barbisan, 2003; Lindequist, 2005) y propiedades antitumorales e inmunomoduladoras (Lull, 2005). Estos antecedentes permiten abrir la posibilidad de estudios similares relacionados con los extractos de hongos de la familia Amanitaceae, presentes en el departamento de Cundinamarca, y en especial de Amanita muscaria que por ser un hongo de carácter tóxico puede presentar una diversidad importante de metabolitos secundarios de interés diverso. Las infecciones por microorganismos generadores de micosis superficiales en animales domésticos como perros, gatos, caballos y otros, se han presentado permanentemente a lo largo del tiempo, sin embargo el aumento de estas afecciones se ha disparado principalmente por el aumento de la población de estos animales y por la falta de tratamiento adecuado, referente a antifúngicos especializados para uso veterinario. No existe un ente encargado en el país que aporte cifras, datos epidemiológicos o incidencia nacional de las enfermedades generadas por estos, principalmente porque estas enfermedades no son consideradas de vigilancia obligatoria; por esta misma razón no existen estudios donde se presenten alternativas para el tratamiento de estas enfermedades producidas por hongos de los géneros Fusarium sp. Actualmente se aplica un tratamiento igual al utilizado con seres humanos, por lo que es considerado un procedimiento económicamente no viable a nivel veterinario. Es de gran importancia abordar esta problemática para generar alternativas de control de dermatomicosis, especialmente para su aplicación en sectores que utilizan animales como fuente de negocio; es el caso de la ganadería donde se reportan pérdidas significativas por problemas en la piel de bovinos.

MATERILES Y METODOS COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES EN CUNDINAMARCA Características y zonas de muestreo El lugar de muestreo definido para la colección de hongos de la familia Amanitaceae fue el departamento de Cundinamarca. El clima del departamento es variado, cálido y seco en el valle del Magdalena, cálido y húmedo en el piedemonte llanero y presenta una variedad de climas fríos, templados y de páramo en las diferentes vertientes de la cordillera de los Andes. Estos factores geográficos y climáticos son característicos del hábitat de los hongos macromicetos, lo que permite definir esta zona como la más indicada para realizar la colecta de los hongos de la familia Amanitaceae. Las zonas definidas para la recolección de los hongos se centraron en la presencia de reservas naturales que cuenten con características como: temperatura 4–18ºC, humedad elevada y con temporada de lluvias; y características de vegetación definidas como bosques de pino y roble. A partir de estos parámetros se seleccionaron seis zonas de muestreo (Tabla 1). Tabla 1. Zonas de muestreo para familia Amanitaceae en Cundinamarca

Provincia Lugar Distrito Capital Cerros Nororientales

Cantón Norte Provincia Sabana Centro Chía Cerros de Yerbabuena

San José de Guausa Provincia Ubaté Embalse del Neusa Distrito Capital Cerros Nororientales Gimnasio

Femenino Provincia Sabana Centro Zipaquirá Pantano redondo

Alto del Águila Provincia del Tequendama San Antonio Tequendama

Parque Chicaque Recolección de Agaricales Para realizar la colecta se tomaron muestras de cuerpo fructífero del hongo completo (píleo y estípite); si el hongo crecía en un sustrato especial se retiró parte del mismo junto con el hongo y definió las características del mismo. Se colectaron especímenes jóvenes y adultos para evidenciar cambios de crecimiento. El tiempo entre la colecta y la identificación macroscópica fue inferior a 4 horas, ya que estos poseen estructuras sensibles y con altos índices de degradación. Por último, se realizó una esporada en papel blanco y/o negro, el cual se adjuntó a la colección tipo seca para posteriores identificaciones (Franco & Vasco, 2005) Caracterización morfológica, macroscópica y microscópica La caracterización morfológica de los especímenes recolectados a partir de las diferentes salidas de campo se realizó por medio de diferentes claves de

identificación macroscópicas (Phillips, 1978) y microscópicas (Largent & Jonson, 1973). FRACCIONAMIENTO Obtención de extractos etanólicos El material colectado en fresco, se secó en horno de convección a una temperatura de 30 +/- 5ºC, y a temperatura ambiente, hasta obtener la máxima deshidratación posible con el propósito de eliminar la mayor cantidad de agua que pueda obstaculizar una buena extracción de los metabolitos presentes en la muestra. Posteriormente se trituró con etanol al 96% v/v y se procedió a extracción con el mismo solvente durante 96 horas por el método de maceración, en dos ciclos de extracción cada uno de 48 horas. Luego de cada ciclo, el extracto se filtró y se llevó al rota-evaporador para concentrar hasta el mínimo volumen o sequedad a presión reducida, logrando de esta forma un extracto etanólico total (Domínguez, 1985; Harborne, 1980). Obtención de fracciones del extracto etanolico A partir del extracto etanólico total se tomó una porción proporcional a 300g de biomasa fresca y se redisolvió a un volumen total de 100mL con etanol al 50% v/v (porción hidroalcohólica) y se sometió a separación discontinua líquido-liquido con 50mL de bencina de petróleo por 3 repeticiones. En este paso se obtiene la fracción de compuestos más apolares, grasas y aceites, que se denominó fracción petrol. Esta fracción se llevó a sequedad en el rota-evaporador a presión reducida. Seguidamente, la porción hidroalcohólica se sometió a fraccionamiento líquido-líquido con 50mL de diclorometano (CH2Cl2), igualmente con 3 repeticiones y se obtuvo la fracción diclorometano, que también se llevó a sequedad en el rota-evaporador a presión reducida. Finalmente, la porción hidroalcohólica se sometió a extracción discontinua líquido-líquido con 50mL de acetato de etilo (AcOEt) con 3 repeticiones y se obtuvo la fracción AcOEt que se llevó a sequedad en el rota-evaporador a presión reducida. La porción hidroalcohólica se concentró en el rota-evaporador a presión reducida hasta el mínimo volumen. De esta forma el extracto etanólico total y cada una de las fracciones se prepararon para ser sometidas a los diferentes bioensayos, pruebas químicas preliminares y TLC (Domínguez, 1985; Harborne, 1980). SCREENING DE GRUPOS FUNCIONALES EN EXTRACTOS ETANÓLICOS Y FRACCIONES Pruebas químicas preliminares (Colorimétricas) Cada una de las fracciones obtenidas fueron sometidas a pruebas químicas preliminares específicas para determinar la presencia o ausencia de ciertos grupos de compuestos químicos, esta caracterización permite agrupar los compuestos de acuerdo a parámetros estructurales generales como grupos funcionales, sistema aromático, sistema anular esteroidal, sistema espirostánico, entre otros (Domínguez, 1985). Para el desarrollo de todas las pruebas químicas preliminares se utilizó una alícuota de extracto crudo o fracción equivalente a 1g de biomasa fresca, y

posteriormente esta alícuota se diluyó al volumen de muestra requerido para cada prueba, las pruebas químicas realizadas fueron para identificación de cumarinas, quinonas, saponinas, glucósidos, terpenoides, flavonoides y alcaloides (Domínguez, 1985). Cromatografía en capa delgada TLC Alícuotas de los extractos etanólicos y fracciones, equivalentes a 0.1g de biomasa fresca, se sembraron sobre placas TLC de sílica-gel 60 F254 (Machery-Nagel). Para la fase móvil se probaron diferentes combinaciones de solventes (cloroformo, acetato de etilo, etanol, metanol, ácido acético, bencina de petróleo y agua) hasta obtener la mejor resolución de bandas. La detección de los compuestos se realizó por fluorescencia bajo luz ultravioleta (254nm y 366nm) y por tinción con reactivos para detección de diferentes tipos estructurales (Sherma, 1996). Los reactivos para tinción de TLC se seleccionaron basándose en grupos funcionales y las posibles estructuras básicas en los que se han reportado metabolitos con actividad antimicrobiana. De este modo se probaron reveladores genéricos como Vainillina en (H2SO4) y reveladores específicos como cloruro de antimonio III (terpenoides), reactivo de Neu – ácido difenilborico-2-aminoetil ester (flavoniodes), hidróxido de potasio (coumarinas), hidroxilamina – cloruro férrico (lactonas), 2,4- dinitrofenil hidracina (cetonas) y DPPH difenil picril hidrazil (antioxidantes) (Geissmann & Griffin, 1971; Merk, 1980). ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Difusión en placas de agar La prueba se realizó en medio sabouraud con adición de cloranfenicol. Consistió en realizar una siembra masiva de las fracciones en el medio con un equivalente a 1g de biomasa fresca, se dejo difundir la muestra en la placa durante una noche en refrigeración. Posteriormente se tomaron discos de agar colonizados con micelio de los aislamientos de Fusarium y se ubicaron en el centro del montaje (Istifadah, 2006). Se realizaron lecturas cada 24 horas del crecimiento radial del micelio sembrado por 8 días, comparados con un control del hongo sin solvente y con solvente, incubados bajo las mismas condiciones de temperatura que la metodología de bioautografía. Bioautografía Alícuotas de los extractos etanólicos y fracciones, equivalentes a 1g de biomasa fresca, se sembraron sobre placas de TLC de sílica-gel 60 F254 (Merck). Las muestras se corrieron en el sistema de solvente seleccionado. El solvente orgánico fue evaporado y posteriormente las placas de TLC se asperjaron con una suspensión de conidios de Fusarium sp. (104 conidios/mL) en una solución de sales básales y sucrosa (FSM) (Cooper, 1975). Las placas se incubaron durante 5-8 días en una cámara húmeda a 28ºC, temperatura óptima de crecimiento de Fusarium sp, en oscuridad. La lectura de zonas de inhibición del crecimiento (micelio) en la placa indica actividad antifúngica.

RESULTADOS COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES EN CUNDINAMARCA Se utilizó el sistema GPS (Global Position System) con el fin de tener una ubicación precisa sobre el lugar de colección de las diferentes especies de Amanita dentro del departamento de Cundinamarca, para definir lugares de muestreo continuo. Dentro de las seis zonas en las que se realizaron búsquedas y muestreos se definieron tres, las cuales cumplieron con las características de clima, sustrato, humedad y con la presencia de cuerpos fructíferos de especies de Amanita en cantidad suficiente (Tabla 2). Tabla 2. Distribución de zonas de muestreo definidas como permanentes.

Provincia Lugar Ubicación GPS Distrito Capital Cerros Nororientales

Cantón Norte Latitud: 4º40’56.88’’N Longitud: 74º1’42.12’’O

Provincia Sabana Centro Chía Cerros de Yerbabuena San José de Guausa

Latitud: 4º51’19.14’’N Longitud: 74º1’20.30’'O

Provincia Ubaté Embalse del Neusa Latitud: 5º4’4.04’’N Longitud: 73º58’0.97’’O

Características morfológicas macroscópicas Píleo de 4 a 25 cm de diámetro, de forma hemisférica a plana cuando madura, con superficie pegajosa y húmeda en periodos de lluvia o pegajosa seca en temporadas de sol, de color rojo carmín brillante o naranja oscuro debido a decoloración por lluvia. Presencia de escamas y velo universal abundante de color blanco o crema. No presenta olor ni sabor característico o distintivo. Las lámelas se encuentran libres en posición cercana o apretada de color blanco a crema. El estípite presenta una longitud promedio de 4 a 18 cm con un diámetro entre 0.5 y 4.5cm en ubicación cercana al ápice es bulboso, con superficie fibrosa o escamosa de color blanco o crema pálido; el estípite es generalmente hueco. Presenta anillo superior colgante dependiendo de la edad, de color blanco. La volva se presenta en forma de anillos al rededor de la base del estípite. Presenta esporada de color blanco a crema Estas características concuerdan con la caracterización de Amanita muscaria por claves taxonómicas macroscópicas y microscópicas (Largent & Jonson, 1973; Franco & Vasco, 2005). Por otro lado se realizó identificación utilizando un software de identificación taxonómica “matchmaker” (Kendrick, 2006), con un resultado de 99% de probabilidad de Amanita muscaria. Características morfológicas microscópicas Amanita muscaria presenta esporas de forma ovoide sin ornamentos (lisas), amiloides en reactivo de Melzer, no presenta diferencia particulares en KOH o Rojo Congo. Presenta basidios de dos a cuatro esterigmas, es decir dos o cuatro esporas por basidio. La organización o trama del contexto tanto de píleo como estípite no es fácil diferenciar por microscopia óptica ya que se requiere de amplia experiencia en realización de cortes y este tipo de observaciones.

SCREENING DE GRUPOS FUNCIONALES EN EXTRACTOS ETANÓLICOS Y FRACCIONES Pruebas químicas preliminares (Colorimétricas) Dentro de las pruebas preliminares que aportaron un resultado positivo se encuentran saponinas y terpenoides para fracción de bencina de petróleo, fracción hidroalcohólica y extracto crudo; glucósidos para extracto crudo, fracción hidroalcohólica y bencina de petróleo y alcaloides para todas las fracciones analizadas (Tabla 3) Tabla 3. Resultados de pruebas químicas preliminares para extracto 1 y 2 de A. muscaria.

Extracto Amanita muscaria

PRUEBAS QUIMICAS PRELIMINARES Fracción Réplica Cumarinas Quinonas Saponinas Flavonoides Glucosidos Terpeniodes Alcaloides

1 - - + - - + +

2 - - + - - + + BP

3 - - + - - + + 1 - - - - - - + 2 - - - - - - + DC 3 - - - - - - + 1 - - - - - - + 2 - - - - - - + AE 3 - - - - - - + 1 - - + - + + +

2 - - + - + + + EC

3 - - + - + + + 1 - - + - + + +

2 - - + - + + + HA

3 - - + - + + +

Los resultados negativos no indican ausencia de los compuestos, ya que las pruebas colorimétricas presentan poca sensibilidad a bajas concentraciones del compuesto y en mezclas de varios y pueden arrojar falsos negativos, a su vez el extracto 1 y 2 se comportaron de la misma forma para cada una de las pruebas. Cromatografía de capa delgada Se probaron 23 combinaciones de fases móviles de las cuales se definió como el solvente apropiado para correr la cromatografía, compuesto por bencina de petróleo y acetato de etilo en proporción (9:1). Teniendo en cuenta los fundamentos de cada uno de los reveladores utilizados se presentaron una serie de bandas las cuales pueden o no ser características a un compuesto específico. Dentro de los resultados obtenidos encontramos; la placa revelada con vainillina al tratarse de un revelador genérico podemos decir que todas las bandas presentes pueden estar relacionadas de una forma inespecífica para: alcoholes, fenoles, esteroides y aceites esenciales. Para la placa revelada con cloruro de antimonio III podemos decir que existe la presencia de terpenoides en las fracciones de bencina de petróleo, hidroalcohólica y extracto crudo. Por otro lado en la placa revelada con reactivo de Neu, encontramos presencia

de cumarinas para las tres fracciones apolares y posiblemente para flavonoides para fracción de bencina de petróleo e hidroalcohólica, ya que no es muy clara la definición de color en la banda. Con el revelador de hidróxido de potasio se presentan bandas características de cumarinas, en las tres fracciones apolares. En hidroxilamina – cloruro férrico no se observaron bandas características para lactonas. En el caso de dinitrofenil hidrazina, presencia de bandas características de aldehídos libres, más no para cetonas. Para las placas reveladas con anisaldehído modificado para glucósidos encontramos bandas en todas las fracciones menos en la de extracto crudo. Por último, con el revelador difenil picril hidrazil (DPPH), encontramos bandas características para antioxidantes en todas las fracciones menos en la de extracto crudo. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Bioautografía Dentro de los resultados obtenidos observamos que las áreas donde no se presentó crecimiento de los hongos, son las mismas donde se presentan bandas en barrido para la placa que se sirvieron con el equivalente a 1g de biomasa fresca, y que se observaron antes de ser asperjadas con la suspensión de conidios en luz de onda corta y onda larga, lo que nos indica que existe algún tipo de actividad antifúngica. Teniendo en cuenta que de acuerdo con los resultados obtenidos para la cromatografía en capa delgada, la fracción que presentó mayor cantidad de compuestos fue la de bencina de petróleo, seguida de la fracción hidroalcohólica, la de diclorometano, acetato de etilo y por último la de extracto crudo. Era de esperarse que en la bioautografía se presentaran zonas de no crecimiento mayores en la fracción bencina de petróleo y fracción hidroalcohólica, como efectivamente se evidenció claramente en las cepas Nº 121 y 160 para la fracción de bencina de petróleo, la poca visualización de las bandas, puede explicarse por la naturaleza apolar del solvente y la presencia de compuestos polares de la muestra que impiden la migración de compuestos apolar, puede ser que queden “atrapados” en la línea de siembra. La finalidad de hacer evaluación de las fracciones y el extracto crudo en la misma placa están encaminadas a determinar si existen relaciones de solapamiento o sinergismo entre los diferentes compuestos presentes en los extractos. La presencia del área de no crecimiento en la fracción de bencina de petróleo no nos aclara la existencia de relaciones sinérgicas o de solapamiento, ya que existe una gran cantidad de compuestos presentes en esta fracción y relacionados con la corrida en la placa de TLC saturada con equivalente a 1g de peso fresco, así como puede ser un solo compuesto el responsable de la inhibición, también puede ser un conjunto de de estos, sin embargo al compararlo con la corrida e inhibición de crecimiento en el extracto crudo podemos decir que algún o algunos compuestos presentes en el extracto crudo concentrado impiden la actividad de inhibición de crecimiento y estos no se separaron en la fracción de bencina de petróleo.

Análisis estadístico de la prueba difusión en placa de agar Para obtener la mayor cantidad de información relacionada con los resultados de la metodología de crecimiento radial en medios con siembra masiva de las fracciones se decidió hacer un manejo estadístico de los datos obtenidos. Las variables que se tienen en cuenta para ajustarlo son los extractos de Amanita muscaria, las cepas de Fusarium, las fracciones y réplicas (1, 2, 3). Inicialmente se ajustó un modelo con todas las variables y sus interacciones para identificar cuales factores se deben dejar en el modelo y cuales no son significativos y ser eliminados, al ser variables redundantes para el modelo. De acuerdo a los resultados se observó que el factor extracto no es representativo en el modelo al igual que las interacciones asociadas a este, es decir que el comportamiento de los dos extractos es significativamente similar, por lo que hacer una relación entre estos no es importante y se utilizó como una réplica. Se decide entonces eliminar esta variable al igual que la variable réplica (Tabla 4; Grafica 1) Tabla 4. Análisis estadístico general a. Área debajo de la curva y relación de probabilidad para las diferentes variable; b. Diámetro de crecimiento y relación de probabilidad para las diferentes variable.

a. b. Área Bajo la Curva Diámetro de Crecimiento

Pr ≥ F ≤ 0,0001 Pr ≥ F ≤ 00639 CEPA MEDIA DUNCAN CEPA MEDIA DUNCAN

160 27,636 A 160 3,958 A 121 25,449 AB 121 3,797 AB 155 24,106 B 155 3,416 B 108 20,767 C 108 2,944 C

Pr ≥ F ≤ 0,0001 Pr ≥ F ≤ 0,0001 FRACCIÓN MEDIA DUNCAN FRACCIÓN MEDIA DUNCAN

C 32,174 A C 4,784 A AE 29,504 AB AE 4,178 AB EC 28,092 BC EC 4,046 BC DC 26,081 C DC 3,696 C AH 21,079 D AH 3,04 D BP 10,007 E BP 1,416 E

Pr ≥ F 0,9128 Pr ≥ F 0,9128 REPLICA MEDIA DUNCAN REPLICA MEDIA DUNCAN

1 24,756 A 1 24,756 A 2 24,444 A 2 24,444 A 3 24,269 A 3 24,269 A

Gráfica 1. Crecimiento general de las cepas de Fusarium relacionado con las fracciones utilizadas.


0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (dias)D

iám

etro

(cm

)

Bencina de Petróleo Diclorometano Acetato de EtiloHidroalcoholica Extracto crudo Control

Se realizó un análisis de varianza (ANOVA), hay que tener en cuenta que en este caso la tabla de ANOVA que se tomó en cuenta es la que corresponde a las sumas de cuadrados Tipo III. Vemos que el modelo ajustado explica bien la variabilidad de la información ya que tiene un R2 de 0.825946 para el análisis de diámetros y 0.669862 para área bajo la curva, además los factores incluidos en el modelo son significativos, esto se concluye observando el p-valor (Tabla 4), el cual ayuda a verificar la hipótesis nula, no hay diferencia significativa entre los factores. Si rechazamos la hipótesis nula estamos diciendo que el factor es diferente de cero es decir que es significativo en el modelo. El criterio de decisión dice que si el p-valor es menor a 0.05 entonces se rechaza la hipótesis nula. Las comparaciones de medias del diámetro y área bajo la curva de las diferentes cepas de Fusarium arrojan algunas diferencias significativas entre ellos para el agrupamiento general de DUNCAN (Tabla 4). Las diferencias entre estos hongos son aproximadamente de un centímetro entre ellos en el caso del análisis para diámetro. Por otra parte el comportamiento de las fracciones en el análisis general indica que existen diferencias entre las fracciones y se evidencian diferencias significativas para la fracción bencina de petróleo e hidroalcohólica referente al poder que tienen para inhibir el crecimiento de las cepas de Fusarium utilizadas, de estos resultados se obtuvieron los porcentajes de inhibición de crecimiento radial (Tabla 5).

Tabla 5. Porcentaje de inhibición de crecimiento para la relación extracto, cepa y fracción.

Fusarium sp. FRACCIÓN Extracto 1 % Inhibición FRACCIÓN Extracto 2 % Inhibición

EC 17,90 5,74 BP 17,73 6,64 HA 18,54 2,37 C 18,99 0 BP 19,11 0 EC 19,32 0 C 18,99 0 DC 20,92 0

AE 24,84 0 AE 21,46 0

108

DC 26,39 0 HA 25,02 0

Fusarium sp. FRACCIÓN Extracto 1 % Inhibición FRACCIÓN Extracto 2 % Inhibición

BP 6,74 81,33 BP 7,68 78,73 HA 14,72 59,22 HA 22,58 37,45 EC 28,97 19,75 EC 27,77 23,07 AE 31,18 13,63 DC 28,58 20,83 DC 32,90 8,86 AE 32,07 11,16

121

C 36,10 0 C 36,10 0 BP 7,79 78,11 BP 9,44 73,27 DC 19,27 45,86 HA 21,62 38,79 HA 19,33 45,69 DC 23,77 32,70 AE 30,13 15,34 EC 26,17 25,91 EC 32,59 8,43 AE 28,52 19,25

155

C 35,59 0 C 35,32 0 BP 6,97 81,79 BP 4,59 88,01 DC 25,59 33,15 HA 20,52 46,39 HA 26,29 31,32 DC 31,23 18,42 AE 33,33 12,93 AE 34,51 9,85 EC 35,91 6,19 EC 36,11 5,67

160

C 38,28 0 C 38,28 0

DISCUSIÓN COLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AGARICALES DE LA FAMLIA Amanitaceae Características y zonas de muestreo para A. muscaria Amanita muscaria se puede encontrar en casi cualquier hábitat, desde las regiones más bajas a los bosques límites de la vegetación, desde las latitudes más meridionales hasta latitudes septentrionales. Crece mayoritariamente dentro de la estación micológica (otoño-invierno), que para el caso de un país como el nuestro está relacionado a los periodos comprendidos entre una estación lluviosa no muy fuerte y un periodo de sequía cálido o húmedo. Amanita muscaria es un hongo que necesita periodos de humedad o lluviosidad significativos, mas no agresivos (Galvis, 2006). Los periodos de presencia o no de cuerpos fructíferos de Amanita muscaria, están ligados directamente a las relaciones climáticas anteriormente descritas. Por otro lado, estas sucesiones ecológicas tienen una finalidad específica en un ecosistema, para nuestro trabajo encontramos que los periodos de exceso de humedad se relacionan con la presencia superior de cuerpos fructíferos de hongos de la familia Boletaceae, los cuales presentan una gran permeabilidad y capacidad para crecer un medio saturado de humedad. Adicionalmente, en los periodos de sequía se presentan hongos de la familia Tricholomataceae, los cuales por sus características de crecimiento pueden desarrollarse bien en medios secos como piedras, troncos de árboles y suelo.

Caracterización morfológica, macroscópica y microscópica0 Para el proceso de identificación de Amanita muscaria debemos tener en cuenta que dentro del estudio de hongos Agaricales, A. muscaria es un modelo recurrente debido principalmente a su característica tóxica, lo que hizo que esta estuviera dentro de un interés particular. La identificación de este hongo es de alguna manera simple, sus características morfológicas son inconfundibles, sin embargo se presentan confusiones significativas si tenemos varias especies de Amanita como Amanita phalloides, A. Bisporigera, A. verna, A. vinosa, A. ocreata, A. temifolia y A. suballiacea, las cuales presentan características similares y específicamente su toxicidad (Michelot, 2003; Satora, 2005). Para nuestro estudio se contó con guías de campo desarrolladas para hongos macromicetos reportadas en el país (Franco, 2000), lo que nos dió una garantía, ya que no se sabía si las características reportadas en regiones como Europa y América del norte se presentarían de la misma manera en una zona subtropical como la nuestra. Encontramos que Amanita muscaria y otras especies de Amanita no nativas de nuestra región, presentan las mismas características de crecimiento con algunas variaciones como el tamaño y su macroscopía en periodos de madurez relacionado a deformaciones por humedad (Geml, 2008). Al mismo tiempo, al confirmar que su comportamiento es normal dentro de nuestra región, también se trabajó con el programa “matchmaker”, desarrollado como herramienta de identificación de hongos de América del Norte y Europa. El programa arrojó una probabilidad de 99% para A. muscaria. Se realizaron todos los protocolos de clasificación morfológica tanto macro como microscópicos donde se tiene completa certeza que se trabajó con A. muscaria. Obtención de extractos etanólicos La obtención de los extractos etanólicos no presentó ningún tipo de complicación, a pesar que no se logró obtener el equipo necesario para realizar el secado de los cuerpos fructíferos (liofilizador u horno de convección con vacío), el realizar el secado al ambiente generó que se presentaran un alto contenido de agua por lo que se decidió modificar la proporción de agua y etanol en el proceso de la realización de la fracción hidroalcohólica. Por otro, lado la cantidad de 500g de biomasa fresca necesitó volúmenes elevados de etanol para la realización del extracto y un aumento en los tiempos de rota-evaporación para la obtención del extracto crudo concentrado. Como se realizaron dos extractos con dos colectas en lugares diferentes de A. muscaria, se evaluaron posibles diferencias con respecto los extractos, se observó que no existió diferencia de color u olor en los dos extractos obtenidos. SCREENING DE GRUPOS FUNCIONALES EN EXTRACTOS ETANOLICOS Y FRACCIONES Pruebas químicas preliminares Las fracciones concentradas fueron sometidas a pruebas calorimétricas para identificar algunos grupos funcionales. Como se mostró en los resultados se obtuvieron positivos para saponinas, las cuales se presentaron en la fracción de

bencina de petróleo, extracto crudo y fracción hidroalcohólica, a pesar que la afinidad de las saponinas no está relacionada con solventes tan apolares. Terpenides se presentaron en la fracción de bencina de petróleo lo cual era de esperarse por su afinidad a solventes de baja polaridad y en las fracciones de extracto crudo e hidroalcohólica, este resultado debido posiblemente a que pueden estar asociados a glucósidos polares. En el extracto crudo y fracción hidroalcohólica se presentaron glucósidos, lo cual es de esperarse debido a que los glucósidos son compuestos altamente polares. Se confirmó la presencia de alcaloides, pues era de esperarse ya que Amanita se caracteriza por ser alucinógena (Chen Li, 2005; Michelot, 2003); por otro lado el resultado positivo para todas las fracciones analizadas está relacionado con lo heterogéneo de los alcaloides y su polaridad (Domínguez, 1973; Calderón, 1963). La prueba de alcaloides se utilizo para generar un control positivo; sin embargo las pruebas calorimétricas no son suficientes ni determinativas para descartar o afirmar la presencia de un compuesto, debido principalmente a que existe la posibilidad de interferencia por estructuras similares y debido a la dificultad que se presenta al realizar una valoración relacionada con reacciones de color, donde la intensidad y fuerza de la reacción es directamente proporcional a la concentración del compuesto por lo que podemos generar falsos positivos o falsos negativos. Cromatografía en capa delgada Dentro de los resultados obtenidos para la prueba de cromatografía en placa delgada es clara la diversidad de metabolitos secundarios presentes en el cuerpo fructífero de Amanita muscaria, esta diversidad es ya bien conocida en hongos tanto macromicetos como micromicetos (Lindesquist, 2005). Para el propósito del trabajo nos interesa la actividad antifungica de estos compuestos encontrados y sus interacciones dentro de un sistema inhibitorio de crecimiento fúngico. No todos los compuestos encontrados presentan actividad antifúngica. Para el caso de los compuestos encontrados podemos hablar de activadad antifúngica, antimicrobiana y anti-inflamatoria de saponinas aisladas de plantas de quinua, agapanto y yuca contra hongos como Botrytis cinerea, Trychophyton mentagrophytes, Sporothrix schenekii, Candida albicans y Cryptococcus neoformans. (Singh D:N, 2008; Stuardo, 2008; Zhang Y, 2008); para el caso terpenos estos presentan reportes sobre actividad antifúngica, antimicrobiana, anti-tumoral e inmunosupresora, estas actividades y posibles usos se han referenciado principalmente a partir de plantas. Para el caso de las cumarinas, se presenta actividad antifúngica frente a Cryptococcus neoformans, Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes Aspergillus niger, Aspergillus flavus y Cladosporium como antimicrobiana frente a Leishmania Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella Typha (Gangadhar, 2008; Kouassi, 2004; Ojala, 2000; Sardari, 1999; Stein, 2006), dentro de este grupo la escopoletina ha presentado importantes resultados (Valle, 1997) y se está estudiando para el desarrollo de anti-cuagulantes y medicamentos preventivos para el cancer, también aislados a partir de plantas y sus frutos (Monti, 2007; Thati, 2007). A su vez, compuestos fenólicos obtenidos del olivo y en específico de la alcaparra presentan

actividad antimicrobial frente a Gram positivos (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, y Staphylococcus aureus), Gram negativos (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae) y hongos (Candida albicans and Cryptococcus neoformans) (Sausa, 2006). También se habla de estudios realizados a partir de plantas, en los que se reporta actividad antifúngica asociada a glucósidos contra F. oxysporum, R. solani y B. fabae. Además actividad de aldehídos frente a Tricophyton mentagrophytes, Microsporum canis y Candida spp (Abbassy, 2007; Battinelli, 2006). Así mismo, compuestos como antioxidantes que no presentan una actividad antifúngica o antibacteriana si presentan una serie de beneficios para el desarrollo de medicamentos relacionados con procesos de deterioro y envejecimiento de las células el aislamientos de estas sustancias de plantas esta muy extendido (Karagözler, 2008; Obied, 2008), actualmente estos compuestos se estan aislado en hongos macromicetos como Agarucus sp, Lactarius deterrimus, Suillus collitinus, Boletus edulis, Xerocomus chrysenteron, Agaricus blazer, Agrocybe cylindracea y Lentinula edodes conocido como Shiitake (Barros, 2008; Sarikurkcu, 2008; Sorane, 2007; Tsai, 2007). Dentro de la producción de metabolitos secundarios se tienen en cuenta la relación de factores de carácter biótico, como predadores; y abiótico como disponibilidad de nutrientes, temperatura y humedad, que generan reacciones de estrés que desencadenan respuestas de protección en los organismos. Estas respuestas pueden ser físicas o químicas, para el caso de compuestos de protección como toxinas (Amanita muscaria “hongo mata moscas”); así mismo, estas respuestas pueden ser estrategias evolutivas. En el caso de A. muscaria se conoce que genera sustancias asociadas directamente a su relación simbiótica con árboles de pino y roble (Koukol, 2008; Nehls, 2007) La técnica de cromatografía en capa delgada nos permite hacer una diferenciación de algunos de los compuestos presentes en los extractos de Amanita muscaria, en términos de grupos funcionales. Sin embargo esta técnica no permite confirmar la naturaleza antimicrobiana de los metabolitos, por lo cual se planteó la metodología de bioautografía, que permite asociar actividad antimicrobiana y naturaleza química del metabolito que está inhibiendo el crecimiento del microorganismo a evaluar ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA Difusión en placas de agar y análisis estadístico Se utilizo un hongo que generara micosis superficial al igual que los dermatofitos y que presentara una tasa de crecimiento mayor, por este motivo se definió a Fusarium como microorganismo de prueba, aunque este no es catalogado dentro de las micologías clínicas como un hongo dermatofito, si tiene la capacidad de generar micosis superficiales en animales pequeños como microorganismo oportunista (Jawetz, 2000; Cutsem, 1991). Se evidenció claramente que la fracción de bencina de petróleo presentó la mayor actividad inhibitoria, en las cuatro cepas, sin embargo la cepa de Fusarium sp. 108 presentó diferencias de comportamiento frente a las otras

cepas trabajadas, aun en el cultivo control. Seguido a la fracción con mayor actividad, las fracciones de diclorometano e hidroalcohólica presentaron actividad intercalada entre las cepas, mientras que el extracto crudo y la fracción acetato de etilo presentaron los más bajos niveles de inhibición. Estos resultados presentaron diferencias entre las cepas, se demostró que la cepas de Fusarium más susceptibles a la acción de las fracciones fueron 160, 121 y 151 con porcentajes entre el 70 y el 90% de inhibición, mientras que la cepa 108 solo llegó a un 7% de inhibición. Debemos tener en cuenta que cada especie de Fusarium presenta características diferentes de respuesta y acción frente a sustancias que ponen en peligro su supervivencia, estas relaciones están dadas por características adquiridas individualmente, por procesos de modificación genética donde las cepas adquieren mecanismos de resistencia específicos y que pueden ser o no compartidos entre diferentes especies. Se debe recordar también, que Fusarium es un hongo que principalmente es catalogado como fitopatógeno y que dentro de sus características se encuentran la producción de toxinas de una gran variedad, esta característica puede estar relacionada la capacidad de tolerar las que él produce y otras (Carrillo, 2003). Por otro lado, como se dijo anteriormente, Fusarium es un hongo fitopatógeno el cual se ha tratado de controlar por diverso medios químicos, estos tratamientos han generado que los hongos desarrollen mecanismos de residencia más elaborados que los hacen poco susceptibles a antifúngicos de origen químico y biológico dentro de estos mecanismos están: incapacidad del fármaco para alcanzar la diana dentro de la célula, que puede ser debida a la existencia de barreras de permeabilidad o a sistemas de bombeo activo del compuesto al exterior; cambios en la interacción fármaco-diana (aumento del número de copias de la diana o modificaciones debido a mutaciones); y modificaciones en las enzimas de las vías metabólicas. Asimismo, se sabe que muchos de estos mecanismos pueden coexistir en una misma célula (Mellado, 2000). Bioautografía Los resultados de la bioautografía confirman los resultados obtenidos a partir de la prueba de difusión en placa, se encuentra inhibición de las diferentes cepas de Fusarium en las todas las fracciones analizadas, sin embargo la fracción que presenta mayor inhibición es la de bencina de petróleo. La relación existente entre los metabolitos y la polaridad del solvente es variada, es decir que dentro de los compuestos apolares existen gran número de metabolitos secundarios que pueden estar actuando. De acuerdo con esto podemos decir que existen relaciones de sinergismos y solapamiento dentro de los metabolitos extraídos de los cuerpos fructíferos de A. muscaria. Teniendo en cuenta que el extracto crudo contiene todos los metabolitos sin ningún tipo de separación, sería de esperarse que este presentara una actividad mayor que la del la fracción de bencina de petróleo, sin embargo la inhibición es muy poca, lo que nos indica que exciten relaciones de solapamiento entre los metabolitos. Por otro lado, no podemos descartar una relación de sinergismo entre los compuestos presentes en la fracción de bencina de petróleo ya que la inhibición se presenta en un espectro muy amplio, es decir que en la cromatografía de capa delgada los RF relacionados en el área donde no se presentó crecimiento

contienen amplio numero de bandas lo que no nos permite diferenciar cual de todas los compuestos es el relacionado con la actividad antifúngica. La técnica de Bioautografía es una herramienta utilizada ampliamente para evidenciar la actividad biológica de fracciones de extractos de plantas frente a bacterias y hongos unicelulares (Evans, 2006; Schmourlo, 2005), sin embargo su uso para determinar actividad antifúngica contra hongos como Fusarium es reducido, ya que la estandarización de crecimiento de hongos en la placa de silica aun no está bien reportada. Las investigaciones que se encuentran hacen referencia a la utilización de la técnica por doble capa o bioutografía directa, es decir que la silica no es el soporte de crecimiento para el microorganismo, sino un medio agarizado. Los problemas que se presentaron con esta técnica para los dermatofitos demostraron que es difícil lograr que el soporte de la silica y un medio líquido complementario como el FSM permita de forma fácil el crecimiento del los hongos. También se deben tener en cuenta las tasas de crecimiento del hongo que son claramente más bajas que las de una bacteria, por este motivo se utilizo un hongo de crecimiento rápido como Fusarium. Las diferencias de crecimiento de los hongos presentan problemas al momento de enfrentarse a contaminantes del medio ambiente, ya que sucede que los hongos contaminantes crecen más rápido que los hongos de estudio, lo que genera la invalidación de la técnica, al no poderse trabajar de forma estéril ya que los metabolitos no pueden ser sometidos a algún proceso de esterilización pues algunos presentan características termolábiles. Por otro lado el uso de un hongo de micelio pigmentado como Fusarium facilitan la lectura de zonas de inhibición en la placa de bioautografía, cuando se utiliza un hongo hialinos como los dermatofitos el contraste al ser revelados con vapores de yodo no es bueno, la placa de silica tiende de pigmentarse del mismo color que el micelio rápidamente. CONCLUSIONES • Se evidencio la diversidad de metabolitos presentes en hongos de la familia Amanitaceae específicamente de Amanita muscaria, esta especie representa un potencial importante para el desarrollo de nuevos compuestos de tipo medico y biotecnológico. Los resultados obtenidos a parir de las pruebas químicas preliminares y la cromatografía demuestran el gran número y diversidad de estos compuestos, donde encontramos terpenoides, glucósidos, flavonoides, cumarinas, aldehídos, antioxidantes, alcaloides entre otros, a partir de las fracciones obtenidas de cuerpo fructífero. Esta búsqueda preliminar de compuestos antifúngicos permite pensar en la necesidad de obtener volúmenes que permitan realizar más prueba, hacer una caracterización más compleja de los compuestos encontrados y su posterior purificación. • El departamento de Cundinamarca en el cual se enmarco el desarrollo de la investigación presenta una gran diversidad de flora y fauna, que son el resultado de la interacción de factores como microclimas, tipos de suelo, pisos térmicos lo que genera que cuente con todas las características necesarias para favorecer el desarrollo de hongos como Amanita muscaria, la explotación de estos recursos de biodiversidad

nativos son de gran importancia económica y pueden ser a mediano o largo plazo un foco de desarrollo científico importante. • Dentro de los resultados obtenidos sobre la actividad antifúngica de los extractos de Amanita muscaria podemos decir que la heterogenicidad de los compuestos encontrados permite pensar en relaciones de solapamiento y sinergismo relacionados con el proceso de inhibición de crecimiento fúngico. Se encontró actividad antifúngica de las fracciones de bencina de petróleo, hidroalcohólica y diclorometano frente a Fusarium sp., donde el porcentaje de inhibición para le caso de bencina de petróleo es superior al 70%, soportado dentro de un análisis estadístico. Este tipo de resultados evidencia la importancia de realizar estudios sobre la actividad de los metabolitos de hongos macromicetos, no solo relacionados con actividad antifúngica si no con actividad antimicrobiana en general. • Se presentaron inconvenientes referentes al manejo de hongos dermatofitos para le desarrollo de pruebas de actividad biológica que tenían como fin evaluar la efectividad de los extractos de A. muscaria frente a los causantes de dermatomicosis. Ya que no existen estandarizaciones sobre el manejo en laboratorio de estos hongos como: medios de cultivo, temperaturas de incubación y evaluación de inhibición de crecimiento, un aporte de esta investigación es la búsqueda, aplicación y evaluación de varios métodos como difusión en placa, inhibición de crecimiento radial y bioautografía para evaluar esta actividad, además de la búsqueda de hongos como Fusarium sp. que permiten realizar una lectura confiable debido a sus características favorables como tasas de crecimiento y micelio pigmentado. • La interacción y relación entre los resultados obtenidos a partir de las pruebas realizadas como cromatografía, bioautografía y difusión en placa permiten soportar la conclusión principal donde Amanita muscaria es capaz de sintetizar, en diferentes proporciones, metabolitos secundarios que poseen actividad antifúngica contra hongos causantes de dermatomicosis aislados de animales domésticos. AGRADECIMIENTOS A mi familia y amigos por su compañía y apoyó a mi directora Maria Ximena Rodríguez y codirectora Claudia Parra por su colaboración y guía para le desarrollo de esta investigación. LITERATURA CITADA Abbassy M, Abdelgaleil S, Belal A, Rasoul M (2007) Insecticidal, antifeedant and antifungal activities of two glucosides isolated from the seeds of Simmondsia chinensis. Industrial Crops and Products 26:345–350.

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