EXTRACCION DE ADN DE mosquito y sangre
-
Upload
libardo-caraballo -
Category
Documents
-
view
6.911 -
download
4
description
Transcript of EXTRACCION DE ADN DE mosquito y sangre
EXTRACCION DE ADN EN SANGRE Y EN MOSQUITO Y
ELECTROFORESIS
Edin Arroyo, Leonardo Chamorro, José Martínez, Libardo caraballo
Universidad de Sucre. Facultad de Educación y Ciencias. Departamento de
Biología. Programa de Biología. Laboratorio de parasitología molecular.
RESUMEN
El proceso de extracción del ADN geonómico sigue ciertas pautas para su
correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación
de proteínas. Existen varias técnicas que se utilizan para la extracción de
ADN; en esta práctica se utilizó el método de altas concentraciones de sales
con el fin de extraer material genético de muestras de sangre y de mosquito.
Este método consiste en la utilización de altas concentraciones de sales
acetato de amonio para precipitar proteínas y posteriormente precipitar ADN
con alcohol absoluto, para comprobar los resultados de la extracción se realizo
un electroforesis en la cual se visualizaron las bandas de ADN corridas en el
gel de agarosa. Este método resulta ser viable para la extracción de ADN en
ambas muestras.
Palabras claves: extracción de ADN, electroforesis, sangre, , mosquito,
acetato de amonio, gel de agarosa.
INTRODUCCION
El ácido desoxirribonucleico,
frecuentemente abreviado como
ADN o DNA, del inglés
DeoxyriboNucleic Acid, es una
macromolécula que forma parte de
todas las células. Contiene la
información genética usada en el
desarrollo y el funcionamiento de los
organismos vivos conocidos y de
algunos virus, siendo el responsable
de su transmisión hereditaria.
La extracción de ADN de una
muestra celular se basa en el hecho
de que los iones salinos son
atraídos hacia las cargas negativas
del ADN, permitiendo su disolución
y posterior extracción de la célula.
Se empieza por lisar (romper) las
células mediante un detergente o un
buffer de lisis, vaciándose su
contenido molecular en una
disolución tampón en la que se
disuelve el ADN. En ese momento,
el tampón contiene ADN y todo un
surtido de restos moleculares: ARN,
carbohidratos, proteínas y otras
sustancias en menor proporción.
Las proteínas asociadas al ADN, de
gran longitud, se habrán fraccionado
en cadenas más pequeñas y
separadas de él por acción del
buffer de lisis. Sólo queda, por
tanto, extraer el ADN de
esa mezcla tampón y detergente,
para lo cual se utiliza etanol frio.
MATERIALES Y METODO
Extracción de ADN en sangre
Para la extracción de ADN se tomo
una muestra de sangre (250 µL) a la
cual se le adiciono 250 µL de buffer
de lisis (NaCl 0,1 M; sacarosa 0,2
M; EDTA 50mM, tris-HCl 100Mm pH
8,25; SDS 0,05 %).A esta solución
de le adiciono proteínas K a una
concentración de 10mg/ml. Se
incubó a 65 °C por una hora y luego
de le adicionó 500 µL de acetato de
potasio 8M se incubo durante 30
minutos en hielo y posteriormente
se centrifugo a 13000 rpm durante
15 minutos. Sele adiciona 100 µL
de etanol y se incubo a temperatura
ambiente por 10 minutos. Se vuelve
a centrifugar por 15 minutos y el
precipitado se lavo con etanol al
70% dos veces. Se seca a
temperatura ambiente y se
resuspende en 20 µL de buffer TE.
Extracción de ADN del mosquito.
El ejemplar de mosquito fue
triturado en 50ml de tampón de lisis.
Esta solución se incubo por 1hr a
65°C. Se adicionaron 14µl de
acetato de potasio 8M y se incubo
por 30min en hielo, posteriormente
se centrifugo a 13000 rpm durante
15min. Y se incubo a temperatura
ambiente por 10min en etanol
absoluto. Se volvió a centrifugar a
13000rpm y el precipitado se lavo
dos veces con etanol al 70%. Se
seco a temperatura ambiente y se
resuspendio en 20µl de buffer TE
Se lavó con 500µL de etanol al
70%, se centrifugó a 12000 rpm por
10 min y se descarto el
sobrenadante. El precipitado se dejó
secar a temperatura ambiente y por
último se re suspende con 100 µL
de agua.
ELECTROFORESISDespués de realizar la extracción de
ADN, tanto del vector como de la
muestra de sangre se procedió a
realizar la electroforesis, la cual se
realizo en gel de agarosa 1%. Las
muestras de DNA tanto de sangre
como de mosquito se disolvieron en
un buffer de carga (Green) en una
proporción 8:2µl respectivamente.
Posterior a esto se hizo la siembra
en los posos y se procedió a realizar
el corrido.
RESULTADOSFig.1 Corrido de las muestras de ADN en el gel de agarosa.
ANALISIS DE RESULTADO
En la práctica realizada se obtuvo
DNA de sangre y de mosquito
mediante el método de altas
concentraciones de sales. Se utilizo
buffer de lisis, cuya función es
romper la membrana celular y
nuclear, permitiendo esto la
liberación del ADN. Dicho buffer,
para la extracción de ADN de
sangre, contenía Proteinasa K, es
una proteasa que degrada las
proteínas de membrana y facilita su
lisis, liberando el ADN.
Químicamente la proteinasa K actúa
a nivel de los péptidos en los
grupos carboxílicos alifáticos y
aminoácidos aromáticos propios en
los lípidos de membrana. Este
proceso de lisis de membrana fue
complementado con el baño de
María que a 65 0c activa de forma
eficiente a la proteinasa K. La
remoción de proteína y
contaminantes se realiza por
centrifugación adicionando alcohol,
obteniendo un sobrenadante
compuesto por restos de
membrana, organelas celulares,
protoplasma y restos de
hemoglobina, esto para el caso del
ADN extraído de sangre, debido a
que la extracción de ADN de
mosquito no se utilizo la proteinasa
K.
Después de la ruptura celular y la
eliminación del pellet de restos
celulares, se añade una sal para
disminuir la solubilidad de las
proteínas por incremento de la
fuerza iónica del solvente, lo que se
conoce como precipitación por
salado. Después de la adición
de cierta cantidad de sal, se
establece una competencia entre
los grupos cargados y polares de la
proteína y los iones de la sal (en
mayor número) por las moléculas de
agua que disminuye la capa de
solvatación alrededor de la molécula
proteica, sus grupos hidrofóbicos
superficiales se exponen y se
favorece el establecimiento de
interacciones intermoleculares, la
agregación y por tanto, la
precipitación. Cuando se centrifuga
se obtiene un precipitado blanco. El
pH puede variar la solubilidad de las
proteínas ya que los grupos pueden
cargarse o descargarse haciendo la
superficie más o menos polar. A pH
isoeléctrico las repulsiones
intermoleculares son mínimas ya
que la carga neta es cero. Las
características del anión y del catión
también son importantes. Las sales
más efectivas son las que presentan
aniones polivalentes mientras que
los cationes son menos importantes,
no obstante se prefieren los
monovalentes. Con el sobrenadante
se procede de igual forma,
separando las proteínas con
solventes orgánicos y precipitando
el DNA de la fase acuosa con etanol
absoluto.
La muestra es lavada y precipitada
con alcohol al 70% del cual el 40%
es alcohol y el 30 % es agua. El
alcohol se encarga de precipitar el
ADN, pues este, es soluble en agua
(y, por tanto, invisible a nuestros
ojos, pues cada molécula está
rodeada de agua y nuestra vista no
percibe moléculas individuales de
ADN) pero insoluble en alcohol, lo
cual origina que en presencia de
éste se aglutine o "se precipite". Al
aglutinarse, el ADN forma partículas
macroscópicas y se hace visible.
Finalmente el ADN es resuspendido
en buffer TE, el cual es una solución
amortiguadora del pH comúnmente
empleada en biología molecular,
especialmente para procedimientos
que buscan proteger al DNA o RNA.
La capacidad amortiguadora del
buffer depende del Tris, mientras
que el EDTA es el responsable de
proteger a los ácidos nucleicos
inactivando a las DNAsas o
RNAsas. El EDTA logra esta
inactivación actuando como
quelante de cationes divalentes
como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales
son indispensables para el
funcionamiento de estas enzimas.
Dicha muestra de ADN se utilizo
para realiza la electroforesis en gel
de agarosa, la cual demostró que el
proceso de extracción de ADN se
dio de forma correcta e incluso se
dieron resultados en la muestras de
ADN mal tratadas. Tal como se
puede observar en la imagen.
CONCLUSIONES
La proteinasa K es un buffer
de lisis del material celular, la
cual degrada los péptidos de
membrana plasmática y
nuclear, facilitando la
liberación de ADN.
El ADN se precipita en
alcohol, pues es insoluble en
este, y se torna visible en la
interfaz alcohol-H2O.
El corrido electroforético
depende de una buena
práctica de extracción de
ADN.
BIBLIOGRAFIA
LETELIER Ignacio. Grupos
sanguíneos. [En línea]. Terra
Networks, S.A. Chile.
Disponibilidad:
http://www.escolares.net/des
cripcion.php?ide=942
Gustavo A. Saldaña, Efraín
G. Salazar. La extracción y
purificación del ADN para el
análisis por PCR [En línea].
Microbial S. Girona España.
Disponibilidad:
http://www.microbial-
systems.com/web/uploads/do
cs/news/Newslet _Microbial