Factores capaces de condicionar la actividadbiológica de los anticuerpos IgG : Acción de las

enzimas proteolíticas e impacto de la cargaeléctrica

Trevani, Analía S.1996

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires

www.digital.bl.fcen.uba.ar

Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica conreconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.

Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires

W R S I D A D DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATUMLES

FACTORES CAPACES DE CONDICIONAR LA ACTIVIDAD

BIOLOGICA DE LOS ANTICUERPOS IgG

Acciiin de Ias enzimas proteoliticas e impacto de la carga elhctrica

Antor: Analia S. Trevani

Tesis para optar a1 titulo de

Doctor de la Universidad de Buenos Aires

Director: Dr. Jorge R. Geffher

Seccibn Inmunologia

Instituto de Investigaciones Hematologicas

Academia Nacional de Medicina

Buenos Aires

UNIVERSITY OF BUENOS AIRES

COLLEGE OF EXACT AND NATURAL SCIENCES

FACTORS THAT CONDITION THE BIOLOGICAL ACTIVITY

OF IgG ANTIBODIES

Action of proteolytic enzymes and electric charge impact

Author: Analia S. Trevani

Thesis to obtain the degree of

PhD fiom the University of Buenos Aires

Director: Jorge R. Geffner, PhD

Deparment of Immunology

Institute of Hematological Research

National Academy of Medicine

Buenos Aires

RESUME.

En la presente Tesis, se estudio la capacidad de factores propios a 10s entornos

idamatorios e inherentes a 10s complejos inrnunes (CI), de condicionar distintas

respuestas biologicas inducidas a consecuencia de la interaction del m e n t o Fc de

10s anticuerpos IgG con sus receptores celulares especifiws (RFcy). Respecto a 10s

primeros se evaluo el efecto de dos enzimas proteoliticas de distinta especificidad,

pronasa y quimotripsina. Los resultados obtenidos indicaron que estas proteasas

incrementan marcadarnente la avidez y la hcionalidad del RFcyII expresado por

neutrbfilos, condicionando la magnitud de las respuestas biolbgicas que involucran la

participaci6n de este receptor. Este efecto, sin embargo, parece ser dependiente de las

caracteristicas del CI empleado como estimulo, puesto que las proteasas aumentaron

notablemente las respuestas inducidas por eritrocitos sensibilizados con anticuerpos

IgG y por CI solubles, pero no modificaron aquellas inducidas por CI precipitantes. La

accion potenciadora de las proteasas parece ser selectiva del RFcyII, pues este efecto

no fue observado en otros receptores operativos en neutrbfilos. Considerando la

existencia de altos niveles de proteasas en heas inflamatorias, es posible que este

mecanisrno sea relevante in vivo en la regulation de la actividad del RFcyII del

neutrofilo hwnano.

En cuanto a 10s factores inherentes a 10s CI, se analizo el irnpacto de la carp

el&rica de 10s anticuerpos y antigenos que 10s conforman, sobre su capacidad de

inducir respuestas proinflamatorias y tromb6ticas mediadas por celulas fagociticas y

plaquetas, respectivarnente. La cationizacion de la fiaccion IgG de 10s CI,

procedimiento que increment6 sus pI desde 5,8-8,2 hasta 8,O-9,5, aumento, a1 menos

en un orden de magnitud, su capacidad de inducir funciones dependientes de 10s RFcy

expresados por celulas fagociticas, tales como la citotoxicidad, la emision de

quimiolwniniscencia y la liberacion extracelular de elastasa. El efecto potenciador de la

cationizacion h e aun miis notable empleando plaquetas. Los CI que incluian

anticuerpos IgG cationizados fieron capaces de inducir fbertes respuestas de

activacibn de plaquetas lavadas, filtradas o plaquetas suspendidas en plasma, mientras

que aquellos formados con componentes nativos fberon incapaces de inducir la

activacion plaquetaria bajo condiciones experimentales similares. La cationizacion del

componente antigenic0 de 10s CI, tambibn increment6 marcadamente su potencia

biol6gica. En conjunto, estos hallazgos indican que la carga elktrica de 10s CI

constituye una propiedad crltica que condiciona su capacjdad de inducir la activaci6n

celular y mgieren que 10s anticuerpos y antigenos cationicos podfian ser relevantes en

eventos inflamatorios asociados a enferrnedades que cursan con altos niveles de CI

circulantes.

Durante el transcurso de estos estudios se realizaron observaciones adicionales

relacionadas con el desarrollo de procesos inflamatorios agudos. El paradigma actual

asume que la capacidad quimiothctica de la IgG reside en su habilidad para formar CI e

inducir la activation del sistema complemento y la subsecuente production de peptidos

quimiotacticos como el C5a. En la presente Tesis, se observo que 10s CI son capaces,

per se, de estimular la quimiotaxis de neutr6fiIos a travb de su interaceion con el

RFcyII.. Esta actividad quimiotactica intrinseca de 10s CI podria ser responsable, al

menos en parte, del reclutamiento de neutrofilos observado en sitios inflamatorios de

huQpedes deficientes de complemento.

In the current Thesis it was studied the ability of different factors to condition

biological functions induced by the interaction of the Fc fiagment of IgG antibodies

with their cellular specific receptors (FcyR). Both factors belonging to inflammatory

focus and IC-intrinsecal factors were evaluated. Among the formers, the effect of two

proteolytic enzymes with distinct specificity, pronase and chymotrypsin, was analyzed.

The results obtained showed that proteases markedly increase the avidity and

hnctionallity of FcyRI1, conditioning the magnitude of the biological responses that

involve this receptor. However, this effect appears to be dependent on the

characteristics of the IC employed as stimulus judging by the capacity of proteases to

increase functions induced by erythrocytes coated with IgG antibodies and soluble IC

but not those induced by precipitating IC. The enhancing action of proteases seems to

be restricted to FcyRII-dependent functions sice proteases did not up-regulate the

activity of other receptors expressed by neutrophils. Taking into account the high

levels of proteases in inflammatory areas, these findings suggest that a mechanism

involving the action of proteolytic enzymes could be relevant for the in vivo regulation

of human neutrophil FcyRII activity.

Among IC-intrinsecal factors, the impact of electric charge of the antibodies

and antigens on their ability to induce proinflammatory and thrombotic responses

mediated by phagocytes and platelets was analyzed. Cationization of the IgG fiaction

of iC, procedure that increased its PI fiom 5.8-8.2 to 8.0-9.5, enhanced at least by

tenfold their ability to induce RFcy-dependent ftnctions by phagocytic cells such as

cytotoxicity, chemiluminescence emission and the elastase extracellular release.

Noteworthy, it was observed that IC prepared with cationized antibodies were able to

trigger platelet activation either in washed platelets, gel-filtered platelets or plasma

suspended platelets. By contrast, IC formed with native components did not induce

platelet activation under similar experimental conditions. Additional experiments

showed that antigen cationization also markedly incresed IC biological activity. These

findings suggest that the electric charge of IC constitutes a critical property that

conditions their ability to induce cellular activation and support a role of cationic

ABSTRACT

antibodies and antigens in the development of inflammatory events associated to

certain IC-induced diseases.

During the course of these studies, additional observations related to the

development of acute inflammatory processes were made. The current paradigm for

the mechanism by which IgG induce neutrophil chemotaxis assert that this ability lies

on its capacity to form IC and induce complement activation with the subsequent

generation of chemotactic peptides such as C5a. In the current Thesis, it was observed

that IC are able, per se, to induce neutrophil chemotaxis through their interaction with

FcyRII. This intrinsic chemotactic activity of IC may account, at least in part, for the

neutrophil recruitment that is observed at inflammatory sites in complement-deficient

hosts.

A Juan y a mi mamci

Este trabajo fbe realizado con el apoyo y colaboracion de personas a quienes quiero

expresar mi agradecimiento:

En especial a mi Director, el Dr. Jorge Gefier, por el apoyo brindado, por su manera

entusiasta de transmitirme sus conocimientos, por el seguirniento constante de mi

trabajo, por su dedicacion y su confianza. Por su afecto y su prokndo sentido del

compaiierismo .

A Mirta Giordano, por su ayuda continua y por el tiernpo dedicado a la revision de este

manuscrito.

A mi compaiiera Graciela Andonegui, por su colaboracion en el trabajo cotidiano, su

afecto y su predisposition constante a dame su ayuda.

A Monica Vermeulen, por brindarrne su amistad y su colaboracion incondicional. Por

escucharrne en todos 10s momentos en que lo necesite.

A Marina Palermo, Graciela Dran y Daniel Lbpez, por su ayuda y calidez.

A Martin Isturiz por transmitbe sus conocimientos y por su &to.

A mis compaiieros en general, por hacer del lugar de trabajo un sitio afectuoso y

comprensivo.

A Juan, por su ayuda incondicional y constante. Por alentarme a lograr mis objetivos.

Por soportar mi ausencia durante la escritura de esta Tesis. Por estar siempre a mi

lado.

A mi mami, por su apoyo constante. Por haberme ayudado a no bajar 10s brazos, a

enfientar la realidad y seguir adelante. Por su dedicacion incondicional para que

lograra todas las metas que me propuse.

................................................................................................ 1 .. INTRODUCCION 1

1.1 .- Receptores celulares para el flagmento Fc de la IgG ........................................... 2 1.1.1 .- Diversidad estructural y distribution celular ................................................ 3 1 . 1. 2.- Subunidades adicionales de 10s RFcy ........................................................... 6 1.1.3.- Interaccion de 10s CI y 10s RFcy: el entrecruzarniento de 10s RFcy como

evento critic0 en la activacion celular ......................................................... 8

1.2.. Funciones mediadas por RFcy inducidas por complejos inmunes ........................ 9 . . 1.2.1 .- Fagoc~tos~s .................................................................................................. 9 1.2.2.- Mecanismos citotoxicos dependientes del oxigeno ..................................... 10 1.2.3 .- Mecanismos citotoxicos independientes del oxigeno .................................. 15 1.2.4.- Liberacion de mediadores lipidicos de idamacion ..................................... 17 1.2.5.- Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) ......................... 19

1.3 .. Papel del 10s RFcy en la injuria tisular inducida por CI ....................................... 21

1.4.- Promiscuidad en el reconocimiento de ligandos y superposition de bciones en el sistema de RFcy ....................................................................... 23

..................................................................................... 3.. MA'IERIALES Y METODOS 27

................................................................................................... 3.1 .- Reactivos generales -27 3.1 .I.- Solucion de Fid-Hypaque .............................................................................. -27 . . ......................................................................................... 3.1.2.- Soluaon de dextrh -27 3.1.3.- Tamp6n fosfkto salino (PBS) ............................................................................. 27 . r .......................................................................................... 3.1.4.- Soluaon de Hank's. -27

I . ............................................................................................... 3.1 5 .- Soluaon Tyrode -28 3.1.6.- Solucion Tris-EDTA para el lavado de plaquetas ............................................... 28

................................................................................................ 3.1.7.- Medio de cultivo 28 3.1.8.- Solucion de Turk para el recuento de dubs.. ................................................. -28

...................................................................................... 3.1.9.- Solucion de azul tri@ 28 3.1.10.- Colorantes para iddcacionde gramlocitos .................................................. 29 3.1.1 1 .. Caracterizacion citoquimica de las distintas poblaciones leuCOCitarias

humanas ........................................................................................................... 29

................................................ 3.2.. Obtenci6n de leucocitos de sangre penf&ica humana 29 ...................................................... 3.2.1 .- Cdulas mononucleares penf6ricas humanas -29

............................................................................................ 3.2.2.- Linfocitos humanos 30 .......................................................................................... 3.2.3.- MoM>citos h~manos -30

........................................................ 3.2.4.- Granulocitos polimorfonuclearres humanos 30 3.2.5.- PMuetas humana~ ........................................................................................ 31

....... 3.3.. Preparation de complejos inrnunes ................................................ 32

....... 3.3.1 .- Obtencion de IgG de wnejo anti-IgG lnunana ................................. 32 3.3.2.- Obtencibn de IgG de wnejo anti-0- ..... . . (OA) y anti-SAB ....... 32

....... 3.3.3 .- Obtencih de suer0 anti-eritrocitos de pollo ..................................... 32

....... 3.3.4.- Antigenos empleados para la pxepam56n de 10s CI .................... 33 ........ 3.3.5 .- Cationizacion de antigenos y anticuapos. ........................................ 33

3.3.6.- Obtencibn de fracciones anibnicas y catihicas de IgG n o d ........................... 34 . . 3.3.7.- Preparmon de CI ............................................................................................... 34 3 .3.7.1 .- CI preparados wn anticuerpos o antigenos cationizados ............................ 34 . . ...................................................... 3.3.7.2.- Complejos he^ preclpltarrtes (CIp) 35 3.3.7.3 .- CI solubles prepslrados con las M o n e s anibnicas y cationicas

de la IgG ..................................................................................................... 35 3.3.7.4.- Preparacion de CI particulados con las M o n e s anionic8 y cationic8

de la IgGc anti-Ep ...................................................................................... 35 3.3.7.5.- Preparacibn de IgG humana age& ....................................................... 36 3.3.7.6.- Determimci&n del peso molecular de 10s CI por ul-on en

gradiente de densidad de sacarosa ........................................................... -36

3.4.. Aaticwpos monoclonales ....................................................................................... 36

..................................................... 3.5.. Ciotoxicidad celular dependiente de anticuerpos -37 3.5.1.-Cdulasblanco .................................................................................................... 37 3 52 . . Marcacibn de dulas blanco con cromato de sodio radioactive ......................... 37 . . . . . 3.5.3.- thabdmaon de las dlulss blanco .................................................................... 37

........................................................................................... 3.5.4.- Reamion de CCDA 37

..................................................................................... 3.6.. Citotoxicidad inducida por CI 38 3.6.1 .- Obtencibn de &lulas blanw .......................................................................... 38 3.6.2.- Marcacion de dulas blanco con mmato de sodio radioactive ................... 38 3.6.3 .- Reaccibn de citotoxicidad inducida pot CI ................................................... 38

3.7.. Emisi6n de ~oluminiscencia (QL) por neutn5iilos y monocitos ..............

3.8.. Citometria de flujo .............................................................................................. 39 3.8.1.-Detamhcion de launion de CI a h supedicie delosneutroiilos .................... 39 3.8.2.- Inhibicibn de la union de CI a la supedcie ceW por bloqueo de

receptores con AcM ......................................................................................... 39 ............................................................ 3.8.3 .. Expresion de P-selectina por phcpetas -40

.............................. 3.8.4.- Uni6n de proteinas cationizadas a la sumc ie plaquetaria -40 ........................................................................ 3.8.5.- Cambio de forma de neutrbfilos 40

3.9.- L i e o n extracelular de elastasa por mtr6flos estimulados ..........

3.10.- Quhiotaxis de neutrofilos ...........................................................

3.1 1 .- Efecto de 10s AcM anti-RFcy sobre diferentes respuestas de neutroflos inducidas por C1 ....................................................................................................................... 42

3.12.- Tratamiento de neutroflos con enzimas ...... ......

3.13 .- Fonnacion de rosetas EA por neutr6fdos.. . . . . . . . .

3.14.- Ensayo de agregacion plaquetaria.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.15 .- Liberacion de ATP por plaquetas.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ....,

3.16.- Liberacion de Tromboxano B2 (m) por plaquetas.. . . . . .

3.17.- Andisis estadistico de 10s datos.. . . . . . . .. . . .. . . . . . . ... .. .. .. ... . . ... .. . . . ..... . . . . .

4.- RESULTADOS 4.1 .- Impacto de las enzimas proteoljticas sobre la actividad del RFcyII en el neutrbfilo

human0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44 4.1.1 .- Efecto de Ias proteasas sobre la expresion de 10s RFcy en el neutroflo.. . . . . . . . . . . .45 4.1.2.- Efiio de las proteasas sobre la capacidad de 10s neutrofdos de unir

eritrocitos sensib%zados con IgG (IgG-Ep) ...........,..... .................................. .. -46 4.1.3.- Efiio de las proteasas sobre la capacidad de 10s neutroflos de mediar

respuestas inducidas por IgG-Ep ..... .. .... . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . .. . . . ... .. . . . .. . . .. . . .. . . . . . . . . . .47 4.1.4.- Efiecto de la neuroaminidasa sobre las respuestas de neutroflos inducidas

por IgG-Ep.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49 4.1.5 .- Efecto de las proteasas sobre la QL mediada por neam3flos inducida por

e e n t e s t ips de CI.. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 1 4.1.6.- Impacto de las proteasas sobre la QL mediada por neutrofilos inducida

por diferentes agonistas.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -55

4.2.- Impacto de la carp eldctrica de anticuerpos y antigenos sobre la capacidad de 10s CI que 10s contienen de inducir respuestas proinflamatorias y tromMticas.. . .. . . . .... . . . . .56

4.2.1 .- Activacion de c&das figociticas inducida por CI preparados con anticuerpos cationizados (CIcat). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57

4.2.1.1 .- Respuestas citotoxicas mediados por ne~ltroflos inducidas por CIcat.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57

4.2.1.2.- Rol del metabolism0 oxidative en la citotoxicidad mediada por neutroflos estimulados por CIcat. ..... . . . . . . .......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59

4.2.1.3.- Rol del citoesqueleto en la citotoxicidad mediada por neutrofilos inducida por CIcat.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 1

4.2.1.4.- Papel de 10s d&rentes RFcy en la citotoxicidad mediada por neutroflos inducida por CIcat.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62

4.2.1 .5 .- Union de CIcat a la superEcie del neutrofdo.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63 4.2.1.6.- citotoxicidad mediada por monocitos inducida por CIcat.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65 4.2.1.7.- Respuesta QL mediada por neutrbfilos y monocitos inducida

por CIcat.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 4.2.1.8.- L i b i o n extracelular de elastasa por neutrofilos esthulados con

CIcat.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68

III

4.2.2.- Activacicin de plaquetas humanas inducida por CI preparados con IgG ................................................................................. humana cationizada.. .69

4.2.2.1 .- Determinacion del tamaflo molecular de 10s CI preparados con ....................................................................... IgG humana cationizada .70

4.2.2.2.- Activation pplaquetmia inducida por CIc y CIcat evaluada en ........................................................... plasma r im en phquetas (PRP). .7 1

4.2.2.3.- Activacion de plaquetas lavdas (PL) o fibadas en geles (PF) por CIc y CIcat.. ................................................................................... -74

4.2.2.4.- Inhibition por polianiones de la agqaci6n plaquetaria inducida ............................................................................................ por CIcat.. -76

4.2.2.5.- Estimulacion de la expresion de P-selectina por CI preparados con IgG cationkada.. ...................................................................... .77

4.2.2.6.- Agregacion p laquha inducida por IgG donizada.. ................... .78 4.2.2.7.-Rol deRFcyIIenlaapgacibnplaqu~inducidapor CIcat ............. 79

4.2.3.- Activacion de neutrofilos hurnanos inducida por CI preparados con k i o n e s anionicas y cationicas de anticuerpos de clase IgG natives.. ............................................................................................................ .80

4.2.4.- Activacion de &lulas hgociticas por CI preparados con antigenos cationizados.. .................................................................................................... .86 4.2.4.1 .- Respuestas mediadas por dulas figociticas estimdadas por CI

................................................ preparados con antigenos cationizados 86 4.2.4.2.- RFcy involucrados en la emisi6n de QL por neutrofilos inducida

por CIcat(Ag). .................................................................................... .88 ................. 4.2.4.3 .- Activation de plaquetas humanas inducida por CIcat(Ag). .89

4.3 .- Qujmiotaxis de neutrofilos humanos inducida por complejos inmunes.. ... 4.3.1 .- Migration de neutnjfilos humanos inducida por la presencia de un

@ate positivo de concentracibn de CI .................................................. 94 4.3.2.- Rol de 10s RFcyII y RFcyJII en la quimiotaxis de neutrofilos inducida

por CI ............................................................................................................. .96 4.3.3.- Quimiotaxis de neutrofilos inducida por la presencia conjunta de FMLP y

5 .- DISCUSION.. .............................................................................

5.1 .- Modulation de la actividad del RFcyII por accion de proteasas.. ........

5.2.- Impacto de la carga elktrica de 10s CI sobre su capacidad de inducir respuestas biologicas mediadas por &Mas fhgociticas y plaquetas humanas. ...................................................................................................

5.2.1 .- Respuestas proinflamatorias mediadas por neutrofilos y monocitos .......... inducidas por CI: Impacto de la carga elkctrica de 10s anticampos IgG 105

5.2.2.- Respuestas tromb6ticas inducidas por CI: Irnpacto de la carp elktrica de 10s anticuerpos IgG.. .................................................................................. .I12

5.2.3 .- Respuestas proinflamatorias mediadas por neutrofilos y monocitos inducidas por CI: Impact0 de la carga eltktrica de 10s antigenos.. .................. . I13

........ 5.3.- Capacidad de 10s CI de inducir per se la quimiotaxis de neutroflos humanos.. 1 16

..... 6.- CONCLUSIONES..

7.- REFERENCIAS.. ............................................................................

8.- PUBLICACIONES PARCIALES DEL TRABAJO REALIZADO Y REUNIDO EN ESTA TESIS ..........................................................

AcM

CCDA

CI

CIan

CIcac

CIcat

CIcat(Ag)

CIP

CIS

EP

GFI

IEF

1s IgG

IgGh

IRO

LES

LT

MPO

OA

PAF

PF

PG

PI

PL

PRP

QL

anticuerpo monoclonal

citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

complejos inmune

complejo inmune preparado con la fiaccion anionica de la IgG nativa

complejo inmune preparado con la fiaccion cationica de la IgG nativa

complejo inmune preparado con anticuerpos IgG cationizados

complejo inrnune preparado con antigenos cationizados

complejo inmune precipitante

complejo inmune soluble

eritrocitos de pollo

ghcosilfosfatidiiositol

isoelectroenfoque

interferon y

inmunoglobulina

inmunoglobulina G

Inmunoglobulina G humana

intermediaries reactivos del oxigeno

lupus eritematoso sisttknico

leucotrieno

rnieloperoxidasa

ovoalbhina

factor activador plaquetario

plaquetas filtradas

prostaglandins

punto isoelktrico

plaquetas lavadas

plasma rico en plaquetas

quimioluminiscencia

RFcy

SAB

SOD

TX

receptor para el fiagmento Fc de la IgG

seroalburnina bovina

superoxido dismutasa

tromboxano

I.- INTRODUCCION

Los seres humanos habitan un ambiente poblado de agentes microbianos

capaces de causar trastornos patologicos y eventualmente provocar su muerte. A fin de

enfi-entar a 10s mismos, 10s vertebrados han desarrollado un sistema inrnunologico

altamente eficiente. Este puede medii dos clases de respuestas: innatas o inespecificas

y adquiridas o especificas, las que hcionando de rnanera coordinada, posibilitan la

elirninacion de 10s agentes infecciosos. Las respuestas especificas son ejecutadas a

traves de dos sistemas genericamente denominados celular y humoral. La inmunidad

celular comprende respuestas mediadas por linfocitos T, mientras que la humoral es

desarrollada por accion de anticuerpos producidos a expensas de la activacion de

linfbcitos B. Arnbos tipos de respuestas son inducidas a consecuencia de la interaccion

entre determinantes antigenicos particulares y receptores de alta especiflcidad,

expresados por clones T y B.

La interaccion de 10s anticuerpos con sus antigenos especificos, conduce a la

formacion de asociaciones macromoleculares denominadas complejos inmunes (CI).

Los misrnos juegan un papel relevante en la etiopatogenesis de numerosas

enfmedades humanas asociadas a la presencia de altos niveles de complejos inmunes

circulantes (CIC) ylo deposit0 tisular de CI, tales como el lupus eritematoso sistemico

(LES), la artritis reumatoidea, ciertas glomenrlonefiitis, vasculitis y una arnplia

variedad de enfermedades de etiologia infiecciosa (1). Debe destacarse, sin embargo, el

papel de 10s CI como herramientas cruciales en la fisiologia de la respuesta inmune,

pues la interaccion de anticuerpos y determinantes antig&icos microbianos, es en

general incapaz de neutraliiar la capacidad infiiciosa ylo patogdnica de 10s

microorganismos. Son entonces 10s CI, 10s que contribuyen criticamente a este

objetivo. Ellos presentan la capacidad, a diferencia de 10s anticuerpos libres, de activar

poderosos mecanismos efectores humorales y celulares hdamentales, no st510 en la

inmunologia antimicrobiana sino tambih en la respuesta inmune antitumoral. Los

mecanismos efectores humorales involucran, principalmente, la activacion del sistema

complemento, iniciada a travds de la interaccion del fiagmento Fc de las IgG e IgM

con el componente Clq (primer componente de la via clasica de activacion) (2,3).

Dicha activacion conduce, no &lo a la lisis de diferentes tipos de microorganismos y

ceulas tumorales, sin0 tambien al reclutamiento local de agentes idamatorios, a

comeamcia de la generacion in situ de potentes factores quimiotacticos y

anafilkticos (2,3). Los mecanismos efectores celulares activados por 10s CI involucran

numerosas respuestas, inducidas como consecuencia de la interaction del fragment0 Fc

de la IgG con sus receptores especificos (RFcy) (4-6). Ellas incluyen la fagocitosis de

&Mas sensibilizadas por anticuerpos, la citotoxicidad celular dependiente de

anticuerpos (CCDA), la liberation de interrnediarios reactivos del oxigeno (IRO), la

secretion de una gran variedad de &mas hidroliticas, la production de citoquinas

como asi tambien la induccion de sefiales inmunomodulatorias capaces de regular la

proliferation linfocitaria y la secretion de anticuerpos (4-6).

Los eventos subsecuentes a la induccion de una respuesta inmune involucran la

accion coordinada y altamente regulada de distintos tipos celulares, a traves de la

activation de receptores expresados en la superiicie de 10s mismos. Estos receptores

incluyen a aquellos clasificados dentro de la superfhilia de las irnunoglobulinas (Ig).

En la misma se agrupan molhlas derivadas de un precursor ghico comun y como

consecuencia evolutivamente relacionadas y estructuralrnente homologas (7). Todos

sus miembros presentan una estructura tridiiensional cormin, caracterizada por la

presencia de a1 menos un dorninio tipo-Ig, hom6logo a 10s dominios C o V de las Igs.

Los mismos contienen residuos wnservados que les permiten asurnir una estructura

terciaria caracteristica, compuesta de un arreglo en &ich de dos hojas R-plegadas

estabiidas por el establecimiento de un puente disulfuro que determina la formacion

de un lazo de 55 a 75 aa (7). Las mol~ulas pertenecientes a la superfbdia de las Igs

juegan un papel critico en el desarrollo de la respuesta inmune. Entre ellas se

encuentran las Igs de superficie de linfocitos B, el receptor antigbico de linfocitos T

(RCT), 10s antigenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y 11, las

mol~ulas CD4, CD8 y CD2, el receptor para PDGF (factor de crecimiento derivado

de plaquetas), las m o l ~ l a s de adhesidn ICAM-1, ICAM-2 y VCAM-1, como asi

tambibn 10s receptores para el fragment0 Fc de las diferentes clases de Igs (RFc) (7):

RFcy para IgG; RFa para IgE; RFca para IgA, RFcp para IgM y RFcG para IgD (8-

16).

En hurnanos, se han descripto hasta el presente tres clases de RFcy: el RFcyI

(CD64), el RFcyII (CD32) y el RFcyIII (CD16) (8-16).

La caracteristica distintiva del RFcyI es la alta avidez por su ligando (K, = 1-3

x 10"'). Constituye el unico RFcy capaz de unir IgG monomkrica (9,lO). No

obstante, su avidez varia fiente a distintas subclases de IgG (IgG 1 > IgG 3 > IgG 4 >>

IgG 2). Se han identificado tres genes altarnente homologos, el RFcyIA, IB y IC, que

codifican a distintas isoformas de este receptor. Los rnismos mapean en el brazo largo

del cromosoma 1. Estos genes responden a una organization estructural comh a

todos 10s genes de RFcy: (1) dos exones diferentes codifican al pbtido leader, el

segundo de 10s cuales codifica el sitio de clivaje para la peptidasa y (2) exones

individuales coacan a cada dorninio tipo-Ig (F'i'gura I ) (9). En el caso del RFcyI, 10s

genes poseen ademas un hico exon que coditica a las regiones transmembrana y

citoplasmhtica. La diferencia entre 10s genes RFcyIA y 10s IBAC esta localizada en el

exon EC3, que codiica al dorninio tipo-Ig m8s cercano a la membrana. En 10s genes

IB y IC, a diferencia del IA, el EC3 codifica codones de termination. El RFcyIA

genera una ghcoproteina de 72 kDa, capaz de unir IgG monomerica. Posee una region

extracelular de 292 aa con tres dorninios tipo-Ig, una region transmembrana de 21 aa y

una cola citoplasmatica de 61 aa. El RFcyIB da origen a dos transcriptos, uno que

codifica al RFcyIbl, que es un receptor soluble, y el otro que origina una forma

transmernbrana, el RFcylb2, carente del tercer dominio tipo-Ig. El RFcyIC codifica

una forma soluble, el RFcyIc (9)pigura 2). Los RFcyI se expresan constitutivamente

en monocitos y macrcifagos; su expresion es inducida por accion del IFNy, en

neutrofilos, dlulas HL-60 y eosin6filos (9,17). En todos 10s t ips celulares analizados

se ha detectado la expresion conjunta de 10s transcriptos RFcyIa y RFcyIb2.

El increment0 en la expresi6n del RFcyI durante infecciones Streptocxjccicas

(18) y durante la proflaxis exitosa con IFNy en pacientes con enfermedad

granulomatosa cronica (9), sugirib que el RFcyI cumple un rol relevante en la

resistencia a infecciones bacterianas. Sin embargo, observaciones realizadas por

Ceuppens y daboradores (1 9,20) en individuos cuyas ceulas fagociticas no expresan

el RFcyI, cuestionaron su importancia biologics. La ausencia del RFcyI no se asocio

con una mayor susceptibilidad a infecciones. Los individuos deficientes en el RFcyI

presentaron a d d s , niveles normales de CIC y respuestas normales de anticuerpos

contra antigenos virales (1 9,20).

El RFcyII se expresa en diversas poblaciones celulares. A diierencia del RFqI,

presenta muy baja avidez por la IgG monomerica (Ka< 10' M' ) (9,10,21-23). La

union de la IgG a este receptor &lo puede ser evidenciada empleando IgG complejada

o polimhica (9,lO). Su especScidad es mayor para las subclases IgGl e IgG3 que

para las IgG2 e IgG4. Los RFcyII constituyen una familia de ghcoproteinas de 40 kDa

que presentan regiones extracelulares sirnilares de 180 aa conteniendo dos dominio

tipo-Ig, una region transmembrana de 27 a 29 aa y dominios citopldticos de

longitudes variables (44 a 76 aa) piguru 2) (9). Se han identificado seis isoformas,

codificadas por un total de tres genes localizados en el brazo largo del cromosoma 1

(RFcyIIA, IIB y IIC) (Figura 11) (5,lO). Las principales diferencias entre las isoformas

yacen en sus regiones intracitoplasdticas, cada una coditicada por tres exones. Este

hecho explica el motivo por el cual 10s anticuerpos monoclodes (AcM) que

reconocen las regiones extracelulares, en general no distinguen entre miembros de la

f d a . Tres transcriptos distintos, RFcyIIbl, b2 y b3, son originados a partir del gen

Ill3 (9). Dos de ellos, bl y b2, son generados por splicing alternativo de 10s exones

citoplasdticos. Un tercero, b3, es generado por splicing alternativo de 10s exones

que codifican a la secuencia seilal. Por adisis de Northern blot se determino que 10s

transcriptos IIB se expresan en monocitos, macrbfagos, linfocitos B y varias lineas

celulares pluripotenciales, per0 no en neutrofilos, dlulas NK y dlulas T. El gen IIB

diiere del IIA d lo en la secuencia se?lal y en parte del dominio citoplasmhtico.

Mientras que las diferencias entre 10s genes IIB y IIC radican en el dominio

citoplhmico, el rasgo que distingue a 10s genes IIA y IIC yace en la secuencia seilal. El

gen IIA da origen a dos transcriptos, RFcyIIal y RFcyIIa2, como resultado de

poliadenilacion alternativa. El gen IIC origina &lo un transcripto, el RFcyIIc (9). Los

genes IIA y IIC se expresan constitutivamente en monocitos, neutr6filos y algunas

Pagina 4

lineas celulares como HI,-60 y K562. No se expresan en linfocitos y celulas NK (9-1 5).

El gen IIA se expresa, a d d s , en plaquetas (25).

La compleja heterogeneidad de 10s RFcyII adquiere An mayor relieve al

considerar la existencia de dos forrnas al6licas del RFcyIIa. Ellas difieren en su

capacidad de inducir la proliferacion de dlulas T activadas por AcM anti-CD3 de clase

IgGl murina; 10s rnonocitos del 70% de 10s dadores Caucasicos normales (altos

respondedores: HR), sustentan eficientemente la respuesta mitogenica, mientras que el

30% restante (bajos respondedores, LR) no lo h a w (26). Sirnilares observaciones han

sido realizadas al analizar diversas respuestas de monocitos inducidas por IgGl murina

(IgGlm) tales como la produccion de TNFa e IL6 y la citotoxicidad contra celulas

blanco sensibilizadas por IgGlm (5). Las diferencias hionales de las dos formas

alelicas del RFcyIIa no solo se expresan en relacion a la IgGlm. Warmerdam y

colaboradores (27), han demostrado que este polimo~smo genktico condiciona las

respuestas a IgG humana. Los fagocitos de individuos homocigotas para el alelo

definido originalmente como RFcyIIaLR, unen e internalizan eritrocitos opsonizados

con IgG2 humana con mayor eficiencia respecto de 10s homocigotas para el alelo

RFcyIIam (27,28). Considerando que la IgG2 cumple un papel prominente no so10 en

las infecciones infecciones a bacterias encapsuladas como Haemophiiius infuenzae y

Streptococcus pneumoniae, sino tarnbitin en la prevencion de sepsis bacterianas (29),

se ha propuesto que 10s individuos con fenotipo RFcyIIam podrian ser mas

susceptibles a infecciones bacterianas (9). Esta hipotesis se halla sustentada en dos

observaciones adicionales: (I) una fiecuencia disminuida de individuos homocigotas

para el alelo RFqIIaLR detectada en un grupo de niiios con infecciones bacterianas

recurrentes y (2) la correlacion existente en la poblaci6n japonesa entre la alta

prevalencia del fenotipo RFcyIIaLR (85%) y la ausencia de infecciones ocasionadas por

H. influeme (30).

El RFcyIII precipita como una banda amplia con pesos moleculares que oscilan

entre 50 y 80 kDa debido a una gluwsilaci6n extensiva. Exhibe baja afinidad por la

IgG monom6rica (Ka 40 ' M') y al igual que el RFcyII, une IgG en forma polimtkica

con mayor eficiencia (9,lO). Dos genes dtamente homologos, el RFcyIIIA y el

RFcyIIIB, codifican a las dos isoformas conocidas, las cuales presentan regiones

extracelulares de 190 aa bajo la forma de dos dominios tipo-Ig (Fzgurm I y 2)(9,10).

El RFcyIIIA codifica a un receptor transmembrana con una cola citopldtica de 25

aa, que es expresado por macrofagos, &Mas NK y algums &Idas T (31,32). El

product0 del gen RFcyIIIB se halla unido a la cara externa de la membrana p l d t i c a

a travb de un enlace glicosilfbsfatidilinositol (GFI). Se expresa constitutivamente en

neutrofilos, siendo inducido en eosin6filos por acci6n del IFNy (9). La diferencia mhs

importante entre 10s productos de arnbos genes, radica en el aa 203. El RFcymB

codifica para una serina en dicha posicibn, lo que detennina el anclaje via GFI;

mientras que una fenilalanina en el RFcyIIIa detemina la preservation de las regiones

transmembrma e intracitoplasmitica (33,34). Debido a1 tip de anclaje, el RFcymb

puede ser liberado de las &lulas por tratamiento con fosfolipasa C especifica de

fosfatidilinositol. Se ha demostrado, ademsls, la existencia de dos formas alelicas del

RFcym", las cuales codifican a 10s aloantigenos NAl y NA2, deiinidos tanto por

serologia como por movilidad electrofor~ca. Los PMN que expresan el alotipo

R F C ~ I I I ~ ~ ~ fagocitan eritrocitos sensibiliios con IgG humana con mayor eficiencia

respecto de 10s que expresan el fenotipo IIIbNN (35). La relevancia fisiologica de esta

observacibn no ha sido aun establecida.

De Haas y colaboradores, por otra parte, han descripto la existencia de

individuos cuyos neutrbfilos no expresan d RFcyIIlb, como consecuencia de una

delecion que abarca parte del gen RFcymB y el gen RFcynC (36). Esta deficiencia no

se asocio con una susceptibilidad incrementada a infecciones bacterianas. La expresion

normal del RFcyIIA en estos individuos, serla suficiente para garantizar la capacidad

microbicida de sus neutrofilos.

El RFcyI y el RFcyIIIa, a1 igual que el RFcsI, son complejos heteroligomericos,

es decir, se hallan asociados a otras proteinas. Las mismas pueden ser dimeros de

cadenas-y, dimeros de cadena < o heterodimeros y<. Arnbos tipos de cadenas, y y c, heron identificados originalmente como componentes del receptor antigknico de 10s

linfocitos T. El RFcyIIIa expresado en dlulas NK (37), se halla asociado a

homodimeros de cadenas < o heterodimeros y 4 , (38-40). Estas subunidades son

esenciales para la expresion del RFcylIIa en la superficie celular, dado que impiden su

degradation en reticulo endoplasmico (41). Por otra parte, parecen curnplir un papel

relevante en 10s mecanismos transduccionales inducidos tanto a traves del RFcyIIIa

como del RFcyI (8,9). Un nivel aun mayor de complejidad es revelado en estudios

realizados en mastocitos, donde se ha descripto la asociaci6n entre la cadena Q del

RFaI y el RFcyIIIa (42).

. .

IA IB IC IIA IIC IIB

Figura 1. Representacibn esquemhtica de los genes que uxlif~can a 10s di&os RFcy humanos. Los exones esth represantados por recthgdos y 10s intrones por lineas dlidas. S: wcueacias seiial; EC: dominies extrace1uIares; TM: dominies transmembrana; C: regih citoplas~ca. Tornado de Immunology Today 14: 21 5, 1993.

Figura 2. Representacih esquemhtica de la familia de RFcy humanos. Tornado de lmmunologv Today 14: 21 5, 1993,

I . 1.3.- Interaccibn de 10s CI -v 10s l3Fc.y: el entrecrtxzamiento ak 10s RFc? como

evento critic0 en la activacion celular

Los CI presentan un avidez hacia 10s RFcy muy superior a la exhibida por la

IgG monomerica. Este hecho result. de la capacidad del antigen0 de actuar como

concentrador espacial de 10s anticuerpos. En el CI, 10s fiagmentos Fc de 10s mismos

son presentados en forrna polim&ica a 10s RFcy expresados sobre la superficie celular,

permitiendo el establecimiento de interacciones multiples entre el CI y sus receptores.

A consecuencia de ellas, no &lo se incrementa la avidez de 10s fiagrnentos Fc por 10s

RFcy, siio que tambihn se induce la agregacibn de 10s mismos. Este ultimo evento

constituye un requerimiento absoluto para la activacion de respuestas celulares a trav6s

de 10s RFcy (8). Ello explica la incapacidad que presentan tanto la IgG monomerica

como 10s CI monovalentes, para inducir la activacion celular (8,25).

La agregacion de 10s RFcy conduce a la concentracion de 10s complejos

ligando-receptor en zonas de alta densidad (patches) sobre la membrana celular

(43,44). La extension de este fenbmeno depende de diferentes variables tales como la

concentracion del ligando en la fase fluida, su valencia y afinidad hacia 10s RFcy y la

densidad de 10s rnismos sobre la superficie celular (45). Este proceso tiende a potenciar

la asociacion entre CI y RFcy, no &lo porque la unibn se torna irreversible, sin0

tambih por las altas concentraciones que 10s CI alcanzan en la superficie celular.

Estudios de inmunofluorescencia realizados en macrofagos han detectado la presencia

de 80 a 250 patches sobre la superficie de cada dlula (45). Cada patch, que cubre un

kea aproximada de 6 pm2 contendria entre 2000 y 12.000 molkulas de anticuerpo y

se encontraria separado de un patch vecino por una distancia promedio de 2,8 pm

(45). Este proceso de acumulaci6n permite que, partiendo de soluciones de CI a una

concentracion de M, la concentracion efectiva de CI en sitios discretos sobre la

superlice del macrofago alcance valores 1.000 veces superiores (46). Procesos

sirnilares de acumulacibn de CI, han sido descriptos en linfocitos (43). La relevancia de

este proceso, tanto en fagocitos como en cdlulas linfoides, es notable, puesto que

permite que pequefias cantidades de CI constituyan estirnulos eficientes para la

induccion de distintas fbnciones a traves de 10s RFcy.

A1 arribar a un foco intlamatorio, 10s fagocitos reconocen al microorganismo

invasor, se adhieren a 8 y lo internalizan (47). La eficiencia de este proceso,

denominado fagocitosis, depende tanto del linaje de la celula fagocitica y su estado de

activacion, como de la presencia sobre la superficie del microorganismo, de molkulas

que puedan ser reconocidas por receptores expresados por 10s fagocitos. Estas

molkulas pueden clasificarse en dos grupos diferentes sebn sean propias a1

microorganismo o se depositen sobre su superficie a consewencia de la interaccion del

agente infeccioso con el sistema inrnune del huesped. Este segundo grupo de

m o l ~ a s , que incluyen a la IgG e IgM y a 10s factores C3b y C3bi, reciben

Pdgina 9

colectivarnente el nombre de opsoninas (47). Ellas facilitan el reconocimiento de 10s

microorganismos por 10s fagocitos, a travbs de su interaction con 10s receptores para

10s componentes C3b y C3bi ( CRl y CR3, respectivamente) y 10s receptores para la

IgG e IgM (RFcy y RFcp, respectivamente). Para la mayoria de las particulas

opsonizadas, las interaeciones C3bi-CR3 y C3b-CR1 promueven la adhesion del agente

invasor al fagocito per0 no su ingestion, mientm que la union IgG-Wcy induce la

adhesion y la internalization (48). Dado que ambos tipos de receptores esth presentes

stdm 10s fqocitos, estas opsoninas a&hn en forma cooperativa, disminuyendo la

cantidad de anticuerpos requerida para inducir la ingestion del microorganismo (49).

En todos 10s casos, la unibn del microorganismo promueve en el fagocito la

polimeniaci6n de actina en la zona subyacente a1 sitio de contacto, lo que conduce a la

extension de pseud6podos que enmeken a la particula dando origen a una vacuola

fagocitica o fagosoma. En forma sirnulthea a estos eventos, 10s lisosomas primaries se

unen al fagosoma naciente dando origen a un fagolisosoma. Dentro del mismo, el

patbgeno es sometido a la accion de dos sistemas citotoxicos de distinta naturaleza

(47), uno dependiente de oxigeno y otro independiente del mismo.

La activation de las celula fagodticas por un estimulo proidamatorio conduce

a la produccion de intermediarios reactivos del oxigeno (IRO) (50). Ellos curnplen un

papel relevante no &lo en la destruction de microorganismos invasores, sino tambib

en la generacion de lesiones tisulares asociadas a manifestaciones autoinmunes. Los

1.0 incluyen radicales oxidantes, halogenos oxidados y el oxigeno singlete. Son

generados por reduccion parcial del oxigeno molecular a traves de un proceso

denominado estaZZid0 respiratorio (50). El mismo se caracteriza por un increment0

abrupt0 en el consumo de oxigeno y la activacibn de la via metabolica denorninada

desviaczon de las hexosus monofosfafo, generadora de potencial de reduccion bajo la

forma de NADPH (50-54).

Todos 10s IRO producidos por 10s fagocitos derivan, en idtima instancia, del

anion superoxido (0; ) (50). La enzima responsable de su generacion es la NADPH

oxidasa, que cataliza la reduccion univalente del oxigeno molecular utilizando NADPH

como dador de electrones, e n la siguiente reaccion:

2 o2 + NADPH U"WHOxidr ~o;+NADP++H+

La enzima NADPH oxidasa, inactiva en condiciones basales, consta de un

componente asociado a la membrana celular, el citocromo b558 y dos componentes

citoplasdticos, p67-phox y p47-phox. El citocromo b5~8 consta de dos subunidades,

una de 22 kDa llamada p22-phox y otra de 9 1 ma, la gp9 1 -phox. Esta dtima presenta

sitios de union para FAD y NADPH. La activaci6n de la NADPH oxidasa involucra la

fosforilacion de p47-phox y su translocaci6r1, junto con p67-phox, a la mernbrana

plasdtica, donde se ensambla con el citocromo bsss y una proteina G monomerica

adicional, denominada Rac (53,54). Las mutaciones en cualquiera de 10s cuatro genes

que codifican a 10s componentes de la NADPH oxidasa dan origen a una patologia

conocida como Enfermedad Granulornatosa Cronica, caracterizada por la incapacidad

de 10s fagocitos para producir O i (55). Ello se asocia a infecciones bacterianas y

micoticas recurrentes, las cuales pueden cawar la muerte del paciente. El defecto miis

fiecuente se rnanifiesta en el gen que d c a para gp91-phox (incidencia relativa:

56%) (56).

El anion superoxido es capaz de reaccionar con un arnplia variedad de sustratos

biologicos. No obstante, el mismo no cumpliria, por si solo, un papel relevante en las

respuestas citotivxicas desarrolladas hacia microorganismos ylo dlulas propias del

hu6sped. Esto estaria dado, kndamentalmente, por dos razones: su escaso potencial

oxidante (57) y la velocidad y eficiencia con la cual dos molkulas de anion superhido

i n t e r a h para formar peroxido de hidrogeno (Hz%) (58). Esta reaccion puede

desarrollarse espontheamente o ser catahada por la enzima superoxido dismutasa

(SOD), se*:

SOD 2 0; + 2 IT-, Hz02 + 0 2

La dismutacion esponthnea ocurre lentamerrte a pH neutro (K=4,5 x lo5 M'

seg-I), pero se acelera a valores de pH acidos semejantes a 10s encontrados dentro del

fagolisosoma (K=8,5 x 10' M' seg-') (59,60). Por su parte, la SOD, presente en

cdlulas eucariotas en dos isoformas, mitocondrial y citoplasdtica, cataliza la reaccion

de dismutacion con una K=1,9 x 10' M' seg-' (61,62). El H202 es un oxidante estable

capaz de ejercer efectos toxicos en distintos sistemas biologicos (63). No obstante,

muchos tipos celulares, entre ellos 10s propios fagocitos y numerosos

microorganismos, suelen contener potentes enzimas que detoxifican el H202, tales

como la catalasa y/o la glutation peroxidasa (64), a travb de las siguientes reacciones:

Hz02 + NADPH Glutatibn m ' d a s a , H20 + NADP+ + H+

Glutatibn ducido

La presencia de tales enzimas, en microorganismos y fagocitos, redunda en una

resistencia marcada a 10s efectos toxicos del H202.

La inhabididad relativa del O i y del Hz02 de actuar per se como agentes

citotoxicos, sugiere que son otras las especies que dan cuenta del potencial citotoxico

de 10s fagocitos. Las mismas pueden ser generadas a expensas de reacciones

posteriores que involucren al O i y a1 Hz%, e incluyen a 10s hipohalitos (XO-) y al

radical hidroxilo (OH) (58).

La produccion de hipohalitos involucra la accion de peroxidasas, las que

pueden ser liberadas al medio extracelular cuando la celda es estirnulada. Ellas

incluyen a la mieloperoxidasa (MPO), que se encuentra tanto en neutrofilos como en

monocitos (constituyendo en 10s neutrofilos el 5% de su peso seco) (58) y a la

peroxidasa de eosimoflos (EPO). Ambas enzimas catalizan la oxidacion de haluros (C1-,

Br- y/o r) por el H202 generando aniones hipohalitos segh la siguiente reaccion:

MPO ~ 2 0 2 + X-Hz0 +ox

donde X = Cl-, Br-, I-.

Mientras que la MPO emplea como sustrato fisiologico el C1-, cuya

concentration plasdtica es mil veces superior respecto de 10s otros haluros, la EPO

emplea Br-, no pudiendo oxidar el C1' (65).

Pdgina 12

Debido a la capacidad oxidante extremadamente alta del hipoclorito, una vez

producido inter& rhpidamente con una variedad de moleculas biologicamente

relevantes, como ser aminas, aminoacidos, tioles, tiokteres, nucleotidos y

hemoproteinas (66). Se calcula que a pH neutro, lo6 neutrofilos generan 2 x moles

de OCP, suficientes para destruir 150 millones de organismos de E. coli en

milisegundos (58,66). Los efectos citotoxicos atribuibles a1 hipoclorito incluyen la

oxidacion ylo decarboxilacion de proteinas de membrana, hecho que conduce al

increment0 de la permeabilidad celular (67), la oxidacion de componentes de la cadena

respiratoria bacteriana (67,68) y la peroxidacion de membranas (69).

El hipoclorito puede reaccionar en forma esponthea con aminas primarias o

secundarias dando origen a otras especies oxidantes conocidas como cloraminas, segh

la siguiente reaction:

R'RNH + HOCl - R'RNCl + H20

Si bien las cloraminas son menos reactivas que el hipoclorito, sus vidas medias

suelen ser mas prolongadas. Algunas de ellas pueden ser recuperadas de sobrenadantes

de neutrofilos luego de 16 horas de ocurrida la activation celular (58).

A pesar de no estar completarnente definido si el hipoclorito o las cloraminas

constituyen el mediador final de 10s efectos toxicos, la evidencia acumulada sugiere

que el hipoclorito, merced a su alta reactividad, ejerce sus efectos tbxicos sobre

b h o s asociados a membrana (58). Este hecho se encuentra sustentado, ademas, por

la naturaleza cationica de la MPO, propiedad que facilita su adherencia a superficies

celulares incrementando la produccion local de hipoclorito (65). Por su parte, las

cloraminas, especialmente aquellas con caracteristicas lipofilicas, difbnden a traves de

la membrana plasmatica atacando componentes citosblicos (58).

Mientras persista la produccion continua de Hz02 por 10s fagocitos (10s

neutroflos humanos son capaces de generar peroxido de hidrogeno durante varias

horas posteriores a su estimulacion -70-), la MPO podra generar HOCl hasta que el

pool de blancos susceptibles se haya agotado, luego de lo cual 10s oxidantes

reaccionarh e inactivarh oxidativamerrte a la propia MPO (66).

A diferencia de lo que ocurre en neutrofilos, monocitos y eosinofilos, 10s

mecanismos microbicidas operativos en macrofagos no incluyen a 10s hipohalitos, dado

que estas celulas presentan muy bajos niveles de MPO (65).

Los fagocitos son capaces de incrementas la potencialidad toxica del O i y el

Hz02 a traves de un mecanismo alternativo, consistente en la produccion de un

oxidante extrernadamente reactivo y destructive, el OH. Este se origina por la

interaction de Oi y Hz02 en una reaccibn catalizada por Fe3+ (reaction de Haber-

Weiss):

Hz02 + 0; OH' + HO'+ O2

No existe consenso en la literatura en relacion a1 papel del OH en 10s

mecanismos citotcixicos mediados por fagocitos. El OH es capaz de reaccionar

rapidamente con una amplia variedad de enlaces quirnicos, causando daiio en regiones

prindmas al sitio de production. Su rol en 10s mecanismos citotoxicos fie sugerido

o r i m e n t e bashdose en el efecto inhibitorio inducido por catalasa, SOD y agentes

secuestradores del OH tales como manitol y benzoato de sodio. Los experimentos

tendientes a deterrninar, en forma directa, la produccion de OH por fagocitos han

arrojado, sin embargo, resultados controvertidos (65). Por otra parte, es necesario

considerar que, en condiciones fisiologicas, la mayor parte del hierro se encuentra

unido a la transferrina o a la lactoferrina, de forma que no es accesible para catalizar la

reaccion de Haber-Weiss (65). No obstante, diversas evidencias sugieren la existencia

de fientes alternativas de hierro para cataliuu la reaction. Entre ellas figuran el hierro

liberado de la transferrina a causa del bajo pH fagolisosomal (71), 10s quelatos de

hierro producidos por acci6n de proteasas bacterianas sobre la transferrina ylo

lactoferrina (72) y 10s sideroforos producidos por patogenos microbianos (73). El

d s i s del papel del OH en 10s mecanismos citotoxicos mediados por 10s fagocitos, se

complica a h miis teniendo en cuenta hallazgos recientes indicando que 10s neutrofilos

pueden generar OH en ausencia de hierro, merced a la accion de la enzima MPO (65),

segiin:

Se ha postulado tambib que 10s fagocitos son capaces de producir una especie

sumamente agresiva denominada oxigeno singlete ('02). El mismo no constituye por

definition un radical libre ya que no presenta electrones desapareados (52). Se han

propuesto diversas reacciones para explicar su producci6n in vivo. De acuerdo a Kahn

(74), la reaccion procederia segitn:

Para Kellogg y Fridovich (75), su produccion involucraria a la reaccion de

Haber-Weiss segrin:

tarnbih podria producirse segitn:

0; + ROOH ~ e ~ + '02 + RO' + HO- - Hasta el presente, la evidencia acumulada no es concluyente en relacion al

papel del 'a en la actividad citotoxica mediada por fagocitos.

1.2.3.- Mecanimos citoloxicos id-wndientes &l oxigeno

Los fagocitos contienen, ademb de su sistema generador de IRO, grhdos

citoplasdticos cargados de agentes antimicrobianos. Los mismos son liberados al

fagolisosorna durante la fagocitosis, o al medio extracelular, en el caso de estimulos

solubles o esthulos particulados no fqocitables. Estos agentes incluyen enzimas

hidroliticas tales como fosfolipasas, glucosidasas, lisozima, proteasas y pdptidod

proteinas capaces de alterar la fisiologia de las dlulas blanco (47).

Pagina 15

Las proteasas de mayor relevancia incluyen a la elastasa, la catepsina G, la

colagenasa y la gelatinasa (5 5,5 7).

La elastasa es una proteasa de serina que se encuentra en altas concentraciones

en 10s grhulos azurofilos de 10s neutrofilos. Es activa sobre una arnplia variedad de

sustratos que incluyen a casi todas las proteinas de la matriz extracelular, proteinas

plasmiticas (Igs, componentes del complemento, factores de coagulacion) y numerosas

proteinas expresadas sobre la superficie de c6lulas intactas (76,77). Ademis de

contribuir a la degradation de 10s rnicroorganismos fagocitados, seria importante para

la locomocion de 10s neutrofilos, dado que al degradar a 10s componentes de la matriz

extracelular facilitaria la penetration de 10s mismos en 10s tejidos. Su relevancia

fisiopatologica ha sido cuestionada debido a que el plasma contiene altas

concentraciones de inhibidores tales como la al-antitripsina, la cL2 -macroglobulina y

el inhibidor de la leucoproteinasa secretoria (65). Sin embargo, se ha demostrado que

estos tres inhibidores pueden ser inactivados por 10s IRO producidos por 10s propios

fagocitos. Ello permitiria a la elastasa mediar su actividad proteolitica (77,78).

Las metdoproteasas incluyen a la colagenasa, que degrada a1 coligeno

intersticial tipo I, II y III y a la gelatinasa, que cliva coligenos tipo V, XI y

posiblemente, tambih al t i p IV (79). Son sintetizadas y liberadas como proenzimas,

es decir, en forrna inactiva. Pese a 10s esfberzos realizados, no se han encontrado a h

enzimas fisiologicas capaces de activarlas. Sin embargo, se ha demostrado que 10s

propios neutrofilos son capaces de inducir su activacibn, a traves de mecanismos de

naturdeza oxidativa, que involucrarian la accion del OCl- ylo las cloraminas (80,81).

Estos hallazgos han sido confirmados en estudios llevados a cabo con neutrofilos

provenientes de pacientes con E n f i i d Granulomatosa Cronica, 10s que se

muestran incapaces de activar a la colagenasa (80).

La catepsina G, constituye en realidad una familia de isozimas cationicas

contenidas en 10s grhulos azurofilos de 10s neutrofilos. Son proteasas de serina que

presentan una especificidad hidrolitica semejante a la quirnotripsina. Su actividad

bactericida seria independiente de la fhcionalidad enzimatica, pues su accion

antimicrobiana persiste luego de ser inactivada por calor (82).

Otras proteinas que forman parte del arsenal destructivo de 10s fagocitos son la

lisozima y la lactoferrina. La lisozima es unit enzima cationica presente en altas

concentraciones en 10s grhulos azurofilos y especificos de 10s neutrofilos y tambien en

rnacrofagos (83). Ejerce sus propiedades bacterioliticas al hidrolizar uniones beta 1-4

glucosidicas de 10s mucopeptidos de la pared celular bacteriana. Es capaz de ejercer

efectos antimicrobianos a travds de mecanismos no enzirnaticos (83). Por su parte, la

lactoferrina media un efecto bacteriostatico al fijar y retener hierro, necesario para el

metabolismo normal bacteriano (83).

Los fagocitos contienen, ademhs, proteinas tales como la BtPI de neutrofilos

(proteins bactericida incrementadora de la permeabilidad) y 10s p6ptidos cationicos 1 y

2 de 10s macrofagos, capaces de permeabi i las membranas bacterianas a traves de

un mecanismo no e d t i c o (84). Presentan tambien defensinas, peptidos

moderadamente cationicos, muy abundantes en 10s grhulos azurofilos de 10s

neutrofilos, que actbn induciendo alteraciones en la integridad de las membranas de

bacterias, hongos y ciertos virus envueltos (83).

1.2.4.- Liberacion de mediadores lipidicos de in flmnaczon

La estimulacion de &Idas fagodticas por CI (86) conduce tambien a la

liberacion de mediadores lipidicos de inflamacion, cuya accibn autbcrina o paracrina

contribuye al desarrollo de la respuesta inflamatoria. Ellos ejercen efectos sobre el

endotelio, el musculo liso, 10s leucocitos y las plaquetas (86). No son acumulados

como mediadores preformados. Son sintetizados de now a expensas de la activacion

del metabolismo fosfolipidico (86).

La interaccion de 10s CI con 10s RFcy induce la liberacion de Acidos grams

insaturados desde 10s fosfolipidos que fonnan parte de la membrana celular (87), por

accion directa de la fosfolipasa A2 o a travk de una accion indirecta mediada por la

fosfolipasa C (88). Entre ellos, el Bcido araquidonico es el miis importante y su

disponibiidad, en estado libre, constituye el factor limitante en la sintesis de

eicosanoides (89). El mismo puede ser metabolizado por la enzima ciclooxigenasa a

prostaglandinas (PG) y tromboxanos (TX) o por la enzima lipoxigenasa, a acidos

hidroperoxidos (HPETEs), kidos hidroxieicosatetraenoicos (HETEs) o leucotrienos

(LT), (52,85,86,90) Figura 3). La preponderancia de cada una de estas vias

metabolicas es variable dependiendo, no solo del tip0 celular sino tambien del estimulo

inductor.

I AC.ARAQUDONIC0

I( x

J I pEEEq -1

' I ' p k q

I\ . ' ~ - H E T E I I - I 1-1 1- Fl wl

En &lulas fagociticas se han identificado dos isoformas de la enzima

lipoxigenasa, la 5-lipoxigenasa y la 15-lipoxigenasa (85). Uno de 10s productos de la 5-

lipoxigenasa, el LTB4, constituiria un mediador endogeno de la activacion leucocitaria

(91). Se ha demostrado que es un potente inductor de la quimiotaxis (92),

quimioquinesis (migration no dirigida) (93), agregacion (94) y liberacion de enzimas

lisosomales (95) por parte de 10s neutr6iilos. El LTB4 estimula tambien el movimiento

celular de eosinofilos, liiocitos y monocitos (86). Se ha demostrado ademis, que

increments la expresion de receptores para C3b en neutrofilos y eosinofilos (95). Otro

product0 de la 5-lipoxigenasa, el 5-HETE, es un debil estirnulador de la actividad

leucocitaria (97), sin embargo, es capaz de potenciar sinergisticarnente las respuestas

de neutrofilos inducidas por PAF y LTB4 (98,99).

La 15-lipoxigenasa, presente en neutrofilos y monocitos (loo), da origen a dos

potentes inhibidorers de la actividad NK (101) conocidos como lipoxinas A y B (LXA

y LXB). La LXA es capaz, tarnbien, de estirnular la degranulacion y el estallido

respiratorio en neutrofilos (100,102).

Por otra parte, en respuesta a una variedad de estimulos especificos, entre ellos

10s CI, numerosos tipos celulares tales como fkgocitos, plaquetas y celulas endoteliales

sintetizan otro poderoso mediador idamatorio conocido como factor de activation

plaquetaria (PAF) (I -0-dquil-2-acetil-m-@wo-3 -fosfocolina) (1 03,104). El PAF

contribuye a la inflarnaci6n causando la degranulacion y agregacion plaquetaria

(103,105,106), estirnulando la adherencia, la agregacion y la degranulacion leucocitaria

(107-log), e incrementando la contraccion del musculo liso y la permeabilidad vascular

(1 10).

La CCDA constituye un mecanismo citotbxico mediado por diferentes

poblaciones efectoras, operativo contra celulas blmco recubiertas por anticuerpos

especificos (111). La destruccibn de las dldas blrmco involucra un proceso no

restrict0 por antigenos de histocompatibilidad, en el cud no participa el sistema

complemento. La especificidad de la CCDA esta confer& por 10s anticuerpos, 10s que

a muy bajas concentraciones (mucho menores que las requeridas para mediar la lisis

por complemento en blancos susceptibles), inducen la citotoxicidad (1 11). Pese a que

10s mecanismos involucrados en la CCDA no han sido elucidados con claridad, en

todos 10s casos, la reaccibn es activada a trav6 de la interaction de 10s fiagmentos Fc

de 10s anticuerpos que recubren la dlula b h o , con 10s RFcy expresados por las

dlulas efectoras. Estas ultimas incluyen no sblo subpoblaciones linfocitarias sino

tambien a 10s leucocitos polimorfonucIeares, monocitos, macrofagos y plaquetas (1 1 1).

A pesar de que hasta el presente no se ha podido determinar en forma concluyente la

relevancia fisiologica de la CCDA, numerosas evidencias indirectas sugieren que la

misma juega un papel importante en la inmunidad antitumoral, antiviral y en el rechazo

a organos transplantados (1 12-1 14).

Los linfocitos killer (linfocitos K) constituyen una subpoblacion linfocitaria,

diferente a 10s linfocitos B y T, capaz de mediar la CCDA con alta eficiencia.

Representan, aproximadamente, el 5% de 10s linfocitos periftkicos humanos y son

capaces, ademas, de mediar una forma distinta de citotoxicidad, la citotoxicidad

natural Killer (NK), efectiva contra diferentes tipos de dlulas blanco no recubiertas

por anticuerpos (1 15). La CCDA mediada por linfocitos K puede ser inducida por

anticuerpos IgG, pertenecientes a cualquiera de las cuatro subclases descriptas en el

hombre. Es efectiva contra una amplia variedad de dlulas blrmco incluyendo celulas

norrnales, tumorales e infectadas por virus como ad tambien contra bacterias, hongos y

parasitos. En contraste con 10s linfocitos K, las otras poblaciones linfocitarias que

expresan RFcy, representadas por el wnjunto de linfocitos B y una subpoblacion de

linfocitos T, no muestran, en general, capacidad para mediar la CCDA (1 11). Ello

indica que la expresion de RFcy por parte de una poblacion celular no le otorga, per se,

capacidad citotoxica.

Los monocitos, macrofagos y leucocitos polimorfonucleares son capaces de

mediar la CCDA, en forma eficiente, contra diferentes tipos de celulas blanco

recubiertas por anticuerpos IgG, en forma similar a lo observado para 10s linfocitos K

(1 11). Su potencialidad citotoxica es regulada por la accion de diferentes citoquinas

ylo productos inflarnatorios. El IFNy activa, en forma notoria, la CCDA mediada por

fagocitos mononucleares y neutrofilos. Este efecto se encuentra asociado a un marcado

incremento tanto en la expresion del RFcyI como en el potencial oxidativo celular

(181). La interleuquina 1 (ILl) y 4 @A) previenen parcialmente el incremento en el

nlimero de RFcyI y en consecuencia, la potenciacion de la CCDA inducida por el IFNy

(1 1 1). Otros mediadores idarnatorios tales como el factor de necrosis tumoral (TNF),

el factor estimulador de la formacion de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-

CSF) y el C5a, potencian la CCDA mediada por fagocitos (1 1 1). Por el contrario, 10s

gluwcorticoides y ciertos agentes capaces de incrementar 10s niveles intracelulares de

AMPc, como la prostaglandins Ez, inhiben la CCDA (1 1 1).

El mecanismo citolitico responsable de la destruccion de la dlulas blanco en la

CCDA no es unico. Dierentes mecanismos parecen operar dependiendo del modelo

experimental. Se ha demostrado que mientras que la CCDA mediada por linfocitos K

involucra procesos no oxidativos, la mediada por monocitos muestra un patron

diferente dependiendo de la &Ida blunco. Aquella ejercida contra eritrocitos es

dependiente de la generacion de IRO, por el contrario, la mediada contra bhcos

linfoblastoides no 10s involucra (1 16). Observaciones sirnilares hen realizadas en

neutrofilos. La CCDA ejercida contra cklulas tumorales ha demostrado ser dependiente

(1 17) e independiente de la produccion de IRO (1 18).

1.3.- Pmel del 10s RFcr en la iniuria n'sular inducida oop CZ

Los CI formados con anticuerpos IgG juegan un papel relevante en diversas

patologias autoinmunes tales como el LES, la artritis reumatoidea, ciertas glomeru-

lonefitis, vasculitis y diferentes enfermedades de naturaleza infecciosa (1 19- 122). El

mecanismo patogenico inducido por 10s CI involucra, en todos 10s casos, el

desencadenamiento de una reaccion inflamatoria de tip0 III (123) pigura 4). La

rnisma involucra tres componentes criticos: 10s CI, el complemento y 10s fagocitos. La

ausencia de cualquiera de estos tres componentes resulta en una marcada atenuacion

de la respuesta inflamatoria. Las cepas de ratones neutropenicos o deficientes de

complemento presentan una reaccion de Arthus (utilizada como modelo de reaccion

inflamatoria de tipo 111) sigmficativamente disminuida (8). A partir de observaciones

realizadas in vitro (124), se propuso un modelo que explica la induction de esta

reaccion idamatoria. El rnismo adjudica un papel fundamental al complemento, tanto

en la fase inicial como en la fase de amplification de la respuesta inflamatoria. Segtin

este modelo, 10s componentes C3a y C5a, generados a consecuencia de la activation

del sisterna complemento por 10s CI, provocan la degranulacion de rnastocitos con la

consecuente liberacion de aminas vasoactivas que incrementan la permeabilidad

vascular. La actividad quirniotactica del CSa, contribuye a d d , al influjo de celulas

fagociticas a1 sitio donde 10s CI se hallan depositados (8). Alli, 10s fagocitos son

activados, tanto por la accion de factores derivados del complemento como por la

interaccion directa de 10s CI con 10s RFcy, producidndose la liberacion de potentes

mediadores idarnatorios. De acuerdo a este modelo, 10s RFcy no estarian

involucrados en la iniciacion del proceso inflamatorio, es decir, en la intiltracion

fagocitica (8).

Este modelo fbe reexaminado empleando ratones que no expresan el RFcyI, el

RFcyIII ni el FcERI (receptor de alta &dad para la IgE), debido a un defect0

genetic0 que les impide sintetizar la cadena y (125). A1 intentar reproducir la reaccion

de Arthus, se observo que el deposit0 tisular de CI no indujo una reaccion inflamatoria

sigmficativa. Tanto el edema como la hemorragia y la Mtracion de neutroflos heron

minimos comparados con lo observado en ratones controles o deficientes &lo de

FcERI (126). La ausencia de neutroflos es particularmente relevante. Sugiere que 10s

RFcy juegan un papel critic0 en la fase inicial de la cascada inf$mgoria, es decir, en el

reclutamiento (quirniotaxis) de 10s fagocitos (8,126). ~xperienkias complementarias,

desarroladas en ratones deficientes de mastocitos, sugieren que la activation de sus

RFcy es responsable, a1 menos en parte, de la infItraci6n idlamatoria (127). La posible

participation de 10s RFcy expresados por otros t ips celulares, en la iniciacion de 10s

procesos idamatorios, no ha sido a h dehida.

Compltjos inmuncs

C

~ h i m i o ~ i s & ~ j i l w

RECLUTMIIENTO

+

.- .-.: . : - ....,.. :...... ' .'..I.. .. ACTIVACION -1.: ..-. '.. .:: ...'.'.' ;,-- - 4 . . . . . . .. ' ... . '1

A n u ~ u vasweliws CWnprejvs i n m ~ Enz L i s u s d e s

EDEM4 UEMORR4GU D M O TISULMl

Figura 4. Modelos de iniciaciin de la reaccih idamatoria de tipo III. La fixha llem corresponde a1 modelo clasico. Las flechas vacias indican el modelo propuesto

por Ravetch (8), que involucraria la participacih de rnastocitos.

Pcigina 22

A diferencia de 10s linfocitos B y las plaquetas, que presentan un solo tipo de

RFcy (el RFcyII), 10s monocitos, macrbfhgos y leucocitos polimorfonucleares

presentan, tal como se ha mencionado previamente, diferentes tipos de RFcy (8- 10,25).

Los fagocitos mononucleares expresan el RFcyI, el RFcyII y el RFcyIII. Los

neutrofilos, expresan el RFcyII y el RFcyIII y luego de su estimulacion con IFNy o

GM-CSF, adquieren la capacidad de expresar el RFcyi. Numerosos trabajos han

analizado la contribucion de cada uno de 10s RFcy a las respuestas biologicas mediadas

por fagocitos. Sin embargo, tanto la coexistencia de distintos RFcy sobre un mismos

tip0 celular, como la heterogeneidad de 10s ligandos capaces de ser reconocidos por

cada uno de ellos, han constituido un o b s ~ d o importante a fin de deterrninar el papel

de 10s distintos RFcy en las respuestas indueidas por diferentes tipos de CI.

A diferencia de otros modelos ligando-receptor, pertenecientes tanto al sistema

inmune como a 10s sistemas nervioso y endkino, 10s ligandos naturales de 10s RFcy

presentan un alto grado de heterogeneidad (1 19). La rnisma esta dada por diferencias,

no d lo en las subclases de IgG que integran el CI, sino tambib por variaciones en la

&dad de 10s anticuerpos, la naturaleza del antigeno (soluble o particulado), la

densidad de epitopes antignicos y la relacion molar antigeno/anticuerpo. Estas

caracteristicas condicionan, no &lo las hciones que un CI es capaz de activar, sino

tarnbien eVlos tipos de RFcy involucrados en su induccion (1 19).

Estudios desarrollados por Zhang y colaboradores (128), empleando CI

preparados con diferentes subclases de IgG, mostraron que aquellos formados con

161, IgG2 e IgG4, per0 no con IgG3, eran capaces de inducir la activation del

estallido respiratorio de neutrofilos. Por el contrario, 10s CI preparados con IgG3

heron 10s que presentaron mayor capacidad para estimular la liberation de enzirnas

lisosomales. La capacidad de inducir el estallido respiratorio de 10s CI preparados con

161 , IgG2 e IgG4, h e dependiente de la relacion molar antigenolanticuerpo.

Aquellos preparados en exceso de anticuerpo mostraron mayor actividad respecto de

10s preparados en equivalencia. Los formados en exceso de antigeno, f'beron 10s que

presentaron menor actividad relativa. Los mismos autores demostraron, por ultimo,

que la densidad de epitopes expresados por el antigen0 condiciona, criticamente, la

capacidad de 10s CI de inducir tanto el estallido respiratorio como la degranulacion de

10s neutrofilos (128).

Estudios desarrollados por Crockett-Torabi y Fantone (129) en neutrofilos, han

demostrado que 10s CI precipitantes inducen la producccion de 0; a traves del

RFcyIII, mientras que 10s CI solubles lo hacen involucrando tanto al RFcyII como al

RFcyIII. Estos resultados ponen de manXesto, no &lo que las caracteristicas del CI

condiciona el tip0 de RFcy involucrado en la activacion celular, sino tambien la

capacidad de diferentes RFcy de mediar una misma respuesta biologics. Son

nurnerosos 10s trabajos que han ilustrado este aspecto. Tanto el RFcyII como el

RFcyIII muestran capacidad de mediar la activacion del estallido respiratorio y la

liberation de enzimas lisosornales por neutrofilos humanos (5,11,130). I-Iallazgos

sirnilares se realizaron al analiutr otras respuestas fbcionales como la fagocitosis de

dlulas sensibilizadas por anticuerpos (131) o la CCDA mediada por monocitos y

neutrofilos contra lineas celulares de hibridoma expresando en su supeficie AcM

especificos para cada uno de 10s RFcy (132). Tanto el RFcyI, como el RFcyII y el

RFcyIIIa k o n capaces de mediar la lisis de las celulas blanco.

Estudios realizados en nuestro laboratorio empleando fagocitos, han

demostrado que la forma particular en la que un CI presenta 10s anticuerpos a 10s

RFcy, condiciona la naturaleza de las respuestas citotoxicas que ellos inducen.

Trabajos desarrollados en 10s afios 198611988 demostraron que la estirnulacion de

&1ulas fagociticas por CI, conduce a la destruction de dlulas blanco no s e n s i b i i

por anticuerpos (citotoxicidad inespecifica-CIN) (133-136). A diferencia de la CCDA,

donde el anticuerpo IgG inductor se encuentra recubriendo a la celula blanco, en la

CIN, 10s anticuerpos IgG no i n t e r a h con ella (Figura 5). Ambos mecanismos

citotoxicos diieron marcadamente en 10s siguientes aspectos: (I) 10s mecanismos

efectores citoliticos, (2) la naturaleza de las vias transduccionales involucradas en su

induccion, (3) su susceptibilidad a ser modulados por accion del IFNy y (4) 10s tipos de

RFcy que participan en su induccion. Estas diferencias no pudieron ser atribuidas a

propiedades particulares de 10s anticuerpos IgG, dado que todas las subclases de IgG

humana heron capaces de inducir ambos mecanismos citot6xicos (137). Mhs aim,

tanto la CCDA como la CIN pudieron ser inducidas por un mismo anticuerpo

monoclonal de origen murino. La primera, a1 presentarse el anticuerpo sobre la

superficie de 10s eritrocitos empleados como blancos de la reaction. La segunda, a1

presentarse d anticuerpo bajo la forma de CI precipitante.

- . . I

Fagociro + Complejos inmunrs + Ceklas blanco Lists de la ckl. blanco '

Fagociro + Cdhrla blanco sensibilizada ,-- Lisis de la ckl. blanco

Figura 5. Representacih e s q u d c a de la CIN y la CCDA

La identificacion de aquellos btores capaces de condicionar la actividad de 10s

CI, constituye un requerimiento indispensable a fin de comprender, no d l0 la

etiopatogenesis de nwnerosas enfbmedades autoinmunes, sino tambien 10s

mecanismos a traves de 10s cuales 10s anticuerpos participan en la inmunidad

antimicrobiana y antiturnoral. La presente Tesis, intenta contribuir a este objetivo

mediante el desarrollo de dos lineas de invezFtigaci6n. La primera, referida al efecto de

ciertas proteasas sobre la h c i o d d a d de 10s RFcy expresados por el neutrofilo

hurnano. La w d a , c o n d e n t e al impact0 de la carga elktrica de 10s CI sobre su

capacidad de inducir respuestas inflamatorias ylo trombcjticas a traves de 10s RFcy

errpresados en fagocitos y plaquetas. Se desarrolla, a d d , una tercera linea de

investigaci611 que analiza la capacidad de 10s CI de actuar, per se, como esthulos

quimiotBcticos, a traves de la activaci6n de 10s RFcy expresados por el neutr6filo.

La presente Tesis involucra dos objetivos relacionados. El primer0 de ellos

concierne a1 d s i s de 10s Wores capaces de condicionar la actividad biologics de 10s CI.

Con este fh se han desarrollado dos lineas de investigation que han centrado su atencion en

(I) el efecto ejercido por ciertas enzimas proteoliticas sobre la hcionalidad de 10s RFcy

expresados por neutrof3os hurnanos y (2) el impact0 de la carga e l f i ca de anticuerpos y

antigenos sobre la capacidad de 10s CI que ellos integran, de inducir requestas

in8.amatorias y trombbticas mediadas por dulas fhgociticas y plaquetas, respectivamente.

El segundo objetivo contempla el &s de la capacidad de 10s CI de inducir, per se,

respuestas quimiothticas mediadas por neutroflos humanos.

3.- UA TERIALES Y METODOS

Las c4lulas mononucleares @kicas humanas (CMPH) y 10s leucocitos

polimorfo~mcleares (PMN) f k o n pwificados mediante el empleo de una solucion de

Ficoll-Hypaque preparada segh el m&odo descripto por Boyurn (138). A 2,4 volbenes

de Ficoll 400 ( P w Uppsala, Suecia) a1 9% en agua ddada , se le agrego un

v o b e n de Hypaque al 34% (Gobby-Novag, Argentina), siendo la densidad final de la

soluci6n a 4°C de 1,077 fl.

Solucion de Dextrhn (266 kD) al 6% en solucion fisiologica (Sigma, St. Louis,

USA).

La solucion fbe preparada con NaCl 0,138M, KC1 0,027M, Na2HP04 0,078M y

IMP04 O,O15M, pH=7,4.

En algunos ensayos, las c4h.h k o n resuspendidas en PBS suplernentado con

0,1% de seroahhina bovina (SAB), CaCb 1mM y MgC12 1mM (j?BSsup). En 10s

ensayos de quimiotaxis, se empleb PBS suplementado sblo con 0,1% de SAB.

3.1.4.- Softicidn & Hank 's

En 10s ensayos de quimioluminiscencia, las c41ulas k o n resuspendidas en

soluci6n de Hank's sin MgC12 y sin rojo fen01 (Sigma, St. Louis, MO).

Pagina 27

Las plaquetas &on resuspendidas en solucion Tyrode conteniendo NaCl 0.13%

KC1 0.002flM, NaHCa 0.01 19M, NaHzpO,, 0.0042M, MgC12 0.001M, CaClz 0.001M ,

glucosa 0.1% y SAB 3.5%, en agua destilada, pH=7,4.

La solucion fbe preparada con Tris 0.015M, NaCl 0.145M, EDTA 0.002M,

glucosa 0.1% y SAB 0.005%, pH=6.5.

Se emplei, medio de cultivo RPMI 1640 (GIBCO Lab., Grand Island, USA),

suplementado con suero fetal bovino (SFB) inacthado por dentamiento a 56°C durante

30 minutos (GIBCO Lab., Grand Island, USA) y gentamicina (5Opglml).

Se preparo una solucion con violeta de genciana (lOOrng), Gdo acdico glacial

(3 1,25ml) y agua destilada (c.s.P. 500ml). Para el recuento de dlulas se realizi, una dilucion

1 :20 en esta solucion y se procedi6 a1 conteo en c h a m de Neubauer.

La rnisrna se prepan5 a partir de dos soluciones madres con el siguiente contenido:

solucion 4 a d tripin: 0,14%; solucion B, cloruro de sodio: 4,25%. La solucion de trabajo

se obtuvo mezclando 4 partes de A y una parte de B. Para la determimion de la viabilidad

celular las mestnu h o n ce&Xqph, el sobredante descartado y el residuo celular

incubado con la solucion de azul triph por 3 minutos a temper- ambiente. Luego, se

procedi6 a1 recuento diferencial de las c&hs que excluian el colorante ( dlulas viables ) y

de aquellas que lo incluian (dlulas nnrertas).

El porcentaje de neutrofdos presente en las suspensiones de granulocitos7 se

determino a travh del recuento diferencial en extendidos coloreados con May-Grunwald-

Giemsa. En 10s experimentos de quimiotaxis, 10s neutroflos heron teiiidos con la

coloration comercia1 Diff-Quick (Dade Diagnostics, Inc., Aguada, PR).

Los porcentajes de linfocitos, monocitos y PMN presentes en las suspensiones

celulares, heron determinados empleando 10s colorantes e s ~ c o s para 4 0 1 AS-D

cloroacetato estearasa (CAE) y a-d-acetat0 estearasa (ANAE), que permiten la

camterizacion de las distintas poblaciones leucocitarias (139). Para ello se fijaron

extendidos celulares con una solucion tamponada compuesta de citrato, acetona y metanol,

durante 2 minutos a temperatura ambiente. Luego7 heron lavados con agua d d a d a e

incubados con a-rmilil-acetato o con 4 0 1 AS-D cloroacetato (Sigma, St. Louis, USA) en

presencia de una sal estable de h n i o (Fast Blue RR y Fast Corinth V, respectivamente)

(Sigma, St. Louis, USA). Posteriomente, k o n lavados, d o s y -0s

rnicrosci,piamente. La actividad de ANAE7 que caracteriza a la poblacion de monocitos,

se evidencio por la presencia de gr6nulos citoplasmhticos negros, mientras que la actividad

de CAE, camteristica de la serie granuldca, se determini, por la presencia de

granulaciones rojas.

3.2.- Obtencibn & leucmitm & m g r e -oen@rica lrumam

Las CMPH i k o n obtenidas a partir de sangre de dadores normales (Secci6n

Hemoterapia-IEEMA-Academia Nacional de Medicina) recogida sobre hepiaim o sobre

citrato de sodio. La sangre fbe diluida a1 medio con solucion fifisiol6gica y sembrada sobre

una solucion de Fid-Hypaque f o d o un sistema bifbico que fbe centrifUgado a 500 x

g durante 30 minutos a 4OC (138). La interfbe oonteniendo las CMPH fie lavada 3 veces

con medio de cultivo. Las &lulas heron contadas y luego de deterrninada la viabilidad,

k o n resuspendidas en el medio adecuado s q h el experiment0 a desarrol1a.r. En todos

10s casos, la viabilidad h e superior al 98% y el grado de contamitmion con PMN h e

menor al5%.

Las CMPH heron cosechadas segh el pr-ento descripto previamente

(3.2.1) y resuspendidas en medio de cultivo suplementado con 5% de SFB a una

concentracion de 2,5 x 107/ml. Posteriormente heron incubadas durante 2 horas a 37"C, en

placas de Petri (pretratadas con medio de cultivo suplementado con 5% de SFB) bajo una

atmosf'era constituida por 5% de C02 y 95% de aire hhedo. Las dlulas no aherentes,

recuperadas mediate lavado con medio de cultivo, contuvieron m b de 95% de linfwitos.

En 10s experirnentos que requirieron monocitos en suspension, se siguio el

procedimiento descripto en 3.2.2. hego de retirados 10s linfocitos, las dlulas adherentes

heron removidas con un rubber policeman y resuspendidas a la concentracion deseada.

Las suspensiones contuvieron 90-95% de monocitos.

En 10s ensayos de citotoxicidad se emplearon monocitos adheridos a policubetas de

pliistico de % pozos, prdratadar con medio & cultivo suplementado con 10% de SFB.

Para ello, alicuotas de 0,15 ml de una suspension de CMPH (5 x lo6 dVrnl) heron

incubadas durante 2 horas a 37°C bajo una at&& de 5% de C@ y 95% de aire

hhedo. Las dulas no adherentes heron luego removidas por lavados sucesivos con

medio de cultivo. Las dlulas adheridas contwieron m&s de 90% de monocitos.

El sediment0 de eritrocitos y granulocitos obtenido segcin 3.2.1 fie dihrido al medio

con solucion fisiologica. Luego se agrego d m al 6%, en una proporcicin de tres

vohhenes de supension celular a un vohhen & dextrh d6%. Se dejo &entar 30

minutos a temperatura ambiente, se retir6 el sobrenadante rim en granulocitos y se lavo

con solucion fisiologica. Los eritrocitos contambmtes k o n eliminados por shock

osmotico con agua destilada durante 30 segundos a 4°C y restitution inmediata de la

isotonicidad. Las preparaciones contuvieron mis de 95% de granulocitos, de 10s cuales el

95-98% heron neutroflos.

Los neutroflos a ser empleados en 10s ensayos de quimiotaxiq &on pdcados a

trav6 de un esquerna similar, realizado a 4OC, con el objeto de minimizar la activation

celular.

Las plaquetas k o n obtenidas a partir de sangre citratada de dadores normales

(Seccion Hernoterapia---Academia Nacional de Medicina) quienes no habian

tomado ninguna medication desde al menos 10s 10 dias previos a la extraaion de la

muestra. El plasma rico en plaquetas (PRP) fie recogido luego de la centrifugation de la

sangre a 180 x g por 10 minutos. Luego de la remocion del PRP, el plasma pobre en

plaquetas (PPP) se obtuvo por cmtrifbgacion de la sangre rernanente a 1500 x g durante 20

minutos. El PRP fbe ajustado a la c o n d o n deseada por adicion de PPP autologo.

El PRP h e centrifugado 15 minutos a 1500 x g en presencia de WTA 5mM y el

sediment0 rim en plaquetas h e lavado dos veces (1500 x g por 15 minutos) con Tris-

EDTA Finalmente las plaquetas lavadas (PL) k o n resuspendidas a la concentration

deseada en solucion Tyrode.

Las plaquetas fltradas (PF) b o n preparadas a partir del PRP por fih-acion en

Sepharosa 2B (Pharmacia, Uppsala , Suecia) en presencia de PgEl ( l m , siguiendo un

protocolo d d p t o previamente (140). Luego de la f%racion, la c o d o n h e ajustada

a 3 x 10~lml con solucion Tirode.

El antisuero se obtuvo por inmunizacion de conejos con IgG humana (IgGh)

purificada cromatogr~camente (Sigma, St. Louis, USA). El esquema de inmunizacion

consistio en una prirnera inoculation ndxutha de IgGh emulsionada en adyuvante de

Freund completo y dos inoculaciones subcutheas de IgGh emulsionadas con adyuvante de

Freund incompleto, 10 y 30 dias despuds de la primera inoculation. Cuarenta dias despuQ

de la primera inoculacibn, el conejo h e sangrado y la IgG h e obtenida por precipitacion

del suero inactivado con sulfato de arnonio a1 50%, cromatogda en DE-52 celulosa

(Whatman Paper Co). Posteriomente, la IgG de conejo h e pasada a travds de una

columna de aihidad de IgGh polimerhda con m d e h i d o , prep& seghn el m&do

descripto por Avrameas y Ternynck (141). La IgG & conejo anti-IgGh (IgGc anti-IgGh)

h e eluida de la colurnna con solucion tamponada de glicinaclorhidrico 0,lM pH=2,8 y

diabada coma PBS.

La ovoalbhha (Cappel Lab., Detroit, Michigan) y la SAB (Sigma, St. Louis,

USA) pudcadas cromato@camente, fieron pasadas a travQ de una columna de

Sephadex G-150 (Plmmam, Uppsala, Suecia) para remover agregados de alto peso

molecular, previo a la i n m m o n . Los antisueros fberon obtenidos siguiendo el rnisrno

esquema de inmunizacion empleado en 3.3.1 y las IgG de conejo anti-OA (IgGc anti-OA) y

anti-SAB (IgGc anti-SAB) k o n pudcadas por cromatografia de &dad seghn 3.3.1.

3.3.3.- Obtencion de suero anti-eritrmitos cbe -&lo

El antisuero h e obtenido mediante inmurimion endovenosa de conejos con lml

de taqxmsi6n de eritrocitos de pollo (Ep) a1 100/o en solucion fisiologica, dos veces a la

semana por el t h i n 0 de un mes. A 10s 45 dias de la primera in-on, se procedio a1

sangrado, separation del sumo e inactieon del misrno por calentamiento. El suero fke

alicuotado y conservado a -20°C hasta el momento & su uso.

Se emplearon IgGh, SAB y OA purificadas cromato~camente (Sigma, St.

Louis, USA). Con el objeto de eliminar contambntes, la IgGh fke adsorbida a una

columna de proteina G acoplada a Sepharosa y luego de eluida, dializada contra PBS.

Se cationizaron 10s siguientes anticuerpos y antigems: IgGc anti-IgGh, IgGc anti-

SAB, IgGh, OA y SAB. La cationizacion fke realizada siguiendo el m&odo descripto por

Gauthier y colaboradores (142) empleando etilendiiamina (EDA) ( S i St. Louis, USA)

como nuclbflo para reernplazar grupos carboxilicos de aminoicidos y 14-3-(3- . .

~ p r o p i l ~ d a (CDI) (Sigma, St. Louis, USA) como activador de la

reaccion Las distintas prddnas fkron dializadas contra solucibn tamponada de acetato

0,lM pH=4,75 previo a la r d 6 n . La mima h e realizada agqando 0,Sg de EDA a

lOml de solucion conteniendo 4 mg de antigem o dcuerpo. Tras ajustar el pH a 4,75, se

agrego 0,3g de CDI. La r d o n h e 11evada a cabo en bail0 de hielo con agitaci6n durante

20 minutos. Finalizada la misma, 10s rectivos en exceso heron removidos por didisis

exbaustva contra PBS (pH=7,4) en Camara fik. Las antigems y anticuerpos controles

*on sometidos at mismo proceso, con excepci6n del agregado de EDA y 0 1 . Los

puntos isoelficos @I) de las proteinas cationkadas y controles h o n deteiminados por

thnicas h a b i i e s de isoelectrenfque (IEE), por compkon con el PI de proteinas

p o n e s @1=3- 10) conidas sidtheamente (Phamada, Uppsala, Suecia). El rango de PI

para 10s anticuerpos nativos de conejo y para la IgGh no tratada correspondio a 5,8-82.

Los pl heron mayores a 9,l para 10s antiwerpos de conejo cationizados y estuvieron enrtre

8 y 9.5 para la IgGh, OA y SAB caiionizadas.

Las h i o n e s anioniw y cationicas de IgGh normal (Sigma, St. Louis, USA), de

IgGc anti-SAB y de IgG de conejo antieritrocitos de pollo (IgGc anti-Ep) (Sigma, St.

Louis, USA) k o n aisladas por cromatoenhcado empleando Polybuffkr 96 y Polybuffer

exchanger PBE 94 (pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia). Las siguientes

fhmiones k o n aisladas y sus pl co-0s por IEE: IgGfi. 6,06,4 y 7,6-8,5; IgGc

anti-SAB: 5,9-6,2 y 7,s-7,8 e IgGc anti-Ep 6,3-6,5 y 7,8-8,O.

Los CI heron preparados en base a curvas de precipitation cuantitativa empleando 12s antigenos o anticuerpos marcados radioactivamente con I @Tew England Nuclear,

Boston, MA). La iodinacion de proteinas h e realizada siguiendo un protocolo descripto

previamente (143), alcanzhdose un nivel de marcacion de 10 a 40 pCi de lZl/mg de

proteins. Los puntos de equivalencia W o n deihidos como las wncentraciones a las cuales

la marca en el precipitado hera mkba. En todos 10s casos, previo a la preparacion de 10s

CI, 10s antigenos y 10s anticuerpos k o n centrifUgados a 50.000 x g durante 1 hora a 4°C

para remover agregados de alto peso molecular.

3.3.7. I.- CIpre_par& con m t i c u e m o antfern cafrcafrmid

Los CI controles k o n preparados empleando IgGh e IgGc anti-IgGh, OA e IgGc

anti-OA, o SAB e IgGc anti-SAB. Los CI cationizados f k o n preparados empleando

antigenos o anticuerpos cationizados. En todos 10s casos 10s CI k o n formados en 5 veces

exceso de antigeno, incubando antigenos y anticuerpos durante 1 hora a 37°C y 18 horas a

4°C. Luego, 10s CI i k o n wddbgados a 5000 x g por 10 minutos, el precipitado

descartado y el sobrenadante empleado como CI solubles. De acuerdo a lo reportado

previamente por Gauthier y colaboradores (142), se observo que la cationizacion de

antigenos y anticuerpos modifid su reacthiidad Para CI preparados con IgGh e IgGc anti-

IgGh no tratadas, el punto de equivalencia comespondio a una rehion de 120 pg I g W

mg IgGc anti-IgGh. Para aquellos preparados con proteinas cationuadas, 10s puntos de

equivalencia k o n : 80 pg de IgGh no tratada/ mg de anticuerpo cationizado y 240 pg de

I@ c a t i o W mg de anticuerpo no tratado. Mod5Caciones d a r e s en la reactividad

se observaron en 10s otros sistemas antig~lanticuerpo.

Los CIp heron preparados en la zona de equivalencia, mediante incubacion del

antigen0 (IgGh) y el anticuerpo (I@ anti-IgGh), durante 1 hora a 37°C y 18 horas a 4°C.

Los CIp asi forrnados heron lavados 3 veces con PBS y resuspendidos a una

concentmion de lmg/ml.

3.3.7.3.- CI solubles-metm& con h fiacciones anianim v mtidnim & la I& -

Se prepararon CI con: (a) IgGc anti-IgGh y las fhaiones anionica o cationica de la

IgGh (ver 3.3.6) y (b) las hcciones anionica o cationica de 10s anticuerpos IgGc anti-SAB

y SAB (ver 3.3.6). Los CI -on formados en 2, 5, 10 ylo 25 veces exceso de antigeno,

incubando antigenos y anticuerpos por 30 mktos a 37°C y 1 hora a 4°C. Luego k o n

-0s 10 minutos a 10.000 x g y 10s sobrenadantes empleados como CI solubles.

Los CI que incluyeron IgG de las fkciones anionic8 y cationica heron llamados anionicos

(CIan) y catibnicos (CIcac), respedvamente. No se observaron diferencias en 10s puntos

de equivalencia correspondientes a 10s CIan y CIm.

3.3.7.4.- Pre_pwacion de CI -lMTnlMTncum con lar _fitacciones micinica -Y Canoniica de la

I* anti-&

Los CI particulados k o n preparados empleando Ep y titulos equivalentes de

fiacciones anionica y cationica de anticueps IgG anti-Ep. Los mismos k o n

determinados en hc i6n de su capacidad de aglutmr Ep.

La IgGh (Smglml), previamente liberada de c o m e s por adsorcion a proteina

G acoplada a Sepharosa, h e incubada durante 12 minutos a 63°C. Posteriormente se

cmtdigo a 10.000 x g por 5 minutos, dewutandose el precipitado. El sobrenadante,

ajustado a la c o n d o n deseada, h e empleado como IgGh agregada.

El estado monom&ico de la IgGh no tratada y de la cationhda, como asi tambith

el peso molecular de 10s CI, heron determinados empleando IgGh marcada con 1251, por

ultracentd5gacion en un gradiente continuo (100?0-30%) de sacarosa en solucion tamp6n

borato salina, conida 18 horas a 4OC a 40.000 rpm en un rotor SW4lTi, utilizando una

umtrihga Beckman L2-65B (Beckman Instruments, Irvjne, CA) (142). Las muestras

k o n colectadas y su r a d i d d a d detectada en un contador gamma (Beckman

Instruments, Inc., Pa10 Alto, California).

El estado monom&ico de la IgG h e determinado tambih por flltracion molecular

(Sephacryl S-200; Pharmacia, Upsala, Suecia). En concordancia con reportes previos se

observo que las proteinas cationizadas interactwon con la ma& del gel (144), por lo cual

fie necesario ernplear NaCl2M como eluyente para superar la hterac&on.

Se utilizaron 10s siguientes antiamps monoclonales (AcM), obtenidos de

Medarex Inc. (West Lebanon, NH): 32.2 (IgGl) y 197 (IgG2a), dirigidos contra el RFcyI

hurnano; IV.3 (IgG2b) y su fiagmento Fab, que reconocen a1 RFcyII human0 y 3G8 (IgG1)

y su F(ab')-L, que reconocen a1 RFcyIII humano.

Se emplearon eritrocitos de pollo (Ep) como dulas blanco. Los rnisrnos heron

obtenidos por puncion venosa con una jeringa humedecida con heparina (Abbot Lab.,

Argentina).

3.5.2.- Mmcmibn de cklular blrmco con cramto de d o radiolactivo

Se incubaron 20 pl de sangre heparinizada obtenida segh 5.1, con 50-100 pCi de 5 1 Cr (New England Nuclear), durante 1 hora a 37"C, con agitation intermitente.

Posteriormente, las dlulas k o n lavadas 7 veces con medio de cultivo y resuspendidas a

la concentracon deseada.

Los Ep &on sensi-os con concentmiones subaglutinantes de antiwerpos

anti-Ep, incubando volimeenes iguales de una suspensi6n de ["c~]-E~ al 0,5% y una

dilucion de anticuerpos anti-Ep, obtenida segh lo detallado en 3.3.3.

3.5.4.- Reaccdn de CCDA

El ensayo h e realizado segh lo descripto previamente (145). Se incubaron 2 x 10' 5 51 neutrofilos (&Idas efectoras) con 2 x 10 [ Crl-Ep sens iWos (&Mas b h o ) , en

placas de % pozos, a 37°C bajo una atmodera conteniendo 5% de COz y 95% de aire

himedo. Todos 10s ensayos k o n reahdos por triplicado, en medio de cultbo RPMI

suplementado con concentraciones de SF' que variaron s e g h el experimento. Luego de

transcurrid0 el tiempo de incubation (variable en 10s distintos ensayos), las dlulas fberon

centnfUgadas y una alicuota de cada sobrenadante (la tercera parte del volhen total) fbe

tran.&erida a tubos para proceder al conteo radioactive. La radktividad de las muestras

( h e n t o celular y sobrenadante) k e detemhada en una contador gamma (Beckman

Instruments, Inc., Palo Alto, California) y el efecto citotoxico h e cuanacado en base a la

siguiente formula:

% Citotoxicidad = cpm sobrenadante x 3 x 100

cpm totales

A1 valor asi obtenido, se le sustrajo el % de liberacion esponthea de ' '~ r , que en

todos 10s expeiimentos h e menor al5%.

3.6.1.- Obfencion & ceIuh blrmco

Se ernplearon eritrocitos de pollo, de carnero, de conejo y eritrocitos humanos,

como dub blmaco.

3.6.2.- Marcacii6n de cdlulas b h o con monuto tde d o ractiuuctivo

La incorporation de 5 1 ~ r por las dlulas blanco h e reaiizada por incubadon de 20

pl de sangre heparkada con 50 pCi de " ~ r durante 1 hora a 37OC. Luego, las dlulas

&on lavadas 7 veces con medio de cultivo y resuspendidas a la c o n d o n deseada.

La citotoxicidad b e ensayada como se describio previamente (133,134). Las

dlulas efkctoras (1 x lo5 monocitos o 2 x lo5 neutrofilos) heron estimuladas por

diferentes concentraciones de CI en presencia de dlulas blcnaco (2 x lo5) y cdhadas

durante 18 horas a 37°C bajo una atmosf~ wnteniendo 5% de COz y 95% de aire

hiunedo. Luego, las &lulas heron centrXbgadas y la radioactividad de las muestras fbe

det*. Los porcentajes de 5 1 ~ r h i o s a1 medio extmxlular fueron calculados de

merdo a lo descripto para la CCDA

Pagina 38

La respuesta 1 urniniscente h e cuadficada con un lumiagregometro (Chrono-log) a

1000 revlminuto y a 37OC en presencia de lurninol (10-'M) (146). Para ello, 1 x lo6

neutrofilos o monocitos fueron estimulados con diversas concatmiones de CI, FMLS,

PAF, zymoshn, PMA o kid0 araquidomco. Inmediatamente despuds del agregado del

estimulo, la emision de luz h e registrada en forma continua durante 10 minutos. Los

resultados heron expresados como unidades relativas de QL (URQL). Una URQL h e

d&da como el conhiento de un lcm en la d o n de la seikl luminosa registrada

automiiticamente.

Todos 10s expimentos heron evaluados empleando un citometro de flujo Becton

Dickinson (Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA).

Los neutrofilos (5 x lo5), resuspendidos en 100pl de PBSsup., k o n incubados

por 30 rninutos a 4OC con 10s CI. Luego heron lavados y la union de 10s CI revelada

mediante el empleo de anticuerpos conjugados con isotiachmto de fluoresceina (ITCF)

(Sigma, St. Louis, USA, Dako, Dinamarm). La intensidad de flurescencia h e detemhada

sobre 10.000 &h en cada muestra. Dado que la intensidad de fluorescencia mostro, en

todos 10s casos, una distribution unimodal, 10s resultados h o n qresados como

intensidad de flurescencia media espec%m 0, calculada luego de restar la fluorescencia

i n w c a .

3.8.2.- Inhibicidn de la unidn de CI a la sutw$cie cehlar-rxw bloqueo ak recepores con

A a

En 10s esperirnentos de bloqueo, las cdulas k o n pretratadas con concentraciones

satmmtes del AcM IV.3 ylo del fhgmento F(abY)2 del AcM 3G8 por 20 minutos a 4°C.

La expresion de P-selectina fbe determinada en plaquetas Wadas (PF) (3 x

10~lml), incubadas en presencia o ausencia de CI o IgGh por 10 minutos a 37°C sin

agitacion. Luego, las plaquetas h o n tmtadas con un A M de raton IgG anti-P-selectina

por 30 rninutos y la uniQ del mismo revelada por incubation con IgG de cabra anti-IgG de

raton conjugada con ITCF (Sigma, St. Louis, USA). La intensidad de fluorescencia fbe

analizada sobre 10.000 dlulas de cada muestm

La union de CI cationizados (formados por IgGh cationizada e IgGc anti-IgGh

nativa) a PF (3 x 10~lml) fbe e v W luego de una incubacion de 10 minutos a 37°C sin

agitacion Se procedio luego aI lavado con Tris-EDTA y posterior incubacion por 30

minutos con IgG de cabra anti-IgGc conjugada con ITCF. Las PF &ern luego la+ y la

fluorescencia determhda.

La union de OA y SAB cationizadas (100pg/ml) a las PF fie analizada luego de 10

miuutos de incubacion a 37°C sii agitacion. Las PF heron luego lavadas e incubadas con

IgG espedica de conejo por 30 mhmtos a 37°C. La union del anticuerpo fbe revelada

mediante el empleo de IgG de cabra anti-IgGc coyugada con ITCF. Los resultados b o n

expresados como IFM.

Los neutrbfilos (1,s x lo6 resuspendidos en lOqrl de PBSsup) fberon incubados en

presencia o ausencia de 100pg/ml de CI o 1 0 " ~ de FMLP, por 15 minutos a 37"C, en

baiio de agua con agitacion. Luego, las ~ lu las fberon lavadas, resuspenddas en PBS y

fijadas por el agregado de un v o h igual de glutmddehido aI0,5% en PBS. El cambio

de forma fie determinado por citometiia de flujo y 10s resultados expresados como valor

medio de distribution de tamaiio.

La liberation de elastasa a1 medio extracellular h e analizada a travQ de la

d e t d 6 n de su efecto amidoltic0 sobre Lpir-M-Lprolil-Gvh-pnitrdda

(KabiVitrum Diagnostics, Suecia), sustrato altamente espedfico para la elastasa de

granulocitos, siguiendo un protocolo descripto previamente (147). Para ello, 5 x lo6

neutrofilos, resuspendidos en 400pl de solucibn de Hank's o PBSsup, k o n incubados

con lpg/rnl de citocalasina B durante 10 minutos a t- ambiente. Luego, las

cklulas &on estimuladas con CI durante 10 minutos a 37°C y la presencia de elastasa en

10s sobrenadantes h e detemhada fotom~cmmte a 405 nm. La actividad medida en las

muestras fbe calculada a trav6 de la formula: UA de elastasa = 138 x A (205).

El ensayo de quimiotaxis h e realizado empleando c&mms de quimiotaxis de 48

poms (Neuroprobe, Cabin John, MD) y Wos de policarbonato libres de polivinil-

pirrolidona (PVP) de 10 pm de espesor y 3pm de tarnaiio de poro (Nucleopore, Bethesda,

MD) (148). Los atractantes (FMLP, suer0 activado por zimoh y CI) fkron diluidos en

PBSsup a las concentmiones indicadas en cada experiment0 y 10s neutrbfilos (2 x lo6 d./ml) ken resuspendidos en PBSsup ao. Luego de una incubation de 30 minutos a

37°C bajo una atmosfera compuesta por 5% de COz y 95% de aire b e d o , 10s filtros

&on retirados de las charas y las ckhdas depositadas en la parte superior de 10s mismos

(&lulas que no migraron), h o n removidas con un rubber policeman. Las cklulas

retenidas en 10s filtros W o n fijadas, coloreadas con DiE-Quick y 10s Ntros montados

sobre un portaobjetos. La m i d o n de mxtr6filos h e detemhada rnediante el recuento

del nhero de c61ulas, que atravesando 10s pros del Wo, alcanzaron la superficie inferior

del mismo. Se examinaron 5 campos micrdpicos (400~) correspondientes a cada pom.

Cada concentncion de atractane h e evabda por triplicado y 10s resultados k o n

expresados como el nhero rnedio de dulas que migraronlampo microdpico.

En ensayos tendientes a determinar el rol de 10s RFcy en la quimiotaxis inducida

por CI, alicuotas de 40 pl de una +irn de neutroflos (5 x lo7/ rnl) en PBSsup Ho,

heron incubadas por 30 rninutos a 4°C en pmmcia o ausencia de c o n d o n e s

saturantes de AcM IV.3 ylo de fhgmentos F(ab7)z del AcM 3G8. Posteriormente, la

c o n d o n de las cklulas h e ajustada a 2 x 10~1ml con PBSsup, siendo empleadas luego

en el ensayo de quirniotaxis. La quimioquinesis h e evaluada empleando un ensayo

chckerbamd tal como hera descripto por Zigmond y Hirsch (149)

Los neutrofilos heron resuspendidos a las concentnuiones indicadas en cada

eqmkmto e incubdm con concentraciones satmantes de AcM anti-RFcy por 30 ntinutos

a 4°C. Luego de lavados, k o n empleados en 10s distintos ensayos.

3.12.- Tratmniento & neutrofilcrs con enzimm

Los neutrofilos (5 x 1o61ml) resuspemhdos en sducion fisiologica, k o n incubdos

en presencia o ausencia de 200&ml de pronasa E (obtenida de Streptomyces pSsars),

lms/ml de aquimotripsina ( t ip 11, obtenida de phcreas bovine, 42Ulmg) o 025 Ulrnl de

neuroaminidasa (tip VI, obtenida de C 1 w . b pemngens), por 30 minutes a 37°C.

Posteriormente k o n lavados 4 veces y resuspendidos en el medio deseado para cada

experimento. La viabilidad celular, juzgada por exclusion del colorante vital 4 trip& he

siempre mayor de 95%.

Las rosetas heron formadas siguiendo el protocolo descripto por Sandor y

colaboradores (150). Para ello, 15pI de suspension de nwtr6filos (5 x 10~1ml) k o n

incubados con 1OOj.J de una suspension a1 2% vlv de Ep s e n s i i i o s con concentraciones

de IgGc anti-Ep (ambos rewspeddos en medio de cultivo con 5% de

SFB), por 45 minutos a 4°C. Luego, el roseteo h e evaluado por observation microsujpica

a 400 x. El porcentaje de neutroflos que unen al menos un Ep y el nhero & Ep en cada

roseta, ban determinados contando al menos 100 necltrofilos en cada preparado.

Fue registrada utilizando un lumhgregometro (Chrono-log, Harverton, PA) por el

m&do descripto por Born y Cross (15 1). La qpgacion fbe detemhada en alicuotas de

400pl de PRP, PL o PF durante 5 a 15 minutos y expresada como porcentaje de

tmmmision mhxima de la luz. Cuando f k o n usadas PL o PF, 0,25mg/ml de fibrinogen0

&on adicionados 1 rninuto previo al agregado de 10s agonistas.

La liberation de ATP fbe detemhada simheamente con la agregacion

plaquetaria por el m&odo de la fuciferin-kcif- utilizando un lumiagregometro

(Chrono-log, Harverton, PA).

El TXJ32 (metabolite estable del m) presente en el sobrenadante de PL

e- fbe medido por ELISA (Caiman Chemical, Ann Arbor, MI).

Las diferencias entre datos con distri ibn normal fberon analizadas a travQ del

test de t de Student. Los datos con distribu&n no ~~)rmaI, b o n comparados por el test

no param&ico de Whxon y el test de Friedman para comparaciones entre dtiples

grupos. A1 comparar 10s resultados obtenidos con los distintos tratamientos, s610 aquellos

que presentaron un valor de P < 0,05 heron considerados signiscativamente difkentes.

4. - RESUL TADOS

La presencia de altas concentmiones de enzimas proteoliticas en el medio

extracelular constituye una caracteristica observada en la mayoria de 10s f m s

inflamatorios. ELlas son producidas in sikr a expems, no &lo de la estirnulacion de &Idas

hgociticas y linfoides, sin0 tambib por activacih de diversos sistemas humorales

ampliamente interconectados, tales como el sistema de kininas, el complement0 y el sisterna

de coagulation (58,152,153). Numerosos trabajos han amhado el papel de las proteasas

como mediadoras de daiio tisulary como asi tambib su capacidad de generar p6ptidos

dotados de diversas propiedades biologicas, a partir del clivaje de proteinas autologas. Los

mismos sugieren que las proteasas juegan un rol relevantey no dlo en la induccion sino

tambih en la amplifidon de 10s fenornenos idlamatonos (58,152, 153).

Las enzimas proteoziticas son capaces, adem& de interadmu con receptores

espdicos expresados sobre diferentes t ips celulares. Esta inkmuion, suele inducir una

amplia variedad de respuestas, tales como el increment0 en 10s niveles htradulares de

ca2+, la activation de protein quinasas, el aumento en la expresion de mol6culas de

adhesion y la tramaipcion de genes de activation temprana ylo prolifimcion celular

(154,157). La induccion de dichas respuestas involucra, dependiendo del mode10

Estudios realizados por Van de Wltlkel y colaboradores (1 58-160) han demostrado

la capacidad de ciertas proteasas de modular la &dad de 10s RFcy expresados por

monocitos humanos. Sus resultados demuestran que el tratamiento de las dlulas con

pronasa o tripsina incrementa la avidez y fbionalidad del RFcyII, a travtb de un

mecanismo a h no dilucidado. En relacion a 10s leucocitos polimorfonucleares se observo

que, a cornencia del tratamiento con emimas proteoliticas, la expresibn del RFcyIII

resulta marcadamente disminuida, sin a f i la expresion del RFcyII (161,162). No

existen estudios previos que hayan analizado el impact0 de las proteasas sobre la

fbncionalidad del RFcyII en el neutr6filo. Es interesante destacar, no obstante, las

observaciones realizadas por Tosi y colaboradores (162) indicando que el tratamiento de

10s neutrofilos con elastasa no ahera su capacidad de producir anion superoxido en

respuesta a CI solubles.

Los hallazgos que se describen a conthacion, ilustran la capacidad de ciertas

proteasas de modular, dmmiticamente, la actividad del RFcyII en el neutrofilo humano.

4.1.1.- Efeco a2 lar protearar sobre la -red& de los RFc'y en el neutrofilo

A fh de evalw la accion de las proteasas sobre la expresion de 10s RFcy, 10s

neutrofilos &on tratados durante 30 minutos a 37°C con dos enzimas dif'erentes: pronasa

y quimotripsina. Posterionnente, la presencia de 10s RFcyIII y RFcyII h e evaluada por

citometria de flujo, mediante el empleo del m e n t o F(ab1)2 del AcM 3G8 (anti-RFcyIII) y

el AcM IV.3 (anti-RFcyII), respectivamente. El tratamiento con proteasas indujo una

marcada reduction en la expresibn del RFcyIII (P<O,Ol), sin afkctar la expresion del RFcyII

Pigura 6).

Figura 6: Los neutrofilos (5x10~/ml, en solucih fisiolbgica) fberon incubados en ausencia o presencia de prmasa (200pglml) o quimutripsina (lmg/ml) durante 30 minutos a 37°C. Posteriormeate fueron lavados e incubados m concentraciones saauantes del AcM IV.3 (anti- RFcy11) o del hgmento F(ab'h del AcM 3G8 (d-RFcyIII) por 30 minutos a 4°C. Luego, fbem lavados y la unih de los AcM fbe revelada mediatrte el empleo de ant icuep de cabra anti-IgG & d m conjugados con ITCF. Los datos &An expresahs como la media aritm&ca *ESde4dadores.

4.1.2.- Efecto cEe h zrotemas sobre la cxmxihi & Jos neuttdfilm & mir erifrocitm

misibiIhhs con InG (laC - E$1

Con el objeto de analizar la accion de las enzirnas proteoliticas sobre la actividad del

RFcyII se examino, en primera instancia, el &o del tratamiento con pronasa y

quimotripsina sobre la capacidad de 10s neutr6filos de reconocer y unir IgG-Ep. Los

resultados obtenidos indicaron que el trataaiento proteolitico increment6 marcadamente

(P<0,01), no &lo el porcentaje de neutrofllos capaces de unir IgG-Ep, sino tambitin el

nhero de Ep presentes en cada roseta (Tabla I).

Tabla 1. Efecto de la prote6lisis sobre la fo&6n de rosetas EA.

Los nmtdfilos (5xl0'/ml, en sducibn fisiol6gica) &em incubados an aumcia o pmmcia de pmtasa (200 ug/m) o quimatripsina (1 Wml) por 30 minutos a 37OC. Postmiomate fireron lavados e incubados con AcM N.3, su fragmento Fab, el .fiagmento F(ab7)t del AcM 3G8 o can medio de cukivo dl0 por 30 minutes a 4OC. Luego, fuem lavados y eenpleados ea eusayos de h c i h de rosetas EA. Lar dates edin expresados colno la media aritmkica * ES de n dadores. ND: No determinado.

A fin de determinar la contribution de 10s RFcyII y RFcyIII a la formacion de

r o w se emplearon el AcM IV.3 y el fhgmento F(ab')2 del AcM 3G8. Arnbos redujeron

sigmiicativamente el porcentaje de rosetas EA, en 10s neutrojilos no tratados con proteasas

(P<0,05) (Tabla I). En neutrofilos tratados con pronasa, la formacion de rosetas EA no k e

a f d por el fiagrnento F(ab')2 del AcM 3G8, per0 fbe marcadamente inhibida (P<O,Ol)

tanto por el AcM IV.3 como por su flagmento Fab (Tabla I). En las cklulas tratadas con

quimotripsha, se observo una leve inhibition por el fhgmento F(ab')2 del AcM 3G8 y una

marcada r-on por parte del A M N.3 o su hgmento Fab (P<O,Ol)(Tabla I) . Los

resultados descriptos indican que, mimtm la union de 10s IgG-Ep a 10s neutrofilos

controles depende tanto del RFcyII corn del RFcyIII, su union a 10s neutrofilos tratados

con proteasas es m a r h e n t e d w e n t e del RFcyII.

El irnpacto del tratarniento proteolitico sobre la fbncionalidad del RFcyII fbe

analizado rnediante el estudio de dos respuestas celulares: la emision de quimiolurninis-

cencia (QL) y la CCDA La activation del estallido respiratorio esti asociada a la emision

de QL (163). Este fenomeno es comencia de la emision de fotones provocada por el

dexaimiento de especies electronicamente excitadas como el oxigmo singlete u otras

generadas a expensas de reacciones de oxidaci6n sobre m o l ~ del entom (146,163).

Tal como se observa en la Fzgura 7, el &&miento de 10s neutrofilos con proteasas

potem50 si@cativamente la QL inducida por I,gEEp (P4,Ol). Un increment0 notable se

observb tarnbitin al analizar la Capacidad de dichos neutrofilos de mediar la CCDA

(P<O,Ol) (Tabla 2). La preincubaci6n de neutnjfilos controles y de aquellos tratados con

proteasas con fhgmentos F(abY)2 del AcM 3G8 no modifid la CCDA m la QL (Tabla 2 y

Figura 7). Ambas hciones, sin embargo, fumn mar-e inhibidas por el AcM IV.3

(P<0,05) (Tdh 2 y Figura 7). Estos resdtados indican que, 111ientras la union de IgG-Ep

a 10s neutrofilos no tratados con proteasas es dependiente del RFcyII y del RFcyIII, las

bciones inducidas por IgG-Ep involucran exclusiv-e a1 RFcyII. Por el contmio,

tanto la union como las hciones estimuladas por IgG-Ep mediadas por neutrbfilos

tratados con proteasas involucran ~610 a1 RFcyII.

Tabla 2. Efecto de la prote6lisis sobre la CCDA.

Los neuirMos (5~10~/ml, ea d u c i h fisidbgica) fierun mcubda ea amencia o presencia de prcmasa (200pg/ml) o qubnmipsina (lmg/ml) dmmte 30 minutos a 37OC. Posteriormente h e m la& e incubah ma d AcM IV.3, cau el lhgmnto F(ab'h del AcM 308 o om meclio de cultivo dlo por 30 mmubs a 4OC. Lueg~ fueron laradar y empleados en msayos de CCDA utilizado dos ma~cimes dikmtes de IgGc anti-Ep. La datos esth qresados c m ~ k m s d i r a r i h o e t i c a + E S & n ~ e s e ~ p a t r i p l i & .

Control Quimotripsina

Figura 7. Efedo de enzimas proteoliticas sobre la QL inducida por IgG-Ep. Los neutroflos (5xl0~1ml, en solucih fisiolbgica) fueron incubados en ausencia o presencia de prcmasa (200pg/ml) o quimotripsina (lmg/ml) durante 30 rninutos a 37°C. Posteriormente Germ lavados e incubados can el AcM IV.3, con el fhgmento F(abY)z del AcM 3G8 o con medio de cultivo solo por 30 minutos a 4OC. Luego heran lavados y empleados en ensayos de QL utilkmdo Ep sensibilizados con concmtracimes subaglutinantes de IgGc anti-Ep como estimulo. Los datos e&m eqresados como la media ardmtitica * ES de (n) dadores evaluados por duplicado.

El contenido de hido &co contribuye a determinar la carga elktrica de la

superficie celular. Se consider6 la posib'ilidad de que el tmtamiento proteolitico ocasionara

el clivaje de &coproteinas de membrana rim en hido si$lico y consecuentemente indujera

una disminucion de la mga negativa neta de la superficie celular. El incremeno en la

bcionalidad del RFcyII inducido por el tratdento proteolitico, podria ser comencia

de una reducci6n de las fierzas repulsivas entre 10s IgG-Ep y 10s neutrbfilos, lo que

fbcilililtaria la i n t d h de 10s rnismos. A ijn de testear esta hipbtesis, se a n a W el efkcto de

la neu~oarn in ia enzima capaz de remover residuos de W o dice, sobre la

hcionalidad del RFcyII. Los resultados descriptos en la Tabla 3 muestran que el

tratamento de 10s neutroflos con neuroaminidasa increment6, no &lo su capacidad de unir

IgG-Ep sin0 tambib su capacidad de mediar la CCDA y de inducir la emision de QL, en

Pdglina 49

niveles sernejantes a 10s obtenidos por accion de la pronasa o la quimotripsina (K0 ,O l ) . El

tmtamiento con neuroaminidasa, por otra parte, no a f i o la expresion de 10s RFcyII y

RFcyIII (Figura 8).

TaMa 3. Efecto de la nanoaminidasa sobre la f&6n & rosetas, la CCDA y la QL inducida por IgG-Ep.

LQS neutrMlos (5xl0~/ml, en solucibn hsiol6gica) incubados en ausencia o presaacia de neuroaminidasa (0,25U/ml) durante 30 minubs a 37°C. Luego fueron lavados y empleados an ansayos de formacih de rosehs EA, CCDA y QL indueidas por IgG-Ep. Los dabs mth e x p e como la media aritm&ica h ES de n dadom evaiuados por triplicado.

Figura 8. E W de la neuroaminidasa sobre la expresih de los RFcy. Los neutrofilos (5x106/ml, en solucih fisiologica) h e m incubados en ausencia o presencia de neuroaminidasa (0,25U/ml) durante 30 minutos a 37OC. Luego k e r n lavados e incubados can mcentraciones satwantes del AcM IV.3 (anti-RFcyIl) o del fragrnento F(ab')2 &l AcM 3G8 (anti-RFcyIU) por 30 minutos a 4OC. Luego, fireran lavados y la unih de 10s AcM fue revelada merllante el ernpleo & anticuerpos & cabra anti-IgG de rath conjugados con ITCF. Los datos & expresados como la media aritmitica * ES de 4 dadores.

A diferencia de lo observado con pronasa y quimotripsina, la union de IgG-Ep a

neutrofilos tratados con newroaminidasa fie si@catimente inhibida tanto por el

fiagmento F(ab')2 del AcM 3G8 como por el fiagmento Fab del AcM IV.3 (P<0,05)

(T'b 4). La CCDA y la QL mediada por neutrofilos sometidos a la accion de la

newroarninidasa heron marcadamente inhibidas por el fiagmento Fab del IV.3 (P<0,01) sin

ser m&cadas por el fhgmento F(ab')2 del AcM 3G8 (Tabla 4).

Tabla 4. Efecto del trakmiento con AcM anti RFcys sobre las hciones mediadas por neutrofilos tratados con neuroaminidasa inducidas por IgG-Ep.

Los neutrofilos (5~10~/ml, en solucih fisiol6gica) fuem incubados en ausencia o presencia de neummiaidasa (0,25U/ml) durante 30 minutos a 37°C. Luego fberon lavados e incubados con el AcM IV.3, el fragment0 F(ab')2 del AcM 3G8 o can medio de cuttivo a510 por 30 minutes a 4OC. Luego, fireron lavados y empleados en ensayos de fonnaciim de rosetas EA, CCDA y QL inducidas por IgG-Ep. Los datos es tb expresados carno la media aritm&ca * ES de 4 dadores evaluados por triplicado.

Considerados en conjunto, 10s resultados obtenidos sugieren que el efecto de las

proteasas puede explicarse? a1 menos pankhmte? en W o n de una reduccion del

contenid0 de &do sibhco & la sqmflcie celular.

4.1.5.- Efecto de las -proteam mbre la OL m e d i h -par neu@filos imihkh -par

c q h m ? S ~ d e C I

Como se ha mencionado previamente, 10s CI constituyen un grupo heterogeneo de

agonistas que difieren no &lo en su capacidad de *cir difmmtes respuestas celulares,

sin0 tambih en 10s mecanismos transduccionales involucrados en su edmuhion

(1 19,128,129,136). Los experimentos descriptos previamente se desarrollaron empleando

IgG-Ep como mode10 de CI. Con el objeto de determinar si las proteasas era capaces de

modular respuestas de neutrbfilos inducidas por otros CI, se evaluo la QL estimulada por

CI del t i p IgGh: IgG de conejo ant i - Ig - preparados tanto en forma soluble (5x exceso

de antigeno) como precipitante. El tratamiento de neutrofllos con pronasa o cphnotripsina

increment0 sigdcativamente (K0,Ol) la respvesta inducida por CIS per0 no modifid

aquella estimulada por CIp Figura 9).

Estimulo

Figura 9. E- de la proteblisis sobre la respuesta QL inducida por CIS y CIp. Los neutrofilos (5~10~/ml, en soluciim fisiolbgica) fueron mcubados en ausencia o presencia de pronasa (200pg/ml) o quimotripsina (lmg/ml) por 30 minutos a 37°C. Luego, h e m lavados y empleados en ensayos de QL utilizando CIS (50pg/ml) o CIp (5pg/ml) como esthulos. Los dams edm evresados como la media aritm6t.h * ES de (n) dadores evaluados por duplicado.

Teniendo en cuenta que el tratamiento proteolitiico induce una reduction -cia1

en la expresibn del RFcyIII, las diferencias observadas podrian expliame considerando la

posibilidad de que la QL inducida por CIp fuese fbertemente dependiente del RFcyIII. En

ese caso, la contniucion de una mayor actividad del RFcyII a la respuesta QL podria verse

compensada por la -cia del RFcyIII. A1 testear esta hipbtesis mediante el ernpfeo de 10s

AcM anti-RFcy, se encontro que la misma no h e w%da puesto que la respuesta inducida

por ambos t ips de CI en neutrbfllos tratados con proteam fbe inhibida en niveles sirnilares

por el A M IV.3 y el fiagmento F(ab7)2 del AcM 3G8 piguru IOA). Por otra parte, en

acuerdo con lo esperado, la QL inducida por ambos t ips de CI, d d a por neutrofilos

tratados con proteasas, fbe prhcticamente suwda por el AcM W.3 (7;igrra IOB).

CIS C ~ P

Estimulo

Estimulo

Figura 10. Efk& de 10s AcM anti-RFcy sobre la QL inducida por CIS y CIp mediada por neutr<ifilos catroIes ytmtacb con proteasas. L a neub-ciflos (5~10~/ml, en soluciim fisiol6gica) heron incubados en ausencia o presencia de pranasa (200~g/ml) o quimotripsina (Imglml) por 30 m i n W a 37°C. Posteriormate heron lavados e incubados can el AcM IV.3, el hgtneato F(ab')z del AcM 3G8 o con medio de cultivo d1o por 30 rninutos a 4OC. Luego, fberon lavados y qleados en ensayos de QL utilizando CIS (50pg/ml) y CIp (5pg/ml) como ~ d o s . (A) QL mediada por neutrofilos no sometidos a la accih de las prateasas. (B) QL mediada por neutrbfilos tratados con enzimas. Los datos &in expresados cam0 la media aritdtica & ES de 5 dadores evaluados por duplicado

Pagina 53

En forma similar a lo realizado con 10s IgG-Ep, se a d z b posteriormente el efecto

de la neuroaminidasa sobre la QL de mutrbfilos inducida por CIS y CIp. Los resultados

obtenidos (Tabla 5) muestran que este tratamiento potencio significativamente no d l0 la

QL inducida por CIS sin0 tambib aquella inducida por CIp (P<0,05), respuestas que

estuvieron mediadas a travks de 10s RFcyII y RFcyIJI (Figura 11). Este efecto con-

con el ejercido por las proteasas, las cuales d o potenciaron la respuesta inducida por CIS.

T a b 5. E f a o del tratamiento con neu~oamhidasa sobre la QL inducida por CIS y CIp.

Lcs neutrbfilos (5xl0~/ml, en soluci6n fisiol6gic.a) fueron incubados en auoecia o p m c i a de neuroaminidasa (0,25U/ml) duante 30 minutos a 37°C. Luego heron lavados y empleados en ensayos de QL inducida por CIS (5Opg/ml) o CIp (5pdml). Los dabs esth expresados como la media aritmdtica * ES de 5 dadores evaluados por duplicado

-1 80 u (P - 60 Q) w

40 'El 0 .- g 20 C - s 0

Cis Estimulo

C ~ P

Figura 11. Efkb de 10s AcM anti-RFcy sobre la QL inducida por CIS y CIp mediada por mmtdlos tratados am n m d a s a . Los ncmtnMlos (5x106/rnl, en solucih fisiolbgica) ftemn incubados en ausencia o p m c i a Q n m d a s a (0,25U/ml) durante 30 minutes a 37°C. Luego h r c m la& e incubados a m el AcM lV.3, el fragment0 F(ab')z dei AcM 3G8 o con medio de &VO &lo por 30 minutes a 4OC. Posterioramb, fuercm la& y empleadas ar ensayos de QL utibndo CIS (50pgM) y CIp (5ps/ml) ~ o m o esthdos. Los datos tishin e r q , r e ~ 8 d o s c o m o l a m e d i a ~ & a * E S d s 4 d a d o ~ ~ ~ d ~ p o r ~ l i ~

A fin de determinar la accion modulatoria ejercida por las proteasas sobre la

bcionalidad de otros sistemas de receptores operatvos en neutroflos, se examino la QL

inducida por diferentes agonistas. Los resultados obtenidos (Figura 12) indicaron que la

emision de luz inducida por el p6ptido quimiothtico FMLP, el zyrnosh y el PAF h e

marcadamente inhibida como consecuencia del tratamiento proteolitico (P<0,01). Por el

contrario, la QL inducida por el hido f*l midstico (PMA) y el (rcido araquidonico,

estinrulos que inducen la adivacion c$ular sin interactuar con receptores de supedicie, no

h e modificada por el tratamiento enzhitico.

Estlmulo

Figura 12. Efkcto de la prok5lisis &sobre la respuesta QL inducida por distintos agonistas. Los neutrofilos (5~10~/ml, en solucibn fisiol<isica) fbem incubados en ausencia o presencia de pronasa (200pg/d) o quimotripsina (Img/ml) durante 30 minutes a 37°C. Luego, fueron lavados y empleados en ensayos de QL uthando 10s agonistas indicados. Los datos estin expresados como la media aritm&ca i ES de 5 dadores evaluados por duplicado.

Considerados en conjunto, 10s resuitados desciiptos demuestran que la action de

ciertas enzimas proteoliticas conduce, de modo selective, a la potenciacion de la

bcionalidad del RFcyII del neutrofilo humno. Dicha accion, no obstarrte, resulta

dependiente de las caracteristicas del CI que actb como esthmlo.

Pdgina 5.5

La formation de CI es un proceso que en general resulta beneficioso para el

hospedador, puesto que conduce a la neutralhion o ehinacion del antigeno. Sin

embargo, bajo ciertas c i r m c i a s , 10s CI pueden depositarse en estmcturas vasculares e

inducir respuestas hfhmtorias capaces de comprometer el fimcionamiento de 10s organos

que ellas irrigan (1,120-122). Este proceso es responsable de diversas manifestaciones

clinicas no ~610 en d d e s de naturaleza autoinmune, sin0 tambitin en enfbmedades

neopbicas y patologias infecciosas ocasionadas por bacteku, virus y parbitos (1,120).

Numerosos trabajos han demostrado que la actividad patoghim de 10s CI guarda una

estrecha relacion con su capacidad de inducir respuestas secretorias y/o citot6xicas

mediadas por &Idas fiqpdticas (1,164,165). No obstante, el conocimiento de las

propiedades inherentes a 10s CI que condicionan su capacidad de inducir tales respuestas es

muy limitado.

En el caso particular del LES, se ha postulado que 10s CI fonnados por ADN y

anticuerpos IgG espedicos se hallan involucrados en la induccion del daiIo renal, que

constituye la madstxion mb severa de la enfmedad (166). Sin embargo, no existe

comelacion entre 10s niveles de anticuerpos anti-ADN y la presencia de compromiso renal

(167). Este hecho sugiere que dichos autoanticuerpos no siempre son nefiitogknicos (168).

Estudios realizados por %ling y Hahn en ratones con LES (169), demostraron la p m c i a

de anticuerpos anti-ADN cationicos (pl> 8,s) coincidentes con el inicio de la lesion renal.

Lm autores ddbieron, a d d , la existm& de una marcada comelacion entre la

severidad de la n&tis y la concentration de estos anticuerpos en 10s eluidos renales de

dichos ratones. Hallazgos posteriores de Datta S.K. y colabaadores (170-173)

confirmaron, tanto en modelos de lupus murino como en el LES humano, la production de

autoanticuerpos anti-ADN cati6nicos asociada a1 desimollo de la n&s. Las propiedades

patoghicas de estos anticuerpos no han sido cIaramente elucidadas. No obstante, merece

mencionarse que 10s CI que incluyen anticuerpos cati6nicos, presentan una herte tendencia

a depositarse y persistir en 10s glomthlos renales (144,174). Este fenomeno involucra el

estable&knto de i n t d o n e s electro~cas entre grupos cargados positivamente

expresados en la m o l ~ a de anticuerpo y sitios anionicos de la membrana basal

glomerular @G) (175,176). La avidez de tal interaccion explica el motivo por el cual la

presencia de anticuerpos cationicos, aim en proporciones rrlinimas, increments

notablernente la capacidad de 10s CI de depositarse a nivel tisular (1 77).

No d e n estudios previos que hayan analizado el impact0 de la carga elMca de

10s anticuerpos IgG en relacion a su capacidad de inducir respuestas proinflamatorias a

trav6 de 10s RFcy. Los resultados que se desaiben a conhation ilustran la investigation

realizada a fin de evaluar este aspecto.

A iin de deterrninar el modo en el cual la c a r p el&rica de 10s anticuerpos IgG

condiciona la actividad de 10s CI, se procedi6 a cationizar in vitro anticuerpos IgGc anti-

IgGh, siguiendo el protocolo descripto en Matdes y M&odos. Luego se p r e p m n CI

solubles empleando IgGh como antigen0 y anticuerpos IgGc anti-IgGh, natives (pl: 5,8-

8,2) o cationidos @1: 92-93). Se &6 posteriormente su capacidad de inducir

respuestas citotoxicas mediadas por neutrofilos contra dlulas b h o no sensiiihadas. En

forma sorpresiva, se observ6 que 10s CI preparados con anticuerpos cationizados (CIcat)

indujeron altos niveles de citotoxicidad, atin a1 emplearse a concentraciones tan bajas como

4wml (Tabla 6). Por el contrario, aquellos preparados con anticuerpos nativos (CIc)

indujeron muy bajos niveles de citotoxicidad, aiin cuando b o n empleados a

c o d o n e s de 200llpJml. Es importante destacar las difmcias en la M t u d de las

respuestas inducidas en cada caw. Los CIcat empleados a concentraciones 50 veces

inferiores respecto de 10s CIc, indujeron niveles de citotoxicidad tres veces superiores.

Con el objeto de confirmar 10s ballazgos descriptos, se empleb un segundo t i p de

CI preparado con s e r o a l b m bovina (SAB) y dcuerpos IgG eqedicos de conejo

nativos (pl: 5,8-8,2) o cationizados @I > 9,l). Los CIcat indujeron, nuevamente, niveles de

citotoxicidad mtoiamente superiores respecto de 10s inducidos por CIc (P<O,Ol) (Tablir

6).

Tabla 6. Citotoxicidad mediada por neutr6fIos inducida por CIcat.

Los CI solubles fueran preparados con IgG humam, nativa o catianizada y anticueps IgG de conejoanti-IgGh,nativos o c a t i a n i z d o s , ~ ~ , . bovina (SAB) y auticuerpos IgG de

conejo amti-SAB, natjvos o catictnbdx, en 5x exc8so de adigeno. Los asayos de chtmicidad fberan desarrollados e&ku&ndo muthfilos y dlulas blanco por 18 horn a 37°C m presencia de 10s CI detallados. Los muhdos esth expresados cam0 la media arim&ia * ES de n e x p e a s dif$mtes realizados par triplicado.

Los resultados mencionados prewkmmte, b o n obtenidos en ensayos de

citotoxicidad en 10s que se usaron Ep como dulas blaraco. El ernpleo de eritrocitos de

carnero y eritrocitos -0s como b k m de citotoxicidad mojo resultados similares.

Los CI formados con IgGh nativa e IgGc anti-IgGh cationida (20&ml), indujeron altos

niveles & citotoxicidad tanto fiente a eritrocitos & camero (% citotoxicidad=SM, n=4)

como contra eiitrocitos humanos (% citotoxicidab=38;t5, n=4). Bajo shihres condiciones,

10s CI preparados con componentes nativos no indujeron westas sigdicativas. Es

importante destacar que, d igual que 10s anticuerpos IgG natives, 10s anticuerps IgG

cationizados no indujeron, per se, niveles si-s de citotoxicidad.

Las experiencias descriptas precedentemente, se rrealizaron empleando anticuerpos

de wnejo cationizados. A fin de evaluar el impact0 de la carga elkctrica de la IgG humana

sobre su actividad biologics, se prepararon CI solubles wn IgGh nativa @1: 5,8-8,2) (CIc)

o cationizada @I: 8,O-9,5) (CIcat) y antimerpos IgG espec%cos de conejo nativos.

Mierrtras que 10s CIcat indujeron altos niveles de citotoxicidad, 10s CIc &on incapaces de

inducir respuestas si@cativas (Tabla 6).

Considerados en conjunto, 10s resultados descriptos indim que la cationizacion de

la f?acci6n IgG de 10s CI, increments a1 menos diez veces su capacidad de inducir

respuestas citotoxicas d a d a s por neutr6flos.

Nuestro grupo de investigation ha demostrado previamente que 10s CI solubles son

capaces de inducir respuestas citotoxim rnediadas por neutrofilos, a travQ de un

d s m o litico que involuma la participation de IRO (133-137). Considerando las

diferencias de magnitud en las respuestas inducidas por CIc y CIcat, se evaluo la posibilidad

de que las rnismas obedecim a la participacibn de dZerentes mecanismos citoliticos. Con

el objeto de testear esta hip&&, 10s -0s de citotoxicidad W o n realizados en

presencia de enzimas capaces de degmdar a 10s IRO producidos a consecuencia de la

acthacion del estallido respiratorio. No se enconbaron difkencias en relacion a las

respuestas inducidas por CIc y CIcat (Tabla 7). Ambas respuestas fkron marcadatnente

inbibidas por catalasa (P<0,01), no siendo modificadas por la SOD (Tablb 7). Ello sugiere

un rol central del H202 en 10s mecanismos citoliticos.

Tal como se mencionara Previamente, el H a es capaz de ejercer e f i o s

citotoxiws per se o a travds del sistema H&mieloperoxidasa-bo, mediante la

production de especies toxicas m b poderosas tales wmo el anion hipocloxito ylo las

cloraminas (58,178). Para diferenciar entre ambas posibilidades se ensay6 la reaui6n en

preaencia de tres inhibidores de hemoenzimas: azida sbdica, cianuro de potasio y

aminoriazol. N i o de 10s tres inhibidores fbe cap= de suprimir las respuestas

citotoxicas. Por el wntrario, en todos 10s casoq ellas fireron signifieativamente

in- (P<0,05) (Tabla 7). Las causas de dichos inmementos no resultan obvias.

No obstante, podrian explicarse considerando que 10s inhibidores de hemo-enzimas podrian

ocasionar un aumento en la concentration e f h de H a a expensas de la inhibiciin de la

catalasa endogena. Esta hipbtesis, sin embargo, no ha sido wrroborada experimentalrnente.

Considerados en conjunto, 10s resultados mencionados sugieren que las respuestas

citotoxicas inducidas tanto por CIc como por CIcat, involucran la participation de

mecanismos liticos dependiente del H a per0 indepemhentes de la mieloperoxidasa.

T a b 7. Mecanismos involucrados en la citoxicidad mediada por neutr6filos indue& por CLcat.

Se emplearoa CI s01uMes prepadas con IgGb y anti- IgG de conejo anti-IgGh, nab:vus (CIc) o catianhdos (CIcat). Los ensayos de cit.&oxicidad f u ~ f ~ l desamllados edhtando neutrMdos y dulas blunco por 18 horas a 37°C en pmsmcia de CIc o Clcat. Los resuhdos ~ e n q , ~ c o m o l a m e d i a ~ c a * E S d e 6 ~ ~ ~ r e a ~ p o r tnplicado. # Catalasa irmtivada por calor.

4.2.1.3.- Rol &I citoesqueleto en la citotoxici~ media& -mr neutrofiIos in&ci&

por CI cat

Estudios previos han establecido la relevancia del citoesqueleto en la

citotoxicidad mediada por cklulas fagociticas (135,136). Con el objeto de determinar el

papel desempeiiado por el mismo en la citotoxicidad inducida por CIc y CIcat, se

evaluo el efecto de dos agentes que interfieren el ensamblado de sus componentes: (I)

la citocalasina B, un agente disruptor del sistema de microfilarnentos de actina (179) y

(2) la colchicina, un inhibidor de la p o l i m b i b n de tubulina (180). Los resultados

obtenidos indicaron que la citotoxicidad inducida por CIc fbe marcadamente

incrementada por citocalasina B (P<0,01), sin ser afectada por tratamiento con

colchicina (Figura 13). Mientras que aquella inducida por CIcat fbe significativarnente

inhibida por citocalasina B (P<0,01) y notablemente potenciada por colchicina

(P<0,01) (Figura 13). Estos resultados sugieren distintos requerimientos del

citoesqueleto en las respuestas citotoxicas inducidas por CIc y CIcat.

Clc Clcat 200pglml 4Wml

Estimulo 1 ~ed io Cifocalasina 6 W Cokhicina I

Figura 13. Efecto de la tdodasina B y de la colchicjna sobre la cbtixicidad mediada por n m o s mducida por CIcat. Los neutdllos (2 x I@ fimun mcubados en pmencia de l&ml de cbcalasina B, 25pglml de colchiicina o medio de wltivo d o durante 5 minutos a 37OC. Posterionnente fireron eaq1,leados en ensayos de ~~ cisarmllados ~ l o s con &I& blanco durante 18 horas a 37OC, en presencia de CI solubles preparados con IgGh y anticue~pos IgG de conejo anti-IgGh, nativos (CIc) o cationizados (CIcat). L a resultados e s t b qresados como la media arimaica * ES de 5 experimentw difbrentes reahidos por triplicado.

Pdgina 61

4.2.1.4.- Pawl de l o ~ eferentes RFq en la c i t o t o x ~ ~ c i ~ d a d ~ -par lteufr@fiZm

iPu#Jcrab-m CIUlt

La participacion de 10s RFcy en la citotoxicidad inducida por CIc y CIcat h e

evaluada ernpleando el AcM IV.3 y el @pento F(aby)-t del AcM 3G8. Dado que 10s CIc

indujeron niveles muy bajos de citotoxicidad, algunos experimentos W o n realizados en

presencia de azida sklica con el objeto de incrementar las respuestm citotoxicas. La

citotoxicidad inducida por CIcat h e completarnente inhl'bida por el tratamiento con el AcM

IV.3 (P<0,01) sin ser modificada por el fragment0 F(ab')-t del AcM 3G8 (Tabla 8). Estos

resultados indim que el RFcyIl es el responsable de la indudon de citotoxicidad. Por el

c0ntrarioy la respuesta inducida por CIc, en presencia o ausencia de azida, h e

sigdicativamente inhibida (P<O,Ol) por 10s dos AcM Pabh 8), lo que sugiere la

participacion de ambos RFcy en su indudon.

Tabla 8. Rol de 10s dif'entes RFcy en la citotoxicidad de neutrfilos inducida por CI C a t i o ~ o s .

Los n d f i l o s fberon incubados durante 30 minlrtos a 37°C en presencia del fiagmento F(ab')z del AcM 3G8 o del AcM IV3. Luego las c41ulas fuem estjmuladas wn CI solubles preparados con IgG humana y anticuerpos IgG de conejo anti-IgG humana, nativos (CIc) o cationizados (CIcat). Los msayos de citobxicidad fueron desarrollados incubando c41ulas efkcbras y dfulas bhnco durante 18 horas a 37°C. Los resultados esth expresados como la media arhndjca * ES de n dadores e v a l d por triplicado.

A1 ser estimulados con IFNy, 10s nezltrofilos neosintetizan y expresan sobre su

supmficie el RFcyI (CD64) (9). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, han

demostrado que el RFcyI no esti involucrado en la citotoxicidad inducida por CIc (1 8 1). A

fin de det& la posible participacion del RFcyI en la induction de la citotoxicidad por

CIcat, 10s neutrofilos &on preincubados con 100 U/ml de IFNy durante 18 hs a 37"C,

evahrtindose luego la contribution del RFcyI rnediante el empleo de dos AcM dirigidos

contra distintos epitopes del RFcyI, el AcM 32.2 y el AcM 197. El t r h e n t o con IFNy no

increment6 la citotoxicidad inducida por CIcat (10 pglml). La misma tampom fue

modificada por el tratamiento conjunto con dichos AcM (% inhiiicion <lo, FS), siendo

prkticamente suprimida por d AcM IV.3 ( % inhnici6n=83S, ~ 5 ) .

Las proteinas cationkidas tienden a unirse con mayor eficiencia que las nativas a

las superfjcies celulares a travQ del establecimiento de intenmiones que involucran sus

grupos wgados positivamente y m o l ~ con carga negativa expresadas sobre la

mernbrana celular (182-184). La mayor capacidad citotoxica exhiiida por 10s CIcat podria

ser consecuencia de su habiilidad para interachm con gran avidez con la superfcie del

neutrofilo mererced a1 establecimiento de hemxiones electroesthticxu no espediicas. A fin

de testear esta hipcjtesis, se evaluo la capacidad & los A M dirigidos contra el RFcyII y el

RFcyIlI de bloquear la union de 10s CIc y CIcat a la qedicie del nmtr6filo. La union de

10s CIc he pdcticamente anulada por el w e n t o de 10s neutrofilos con el AcM IV.3

y el fkpento F(ab')2 del AcM 3G8 (P<O,Ol) (Figura 14), seiIalando la rxilmdeza

+ca & la union. Por el contrario, la uni6n de 10s CIcat fbe ~610 parcialmente inhibida

por el bloqueo conjunto de arnbos receptores (P<O,OS) (Figura 14), lo que sugiere la

participacion de mecanismos adsorptivos heqiedicos en su union a las m e d m a s

celulares. Este hecho fhe confirmado d determinar que 10s timocitos murinos, que no

expresan mayoritariamente RFcy (lo), h o n capaces de unir cantidades relativarnente altas

de CIcat (Figura 15).

Clc Estimulo

Clcat

figura 14. Inhibicih de la unih de CI por AcM dirigidos contra 10s RFcy. Los neutrofilos (5 x lo6) heron incubados durante 30 minutas a 4OC can fragmentm F(ab')z del AcM 3G8, el AcM IV.3, fragmentm F(ab')z del AcM 3G8 d s el AcM IV.3 o con medio de cultivo &lo. Luego fuerm lavados e incubados durante 30 minutos a 4OC con C1 solubles preparados con IgGh e IgGc anti-IgGh nativa (CIc) o cationizada (CIcat). Posteriorrnente, la unib de los mismos k e revelada por incubacih con el hgmento F(ab')z de IgGc anti-IgGh conjugada ccm ITCF. LQS datos e s h expresados como valores medios de &ensidad de fluorescmcia especifica * ES de 5 dadores.

Clc Clcat

Estimulo

Ffgunr 15. Uniim de CIcat a hoc i tm murinos. La thnocitos (2 x lo6) fimm incubados duraute 30 minutes a 4OC con CI solubles preparados con IgGh e IgGc anti-IgGh nativa (CIc) o cationizada (CIcat). Posteriormente heron lavados y la unih de 10s CI fbe mvelada por incubacih can fhgmtmtos F(ab'h de IgGc d-lgGh ccmjugada con ITCF. Los dabs esth expresados como valores medios de intensidad de fluoresceslcia especifica * ES de 3 dadores. Significacib estadistica: P<O,Ol, CIcat vs CIc.

En continuidad con 10s estudios previos, se evaluo si, tat como se habh obmado

con neutr6filos, 10s CIcat eran capaces de inducir niveles altos de citotoxicidad mediados

por monocitos. Los experimentos heron reabdos empleaado tres t ips difkrentes de CI

solubles, preparados con: ( I ) IgGh nativa como antigen0 y anticuerpos IgGc anti-IgGh

aativos (pl:5,8-82) o cationhdos (pI>9,1), (2) SAB y anticuerpos IgGc anti-SAB nativos

(pk 5,8-8,2) o cationizados (pH, 1) y (3) IgGh nativa (pk 5,8-82) o cationkida @I%, 1) y

anticuerpos IgGc anti-IgGh nativos. Los multados obtenidos (Figura 16 y Tabla 9)

indican que 10s CIcat indujeron niveles de citotoxicidad marcadamente superiores a 10s

obtenidos con CIc (P<0,01), a h cuando ddos fiieran empleados a concentraciones de diez

a cincuenta veces mayores.

En forma W a r a lo observado con neutrofilos, el tmtatniento con catalasa

(200pg/ml) inhio notablexnente la citotoxicidad inducida tanto p r CIc corn CIcat (%

inhibition > 86 en todos 10s casos, P<0,01, n=10), mientras que la SOD (200pg/ml) y la

catalasa inactivada por calor no ejercieron d o s . Estos haUazgos sugieren un papel

bdamental del H& en la citotoxicidad inducida tanto por CIc corn por CIcat.

Clc Estimulo

1 E, c a m €I E. conep E. h u m s I

Figura 16. Citdmicidad media& por manocitos inducida por Chat amtm clistintos tipos de cduh blanco. L a ~ossayos de citatoxicidad fueron desarrollados anfientando monocitos y eritroch de distintas especies wmo dlulas blamo durante 18 horas a 37°C en preseucia de CI preparados can I@ anti-IgGh e IgGb nativa (CIc) o cationizada (CIcat). Los resultados & qresados wmo la media aribn&ca * ES de 5 expe- ~~ xdhdos por triplicado.

Tabla 9. Citotoxicidad de monocitos inducida por CIcat.

Los CI solubles heron p r e p a h con IgGh y anticuerpos IgG de conejo anti-QGh, natives o d a n b d o s o SAB y auticuerpos IgG de cancjo anti-SAB, nativos o dmizacbs, en 5x exceso de -0. Los ensayos de c d a b x i a fueron desamllados &entando n e w @ y dlulas blanco por 18 horas a 3PC. Los redtack esth expresados como la media aritdtica f ES de n expe- difbreutes realizados por triplido.

4.2.1.7.- Rewuesia QL mahh-vor mtdrcifihv rnmitbs i m k ~ vor CIcaf

Los resultados descriptos en 10s ph.afos previos, indican que las respuestas

citotoxicas inducidas por CIc y CIcat involucran la generacibn de IRO. Las difkemias en la

magnitud de las respuestas obmadas en cada caso @an reflejar diferentes capacidades

de 10s CIc y 10s CIcat de inducir la achaci6n del &do respiratorio. Este aspect0 fire

analizado e v M o la respuesta QL como indicador general de la production de 1.0. Los

d tados obtenidos (Tabla 10) muestran que la emision de luz por neutrofilos y monocitos

h e rnarcadamente superior cuando las dlulas se estimularon con CIcat (P<0,01), a h

cuando estos fueron empleados a concentraciones diez veces menores respecto de 10s CIc.

Posterionnente se determino el papel de 10s diferentes RFcy expresados por

neutrofilos en la induccion de QL. En acuerdo con las observaciones referidas a la

induccion de citotoxicidad, la QL inducida por CIcat h e dependiente del RFcyII, mientras

que la inducida por CIc f ie mediada a trav6 del RFcyII y dd RFcyIII (Tabla 10).

Tabla 10. Emision de QL por neutrofilos y monocitos estimulados por CIcat.

Los CI solubles fueron preparados con anticwrpos IgG de conejo anti-IgG humana nativos e IgG humana nativa (CIc) o catianizada (CIcat). La seiial &xima de QL registrada en 10s 10 minutes posteriores a la estbulacih fue e q r d en unidades relativas de QL (URQL). Eh algunos casos, las &lulas f iem incubadas durante 30 min a 4°C con fragmentos F(abk del AcM 3G8 ylo el AcM IV.3, antes del aiiadido del edmulo. Los resultados se expreszm wmo la media arim&ica * ES de n experhentos &rentes realizados por duplicado. ND: No determinado.

4.2.1.8.- Likacion exirucehlar & e h i m - p w neufrofi10s estimuhdx con CIcat

Como se mencion6 pre!viamente7 el rol tisiol6gico de la elastasa leuwcitaria, incluye

la degradation de microorganismos invasores en las vacuolas ~ ~ c a s y la locomotion y

pen&6n de 10s neutroflos en 10s tejidos pexifhcos. Sin embargo, se considera que

junto a 10s IRO, la elastasa ample tambib un rol relevante en el daiio tisular mediado por

neutroslos (58,77,185). La habilidad de 10s CIcat de inducir la l i W o n de elastasa,

co- una medida apropiada de su capacidad de activar mecanismos citotoxicos

independientes del odgeno. Los resultados obtenidos pigura 17) mestran que la

liberacion de elastasa inducida por CIcat fbe signiscativamente superior a la inducida por

CIc (P<0,01), alcanzando niveles sirnilares a 10s observados por accion del FMLP (1 OW, que constituye un potente inductor de la degradaaon de neutr6filos.

Ninguno Clc Clcat FMLP

Estimulo

Figura 17. Liberaciim de elastasa por neutrbfilos estimulados por CIcat. La liberacib de elastasa en &lulas preincubadas con citmalasina B (lClg/ml), h e inducida por 100pg/ml de CI solubles preparados con anticuerpos IgG de cmejo nativos e IgG hurnana, nativa (CIc) o catimhda (Clcat) o por FMLP (10%). LQS mdtados esth expresados como la media aritm&ca + ES de 8 experimentm diferentes realizados por triplicado.

Por otra parte, a1 igual que lo observado en rehion a la induccion de citotoxicidad

y QL, la liberacion de elastasa inducida por CIcat fbe inhibida por el AcM IV.3 (P<O,Ol),

pero no por el fiagmento F(ab')2 del AcM 3G8 (Figura 18). Por el contmio, la libexmion

de elastasa inducida por CIc fbe si@cativamente inhibida por ambos AcM (P< 0,Ol)

(Figura 18).

Clc Clcat

Estimulo

P i 18. E ikb de 10s AcM anti-RFcys sobm la 1.- de elastasa mducida por CIcat. Los neutrMlos fberon incubados durante 30 min a 4OC con hgmentos F(ab')z del AcM 3G8 o cog el AcM IV.3. Luego, fueron incubados con citcdasina B (lpg/rnl) y la liberacih de elastasa fue mducida por CI solubles preparados can anticuerpos IgG de canejo nativos e IgG hurnana, nativa (CIc) o caticmizada (CIcat). Los resultados esth expresados como la media aritm&ca * ES de 4 experimentos &rentes realizados por triplicado.

La hkraccion de 10s CI con el RFcyII qxesado en plaquetas (1 86,187), es capaz

de inducir la -on plaquetaria y la l i i h del contenido de sus gtindos eqeciflcos

(188-191). Independienternente & estas observaciones realizadas in viao, el rol

fisiopatol6gico del RFcyII plaquetario, no ha sido a h d lec ido . A difkencia del papel

de 10s RFcy expresados en fhgocitos, su posible participation tanto en la respuesta inmune

anti-infecciom, como asi tambib en f k d m m s hmo&icos ylo de autoimnunidad,

wnstituye un interrogante abierto.

Difkrentes autoanticuerpos presentes en el suer0 de pacientes con LES han sido

camc tdos . Entre ellos, aqudos con eqedicidad por ADN y por fbsfolpidos

anioniws han recibido una ahmion particular (192,193). Numerosos trabajos han

establecido la existencia de &dad cruzada entre ambas f lunib de anticuerpos (169-

171). Como se menciono previamente, 10s anticuerpos anti-ADN, especialmente aquellos

que presentan altos PI, parecen jugar un papel hdamer&d en la patoghesis de la

glomerulonefiitis y tal vez en otras manifestaciones autoinmunes del LES (1 69- 1 7 1). Por

otra parte, 10s anticuerpos anti-fosfolpidos, participan en la induction de fenomenos

tromboembblicos asociados al LES y a otras patologias de naturaleza autoinmune (169-

171). Dentro de 10s misrnos, se ha i d d c a d o a una subfkdia de anticuerpos con altos pl

(RUIZ ArguelIes, Universidad de Puebla, MQrico, comunicacion personal). Considerando:

(a) la marcada eficiencia que presetrtan 10s CI preparados con anticuerpos cationizados de

inducir la activation de &lulas iig0citic.a~ a trav6 de 10s RFcy, (6) la presencia de

anticuerpos cationicos en el suer0 de pacientes con d d o n e s tromboembblicas, y (c)

la prevalencia de fenomenos de agregacion plaquetaria en dichas d d o n e s , se d u o

el impact0 de la carga elktriai de 10s anticuerpos IgG sobre la capacidad de 10s CI de

inducir la activation de plaquetas humanas. Para ello se ernplearon, en todos 10s casos, CI

solubles preparados en 5 veces aceso de antigeno, con anticuerpos IgGc anti-IgGh e IgGh

nativa (CIc) o cationizada (CIcat).

4.2.2.1.- Determination &I tama)?io molecular ik Im Cl preparados con I& hrrmana

ca t i~~~~zaQb

El tamafio molecular de 10s CIc y CIcat h e determinado por ul-on en

gradientes de densidad de sacarm. Contimando resultados prelimhares obtenidos por

tkmicas de tamizaje molecular (datos no mostrados), no se observaron &en& en el

tamaiio molecular de ambos t ips de CI (Fjgura 19). Por otra parte, en comrdancia con

lo quest0 por otros autores (142,144,177), se determino que la IgG permanece en estado

monomkico luego del procedimiento de cationbaei6n (Fzgura 19).

0 20 40 60 80 100

Porcentaje del volumen del gradiente

I + lgG humana -A- Ck -m- Clcat I

Figura 19. Canjmacih del i m S o molecular & los CIc y CIcat por &w&dbgacih en &a& d u o s de mama. La CI fkm prepados en 5 veces aceso de antigen0 qleando anticueps IgG de canejo anti-IgGh e IgG human nativa (CIc) o caticmjzada (CIcat).

Empleando PRP se anaW, en primera instancia, la capacidad de 10s CIcat de

inducir la e o n plaquetaria. Los resultados obtenidos (Figura 20A) demostraron que

10s rnismos constituyen potentes agonistas plaquetarios. Es importante destacar que las

respuestas descriptas fireron inducidas empleando muy bajas concentmciones de Clcat (1,5-

3Opg/ml) y m niunero fisiologico de plaquetas (3 x 108/ml). Los CIc, por el contmio,

k o n incapaces de inducir niveles signdcatkos de apgacion, a h a1 emplearse en

concentmiones tan altas como 500 d m 1 (Figura 20).

Pcigina 71

. . s w Clcat (1530pg/mi)

c 60 - :2 0 (P

40 - Clcat (as/mJ

L

P 20 - Clcat (1, wg/mJ - --------lc(509us/mJ

F i a 20. AgregaciQ p l a q u h inducida pol CIcat en PRP. Las cc#1cmtraciones de CIc y CIcat indicadas entre parhsis fueron aiiadidas a1 PRP (400 p1, 3 x 10' plaquetas/ml). La figura muestra un experimmto representativo de 10s 15 realizados.

La preincubacion de las plaquetas durante un minuto con 5mM de EDTA (n=5) o

1@ml de Prostaglandins El (A) su+o la agqpwion inducida por 15-30cls/ml de

CIcat (% inhibition > W?). Eillo indica que la respuesta observada constituye un fenomeno

metabblicamente activo, es deck, no qmxmta aghdnaaon plaquetaria. La IgG

cationhda no tuvo efectos per se sobre la agregacion plaquetaria, a h cuando k a

empleada a concentmiones tan elevadas como 200pglml.

Posteriomente, se Se la capacidad de 10s CIcat de actuar como agentes

primantes de respuestas plaquetarias inducidas por 10s agonistas habitdes. La

preincubacion del PRP con concentraciones de CIcat inferiores a las requeridas para inducir

la ag~gacibn plaquetaria (0,5-l&ml) increment6 marcadamente la agr@6n inducida

por c o n d o n e s suboptimas de ADP, PAF, epinefiina o PMA (P<O,Ol) (Tabla 11). De

hecho, en phquetas pincubadas con CIcat, la primer ola de agegacion inducida por ADP,

PAF o a d r e fie seguida por una segunda ola de agregacion asociada a h'beraci6n de

ATP (TabIh- I 1 y Figura 21). La prehcubacion del PRP con CIc se mostro, por el

c o h o , incapaz de potenciar las respuestas inducidas por 10s rnismos agonistas.

Pdgina 72

Tabla 11. Potenciacion por preincubacion con CIcat de la agregacion plaquetaria y de la liberacibn de ATP inducida por diferentes agonistas.

Una suspensih de 400 ul de PRP (3x108 plaquwml) fbe incubatla durante 1 minuto a 37°C en presencia (+) o ausencia (-) de cancatracianes de CIcat ideriores a las necesarias para mducir la agregacih (0.5-1 pg/ml). Luego, la agmgacih plaquetaria y la liberacih de ATP fue inducida por concantraciones subumbrales de di&mtes agcmistas. Los resultados son expresados como porcentajes, &ridos a los niveles miximos de agregacih plaquetaria y poles of ATP liberados. Los valores represePltan la media aritmt5t.b ES de (n) experhtmtos diikrentes. ND: no determinado

Clcat + ADP

Flgura 21. Efkh de conmtmcimes sub6phas de CIcat sobre la agregaci(m inducida por ADP. El PRP (400~1, 3 x 10' plaquetastml) fue incubado durante 1 minuto a 37°C con concentraciones de CIcat hfbriores a las requeridas para inducir agregacih (0,5pg/ml). Luego, la agregacih plaquetaria h e mducida por concentraciones subumbrales de ADP (0,5CLM). Se indican tambib las respuestas de agregacih inducidas por CIcat (0,5pg/ml) o ADP (0,5pM) siilos. La figura muestra un exprimento repmenmivo de los 5 realizados.

Se emmino luego, la capacidad de 10s CIcat de estimular la activacion de PL. Se

evaluo no dlo la agregacion plaquetaria, sino tarn&& otros paritmetros de activacion tales

como la libemion de ATP y la production de Tromboxano & OX&). LQS CIcat, aim

empleados a muy bajas c o n d o n e s (1-4C18/ml), indujeron una potente agrewon de

PLY remqxdidas a concentmiones fisiol6gicas Figura 22). Bajo shi lam condiciones

10s CIc k o n incapaces de inducir la agregacibn de PL (Figura 22). Solo se observaron

niveles significativos de agregacibn (% de e o n : 35k2, n=5) a1 emplear

sirn*eamente altas c o n d o n e s de plaquetas (9 x 108/ml) y CIc (500pg/ml)

(P<0,05).

Cleat (4Wml)

Cleat ( w m r )

Cleat (lpgAml) Cle (1OOpgAmQ

Figura 22. Agregacibn de PL inducida por CIcat. Las PL (400~1, 3 x 108/rnl) fberon estimuladas con CIc y CIcat a las concentracianes indicadas. La figura muestra los resultados correspondieates a un experimento representative de los 15 realizados.

Considerando que el proceso de lavado podria preactivar a las plaquetas,

tornhdolas susceptibles a ser activadas por concentmiones wlxjptimas de agonistas, se

decidi6 d u a r el efecto de 10s CIcat sobre PF. Los CIcat indujeron agregacion y libemion

de ATP en niveles sitnilares a 10s observados empleando PL (Figura 23 A y B). La

preincubaci6n de las plaquetas con EDTA (SmM, n=4) o Prostaglandins El (1 clg/ml, n=4)

suprimio la respuesta de agregacion y la liberation de ATP estim- por CIcat (4pg/ml)

tanto con PL como con PF (% inhibition > 92%, en todos 10s casos).

Figura 23. (A) Agregaciin de PF y & PL inducida por CIcat. (B) Liberacih de ATP por PL y por PF inducida por CIcat. Las PL y las PF (400~1, 3 x 108hnl) fireron esljmuladas can 4-5pgIml de CIcat. Los mdtados estin expresados como la media arhndtica * ES de 4 (A) o 5 (B) exj~rimentm di&mtes.

La agregacion plaquetaria inducida por 10s CIcat estuvo asociada a la produccion

de 'IXBz (Tabla 12). Al empleame bajas concentmiones de CIcat (1-1,5pg/ml), ambsls

respuestas fieron completarnente inhibidas por princubacion con aspirim (P<0,01) (Tabla

12). Por el contraiio, a altas concentmiones de CIcat (4-5clg/ml), la agregacion se mostro

levemente disrnirmida (P<0,05), mientras que la produccion de TXBz f ie completarnente

suprimida (P<O,Ol) ( T d h 12).

Tabla 12 Agregacion de plaquetas lavadas y produccion de TxB, inducida por CIcat. Inhibition por aspirins.

Una suspemiirn de 400 ul de plaquehs lavadas (3 x 10' plaquetadml) fie incubada durante 3 minutas a tmpemhm ambiente ea presencia (+) o awncia (-) de aspha (1pM). Luego, la agregacih platpetaria y la liberacih de TX& fuercm inducidas por las concentraciones indidas de CIcat o acid0 ~~ (M). Los resultados e d n expresados como porcmtajes de agmgacih y ng/rnl de TXB2. Cada valor repmsmta la media aritm&ca * ES de 5 experimembs e x p r h m b s . ND: No dete*.

4.2.2.4.- Inhibicih-mr-mlianiones & la ammcih ~laouetmia inducih m r CIcat

La notable capacidad de 10s CIcat de inducir activation plaquetaia podria ser

explicada, a1 menos pardmente, por un increaeno en la avidez de 10s CI por el RFqII,

debido a interacciones electrostiticas inespedicas establecidas entre 10s grupos cargados

positivamente expresados en 10s CIcat y 10s fbsfolpidos anionicos de la super£icie

plaquetaria. Para testear esta hipi,tesis, se estudio la capacidad de distintos compuestos

poliani6nicos de &iir la activacibn plaqmtam eshdada por CIcat. El pretmhmiento de

PL con heparina suprimi6 la agregacion inducida por CIcat, sin modificar la respuestas

inchicidas por kid0 araquidonico, PAF o trombina (Tabh 13).

Tabla 13. Efecto de la heparina sobre la agregacibn p1aqueta-h inducida por CIcat.

Las PL (400$, 3 x 10~/rnl) &em preincubadas durante 1 minuto a 37°C con heparina (0,OSUhnl). Luegw, la agqpcih phptana he inducida wn 4pg/ml de CIcat, 0,3mM de AA, 5nM de PAF o 1U/ml de trombina. Los resultados esth expmsacbs camo la media aritndica * ES de 5 mq>enmartos*w.

La accion de la heparina se cornlacion6 con una disminucion marcada en la union

de 10s CIcat a la superhie plaquetaria, aid& por citometrh de b j o (% inhibicion:

67k8, ~ 5 ) . Se obtuvieron resultados similares a1 ensayar el efecto de un segundo

polhion, el dextrh suWo (2O&ml), sobre la agregacion plaquetaria inducida por

4Mml de CIcat (% inhibicion: 96a6, n=5).

4.2.2.5.- lWtmlacih de la epresidn r;fe P-selectim -par CI _we_& con I&

cationi&

Con el objeto de analizar si la activation plaquetaria inducida por CIcat, requeria la

intenmion plaqueta-plaqueta, se &o cotno marcador de activation temprano, la

expresion de P-selectjna en un sistema sin agitaci6n. Bajo estas condiciones se observo que,

a h en ausencia de agregacion plaquetaria, 10s CIcat k o n capaces de inducir un marcado

increment0 en la expresion de P - s e l h (P<O,Ol) (Figura 24).

Ninguno Trombina

Estimulo

Figura 24. Expresh de P-selecba por plqudas e s t h M a s can CIcat. Una smpmsiim de 4OOpl de PF (3 x 1 o8/ml) he incubada m prexncia de 4&ml de CIcat o 1Ulml de trombina durante 10 minutos a 37°C sin agitacih. Luego las PF f h m incubadas can un AcM anti-Pseleceina cturante 30 minubs y la unib fbe revelada con un anticuapo de cabra anti-IgG de rath coojugado con lTCF. Los mdtados esth expmdos como la media aritm&ca * ES de 4 experbentos ~~.

A diferencia de 10s resultados obtenidos empleando neutrofilos y monocitos se

mntro, de mod0 inesperado, que la IgG humana casionkuia era capaz per se de inducir

agregacion de PL. Sin embargo, las wncentraciones de IgGcat necesarias para inducir un

5% del valor m k h o de agregacibn (18,BO,8Crg/ml), demostnuon ser 8 veces superiores

a las requeridas para alcanzar la mima respuesta e m p l d o CIcat como estimulo

(2,3M,3cl8/ml). Otras proteinas cationbadas, tales como la OA (pl 9,4) o la SAB (pl: 9,l)

k o n incapaces de inducir &on plapuetaia suin cuando heran ensayadas a altas

c 0 M o n e s (200vg/ml).

La agregacion inducida por IgGh cationhub (35~43/ml) h e inhibida por 0,05U/ml

de heparina ( % inhibition: 95*4, n=4), la cual a su vez suprimi6 en forma rnarcada la union

de la IgGh cationizada a la superlicie plaquetaria (Oh reduceion en la IFM: 77k8, P<0,05,

rr=4).

Pcigina 78

4.2.2.7.- Rol de RFcYITI en la -phmetrma inalucidb vor CIcat

Se eduo luego, la participation del RFcyII en la agregacion plaquetatia inducida

por CIcat. El pretratamiento de PL con el AcM IV.3, inhibio en f o m prkticamente total

la agregaCon inducida por CIcat (Fgura 25). Se obtuvieron resultados similares a1 analizar

el efkcto del IV.3 sobre la agregacibn inducida por IgGh cationizada (Figura 25). La

pkubacion de PL con IV.3 no modifid las respuestas de agepion inducidas por

otros agonistas como el ADP (2,5CLM) o el cobeno (lpglml) (datos no mostrados). Se

obtmieron redtados similares ernpleando PRP y 30 &ml de CIad como agonista (datos

no mostrados).

Estimulo

Figura 25. Rol del RFcyII en la agregacih pkpehna inducida por CIcat o IgGcat. Una suspensih de 400pl de PL (3 x 10' plaquetaslml) fie incubada 20 minutos antes de la adicih del atitnulo con concentraciones saturantes del AcM IV.3. Luego, la agregacih fie inducida con 4pg/ml de CIcat o 5Opg/ml de CIcat Los resultados estain expresados como la media aritm&ca * ES de 3 experimentos difereaks.

Por ob'a parte, se observo que la prehmbacion del PRP con IV.3, andb el

skrgbmo en la respuesta obtenida con conmtraciones wbbptimas de ADP y CIcat. De

hecho, en presencia de IV.3 no se observ6 una segunda ola de agqacion inducida por la

accion conjunta de ambos agonistas, oluoque la primer ola causada por el ADP no fbe

modi6cada (Figura 226).

CIcat + ADP

F i a 26. Rol del RFcyII en la agregacib plaquetana inducida por CIcat y ADP. El PRP (400pl, 3 x 10~~laquetas/rnl) f ie incubado 20 minutos antes de la adicion del estimulo con concefltraciones saturantes del AcM IV.3 a temperatura arnbiente. Luego f ie incubado durante 1 minuto a 37°C sin agitacih con concentraciones no agregantes de CIcat (0,5pg/ml). Posteriomente, la agregacih f ie inducida can concmtraciones subumbrales de ADP (0,5pM). La figura muestra un experimento representative de 10s 3 realizados.

En un p p o adicional de experirnentos, se evaluo la habilidad del AcM IV.3 de

inhibir la union de 10s CI a la superflcie plaquetaria. Pese a su capacidad de suprhb la

activation plaquetaria inducida por CIcat, el AcM IV.3 siilo indujo una leve reduction de la

union de 10s CIcat a las plaquetas (Oh inhibition: 24k4, P<0,05, n=5).

423- A dw&h de neu ~ h u ~ ~ c i r l b m C Z ~ c o v r t i . a c c i o n e s

Los resultados expuestos previamente indium que la capacidad agonista de 10s CI

resulta notablernente potenciada a1 incrementarse 10s pl de las IgG nativas a valores

comprendidos en el rango 8,s-10,O. Considerando el alto grado de heterogeneidad presente

en 10s pl de las IgG nativas @L5,8-8,5), se decidio analizar la posible existencia de

diferencias en su actividad, en hci6n de sus valores partiadares de PI. Con este objetivo

se aislaron por tknicas de cromatOenfOcado hcciones anionicas y cationicas de

anticuerpos IgG a partir de: (I) sueros inmunes obtenidos en conejo y (2) un pool de IgG

hurnana normal. Los pI de cada una de las fiacciones fberon con6irmados por

isoelectroenfbque (Figura 27).

Figura 27. Isoel-e de las lascciones aniinicas y catiinicas de la IgGh aisladas por cmmbak& a partir de un pool de IgGh n d . Calle P, patrones de IEF. Calle 1, lascciirn aniinica de la IgGb nab. Calle 2, fiacciin c a t i k de la IgGh h.. Calle 3, IgGh total a partir d e l a c u a l s e a i s l a r o a l a s f r a c c o n e s ~ c a y ~ .

Un primer grupo de experimentos fbe llevado a cabo con CI solubles preparados

con anticuerpos IgGc anti-IgGh y la Eracch anionica @1:6,0-6,4) (CIan) o cationica

@1:7,6-8,s) (CIcac) de la IgGh nativa. Se investigo su capacidad de inducir el carnbio de

forma de neutroflos humanos, lo que constituye una respuesta temprana de activation

leucmitaria (1 94,195). No se observaron diferencias en la extension del carnbio de forma

inducida por 10s dos t ips de CI (Figura 28). La Figura 29 muestm un expimento

representative de 10s seis realizados.

Ninguno Clan

Estimulo

Clcac

F i 28. Ekto de 10s Clan y CIcac sobre el cambio de &ma de neutrM05. El ensayo fbe realizado mpleando IOOClghnl de CI preparados can Manes anibica o catihica de IgGh nativa y a n t i c u e ~ ~ ~ ~ IgGcanti-I&&. Los resuttados h e x p m a d o s cam0 eltamaiiomedio relative ( T M R ) ~ E S d e 6 e x p ~ ~ .

Figura 29. E & o de 10s CIan y CIcac sobre el cambio de fim de neutn%los. El awyo fie reabdo qleando 1OOct9/ml de CI prepdos can fiatxiones aniinica o caticklica de nativa y anticuerpos I@ anti-IgGh. El e k h del FMLP ~o-'M fie evaluado como cmtro1 p0sit.i~. Los histogramas son r e p ~ v o s de un dador de 10s 6 evaluados.

Pagina 82

Empleando 10s CI solubles d&ptos en el piurafo precedente y otros preparados

con SAB y la kiwion anionica (gl: 5,9-6,2) o cationica (pl: 7,5-7,8) de anticuerpos IgGc

anti-SAB, se examino su capacidad de inducir la emision de QL y la Iikacion de el-.

Los CIc y CIcac indujeron respuestas &nilares para todas las relaciones antigen01

anticuerpo analizadas (Tabla 14).

Tabla 14. Emision de QL y liberation de elastasa por CI preparados w n fiacciones anionicas y cationicas de anticuerpos IgG.

Ambas respuestas fueron inducidas por lOOpg/ml de CI solubles preparados con hcciones aniirnicas (CIan) o catihicas (CIcac) de IgGh empleada can0 antigen0 e IgGc anti-IgGh o CZ krmados con SAB y fiaccianes anibicas (CIan) o catihicas (CIcac) de anticuerpos IgGc anti-SAB. Los datos esth expresados como la media M c a * ES de n dadores evaluados por duplicado.

Teniendo en cuenta las diferentes propiedades que presentan 10s CI solubles y

partiddos (1 19,129), se detemino si 10s CI particulados preparados con anticuerpos IgG

nativos de distintospl, presentaban diferencias en su actividad biologics. Como mode10 de

CI partidado, se emplearon Ep sensibilizados con dcuerpos IgG eqedficos de conejo

co~espondientes a las himiones anionica 6,3-6,s) o cationica @L 7,8-8,0), en thdos

Pdgina 83

equivalentes. Estos CI k o n utilizados para &uar su capacidad de esthula~ la QL y la

CCDA mediadas por neutrofilos (Figura 30). Los resultados obtenidos indicaron, en

acuerdo con lo observado para 10s CIS, que la actividad de 10s CI particulados no sere en

hcion & 10s valores particukes de pl que presentan 10s anticuerpos IgG nativos que 10s

conforman.

Clan rn C/cm L J

lEFgurn 30. CCDA y emisih de QL inducidas por IgG-Ep. La CCDA (A) y la QL (B) fieron inducidas por Ep sensibilizados con difbrmtes d d e s de fiaccimes anibicas y catibicas de IgGc anti-Ep, enpleando relaciones neutr6filo:Ep de 1: 1 para la CCDA y 1:5 para la QL, r e s p e & i w . Los dsrtos esth expresados como la media aritm&ica * ES de 6 dadores evaluach por triplicado.

La notable actividad agonista que presentan 10s CI preparados con IgG cationhuh

in vitro, se encuentra asociada, tal como se ha mencionado previmente, a1 establecimiento

de interacciones adsortivas hespecificas, insensiiles a1 bloqueo de 10s RFcy con AcM

espedicos. La ausencia de diferencias en las requestas inducidas por CI preparados con

anticuerpos IgG nativos de distintos pl, podria rdejar la incapacidad de las fracciones

cati6nicas & la IgG nativa de establecer uniones electrosuiticas i n e m con la

superficie celular. En apoyo a est. hip6tesis se observo que, 10s CI preparados con

anticuerpos IgGc anti-IgGh y la flawion anionic8 o cationic8 de la IgGh, no dIo exhi ion

niveles semejantes de union a la suwcie de 10s neutrofilos piguru 31), sin0 que ademis

dicha union h e inhibida en forma prhctimente total, por el W e n t o cojunto con 10s

AcM IV.3 y 3G8 (% de inhibiciin > 85, P<O,Ol, 16)).

Clan Clcac

Estimulo

F m 31. Unih cle los CIan y CIcac a la supedcie de 10s wutrbfdos. Los neutrSlos (40Crl, 5 x 10'hnl) fUeron incubados el -cia de 1OOClghnl de Clan o CIcac durante 20 minutm a 4°C. ~ f u e r m h M d o s y l a u m i i n d e l o s C I f t e r e v e l a d a c o a d ~ ~ e r p o s d - ~ d e a n e j o txmjugah ccm ITCF. Los refllltados estim e x p d como la inkmidad de f l u o m c i a media ( I F M ) * E S d e 2 1 e x p e r k n t o s ~ .

Considerados en conjunto, 10s resultados M p t o s indican que a diferencia de 10s

anticuerpos IgG ca t i odos in vitro, que presentan altos valores depI (8,5-10,0), la carga

elktrica de 10s anticuerpos IgG nativos no afecta su capacidad de inducir la activation

celular a trav6 de 10s RFcy.

La capacidad de 10s antigenos proteicos de depositarse y persistir a nivel tisular

constituye una propiedad patogtkica relevante capaz de condicionar la severidad de las

lesiones r d e s y articulares en distintos modelos de glomerulondiitis y artritis. La MBG

(196-198), el cartilago y el sinovio (199,200) poseen sitios anionicos capaces de actuar

como receptores para antigenos cationicos, incrementando la persistencia de 10s mismos en

estos tejidos. Las proteinas con alta carga eldctrica poseen entonces, un potencial

mflitoghico y arhitogbico superior, en virtud de su capacidad de unirse superficies

anionicas y predisponer a la fonnacion CI in siru (144,20 1,202). Los trabajos desarrollados

hasta el present, concemientes a la capacidad de las proteinas cationicas de inducir lesiones

renales y de actuar como potentes artrit6genoq se han limitado a la evaluation de las

manifestaciones clinicas de las mismas o a la examination histologica de 10s cambios que a

ellas subyacen. Los experhentos que se describen a continuation, k o n realizados con el

objeto de determinar si la carga eldctrica antighica, a1 igual que la carga elktica de 10s

anticuerpos, es capaz de condicionar la capacidad de 10s CI de inducir respuestas

prointlamaorias a travks de 10s RFcy.

4.2.4.1. - Reqestas med& -par ctlular-fapiticas es t r 'mub -mr CIvre-par& con

antipenm catrcatroniz-&s

Se prepararon CI solubles con anticuerpos IgGc nativos y OA nativa (pl: 43) (CIc)

o cationizada @I: 8-9) -CIcat(Ag)-. Los mismos ikeron empleados en ensayos de

citotoxicidad, emision de QL y liberation de elastasa Los resultados obtenidos indican

que, en todos 10s casoq 10s CIcat(Ag) indujeron respuestas notablemente superiores

respecto de aquellas inducidas por 10s CIc (P<O,Ol) (Tabla 15). La OA cationizada fix

incapaz per se de inducir respuesta significaiivas (Tabla 15).

Tabla 15. Respuestas mediadas por neutroflos y monocitos inducidas por CIcat(Ag).

Las diftennts respuestas fieran inducidas por 100 pg/ml de CI solubles preparados con OA nativa (CIc) o catimkada -CIcat(Ag)- y anticueqos IgG de conejo nativos o con lOOpg/ml de OA cationizada. Los resultados & expresados como la media aritm&ica * ES de n experimentm d&r&es realizados por duplicado o triplicado.

Los resultados obtenidos fireron contkmdos, en m segundo grupo de

experimentos, empleando CI preparados con a n t i c u m IgGc nativos y SAB nativa (pl:

43) (CIc) o cationizada (pl: 8-9) -CIcat(Ag)-. Nuevamente, 10s CIcat(Ag) indujeron

requestas sustmdmente mayores respecto de 10s CIc (P<O,Ol). No obstante, las mismas

fberon menores a las obtenidas con 10s CI preparados con anticuerpos IgGc cationizados

@I > 9,l) y SAB nativa. A fin de obtener niveles similares de respuesta, 10s CIcat(Ag)

debieron ser empleados a concentraciones cinco veces mayores respecto de 10s CIcat(IgG)

(Tabla 16).

Tabla 16. Respuestas mediadas por neutroflos inducidas por CIcat(Ag).

Las respuestas fueran inducidas por CI solubles preparados can anticuerpos IgGc anti-SAB natives y SAB nativa (CIc) o cationhda -CIcat(SABcat)- o con CI fbrmados con IgGc anti- IgGh nativa e IgGh cationizada -CIcat(IgGcat)-. Los resultados e s t h expresados como la media arkmhtica ES de 3 difi3rat.m realizados por duplicado o triplicado.

Los resultados presentados indim que, no ~610 la cationizacion de 10s anticuerpos,

sino tambih la de 10s antigenos potencia notablemente la capacidad de 10s CI de inducir la

activation de eklulas fagdcas.

A fin de analizar la participation de 10s diferentes RFcy en la respuesta QL

estimulada por CIcat(Ag), se ernplearon 10s AcM IV.3 y el hgmento F(abth del AcM

3G8. Los dos mticuerpos inhibieron si@&amente las respuestas inducidas tanto por

CI preparados con OA nativa como por aquellos preparados con OA cationkada (P<O,OS)

(Rigtrra 32). Para ambos CI, la emisi6n de luz fbe supimida por tratamiento conjunto con

10s dos AcM (Figu~a 32). Estos resultados indican que, a diferencia de lo observacio con

10s CI preparados con anticuerpos IgG cationhdoq la QL inducida por CIcat(Ag) es

dependiente no &lo del RFcyII sino tambih del RFcyIII.

Clc Cl@(AQ)

Estimulo

Figura 32. Rol de 10s RFcys an la emisih de QL indwida por CIcat(Ag). Los CI solubles fueron preparados can anticuerpos IgGc anti-OA y OA nativa (CIc) o cationkcla -CIcat(Ag)-. Las &Iulas fuenm incubadas durante 30 minutos a 4°C coa -tos F(ab> del AcM 3G8 ylo el AcM IV.3 antes &l aiiadido del esthulo. Los redtados es th expresados como expresados como la media arimkica It ES de 4 experhentos &rentes realizados por duplicado.

Las plaquetas expresan un dl0 tip0 de RFcy, el RFcyII (25). Los resultados

mostrados en el phafo anterior sugieren que, al menos en neutrofilos, la activation

inducida por CIcat(Ag) requiere la participacibn de 10s RFcyII y RFcylII. Podrian 10s

antigenos cationizados potenciar la actividad de 10s CI en sistemas celulares que sblo

expresasen el RFcyII ?

Con el objeto de responder a este interrogante, se seplearon CI preparados con

anticuerpos IgGc nativos y OA nativa @1: 43) o cationizada (pL8,O-9,5). Se evaluo, en

primer lugar, su capacidad de inducir la agregacibn plaqwtaria utilizando PRP. A diferencia

del comportamiento observado con 10s CI formados con IgG cationkada, 10s CI

preparados con OA cationizada k o n in- de inducir la agregacion plaquetaia

Pigura 33).

Clc Clcat(Ag) Clcat(lgG)

Estimulo

F ' i i a 33. Agregacih de plaquetas inducida por CIcat(Ag) en PRP. La gregacih f ie mducida por el afiadido de CI preparados con IgGc anti-OA nativa y OA nativa (CIc, 100pg/ml) o c a t i h d a -CIcat(&), 100pglml- o CI preparados con IgGc anti-IgGh e IgGh cationizada CIcat(IgG), 15pglml- a 400d (3 x 10' plaquetas/ml) de PRP. Los datos & expresados como la media h & c a * ES de 8 dadores d&mntes.

Se analid luego su capacidad de estimular la activation de PL. Los CI que incluian

OA cationizada indujeron niveles altos de agrqpcion y liberation de ATP. Por el contrario,

aquellos CI formados con OA nativa no indujeron respuesta alguna Figura 34). Merece

destacarse, sin embargo, que 10s CI preparados con OA cationkb rnostraron menor

potencia agonista, respecto de aquellos preparados con IgG cationizada. Es por ello que, a

fin de obtener respuestas shilares, 10s CI preparados con OA cationionizada debieron

emplearse a concentraciones cinco veces superiores (Eigura 34).

Clc ClCWVJ) C l W w ) 1 oO~g/ml 2 W m l Spglml

Estimulo

- Clc clcat(Ag) Clcat(lgG)

10011g/ml 251rg/ml 5pglml

Estimulo

F3gura 34. Activacik de plaquetas lavadas inducida por CIcat(Ag). Una suspeasih de 400 ul de PL (3 x 10' plaquetaslml) f ie estimulada cm CI preparados con IgGc anti-OA nativa y OA nativa (CIc) o cationizada -CIcat(Ag)- o can CI preparados con IgGc anti-IgGh e IgGh cationizada -CIcat(IgG)-, determiuhdose la agregaciiw plaquetaria (A) y la liberacih de ATP (B) en forma simukinea. Los data e&hn eqresados como la media aritmbtica * ES de 7 dadores evaluados por duplicado.

En acuerdo con lo esperado, el AcM N.3 inhibio en forma prhticamente total la

agregacih de PL inducida por CI preparados con OA cationizada (Figura 35). Asimismo,

Pdgina 90

en presencia de heparina se observo una inhliicion de la agregacion superior a1 90%

(Figura 35).

Medio Acid IV.3 Heparina

Tratamiento

F m 35. Inhibiciim de la agregacih de PL por el AcM anti-RFcyII o por heparina. Una suspensitm de 400 ul de PL (3 x 1 0 ~ l a q ~ m l ) fie incubada 1 minuto antes de la adicih del estimulo con AcM IV.3 (lpg/ml) o heparina (0,05 Ulml). Luego, la agregacib fie inducida por 25pglml de CI preparados can IgGc anti-OA nativa y OA caticmizada. Los resultados estam expresados como la media aritm6tica * ES de 4 experkatis realizados por duplicado.

Por idtirno, en las experiencias realizadas a fin de determjnar la expresion de P-

selectina en ausencia de agregacion plaquetaria, se observb que 10s CI preparados con OA

catibnica estimularon su expresion en niveles significativamente superiores a 10s inducidos

por 10s CIc (P<0,05) (Figura 36).

Ninguno Clc Cl=t(AQ)

Estimulo

I 5 p a 36. Eqresiin de P-seledua por plaqWas t shuUs con CIcat(Ag). Una mjmsiin de 400d de PL (3 x 10*/rnl) ibe incubada durante 10 miuutos a 37°C sin agitacih con CI preparados con IgGc anti-OA nativa y OA nativa (CIc) o cati&da -CIcat(Ag)- (25pg/ml) o con CI preparados con IgGc anti-IgGh e IgGh caticmizada -CIcat(IgG)- (5pg/ml). Luego las PL fUeron incubadas am m AcM anti-P-selectina durante 30 minubs y la unih fue revelada con tm segundo a u t i q de cabra anti-IgG de ratin c a n . cun ITCF. Los resuhados estim expresados wrno la mediaardm&ca~ESde4experimentosdifk~.

Considerados en conjunto, estos resultados sugieren que, no ~610 la donizacion

de la kiwion anticuerpo de un CI, sin0 tambih de su hccion antighica, potencia

notablemente su capacidad agonista.

Los neutrofilos juegan un papel preponderante en la d e f i del huesped, debido a

que rbpidamente acuden a sitios de invasion mirnicrobiana en respuesta a la production in situ

de edmulos quimiotiicticos (56,203). Estos estjmulos son 10s responsables de orientar la

migracion d a r a traves de la genemion de un @ente positivo de concentration, es

decir, desde un iuea camcterizada por la presencia de bajas c o n d o n e s de &ulo

hacia otra donde &e al- su mavrima c o n d o n (204). El mecanismo quimiothtico

involucra la union del atmetante a recqtores eqedlicos sobre la membrana plasm&ica, la

adherencia reversible de las &lulas a1 endotelio o a la matriz extracelular, la deformation

celular, que les permite atravesar espacios intercellulaes y la I i o n de distintos

mediadores leuCOCitarios, que en algunos casos ampliflcan la respuesta idamatoria y en

otros la limitan (203-207).

Se han identificado numerosos h u l o s quimiothticos para 10s PMN. Entre ellos

figuran productos derivados de la actkcion del sistema complemento, particularmente el

C5a (208-21 l), pdptidos fonnilados bacterianos (212,213), c i t m produeidas por

leu&os (2 14) y factores derivados de PMN activados (942 1 5,2 16).

La capacidad de 10s CI de inducir quimiotaxis de neutrof3oq ha sido

tradicionahmte adjudicada, a su habilidad de activar a1 sistema complemento con la

consecuente generation de C5a (217,218). Estudios desarrollados por W W n , no

obstante (219), han demostrado que la IgG humana agregada por calor induce per se la

migration de neutrofilos humanos. En el mismo sentido, Arashi y colaboradores (220), han

indicado que las Ig monom6rica.s de rata son capaces de inducir la locomotion celular.

Otros investigadores, por el contrario, han ddescpto la incapidad tanto de la IgG

monomkica como de la IgG agregada, de inducir la migracion de neutroflos (221,222).

No existen trabajos previos que hayan establecido la capacidad de 10s CI de estimularper

se la mimigron de neutroflos. Este aspect0 ad@= un relieve notable a la luz de trabajos

recientes dmoIlados m vivo por Sylvestre y &etch (126), sugiriendo que la induction

del infiltrado &&CO en las d o n e s infhnatorias de tip III involucraria una &on

directa de 10s CI, no mediada a travQ de la activation del sisterna complemento (8). Los

redados que se presentan a continuation ddemuestran la habilidad de 10s CI de estimular in

via0 la quimiotaxis de 10s neutrofilos.

A fin de evaluar la capacidad de 10s CI de inducir la migracion de neutrofilos, se

utilizaron CI preparados con (I) IgG humana y anticuerpos IgG de conejo anti-IgGh y (2)

OA y antiampos IgG de conejo anti-OA Las && y 10s CI fkron resuspendidos en una

solucion tamponada no enriquecida en proteinas s&icas, con el objeto de descartar la

presencia de componentes del sistema complemento. Se &servo que 10s CI *on capaces

de inducir la migracion de 10s neutrbfilos, en forma dependiente de la concentration

Figura 37). Merece destacme7 que dichas respuestas locomotoras W o n observadas a h

a concenhwiones de CI inferiores a las descriptas en diversos focos damatorios (58,83).

Empleando IgG humans soluble agregada por calor como d o g o adiicial de CI, se

obmaron niveles similares de migracion Figura 37A). En acuerdo con el pamhgtna de

activation celular mediado por RFq7 segh el cual la microagregacion de receptores es un

requerimiento insoslayable para la inducxi6n de respuestas biologicas, la IgG monom&ica

se mostro incapaz de inducir migracion celular Figura 37A y B).

Ovg/ml 6lrglml 17pglml 50pglml 15Opglml 450pglml

Concentration de estimulo

Figura 37. Migracib de neutrofilos inducida por (A) CI preparados con 1gGh:IgGc anti-IgGh 0, por IgGh agregada por calor 0, IgG mcmdrica @El) o en ausencia de &do m; (B) por CI pqmtdos con OA-IgGc anti-OA o en ausencia de estimulo m. Los d a b esth expresados como la media &&ica * ES de 9 dadores evaluados por triplicado. Siguificaciirn estadistica: * P< 0,01, ** P< 0,05 wmpamdos con el control.

Con el objeto de discernir si la migracih observada era dirigida por un gmdiente

positivo de concentracion de CI (quimiotaxis) o simplemente reflejaba un increment0

ahtori0 en la motilidad celular (jpimoquinesis), se realizi, un di ckcKerbarrd(l49).

El rnismo refkja la respuesta locomotora celular inducida por: (I) un gnchente positivo de

concentmion del estirrmlo, (2) un Mente negative de c o d o n del estimulo y (3) la

presencia del estjmulo, en ausencia de gradiente de concentmion. Los resultados

obtenidoq indicaron que la motilidad &e dependiente de la presencia de un gradiente

positivo de concentracion de CI (Tabla 177, lo que define Wcamente un mecanismo

quirniothctico de locomotion.

Tabla 17. M s i s checkerboard de la Illigmibn de neutrbfilos inducida por CI.

Los datos 05th expresados como la media a o a * ES de 5 dadores evaluados por triplidos. Sigdkac ib esbdistica: c P<0,05 canparado can a y con i ; b P<0,05 comparado con a y con e; f P<O,OS amparado con i; d NS cornparack, cm a; h M , O 5 amparado con e. a CI: 1gGh:IgGc anti-IgGh.

Para que la respuesta qu imio~ca se haga efectiva, se requiere la union del

quimioatractante a receptores espedicos de la membrana p l d c a , lo cual pamite

la infomacion ambiental en una seiie de respuestm celulares que dm como

resultado el movimiento dirigido (205).

Con el objeto de determinar el papel de 10s Wcy expresados por 10s neutrofilos en

la quixniotaxis inducida por CI, se examin6 el -0 del AcM IV.3 y del m e n t o F ( a b

del A M 3G8. Ambos anticuerpos disminuyeron significativamente la respuesta

quimiotktica (Figura 38). No obstante, la inhi'bicion observada en presencia del IV.3 h e

marcadamente superior, sugiriendo un rol preponderante del RFcyII en la induction de la

quimomis.

Anticuerpo Monoclonal

Figura 38. E W de 10s AcM anti-RFcys sobre la quimiataxis de neutrofilos inducida por CI. La migracicln f ie inducida por CI preparados con 1gGh:IgGc anti-IgGh. Los d a b s e s h expresados como porumtajes de inhibicih de la migracih calculada desp& de restarles 10s valores de migration a1 azar. Cada barra represents la media aritmdtica * ES de 6 dadores evaluados por triplicado. Sigdicacih estadktica: * P< 0,01, ** P< 0,OS wmparados con 10s umtroles.

Se a d z 6 posteriormente la contribucic5n reMw de 10s RFcy a la union de 10s CI.

El fiagmento F(ab7)z del3G8 inhibio en forma marcada la union de 10s CI, mientras que el

IV.3 &lo la redujo moderadamente (Figrrra 39). Ello indica que la capacidad de 10s RFcy

de w CI guarda una relacion directa con el nbero de receptores expresados sobre la

supedcie celular (lo5 RFcyWdlula y lo4 RFcyII/&hda). Estos resultados plantean,

adem& que la participation de cada n o de 10s RFcy en la induction de la respuesta

quhniothdca no se comelaciona con su capacidad de unir CI.

AcM 3G8 AcM IV.3 Tratamiento

Figura 39. Inhibicih de la unih de CI por AcM dirigidos contra 10s RFcy. Los neutrofilos (2 x 10'1ml) fbem incubados durante 30 minutos a 4OC con hgmentos F(ab')z del AcM 3G8 o el AcM IV.3 o con medio de cultivo solo. Luego fbem lavados e incubados durante 30 minutos a 4°C con CI solubles preparados con IgGh e IgGc anti-IgGh. Posteriormente, la Unih de 10s mismos fbe revelada por incubacih con anticuerpos IgG anti-IgGc conjugados con ITCF. Los datos &in eqresados como % de inhibicih de la unih de CI y representan la media aritm&ca * ES de 4 dadores. Sigdicacih estadistica: * P< 0,01, ** P< 0,OS unnpados con 10s controles.

A fin de descartar que el efkcto de 10s AcM se debiese a la induction de seiiaes

inhi'bitorias y no al bloqueo espe&ico de 10s RFcy, se realizaron experimentos adicionales

donde se evaluo la accion de 10s mismos sobre la quimiotaxis inducida por FMLP o suer0

activado por zymoh. En ninghn caso, se observo inhibition de las respuestas

~ o ~ e a s (Tabla 18). Por el contrario, empleando suer0 activado por zymoh como

estirrmlo, el bloqueo del RFcylII la increment6 signifidvamente. Las causas de dicho

i n c r m o , no obstante, no han hand0 exatllinadas.

Pdgina 98

Tabla 18. Efecto de 10s AcM anti-RFcys sobre la respuesta quirniotactica inducida por FMLP y suer0 activado por zymoszin.

Inhibicih de la quimiotaxis inducida por FMLP y suem activado por z y m 6 por AcM dirigidos hacia el RFcyII y RFcyIII. Los datos w t h expresados como la media aritm&ica ES de n dadores evaluaclos por triplido despuk de restarle los valores de migracih a1 azar. S i w c a c i h estadistica: * P<0,05 comparado can valores obtenidos en ausencia de AcM.

4.3.3.- ak neut@fiZm imbdz-m# la-mesencia con^ & JWLP v CI

Los pdptidos fonnilados bacterianos juegan LUI rol critic0 en el reclutamiento de

neutr6flos en sitios ~ o r i o s asociados a diversos procesos infecciosos (212,223).

Considemindo que la presencia de altas concentraciones de CI constituye una caracteristica

observada en numerosas itlfecciones b acterianas (120), se evaluo la quimiotaxis inducida

por la presencia conjunta de 10s CI y el FMLP. La resultados descriptos en la Figura 40

mestran un increment0 de natural- aditiva, ea la respuesta estimulada por ambos

agonistas.

PBS CI 15-

CI CI - 1- + FMLP

Estimulo

CI cmoramd

+ FMLP

Kgura 40. Efedo de 10s CI sobre la quimiataxis inducida por FMLP. La rnigracih he inducida por FMLP, CI o FMLP m i s CI. Cada barra represents la media aritmtitica * ES de 6 dadores evaluados por triplido. Significacih estadistica: * P< 0,05 comparado con la migracicin inducida por FMLP (10-9M) solo y NS amparado con la migracih inducida por CI(155 yglml); ** PC 0,05 comparado con la quimiotaxis inducida por FMLP (lo'%) y con CI (500pglml).

Considerados en wyunto, 10s resultados pmentados indican que 10s CI constituyen per

se potentes estimulos quimiotkticos para 10s neutrofilos. Ello sugiere que 10s mismos

podrian participar en la respuesta inmune, no &lo como inductores de respuestas

secretorias ylo citotoxicas mediadas por fbgocitos, sin0 tambib wmo agentes relevantes en

el reclutamiento de 10s neutrofilos en el el tbcoorio.

5.- DISCUSION

Las enzimas proteoliticas se encveJrtran en altas concatmiones en 10s focos

inflamatorios (85,224). A ellos confluyen difkrentes proteasas libadas, no &lo por

granulocitos y macr6fkgos activados (225) sin0 tambih por tinfocitos T, &Idas NK y

mastocitos (226-228). La activacibn de sistemas humorales tales como el complement0 y

10s sistemas de coagulaclon y firinolitico wntribuyen a incremm las concentmiones

locales de proteasas.

Las proteasas curnplen timiones biol6gicas mciales en la fisiologia de 10s seres

vivos. Distintas enzimas proteoliticas son responsables del mantenimiento del balance

hemosttdco (229,230) y fibrinolitico (229-231), la activacibn del sistema complement0

(2,3), la gemmion de seMes conctucentes a la activation celular ylo muerte celular

programada (154-157,232,233) y la destruction de agentes infecciosos, dhlas i n f d

por virus y cdulas tumorales (226,227). La evidencia experimental reciente sugiere que las

proteasas participarian en la rephion de las Wones leu&as y consecuentemente

en la moddacion de 10s promsos idamatorios (234). Estudios desarrollados por Tax y van

de Winkel (158,160) demostraron que la actividad del RFcyII expresado en monocitos

humanos y en ckhdas W62, puede ser hames&a por proteblisis. En concordancia con

estos hallazgos, 10s resultados presentados en esta Tesis muestran que el tratamiento de

neutrofilos humanos con proteasas ammta tanto la avidez como la funcionalidad del

RFcyII.

Merece destacarse la magnitud del &o de las proteasas sobre este receptor.

Empleaado IgG-Ep como CI, se encontro que la caddad de Ep unidos por cien neutrofilos

se increments entre seis y diez veces a co-cia del tratamiento proteolitico.

Considerando que la proteblisis no induce la e o n de nuevos RFcy y pMcamente

anula la expresion del RFcyIII, 10s rewhados obtenidos pueden ser adjudicados a un

aumento en la avidez del RFcyII. Esta conclusion esth sustentada en 10s hahugos

realizados en presencia de AcM anti-RFcy, que demuestran que la union de IgG-Ep a 10s

neutr6filos tratados con proteasas es depedente hndamentalmente del RFcyII. En el

mismo sentido, Van de Winkel y colaboradores (158) desuibieron que el tratamiento con

proteasas de monocitos humanos cuyos RFcyI k o n selectivamente modulados,

increments su capacidad de unir IgG-E. Por otra parte, en dhdas K562, que &lo expresan

el RFcyII (235), la incubaci6n con pronasa o elasma menta si@cati-e su

ahidad por la IgG humana sin modjfiar la expmi6n de este receptor (1 58).

El aumento en la avidez del RFcy11 d o n a d o por el W e n t o em mat^ . , . cose

asocio a un increment0 en las respuestas inducidas por IgG-Ep tales como la CCDA y la

QL (Tabla 2 y Figura 7). Efectos similares k o n d d p t o s por Debets y colaboradores

(159) en monocitos deflcientes de RFcyI. El &atmiento con proteasas increment0 la

production de TNFa inducida por IgG, a experms de una actividad e x a a h h del

RFcyII.

El &&to potenciador de las proteasas, sin embargo, h e dependiente de las

caracteristicas del CI empleado como eshulo. En este sentido, se! observo que mientras las

respuestas QL inducidas por IgG-Ep y por CIS ken significativamente inmementadas

luego de la incubation de 10s neutrofilos con pronasa o quimotripsina, la QL inducida por

CIp no h e modificada (Figura 9). Dado que el mecanism0 de potenciacion ejercido por las

proteasas sobre la actividad del RFcyII no ha sido ehcidado, no resulta 40 elaborar

una hipbtesis cap= de expliw el efecto difkrencial de la proteblisis sobre la respuesta QL

hduda por CIS y CIp. Esta dificultad es aim mayor a1 comiderar que ambas respuestas

mediadas por &lulas controles, involucran una participation similar de 10s RFcyII y

RFcyIII. Los CIp, a diferencia de 10s CIS, constituyen grandes redes de anticuerpos, hecho

que hcrementa su valencia y avidez hacia 10s RFcy. Esta propiedad, sin embargo, no

permitiria explicar las diferencias observradas dado que la mhima capacidad potenciadora

de las proteasas se o b m 0 con IgG-Ep, 10s d e s , a1 igual que los CI precipitantes, se

caracterizan por pmentar a 10s antiuerpos bajo la f o m de amplias redes lo que les

coniiere alta avidez hacia 10s RFcy. Hdhzgos adicionales reslizados en mestro laboratorio

pmcen indicar, por otra part% que d & h s respuestas biologicas inducidas por un mismo

CI pueden ser moduladas diferen-e por el tratamiento emimhtico. Asi, mientras que

el traiamiento de 10s neutrbflos con proteasas izummt6 notablemente la QL inducida por

CIS piguru 9), no afecto la citotoxicidad inducida por 10s mismos contra dlulas b k o no

sensibilizadas (236).

La capacidad potenciadora de las prateass parece estar reshingida a las W o n e s

dependientes del RFcyII. De hecho, la QL iaducida por agorkhs que actinn a las dlulas a

travQ de otros receptores, como el FMLP, el PAF y el zymo& fh marcadamente inhibida

por el tmtamiento proteolitico.

No todas la proteasas parecen ser capaces de potenciar la actividad del RFcyII.

Tosi y Bergex (162) encontmon que la hwbacih & neutr6filos con elastasa l d t a r i a

no incrementa en la ingestion de parti- cubiertas con IgG ni la produccion de

inducida por CI. En acuerdo con estos resultado% se 0-6 que el tratamiento de

neutrbfilos con elastasa (10-lOopg/ml) no afecta la f d o n de rosetas EA, la CCDA ni

la QL inducda por IgG-Ep (datos no mostrados). Teniendo en cuenta la accion

potenciadora de la elastasa sobre la avidez del RFcyII en dlulas K562 (158), estos

resultados sugieren que el impact0 de las pfoteasas sobre la actividad del RFcyII se

encuentra condicionado por la estirpe celular que lo qresa.

El mecanism0 por el cual las proteasas incrementan la actividad del RFcyII no es

conocido. Van de Winkel y colaboradores (158) han informado que el tratamiento de

dulas K562 con pronasa, no modifica d peso molecular ni el pl del RFcyII. Estos

hallazgos argumentan en contra de una 8CCi6n directa de las enzimas sobre el receptor. No

me, no es posible descartar que las proteasas induzcan un cambio conformacional en

la molhla o alteren su disposition en la membrana celular, de mod0 tal que se incremente

su movilidad lateral y su capacidad & microgregarse. Un efixto idkecto sobre molhlas

accesoriss podria tambih ser Mble. Esta posibilidad se encuentra avalada por tres

&&ones: (I) el papel relevante que juega la integrina CDl 1 b/CD 18 en la bduccion de

numerosas questas inducidas a trav6 de 10s RFcy tales como la CCDA y la figocitosis

(55); (2) la impacidad de las enzimas proteatiticas & reducir la expresion del complejo

CDI 1 WCD18 y (3) el increment0 en la actividad del complejo CDl lblCD18, medido en

W o n de su capacidad de unir firdgeno a casemencia del tfatamiento proteolitico (b y

c, resultados propios no mostrados).

El hido sihlico de la membrana, incluyendo 10s derivados acetilados de

aminohexosas y bid0 N - a c d i h m h c o , es a1 menos en parte, responsable de la carga

negativa neta de la superficie celular (237,238). Estudios previos han demostrado que la

rennoCon parcial del hido sihlico de la membrana celular por tmtamiento con

neuroaminidasa, incrementa la uni6n de IgG-E a monocitos humanos y potencia tanto la

figocitois de S. arnm opsonizado con IgG como la produccion de a- por neutriflos

humanos en respuesta a 10s mismos (239,240). Estos dmtos heron explicados

considerando que la disminucion de la wga negativa neta superficial por accibn de la

sialidasa ocasi0m-h una reduction de las fuerzas repulsivas entre las dlulas efectoras y 10s

blrmcos. Un mecanisno similar podria ser el responsable, al menos parcialmente, del efecto

potenciador de las proteasas sobre la advidad del RFcyII. Ellas podrim inducir una

disminucion del contenido de hido sidico a expensas del clivaje de ciertas glicoproteinas

ricas en el misrno. Esta hip6tesis p d t e explicar 10s resultados obtenidos empleando IgG-

Ep. Sin embargo, no explica aquellos obtenidos con otros t ips de CI, puesto que el . .

comportamiento de las proteasas no mmetm en todos 10s casos 10s efectos de la

neuroarninidasa, tal como lo evidencian sus respectivas acciones sobre la QL inducida por

CIp (Figura 9 y Tabla 5).

La enzimas lisosomales de 10s neutr6flos humanos como la elastasa, gelatinasa y

colagenasa, a las que tradicionalmente se l a ha adjudicado un papel relevante en 10s

mecanismos de agresion tisular, se hallan presentes en cantidades superiores a lpg/106

cdulas (58). Considerando la presencia de 25 x 1 o6 neutroflos por cada 1004 de fluido en

sitios intlamatorios intersticiales (58), es posile que altas c o n d o n e s de enzimas,

sindares o a h mayores a las empleadas en el presente estudio, se encuentren en 10s focos

inflarnatorios. Por otra parte, las proteasas producidas a consecuencia de la activation de

sistemas de coapplacion, mmplemento y quininas podrian contribuir a inmementar a h mh

las concentraciones locales de enzimas. Si bien el potential proteolitico de las mismas se

hallaria bitado p r la accion de 10s inhibidores de proteasas presentes en grandes

cantidades en 10s fluidos intersticiales (77,241), la evidencia acumulada hasta el presente

sugiere que estos inhibidores son eficientemente inactivados por 10s IRO producidos por las

propias dulas ~ o d t i c a s , generando de este modo, un microentorno permisible a la accion

de las proteasas (58,77,78,241,243,244). El efeco de las enzimas proteoliticas sobre la

actbidad del RFcyIl observado in viho, podria por 10 tanto, ser tambih operativo in vivo.

5.2.1.- Respeskn p r o i n ~ m w r a s mdiadbs tm neutrofilm ?I monocitm inhcidm -par

CI: Impact0 de la carna eltcm'cu d;e lm ~~~ I f l .

Diversos autoanticuerpos son enwntrados en el suero de pacientes lupicos (166).

Entre ellos, aquellos con eqwdicidad por el ADN parecen jugar un rot critic0 en la

induction de fenomenos inflamatorios conducentes al dafio renal. La evidencia acumulada

hasta el presente sugiere, sin embargo, que 10s xnismos no siempre son nefrtoghicos. Ello

irnpulsi, numerosas investigaciones tendientes a determinar la naturaleza de 10s factores que

influemian la patogenicidad & 10s mismos. Estos estudios cawbiaron inmunoq~ca,

idiotipica y estructuralmente a 10s anticueqms anti-ADN (245-248). Se encontro que 10s

antimerpos anti-ADN neflitoghicos son de clase IgG, principalmente IgGl e IgG3, las

subclases que fijan complement0 miis tdicientemente (249). Entre ellos, aquellos de alta

av idq es decir con mayor capacidad de formar complejos estables, son 10s miis

fkcuenternente asociados al d m l l o de la enfmedad renal (250,251). Trabajando en

modelos de lupus murino, Ebling y Hahn (169) demostraron, en forma original, que 10s

anticuerpos anti-ADN nativo predominantes tanto en el sumo como en el eluido renal son

cationicos. Mientras 10s anticuerpos anti-ADN dricos pmentaron pl entre 8,O y 8,5,

aquellos obtenidos de eluidos glomerulares presentaron pI entre 8,O y 9,0, sugiriendo una

retention local selectiva Estudios posteriores desarrollados por Datta y colaboradores

(170) utilizando cepas murinas uswlmente empleadas para el estudio de la patogenesis del

LES -+I+, (NZl3 x NZW)Fl y (NZB x SWR)Fl], demostraron en las tres cepas, un

defect0 inmunoregulatorio comb coincidente con el inicio de la glomerulondXtis. Dicho

defkto se tradujo en la production de antiuerpos &ADN h e n t e cationicos (gl:8,5-

10,O). Nurnerosos trabajos establecieron, poshionnente, la presencia de anticuerpos IgG

altamente catibnic0s con espedcidad anti-ADN en el suero de pacientes con LES

(1 71,252,253) y sugirieron su participacibn en la g&esis del d&o renal. La carga cati6nica

de estos anticuerpos esth detedmda, fkhmtahente, por la presencia de residuos

bbicos en las regiones variables de sus cadenas pesadas (173,254). En este sentido, se ha

observado que las mutaciones somiticas en 10s genes que wdifican a 10s anticuerpos anti-

ADN conducen, con alta fiecuencia, a la incorporation de arninoiicidos bhicos tales como

arginina, asparragha y lisina, 10s que incremetlltan su afinidad por el ADN co&Wes,

ademis, capacidad de unir otras mo1kula.s mgadas negativamente como el heparan sulfato

(254,255).

Los anticuerpos IgG cationizados tienden a depositarse en la MBG (174) debido a

la presencia de sitios wgados negativamnte (1 75,176). Hallazgos reakados por Gauthier

y Mannik (177) indican que la presencia de anticuerpos IgG cationicos en un CI, a h en

proporciones m h h q increments sustancialmene su tendencia al dep6sito tisular. Estas

evidencias sugieren que 10s anticuerpos IgG cationicos son potenciaimente nefEtogkicos

en virtud de su alta avidez por la MBG, sin embargo, no expliw 10s d s r n o s a trav6

de 10s cuales inducen el daiio tisular. Los resultados pr&os en esta Tesis demuestran

que la presencia de anticuerpos cationizados en un CI potencia mtablemente su capacidad

de inducir respuestas inflamatorias mediadas por dulas fhgdcas. Este fenomeno podria

jugar un papel relevante en 10s mecankos de injuria tiwku en 10s pacientes con LES. La

convalidacion de esta hipbtesis requiere la realization de expmhentos adicionales que

empleen anticuerpos cationicos naturales aislados a partir del sumo de pacientes con LES

activo. Esta fase experimental ha sido encarada recientemente. Por otra parte, 10s

resultados presentados indican que, bajo cieitas circwstmk, la carga elktrica de 10s

anticuerpos constituye una propiedad critica en relacibn a las propiedades biologicas de 10s

CI que 10s contienen. Estudios adicionales son necesarios a fin de e x a m k la posible

participaci6n de anticuerpos cationicos en dras entidades patologicas como ad tambih

para d e t h si la modifidbn del pI de 10s anticuerpos podria consthir una

hmamienta villi& desde el punto de vista terap6dco.

Estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que la esthdacion

de neutrofllos y monocitos por CI conduce a la destruction de deerentes cdulas b h o a

trav6 de un mecanismo litico de naturaleza oxidativa (133-137). Este sisterna citotoxico

constituye un modelo adecuado para el estudio de 10s fenomenos de injuria tisular

asociados a la presencia de fkgocitos y CI. Es importante destacar que si bien es necesaria

la production de IRO por parte de 10s fagocitos para mediar la destruction de 10s b h m ,

no siempre se encuentra correlation entre la d d a d de Oz- ylo H a producido y 10s

niveles de citotoxicidad (181). Los resultados que wmponen la presente Tesis indican que

la cationizacion de la e o n IgG de 10s CI incremen@ al menos en un orden de magnitud,

10s niveles de citotoxicidad inducidos por 10s misrnos. A h cuando 10s CIcat fberon

empleados a concentraciones entre diez y ckuenta veces menores respecto de 10s CIc,

indujeron respuestas citotoxicas en niveles a1 menos tres veces superiores (Tabla 6).

Las respuestas citotoxicas inducidas por CIc y CIcat difirieron no ~610 en el aspect0

cuantitativo sin0 tarnbikn en 10s requerimientos del citoesqueleto involucrados en su

production. En este sentido, se obseivo que la c i t u B ejerci6 efectos opuestos sobre

las mismas, incrementando notablernente la citotoxicidad inducida por CIc e inhibiendo

martxchmte aquella inducida por CIcat (Figura 13). Se determinaron tarnbih efectos

diferentes, a1 analizar la accibn de la colchicina. La misrna no afecto la respuesta inducida

por CIc rnientras que prkti-e duplici, aquella estimulada por CIcat. Mhs interesantes

atin heron las observaciones realizadas a1 emplear Prostaglandins E2 como

inmunomodulador. Se determino que a concentraciones de O.1pM no -6 la

citotoxicidad inducida por CIc (200pgld; % inhibition: 5*4, n=5) pero inhibio

maradamente las citotoxicidad inducida por CIcat (4pghl, % inhiici6n: 6W1, P<O,Ol,

n=6). Esta~ diferencias no pueden ser fkdtnente expli&. Las mismas constituyen un

objeto de estudio en la actualidad.

Los IRO son capaces de inducir la destmcci6n de tejidos (256-259) a travb de un

conjunto de mecanismos, entre 10s que @man la alteration de proteinas intra y

atracelulares, la modification de la estructura de 10s kidos nucleicos y la peroxidacion

lipidica, conducente a la ptkdida de la htegridad estructural de las mernbranas c e l h

(52). Los resultados del presente estudio indican que 10s CIcat inducen respuestas QL

mar-e exacerbadas respecto de las estirmuladas por CIc. La identidad de las

especies responsables de la emision de luz no ha sido detemhada. Sin embargo, la marcada

inbibicion de la QL inducida por ambos tips CI en presencia de SOD (% inhibicionm, en

todos 10s casos), conjirman que las @es reactivas del oxigeno generadas por activacibn

celular son las principales responsables de la respuesta observada.

Numerosas evidencias sugieren que la elastasa, junto con las metaloproteasas

colagenasa y gelatinasa, constituyen mediadores claves de la destruction tisular en 10s

procesos inflamatorios (58,77). De hecho, cada una de estas enzimas es capaz no &lo de

degradar componentes de la mab.iz e x t m d h sin0 que tarnbib puede ampHcar 10s

procesos inflamatorios at clivar componentes del complemento, el fibrinogen0 y el &or de

Hageman y genera- hgmentos bioactivos (260,261). La actividad de las proteasas se

encuentra regdada por diferentes antiproteasas presents en el plasma y 10s fhidos

htemticiales tales como la al-~psina, la aTmacmglobulina y el inhibidor de

leucopmte!asas. Sin embargo, estos inhibidores pueden ser oxidativamente imdivados tanto

in vim (77,78241,243,244,262) como in viw (244,263) por radicales h i generados a

expasas de la activacion de 10s propios neuthflos. Por lo tanto, la capacidad destructiva

de las proteasas del neutrofilo m in, v d a estrecha relacion con la habilidad de 10s

misrnos de generar oxidantes. Esta afhaci6n se halla sustentada, adem& en la actividad

que ejercen 10s oxidantes sobre la colagenasa y la gelatima Ellas son liberadas como

proemhas y son activadas por IRO producidos p r las &Idas fhgociticas (80,Sl).

LAM resultados presentados en esta Tesis indium que 10s CIcat, no &lo estimulan la

produccibn de mayores d d a d e s de IRO respecto de 10s CIc, sin0 que a d d son

pot- inductores de la liberacibn extmahh de elastasa (Ezgura 17). Es posiile

entonces, que 10s oxidantes producidos a expems de la activacion inducida por CIcat,

subviertan, in viva, la capacidad d p t e h i c a de los tejidoq permitiendo a las enzimas

proteoliticas incrementar la destmccion tisular y ampNcar la idhmcion. . .

Los ~ ~ o s hhumanos expresan co-e dos t ips de RFcy, el RFcyII y

el RFcyIII. Empleando neutrbflos intactoq Tosi y Berger (162), cuantificaron estos

receptores mediante el uso de 10s AcM IV.3 y 3G8, r a d i d o s con L25~. LOS mismos

revelaron la existencia de 1 10.200 k 9600 RFcyIII/&lula y 15.100 700 RFcyWdlula,

coincidente con lo infonnado por Petrom y colaboradores (264). El RFcyII es una proteina

tnmmmbrana de 40 kDa de peso molecular, mientras que el RFcyIII expresado en

neufr6filos, es una m01dcu.h ex thmx anclada a la membrana a travb de un enlace GFL,

wyo peso molecular varia entre 50 y 70 kDa depedendo del grado de glicosilacion

(4,265,266). El sigdcado ihcbnal de cada uno de ellos en la adivacion de respuestas de

neutrofilos hurnanos inducidas por CI ha sido rnotivo de una fierte controversia. Tosi y

Berger (162) desuiiieron que la e h h i o n del RFcyIll por tmtamiento con elastasa no

inhibe la @ocitosis de partidas de paraha cubierhs con IgG. Este tratamiento tampoco

i n h i la produccibn de OZ- esthmhb por difkmtes t ips de CI, tales como IgG agregada

por calor, CI foxmados con s e r o a l b h humans (SAH)/anti-SAH o partidas de hex

cubierbs con SAH/anti-SAH. Coincidiendo con estos resultados, GraziaM, y Fanger (132)

observaron que el R F W del neutrofilo es incapaz de mediar la CCDA contra line85

ceWares de hibridoma que exprem en su supeaficie AcM espedicos para este receptor.

Considerados en conjunto, estos hallazgos sugieren que el RFcyIII expresado por el

neutrofilo no constituye, a1 menos en estos d e l o s experimdes, LUI receptor

transduccionalmente activo. Huizinga y colaboradores (267) sugirieron, por otra parte, que

la union de un CI al RFcyIII increments h afinidad del mismo por el RFcyII, el cual

constituye un receptor activo tmsduccionalmente. De acuerdo a este modelo, el RFcyIII

eqresado en neutr66los, en virtud de su superioridad mm&ica, podria cumplir un papel

relevante como sitio de anclaje para 10s CI. Ello incrementaria la c o n d o n local de 10s

mismos, fkdtando su interaction con el RFcyII (8).

Contrastando con estos estudios, Shen y colaboradores (268) demostraron que la

CCDA contra bIancos eritroides puede ser inducida por heteroanticuerpos consistentes de

hgmentos Fab del AcM 3G8 (anti-RFcyIIl) y fhgmentos Fab con espedicidad hacia las

c61ulas blanco. Ello sugiere que el Wcym por el neutrifilo, pese a a anclado

a la membrana c i t o p l d c a a trav6 de un grupo GFI puede hcionar como molWa

transductora de seiiales de activation. Por otra parte, en estudios realizados a fin de

determhm las wnsecuencias bcionales relacionadas con la existencia de las variantes

al&cas NAl y NA2 del RFcyILl, Salmon y wlaboradores (13 1) obmaron que el bloqueo

del RFcyII con hgmentos Fab del AcM IV.3 inhl'be ~610 parcialmente la fhgocitosis de

EA, mienbas que fhqpentos Fab del3G8 lo hacen marcadamente. h s autores postularon

que ambos receptores participan de mod0 sinkgico en la f3lsocitosis de EA. Asimismo,

obmaron que neutrofilos de individuos con el alotipo NA2 fkgocitan menos

eficientemente EA que aquellos que exhiben el alotipo NAl y que dicha dif'erencia se

amplifica tres veces si se bloquea a1 RFcyII. Resultados Osares fueron obtenidos por

Bredius y colaboradores (269) empleando S. tmrew, H irtfluenzrae tipo b y N meningr'tids

grupo B, sensibdhdos con anticuerpos IgGl. Por otra parte, Hun& y Schmidt (270)

informaron, que tanto el RFcyII como el RFcyIII son capaces de inducir el estallido

respiratono al ser erne& con AcM espe&cos. Crockett-Torabi y Fantone (129)

demostraron que 10s CI precipitantes inducen la production de 6- a trav6 del RFcyIII, en

tanto que ambos receptores son responsables de la activacon del nmtrofilo inducida por CI

solubles. Estudios adicionales demostraron que ambos Wcy es th involucrados en la

liberation de enzimas lisosomales (271,272). Estos hallazgos sugieren que tanto el RFcyII

como el RFcyIII son capaces de inducir la activacibn de difkrentes respuestas en el

neutrofilo humano. El rol de cada uno de ellos parece depender de las camcteristicas del CI

empleado y de la hcion analizada.

Las respuestas inducidas por CI preparados con IgG cationica involucran &lo la

participacion del RFcyII. El hecho de que concentraciones satwantes del AcM 3G8

resulten incapaces de reducir las diferentes Wones analizadas, sugiere que el RFcyIII no

W o n a como elemento de anclaje de 10s CIcat a la superficie celular ni participa en la

transduccion de se5ales de activation celular. La supresion completa de las respuestas,

producida a wnsecuencia del bloqueo del RFcyII con el AcM IV.3, confirman este idtho

topiw. En relacion a las hciones inducidas por CIc o CIcat(Ag), se observo una

inhibicion p a r d a cornencia del bloqueo del RFcyIII sugiriendo que este receptor

participa en las respuestas estimuladas por estos CI. Su mod0 de participacion no se hallaria

restringido a1 anclaje de 10s CI, como lo d- el hecho de que a h en presencia de

c o n d o n e s saturantes del AcM IV.3, las difkentes requestas analizadas alcanzan

valores sigmficativos.

Los neutrofilos humanos no expresm en condiciones basales el RFcyI. Sin

embargo, el mismo puede ser inducido por accion del IFNy (17,268). El IFNy se ha

detectado en altas wncentraciones en el suero de pacientes con enfbmedades autoinmunes

(271). Se ha descripto tambih una conelacion entre 10s niveles de I F N y sdricos y la

actividad de la dermedad (271) Considerando la relevancia de 10s CI en las

d W o n e s clinicas de las enfmedades autohmneq y en particular la importancia de

10s dcuerpos catibnicos en las db tac iones renales de LES, se especulo que 10s CIcat

sedan capaces de inducir a h mayores niveles & citotoxicidad luego de la neosintesis del

RFcyI, a consecuencia de la incubacon con IFNy. El pmtmtamiento de neutrofllos con

IFNy no increinento, sin embargo, las respuestas citotbxicas inducidas por CIc o CIcat. La

irrelevancia del RFcyI en la induction de dichas respuestas h e demostrada, adem&

mediante d empleo de dos AcM dirigidos contra difierentes epitopes del RFcyI. Ellos se

mostraron absolutamente incapaces de inhibir la citotoxicidad inducida por 10s misrnos.

Los mecanismos responsables de la notable acthidad agonista de 10s CIcat, no han

sido elucidados. Nwnerosos trabajos han establecido que las proteinas cationizadas son

capaces de unirse a las supedicies celulares a travQ del establecbiento de intemxiones

inesmcas de naturaleza electrostktica (272,273). Ginsburg y colaboradores (274)

describieron la capacidad & la p o l i - L m de a&utimr leu&os y Streptoexxms a

pH 7,4. Los rnismos autores, dernostsaron que, al ser cationizadas? las enzirnas glucosa

oxidasa y cataka adquieren una alta avidez por las dulas endoteliales (275). M h a h , la

glucosa oxidasa cationizada, al ser instilada en la baquea de ratas anestesiadas, mostro una

actkidad tbxica sobre el puMn a1 menos diez veces mar respecto de la enzima nativa

(275). Otros autores demostraron que las moltidas policati6nicas pueden interactuar con

cargas negatk presentes en el himen del endokho m i c r d (276,277). Triguero y

colabodores (278), por su parte, establecieron que la cationizacion de la IgG permiten su

pasaje a tmvb de la barrera h e m a t d m el cual no se observa empleando IgG nativa.

S e g h estos autores, las interacciones electrosthticas establecidas entre las moleculas de

IgG y secciones mionicas de las superficies capilam inducen un mecanism de endocitosis

que conduce in v h a la tramcitosis neta de la IgG cationizada al cerebro (278).

Teniendo en cuenta estos m e s , es posille espedar que el establecimiento

de interacciones elecb-ostiiicas mtre las menhmas de las &Mas iitgociticas y grupos

catithicos de 10s CIcat, incmmnte la union de 10s mismos a la superficie celular?

aumentando la avidez del CI por 10s RFcy y su capacidad de activar respuestas a travb de

10s mismos. Esta presmcion se fbndmenta, adem8s, en 10s resultados obtenidos al analizar

la actividad agonista de 10s CIcat sobre plaquetq en presencia de agentes fberternente

aniomoos tales corn la hepatina (Tabla 13). No s61o la union de 10s CIcat a la su@cie

cdular fbe rnarcadamente disminuida, sino que su capacidad de inducir la acthmion

phqwhm result6 reducida a 10s niveles observados para 10s CIc. Resultados sirnilares se

mcontmon al analizar la actividad agonista de 10s CIcat sobre &lulas hgdticas (datos no

mostmdos).

El aumento de la capacidad agonista de 10s CI ocasionado por la cationizacion de la

f?acci6n IgG, se manif~esta a h en cir- en que la IgG bciona como antigen0 en

el CI. Esta d>servacibn resulta relevante a la luz de recientes hip6tesis propuestas a fin de

q l i m la etiopatoghesis de la nefiitis hipla Sugisaki y culaboradores (279) demostraron

en ratones NZBNZW F1, la existencia de dcueapos adnucleares con reachidad

cnuada hacia el Fc de las IgG, es decir, con adividad de W o r rwmatoideo (TR). Cabe

destacar que 10s FR se encuentran presntes en el suero de aproximadamente el 50% de 10s

pacientes con lupus activo (279) y parecenjugar un papel relevante en la induction de daiio

renal. A1 anatizar la composici6n de 10s depbsitos inmunes glomerulares 10s autores

establecieron la presencia de CI fbrmados por IgG e IgG antinuclear con actividad de FR

Teniendo en cuenta la presencia de altas concatmiones de IgG cationica tanto en el suero

como en el ehddo renal de pacientes con LES, es posiile suponer que ah^ cuando la IgG

cationica constituya la fiaccion antighica de 10s CI, la rnisrna podria inducir un notorio

increment0 en la rnagnitud de las reacciones inknatorias g d in siru, a consecuencia

del dep6sito de CI sobre la MBG.

Diversas evidencias involucran a las plaquetas en la idamacion glomerular en el

LES. Se han detectado niveles relativamente bajos de plquetas circulantes en pacientes con

nefiitis activa (280). Coincidentemente, se ha observado que la disrninucion en 10s niveles

de plaquetas se correlaciona con la presencia de trombos intraglomexulares y patologia

renal (285). Se ha encontrado, ad- una disminucih en 10s niveles de serotonina

intrapIaquetaria en pacientes con n&s lupica (281), la que se correlaciona con una

elevada capacidad agregante de las plaquetas (281,282) y un aumento en 10s niveles de

serotonina phmiitica, sugiriendo que la h i o n de aminas vasoactivas plaquetarias time

lugar in vivo. Debido a que 10s niveles m8s bajos de serotonim intraplaquetaria k o n

observados en pacientes con dopatia rnembmsa, prototipo de glomerulon&s

mediada por CI (166), se ha postulado que la activaci6n plaquetaria es el resultado de la

ideraccion entre plaquetas y CI (1 66).

Es importante destacar la prevalencia de -ones tromboembblicas en

pacientes con glomeruloneiiitis lupica. La presencia de anticuerpos cationicos en estos

pacientes (171,252) y la marcada eficiencia de 10s CI que 10s contienen para inducir

acha&n plaquetaxia, sugieren que 10s mismos podrian co- importantes factores

tromboghicos que contribuyan a1 deterioro de la hcionalidad renal en el LES. En este

sentido, cabe seiialar ad& la existencia de una fieate asockion entre eventos

tromboembilicos asociados a la glomerul-s hipica y la presencia de diferentes

fbdias de anticuerpos ad-fbsfolpidos (286,287), una de las d e s se auactmh por

expresar altos pl @r Ruiz Arguelles, Universidad de Puebla, Mhico, comunicacion

personal). Estos anticuerpos, a1 igual que 10s anlicuerpos cationicos anti-ADN podrian

jugar un papel relevante en la patoghesis del LES, confjrihdole a 10s CI que 10s contienen,

una notable potencia inflamatoria y trornb6tica. La eficiencia de 10s CIcat de inducir

activation plaquetaria, por otra parte, podria tambib ser importante como fenomeno

arnplificador de la inflamacion, a travQ de la liberation de aminas vasoactivas plaquehrias,

las cuales @an inmementar el influjo de fiigocitos, exacerbando la severidad de las

lesiones renales.

Los resultados obtenidos en el presente estudio, indican que la IgG humana

cationizada es capaz per se de inducir agregacion de PL y PF. Estos resultados difieren de

10s obtenidos empleando neutrofilos y monocitos como dlulas efectoras, con 10s cuales la

IgG cationizada result6 incapaz de inducir la activacion celular. Por otra parte, este

hallazgo contradice al actual paradigm de activacion que sostiene que s610 la IgG

agtqpda o 10s CI conteniendo IgG son capaces de inducir fbdones dependientes de 10s

RFcy (23,25,288). A h cuando no results posible descartar que este efecto obedezm a la

presencia de bajas concentmiones de IgG agrqph, otro mecanism0 podria ser operative.

Trabajos recientes han demostrado que ciertos A M dirigidos contra Ag de la superfiecie

p l a q u d son capaces de activar a las plaquetas a travQ de la m i c r o ~ o n de RFcy

de plaquetas adyacentes (289-291). Es posible eqecdar, que las m o l ~ a s de IgG

cationida, merced a su capacidad de estabh hertes interaccones electrosthtic8s con

moldadas anionicas de la supedicie plaqueta~@ confomen un CI partidado capaz inducir

la agregacibn plaquetaria.

5.2.3.- Remestas m o i n ~ o n o n a s med& -m neutrbfilos v mom'tm huhciih r x ~

CI: I' & la -a elbctrr'cu & IOS ad-

Los d t a d o s presentados en esta Tesis mestran, adem& que la incorporation

de antigems cationicos en un CI le contiere tambib notables propiedades agonistas.

Menxe destacarse, no obstante, que en todos 10s sistemas estudiados 10s niveles de

activation inducidos por 10s CIcat(Ag) heron significativamente menores respecto de

aquellos inducidos por 10s CI preparados con IgG cationica. Este comportamiento se

evidencio con mayor claridad al evaluar las respestas de actkcion plaquetaxia ensayadas

en PRP (Figura 33). Miemas que 10s CI preparados con IgG cationica indujeron potentes

respuestas de agregacibn, aquellos preparados con antigenos cationizados no indujeron

respuesta dguna. Los motivos de td comportmiento no resultan obvios. Podrian estar

relacionados con la mayor o menor distancia de 10s grupos quirnicos cargados

positharmate, respecto del dominio del Fc de la IgG responsable de interactuar con 10s

RFcy.

Numerosos estudios previos han sugerido que 10s antigenos cationicos presentan

propiedades in€lamatorias particulares, las que parecen jugar un papel relevante en la

patoghesis del LES como ad tambib en ciertas glomerulonefiitis y artritis de origen

infeccioso.

Los sitios anicinicos de la MBG condicionan la permeabilidad glomerular a las

proteinas plasmtiticas (175,176,196,198,292). Los antigenos cationicos presentan una

capacidad incrementada respecto de 10s anionicos o neutros para establecer interacciones

electrostiticas con proteoglicanos altamente anionicos de la MBG. Oite y colaboradores

(144) han demostrado que la perfkcin en la arteria renal de antigenos cationicos, seguida

por la administration sisthica de anticuerpos espedcos induce glomerulonefitis severa

en ratas, mientras que el rnismo pr-ento no es nerfritogbico al emplear antigenos

nativos. Por otra parte, se ha demostrado que la administration diaria de SAB cationizada

(pI>9,5) a conejos, predispone a la formacion de CI in siru, induciendo d o p a t h

membranosa asociada a sindrome nefibtico (201). Estos antecedentes llevaron a postular

que diversas proteinas cationicas +an estar involucradas en la induccion del daiio tisular

asociado a las d d o n e s renales del LES (293,294). Entre ellas, las histonas,

proteinas altamente cationicas @I=10,5-11,O) con gran afinidad por la MBG, han recibido

una atmeion particular debido a que esth present= en concentmiones aumentadas en el

suer0 de pacientes con LES (295,296)- La deposici6n de histonas, fen6meno observado en

glom&ulos de pacientes lupicos (293), podria promover la deposition adicional de ADN

liberado local o sisthicamente y deterndnaria, ademis, la formacion de CI a consecuencia

de la intawxion de anticuerpos anti-ADN ylo anti-histonas. De hecho, 10s anticuerpos anti-

histonas son 10s prevalentes entre 10s a n t i v s antinucleares del LES (297), existiendo

una cordaci6n popositiva entre la actividad de la enfermedad y sus niveles sisthicos

(298,299).

La participation de 10s antigenos catihicos en la induccion de daiio renal no se

hallaria restrhgido a1 LES. Se ha demostrado que 10s Sfrephmccos del grupo A producen

ciertas proteinas catiCnzicas extdulares (pP8,5) que presentan alta &dad por la MBG

(300). Las rnisrnas tienden a depositarse en glomhlos, siendo encon& como depbsitos

inmunes gl0memh-e~ en las g l o m e d o ~ post-streptockmcas en el hombre (301).

Los estudios mencionados han adjudicado el potencial miihog6nico de 10s

antigems cationicos a su mayor terrdencia a depositarse a &el renal y neutdbm a 10s

polianiones glomeiulares. Los resultados de la presente Tesis sugieren, sin embargo, que

mkpediea~em.ente de su capacidad & alteaw la permakilidad glomerular, el papel

patoghico & 10s antigenos cationicos podria estar relacionado a su capacidad de conferir,

a 10s CI que 10s contienen, propiedades proidamatorias y tr-cas exacerbadas.

La carga elktica, como hctor que influencia la retencibn articular de 10s

antigenos, esth emergiendo como LUI concepto hprtante en la inmunopatologia de las

artritis. La retencibn antigenica constituye uno de 10s fenomenos responsables de la

pemktmcia de la intlamacon articular7 que m e puede conducir a la destmcci6n

severa del d a g o en diversas formas de artitis cri,nicas (302-304). No obstante, se ha

demostrado que la cationicidad de una proteha no gmntha per se su potencialidad

arhitogknica. En distintos modelos de artritis se establecio que se requiere la

-on del animal para el desarrollo de la mismsl(3027305,306). Ello sugiere que

la formation de CI es un hecho det erminante para que la inflamacon articular tenga lugar.

Estos hallazgos esth de acuerdo con 10s resuhados de la presente Tesis donde se encmtro

que 10s antigenos cationizados son in-per se de inducir respuestas proinhnatorias.

La notoria capacidad artitoghica confkida por 10s antigenos cationicos a 10s CI

que 10s incluyen, podria explicar el desa1~0110 de ciertas artritis infecciosas, en las d e s se

han desaipto antigems bacteiianos abmente cati6nicos tales como las inducidas por

Yersinia entemlitica y Streptoc0y:cm del grupo A (300,306).

El tmtamiento de las glomeruloneflitb y de las arhitis estii. basado m p a h e n t e en

terapias imnunosupresoras y anti-idhatorias. Son rmiltiples las evidencias presentadas

que sugiefen un papel destacado para 10s a n t h e a p s y antigenos cationicos en las mismas.

Seria importante evaluar el p o t d tmqxhtico de aquellos agentes capaces de intderir,

in vivo, las laseracciones e l e c t r ~ c a s establecidas entre 10s agentes cationicos,

potenckihmte -0s y diversas mol6a.h anionicas natural=. Hallazgos de Adler y

colaboradores (307) i n d i d que la protamina interfiere en la d n de antigems

donicos ex6genos a sitios anibnicos de la pared capilar glmerular, ejerciendo un efedo

Pagina 1 15

bendcioso sobre la nefkopatia rnernbranosa (307), alientan a continuar la investigation en

este campo.

La incrementada actividad biologics confericla a 10s anticuerpos IgG como

consecuencia de su cationizwion in vitro, plantea la p i d a d de que este procedimiento

brinde una M e n t a temp$&= adecuada en casos, tales corn la inmunoterapia pasiva

anti-tumod, en 10s que el reclutamiento de Wones &kctoras hhcidas a trav6s de 10s

RFcy es deseable. A este respecto, merecen destacarse hallazgos realizados en otros

laboratorios empleando pr-entos de donbacion in vitro sirnilares a 10s utilizados

en el presente estudio. Triguero y colaboradores (308) demostraron que la IgG cationizada

presents, en relacion a la IgG nativa, no s610 un mayor indice de captura por difemntes

brganos luego de su administration in vivo, sino tambien la capacidad de d e r a sitios

protegidos como el sisteina nervioso central (SNC) (278). Por otra parte, Pardridge y

colaboradores (309,3 10) c a t i o ~ o n AcM IgG dirigidos contra una proteina del virus de

la inmunod&ciencia humana (HIV) observando que, a Mixencia de 10s antiampos IgG

nativos, 10s cationicos presentan una mayor tendencia a ser endocitados, inhibiendo la

replicacih del HIV en linfocitos @kicos humanos. Estos resultados l lwon a postular

el empleo de AcM cationicos para el diagn6stico ylo tratamiento de distintas patologias

(311). En rnuestro laboratorio hemos reabb, en 10s irltimos meses, una serie de

ex.peri& tendientes a evaluar in vivo la capacidad de 10s anticuerpos I@ cationicos de

inducir mecanimos citotoxicos dirigidos contra adenocarcinomas murinos. Los resultados

obtenidos, sumamente pr-es, son alenhdores y sugieren que la moditicaci6n del PI

de 10s anticuqos IgG constituye una alt-a que merece ser explorada en hcion de

su posible utilidad dmgnostica ylo temp6utic.a.

Es aceptado que las propiedades quimiothticas de la IgG residen en su habilidad de

formar CI e inducir, consecuentemente, la activacibn del complemento y la subsecuente

produccibn de p6ptidos quimiotkticos como el C5a (2 1 7,2 1 8,3 12,3 13). Sin embargo, 10s

resultados de algunos estudios han cuestionado esta apreciacion. Wllldnson (219),

determino que mientras la IgG nativa no indujo quimiotaxis de neutrolilos, la IgG agregada

por calor ejercio efectos quimiotiicticos y quimioquinkticos. Contrastando con estos

hallazgos, Sibille y colaboradores (221) descriiieron que la IgG nativa h e quimiotictica,

per0 no quimioquin&ica. Arashi y colaboradores (220), por otra parte, demostraron que

tanto las IgG monomericas de rata como tambih 10s CI con ellas formados, estimularon la

locomotion celular, aunque la natural- de tal migraci6n (quimiothtica o

quimioquin6tica) difirio entre las distintas subclases de IgG. Otros estudios, por el

contmio, seMaron la incapacidad, tanto de la IgG nativa como de la agregada de inducir

la migracion de neutrofilos (221,222). Los resultados de la presente Tesis indicaron que

distintas clases de CI solubles son capaces de inducir la migracibn de neutrofilos -0s

en ausencia de complement0 Pigura 36). El d s i s checkerboard establecio la natural-

quitniothdca de dicha respuesta locomotora ( T d h 17). En acuerdo con Wilkinson (2 19)

se observo, ad-, que la IgG monom6rica es incapaz per se de inducir la quimiotaxis de

PMN, per0 w e r e dich capacidad al ser agregada por calor. Se determi&, tambitb, que

la capacidad quirniothctjca de 10s CI y la IgG agregada (dato no mostrado) fbe dependiente

pincipalmente del RFcyII. El hecho de que (1) &lo la IgG complejada o polim&ica sea

cap= de inducir la migracion celular y (2) que dicha respuesta involucre la participation de

10s RFcy, esthn de acuerdo con el p d g m a cWco respecto de la Wonalidad de 10s

RFcy, que indica que sblo aquellos ligandos capaces de inducir la microagmgacion de 10s

RFcy son capaces de transducir d e s de acthcion celular.

Durante el desarrollo de 10s experimentos se observo, en uno de 10s controles, que

la mi@6n de neutrofilos inducida por FMLP no ibe af&tada por la preincubacion de las

dulas con el fiagmento F(ab')2 del AcM 3G8. Estos resultados contrastan mmadamente

con 10s informados por Kew y colaboradores (3 14), quienes encontraron que tanto el AcM

3G8 como sus hgmentos Fab inhiben la Wotaxis inducida por FMLP. Las razones de

esta discrepancia no pueden ser ikdmente explicadas, sin embargo, es posible que

obedezcan, al menos en parte, a las distintas metodologias ernpleadas para evahm la

migraci6n cduhr. El m&odo empleado por Kew y colaboradores, (ZedngJionl method),

requiem el uso de un filtro cuyo espesor es de aproxhmhmte 120-130 pn, siendo la

quimiotaxis d c a d a en hcion de la proMdad de penemuion alcanzada por las

cklulas que migran mhs lejos (3 15). El efecto inhibitorio del AcM 3G8 observado bajo

dichas condiciones experhentales, podrSa dejar una reduction en la velocidad de

migracion de la poblacion entera o bien de una subpoblaci6n de la misrna. La evaluation de

las respuestas quimiothcticas en la presente Tesk, se basa en el empleo de un filtro 10 veces

mirs delgado, siendo la migration detemhada en hcion del recuento de las du las que

atraviesan el mismo. Reducciones parciales en la velocidad de locomoci6n por lo tanto,

podrian ser distinguidas por el m&odo de Kew y colaboradores sin ser aparentes en las

condiciones experhentales empleadas en este estudio.

Los pkptidos formilados bacterianos juegan un ro1 critico en el reclutamiento de

neutrofilos a sitios inflamatorios durante el transcwso de div- hkciones bacterianas

(212,223). Los resultados del presente estudio indicaron que la quimiotaxis inducida por

FMLP o por CI es incrementada aditivarnente cuando la mignuion es inducida de manera

S ' i e a por arnbos esthdos Pigura 40). Esta respuesta de naturaleza aditiva podria ser

relemmte en numerosos procesos infecciosos asociados a la presencia de CI circulantes

(120).

Los hallazgos recientes de Sylvestre y Ravetch en ratones deficient- de RFcy,

sugieren que 10s CI son 10s respnsables de iniciar las respuestas idamatorias de tipo III, a

trw& del rechtamiento de dldas firgociticas (8,126). En contrapsicion con las hipbtesis

tradicionales, el cornplemento contiibuhh d o a amplificar la reaccion ~amatoria. Esta

hip6tesis se encuentra sustentada, adem& en observaciones realizadas en hu6spedes

deficientes del complemento, en 10s d e s se observa un infilmdo idamatorio signdicativo

(3 16-3 18). Los resultados del presente estudio proveen evidencias de que 10s CI podrian

inducir per se la quirniotaxis de neutrofilos a dichos fms intlamatorios. El empleo de un

modelo m vivo que permita determinar la importancia de este fknbmeno, no &lo en la

etiologia de la injuria tisular de natural- autoinmune sin0 tambikn en el reclutamiento

necesario de 10s neutrofilos a h de enfbtar las diversas agresiones m i c r o b i i

constituye un proyecto desafhte a ser ernprendido en un fituro prC,ximo.

6.- CONCLUSIONES

El tratamiento de neutrofilos humanos con pronasa o quimotripsina potencia

notablernente la actividad del RFcyII. Esta potenciacion se expresa en una capacidad

incremenfada de formar rosetas EA y de mediar la CCDA y la QL. Este efecto es

selectho para el RFcyIT, no siendo observado en otros receptores operatives en el

neutrofilo.

La cationizacion de la fraccion IgG de 10s CI, incrementa a1 menos en un orden de

magnitud su capacidad agonista dependiente de 10s RFcy. Aun cuando 10s CIcat

sean empleados a concentraciones entre diez y cincuenta veces menores, inducen

respuestas proinflamatorias mediadas por dlulas fagociticas en niveles superiores a

las inducidas por 10s CIc. Las respuestas estirnuladas por 10s CIcat involucran

exclusivamente la participacion del RFcyII, mientras que aquellas inducidas por 10s

CIc esth mediadas por el RFcyII y el RFcyIII.

Las plaquetas constituyen el sistema celular donde el impact0 de la carga elktrica

de 10s CI se evidencia con mayor intensidad. Los CIcat indujeron una ikerte

respuesta de activacion plaquetaria empleando concentraciones fisiologicas de PL,

PF o PRP. Bajo identicas condiciones, 10s CIc no estimularon la activacion

plaquetaria aim cuando fberon utilizados a concentraciones cien veces superiores.

Los CIc &lo indujeron bajos niveles de activacion cuando se usaron a

concentraciones 500 veces mayores y en presencia de concentraciones de plaquetas

tres veces superiores.

La cationizacion del componente antighico de 10s CI -CIcat(Ag)-, tambih

incrementa notablemente la potencia biologica de 10s misrnos comparada con

aquella exhibida por CI formados con antigenos nativos. A dif'erencia de 10s RFcy

involucrados en las respuestas estimuladas por 10s CIcat, las respuestas inducidas

por 10s CIcat(Ag) involucran la participacion del RFcyII y del RFcyIU. La presencia

del RFcyIII, sin embargo, no es un requisite indispensable para que 10s CIcat(Ag) se

comporten como potentes agonistas, dado que 10s rnismos indujeron kertes

respuestas de activacion de plaquetas, las cuales solo expresan el RFcyII.

Los anticuerpos IgG nativos obtenidos del suero de individuos n o d e s presentan pI

heterogbs, comprendidos en el rango 5,8-8,5. Sin embargo, la wga elthica de 10s

misrnos, no afecta la capacidad de 10s CI que 10s incluyen de inducir respuestas

dependientes de 10s RFcy mediadas por cdhdas fhgociticas.

Lns CI constituyen per se potentes esthdos qu im io~cos para 10s neutrofilos

humanos. Su capwidad de inducir la migration de neutroflos involucra,

hdamentalmente, la participation del RFcyII.

10.- Ravekh, J. y Kinet, J.P. Fc receptors. Ann. Rev. Immunol. 9: 457, 1991.

7.- REFERENCIAS

1.- Theofilopoulos, A.N. y Dixon, F.J. Immune complexes in human diseases. Am. J. of Pathol. 100: 53 1, 1980.

2. - Muller-Erberhard, J.H. Complement reaction pathways. En Progress in Immunology IV, ed. Fougereau M.y Dausset, J. Academic Press, New York, 1980, pp. 1002.

3.- Kathryn Liszewsky, M. y Atkinson, P. The complement system. En Fundamental Immunology 111, ed. Paul, W.E. Raven Press, New York, 1993, pp.917.

4.- Unkeless, J.C. Function and heterogeneity of human Fc receptors for immunoglobulin G. J. Clin. Invest. 83: 355, 1989.

5.- Van de Winkel, J.G.J. y Anderson, C.L. Biology of human immunoglobulin G Fc receptors. J. Leuk. Biol. 49: 51 1, 1991.

6.- Amqgorena, S., Bonnerot, C., Drake, J.R., Choquet, D., Hunziker, W., Guillet, J.G.,Wester,P., Sautes, C., Mellanm, I. y Fridmau, W.H. Cytoplasmic domain heterogeneity and functions of IgG Fc receptors in B lymphocytes. Science 256: 1808,1992.

7. - Williams, A.F. y Neil Barclay A. The immunoglobulin superkdy-dmains f i r cell surface recognition. Ann. Rev. Immunol. 6: 381, 1988.

8.- Ravetch, J. Fc receptors: Rubor redux. Cell. 78: 553, 1994.

3.- Van de Winkel, J.G.J. y Capel, P.J.A. Human IgG Fc receptor heter0geneity:molecuIar aspects and clinical implications. Immunol. Today 14: 2 15,1993.

1 1 .- Fridman, W.H., Bonnerot, C., Daem, M., Amigorena, S., Teillaud, J.L. y Sautes, C. Structural bases of FcyReceptor fimdians. Immunol. Rev. 125: 49, 1992.

12.- Metzger, H. y Kinet, J.P. How antibodies work: fixus on Fc receptors. FASEB J. 2: 3, 1988.

13.- Metzger,H. The recqtor with high affinrty for IgE. Immunol.Rev. 125: 37, 1992.

14.- Beaven, M.A. y Metzger, H. Slgnal transduction by Fc receptors: the FsRI case. 1mmunol.Today 14: 222, 1993.

1 5 .- Sandor, M. y Lynch, R.G. The biology and pathology of Fc receptors. J. Clin. Immunol. 13: 237, 1993.

16.- Dower, S.K., De Lisi, C, Titus, J.A. y Segal, P.M. The mechatllsm of binding of multivalent immune complexes to Fc receptors. Biochemistry 20: 6335,1981.

17.- Perussia, B., Dayton, E., Lazaruz, R.,Fa~mhg, V. y Trinchieri, G. Immune interferon inducesthe receptor for monomeric IgGl on human monocytx and myeloid cells. J. E q . Med. 158: 1092, 1983.

18.- Walker, B.A.M., Hagenlocker, B.E., Stubbs, E.B., Sandborg, R.R., Agranoff, B.W. y Ward, P.A. Signal transduction events and RFcy engagement m human neutrophils stimulated with human immune complexes. J. Immunol. 146: 735, 1991.

19.- Ceuppens, J.L., Bloemmen, F. J. y Van Wauwe, J.P. T-cell unresponsiveness to the mitopic activity of OKT3 antibody results fiom a deficienty of the monocyte Fc-gamma receptors f i r murine IgG2a and inhablhty to cross-link the T3-Ti complex. J. Immunol. 135: 165, 1985.

20.- Ceuppens, J.L., Baroja, M.L.m Van Vaeck, F. y Anderson, C.L. Defkct in membrane expression of high afFmty 72-kD Fcg receptors on phagocutic cells in four healthy subjects. J. Clin. Invest. 82: 571,1988.

21.- Cohea, L., Sharp, S.,Kulczy&, A. Jr. Human monocytes, B lymphocyheach has structurally lmique Fc receptors. J. Immunol. 131:378, 1983.

22. - Kurlander, R. J., Haney, A.F., Gartrell, J. Human peritoneal macrophages posses two populatios of IgG Fc receptors. Cell. Immunol. 86: 479,1984.

Pagina I22

23. - Rosenfild, S .I., Looney, R. J., Leddy, J.P.,Phqps, D.C .,Abraham, G.N., Anderson, C .L.. Human platelet Fc receptor for immunoglobulin G: Identificatim as a 40,000 molecular weight membrane protein shared by monoqtes. J. Clin. Invest.76: 23 17, 1985.

24.- Warmerdan, P.A.M., Van de Winkel, J.G.J., Vlug, A., Westerdaal, N.A.C., 1 Cape1,P.J.A. A single aminoacid in the second Ig-like domain of the human Fcy receptor I1 is critical for the human IgG2 bin-. J. Immunol. 147: 1338, 1991.

25 .- Anderson, C.L., Chacko, G. W., Osbome, J.M. Brandt, J.T. The Fc receptor for the immunoglobulin G (FcyRII) on human platelets. Seminars in Thrombosis and hemostasis 2 1 : 1,1995.

26.- Taq W.J.M., Willems, H.W., Reekers, P.P.M., Capel P.J.A., y Koene, R.A.P. Polymorphism in mitogenic of IgGl monoclonal antibodies against T3 antigen on human T cells. Nature 304: 445,1983.

27.- Warmerdan, P.A.M., Van de Winkel, J.G.J., Vlug, A., Westerdaal, N.A.C., y Capel,P.J.A. A single aminoacid in the second Ig-like domain of the human Fc y receptor 11 is critical for the human IgG2 binding. J. Immunol. 147: 1338, 1991.

28 .- Warmerdan, P.A.M., Van de Winkel, J.G.J.,Gosselin, E. J., y Capel, P.J.A. Molecular basis for the polimorphism of human Fcy RII (CD32). J. Exp. Med.172:109,1990.

29.- Katz, H.R., Raizman, M.B., Gartner, C.S., Scott, H.C., Benson, A.C. y Frank Austen, K. Secretory granules mediators release and generation of oxidative metabolites of arachidonic acid via Fc-IgG receptor binding in mouse mast cells. J. Immunol. 148: 868, 1992.

3 0. - Narasimhan, V., Holowka, D. y Baird, B. A guanine nucldde-binding protein participates in IgE receptor mediated activation of endogenous and reconstihrted phospholipase A2 in a permeabilized d system. J. Biol. Chem. 265: 1459, 1990.

3 1 .- Selvaraj, P.,Carpen, O., Hibbs, M.L. y Springer,T. A. Natural killerang granulocyte Fcg receptor JII (CD16) &r in membrane anchor and sigtlal transduction. J. Immunol. 143: 3283, 1989.

32.- Scallon, B. J., Scighano,E., Freedmm,V.H., Miedel, M.C., Pan, I.C.E., Unkeless, J.C., y Schlondorff, D.A. A human immunoglobulin G receptor exists in both polypeptide-anchored and phosphatid~ositol$ycan-anchored fbnns. Proc. Nac. Acad. Sci. USA. 86: 5079,1989.

33 .- K u r d , T. y Ravetch, J.V. A single aminoacid in the glycosyl phosphatidylmositol attachment domain determines the membrane topology of FcyRUI. Nature 342: 805,1989.

34.- Lanier, L., Cwirla, S.,Yu, G., Testi, R. y Philips, J.H. Membrane anchoring of a human Fc receptor (CD16) determined by a single aminoacid. Science 246: 161 1,1989.

3 5 .- Salmon, J.E., Edberg, J.C. y Kimberly, R.P. Fcy receptor I11 on human neutrophils. Allelic variants have hctionally distinct capacities. J. Clin. Invest. 85: 1287, 1990.

36.- De Haas, M., Kleijer, M., van Zwi-, R., Roos, D. y von dam Borne, A.E.C.Kr. Neutrophil FcgRIIIb deficient., nature, and clinical consecuences: study of 21 individuals from 14 f8milies. Blood 86: 2403, 1995.

37.- Weissman, A.M., Baniyash, M., Hou, D., Samuelson, L.E., Burgess, W.H. y Klamer, RD. Molecular cloning of the < chain of the T cell antigen receptor. Science 239: 1018,1989.

38.- Anderson, P., Caligiuri, M., O'Brian, C., Manley, T., Ritz, J. y Schlossrnan, S. FcyRIII(CD16) is included in the < Nk receptor complex expressed by human natural killer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274, 1990.

39.- Wirthmueller, U. Kurosaki, T., Murakami, M.S. y Ravetch, J.V. Signal transduction by FcyRIlI (CD16) is mediatad through the g chain. J. Exp. Med. 175: 1381,1992.

40. - Lanier, L.L., Yu, G. y Philhps, J.P. Co-association of the CD3 with a receptor (CD16) fbr IgG Fc on human NK cells. Nature 342: 803,1989.

4 1. - Kurosaki, T., Gander, I. y Ravetch, J.V. A subunit common to an IgG Fc receptor and the T cell receptor mediates assembly through dierent interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3837, 1991.

42.- Kurosaki, T., Gander, I., Wirthrnueller, U. y Ravetch, J.V. The P subunit of the FaRI is associated with the RcyRm an mast cells. J. Exp. Med. 175: 447,1992.

43 .- Klingenstein, R. J. y Dickler, H.P. The effect of pharmacologic agents on immune complex-mduced redistribution of B- lymphocyte Fc y receptor. Scand. J. Immunol. 10: 145, 1983.

44.- Segal, D.M., Titus, J.A. y Dower, S.K. The FcyR mediated endocytosis of model immune complexes by cells from the P388D1 mouse macrophage line. 11. The role of ligand-induced self -ion in promoting internalization. J. Immunol. 130: 138, 1983.

45.- Leslie, R.G.Q. Complex aggregation: a critical event m macrophage handling of soluble immune complexes. Immunology today 6: 183,1985.

46.- Dower, S.K., De Lisi, C., Titus, J.A. y Segal, D.M. The mechanism of binding of multivalent immune complexes to Fc receptors. Biochemistry 20: 6335, 198 1.

47. - Verhoef, J. y Visser, M.R. Neutrophil phagocytosis and killmg. En The natural immune system: The neutrophd, ed. Abramson, J. y Gary Wheeler, J. Oxford University Press Inc, Nueva York, 1993, pp. 109.

48.- Metzger, H. Fc receptors and the action of antibodies, ed. Metzer, H. ASM Publications, Wadmgtm DC, 1987.

49.- Shaw, D.R. y Griffin, F.M. Phagocytes require repeated triggering of macrophage phagocytrc receptor during particle ingestion. Nature 289: 409, 198 1.

50.- Babior, B.M. The respiratory burst oxidase. Advances in Enzymology 65: 49,1992.

5 1 .- Rosen, G., Pou, S., Ramos, C., Cohen, M. y Britigan, B. Free radicals and phagocytic cells. Faseb J. 9: 200,1995.

52.- Flohe, L., Beckmann, H. y loschm, G. Oxygen-centered fiee radicals as mediators of idammation. En: Oxidative stress, ed. Sies, H. Academic Press Inc, Londres, 1985. pp.403.

53 .- Bastian, N. y Hibbs, J. Assembly and regulation of NADPH oxidase and nitric oxide syntase. Curr. Op. b u n o l . 6:131-39,1994.

54.- McPhail, L. SH3dependent assembly of the phagocytes NADPH oxidase. J. Exp. Med. 180: 2011,1994.

55.- Mills,E.L.yNoya,F.J.D. Congenital neutrophils deficiencies. En The natural immune system: The neutrophil. ed. Abramsan, J. y Gary Wheeler, J. Oxfbrd University Press Inc, Nueva York, 1993. pp .194.

56.- McPhail, L.C. y Harvath, L. Signal transduction in neutrophil oxidative metabolism and chemotaxis. En The natural immune system: The neutqhil, ed. Abramson, J. y Gary Wheeler, J. Oxfbrd Universe Press Inc, Nueva York, 1993. pp. 63.

57.- Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. y Cumutte, J. Neutrophils and host defbse. Ann. Intern. Med. 109: 127,1988.

58.- Weiss, S. Tissue destruction by neutrophils New Engl. J. Med. 320: 365,1989

59.- Klebanoff, S.J. Myeloperoxidase-mediated cybtoxic system. b: The reticuloendathelial system. Vol. 2 Biochemistry and metabolism, ed. Sbarra, A.J. y Straws, R.R. Plenum Press, New York, 1980, pp.279.

60.- Bielsky, B.H. y Allen, A.O. Mechanism of d isprd idon of superoxide radicals. J. Phys. Chem. 81: 1048,1977.

61.- Jensen,M.S. yBainton, D.F. Temporal changes in pH within the phagocytic vacuole of the polymorphonuclear neutrophilic leukocytes. Cell. Biol. 56: 379,1973.

62.- Chance, B., Sies, H. y Boveris, A. Hidroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol. Rev. 59: 527, 1979.

63 .- Hyslop, P. A, Hinshaw, D.B. y Halsey W.A. Mechanisms of oxidant med&ed~ell ijury: the ghloolybc and m i t o a d d pathways of ADP phosphorilation are major intracellular targets iuactivated by hydrogen peroxide. J. Biol. Chem. 263: 1665,1988.

64.- Thomas, L.T. yLehrer, R.I. Human neutrophil antimicrobial activity. Rev. In&. Dis. 10, suppl. 2: S450, 1988.

65.- Row, G., Pou, S., Ramos, C., Cohm, M. y Britigan, B. Free radicals and phagocytic cells. Faseb J. 9: 200, 1995.

66.- Test, S.T. y Weiss, S.J. The generation of utilization of chlorinated oxidants by human neutrophils. Adv. Free Radical Biol. Med. 2: 9 1, 1986.

67. - Albrich, RJ., Gilbaugh, J.H.,Callahan, K.B. y Hurst, J.K. E W of the putative neutrophil- taxin, hypoddorous acid on membrane perrneabii and tmsport systems of Escherichia coli. J. Clin. Invest. 78: 177, 1986.

68 .- Rakita, R.M., Michel, B.R. y Rosen, H. Mieloperoxidase mediated inhibitim of microbial respiration: damage to Escherichia coli ubi@01 oxidase. Biochemstry 28: 3031,1989.

69.- W ~ C . C . , v a n d e r B e r g , J . J . R o ~ E . y K u i p e f ~ , F . A . Chlorohydrm fbmution fium unsaturated f&y acids reacted with hypochlorous acid. Arch. Biochem. Biuphys. 2%: 547,1992.

70.- Nathan, C.F. Neutrophil activation on biological mibces: masive secretion of hydrogen peroxide in response to products of macrophages and lymphocytes. J. Clin Invest. 80: 1550, 1987.

71.- Klebatl- S.J.yW-h, A.M. Prooxidant activity oftramfkrrin and lactufbrrin. J. Exp. Med. 172: 1293,1990.

72.- Bdi jp , B.E. y Edeker, B.L. Pseudomanas and neubqhil products modifL kmdkin and lacto&rrin to create conditicms that &vor hydro4 radical fbnnatim. J. Cih. Invest. 88: 1092,1991.

73.- CMhan,T.J.Cox,C.D.,Edek,B.L.yB~B.E. Possible role of bacterial sideqhores in hthmsticm. Imn bound to the Pseudomones slderaphore pyochelin can f i m c h as a hydmxd radical catalyst. J. Clin. Invest. 86: 1030,1990.

74.- K&,A.V. y U M . Red chnhmb-ce ofmolecular oxygen in aqueous soluth. Chem Phys. 39:2105,1%3.

75.- Kellog, E.W. y Fridovicb, I. Superoxide, hydrogen peroxide and smglet oxygm in b id paoxidation by a xantine oxidase systertl. J. Bid. Chem 250: 88 12,1975.

76.- H~P.M.,Henson,J.E.,F~en,C.,IGmam,G.,Brathm,D.L.yRi&es,D.W.H. Phagoq&c cells: degmulaticm and semtkm. En Idhmation: basic principles and clinical correlates. ed. Gallm, J.I., Goldstein, LM. y Snyder- R, R a m Press, Nueva york, pp.363,1988.

77 .- J a n e A. Elastase m tissue injury. Atmu. Rev. Med. 36: 207,1985.

78.- Kramps, J.A., Van Twlsk, C. y Di$man, JH. Oxidative inactidan of bronchial a n t k h p w by triggered polyrmnphmuclear leukocytes. Am. Rev. Respir. Dis. 135:290,1987 (abstr.)

79.- Weiss, S.J. y Peppin, G.J. Collagaolytic metall~azymes of the human neutqhil: chmk&ics, regulatan and patenbl fimcticn m viw. Biochem. Phannacol. 35: 3189,1986.

80.- Weiss,S.J.,Peppin,G.J.,~X.,Ragdak,C.yTest,S.T. Oxidative autoactidon of latent collagenase by humau neutrophils. Science 227: 747,1985.

81.- Peppm,G.J.yWeiss,S.J. Activation ofthe endogenous metallaprdzimw, gelatkm, by- human neutrophils. Proc. Nac. Acad. Sci. USA 83:43224,1986.

82.- Odeberg, H. y Olsscm, I. Mecbanisns h r the microbicidal activity ufcationic pr&hs ofhumau grauulocites. Met. hmunuu. 14: 1269,1976.

83 .- Gmz, T., Selsted, M., Babior, B. y Cumutb, J. Neutrophils and host d&nse. Ann. Wem. Med. 109: 127,1988.

84.- Weiss, J., Elsbach, P., Olsson, I. y Odeberg, H. Purification and characterization of a patent microbicidal and membrane active protein from the granules of human polimorphonuclear leukocytes. J. Biol. Chem. 253: 2664,1978.

85.- Larsan,G.L. yHenson, P.M. Mediators of w a n . Ann. Rev. Immunol. 1: 335, 1983.

86.- Sturm, R.J. y Chang, J.Y. Neutrophdderived lipid mediators of dammation En: hmunophannacology, ed. Gilman, S.C. y Rogers, T. J. The Telfbrd Press, Caldwell, New Jersey, 1989, pp.89-104.

87.- Sato, M., Nakamura, T. y Koyama, J. DBbrent abilities of two distinct Fcg receptors on guinea pig polymorphonuclear leukocytes to trigger the arachidonic acid metabolic cascade. FEBS letters 224: 29, 1987.

88.- Smith, R.J., Yein, F.S., Speciale, S.C. y Bowman, B.J. A possible requirement fE,r arachidonic acid @oxygenation in the mechanism of phagocytic degranulaticm by human neutmphils stimulated with aggregated immunoglobulin G. Biochem. Biophys. Res. Commun. 136: 310,1986.

89.- Irvine, R.F. How is the level of fiee arachidonic acid umtrolled in mammalian cells? Biochem. J. 204: 3,1982.

90.- Parker, C .W. Lipid mediators produced through the llpoxygenase pathway. Ann. Rev. Immunol. 5: 65, 1987.

9 1 .- O'Flaherty, J.T., Wykle, R.L., Thomas, M.J. y McCall, G.E. Neutrophil degranulation responses to combinations of arachidamte metabolites and platelet-activating factor. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 43: 3,1984.

92 .- Goetzel, E. J. y Pickett, W .G. The human polimorphonuclear leukocyte chemotactic activity of complex hydroxy- eicosabtraenoic acid. J. Immunol. 125: 1789, 1980.

93 .- Palmer, R.M. J., Stepney, R. J. y Eakins, K.E. Chemokinetic activity of arachidonic acid llpoxygenase products of leukocytes of difBrent species. Prostaglandins 20: 411, 1980.

94.- Ford-Hutchinsan, A.W ., Bray, M.A., Doig, M.U., Shipley, M.E. y Smith, M. J.H. Leukotriene B4 a potent chernokinetic and aggqpthg substance released fiom polimorphonuclear leukocytes. Nature 286: 264,1980.

95.- Bokoch, G.M. y Reed, P.W. E f b t of various lipoxygemse~ metabolites of arachidonic acid on degranulation of polimorphonuclear leukocytes. J. Biol. Chem. 256: 5317, 1981.

Pagina 129

96. - Benveniste, J., Henson, P.M., y Cochrane, C.G. Leukocytedependent histamine release from rabbit platelets. The role of IgE, basophils and platelet-activating hctor. J. Exp. Med. 136: 1356,1972.

97.- O'Flaherty, J.T., Thomas, M. J., Lees, C. J. y McCall, G.E. Neutrophil aggregating activity of monohydroxyeicosatetraenoic acids. Am. J. Pathol. 104: 55, 1981.

98.- O'Flaherty, J.T. Neutrophil degranulation: evihce pertaining to its mediation by the combined e&& of leukatriene B4 platelet-activating factor, and 5-HETE. J. Cell. Physiol. 122: 229, 1985.

99.- 07Flaherty7 J.T., Thomas, M. J., McCall, G.E. y Wykle, R.L. Patentiating actions of hydroxyeicos&traen& on human neutrophil degranulaticm responses to leukotriene Bq and phorbol myristate acetate. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 40: 475, 1983.

100.- Serhan, G.N. Hamberg, M. y Samuelson, B. Lipoxins: a novel series of biological active compounds firmed fiom arachidonic acid m human leukocytes. Proc. Nd. Acad. Sci. USA 81: 5335,1984.

10 1 .- Ramstedt, U., Ng, J., Wigzell, H., Seaham, C.N. y Samuelm, B. Actions of a novel eicosanoids lipoxin A & B on human natural Killer cell cyb%oxicity: ef3kts cm iutracellular CAMP an target cell binding. J. Immuuol. 135: 3434, 1985.

102. - Vanderhoek, J.Y., Karim, M.T. y Ekboug, S.L. hdogenous hydroxyeicosatetraenoic acids stimulate the human polymorphonuclear leukocyte 15-ltpoxygause pathway. J. Biol. Chern. 260: 15483, 1985.

1 03. - Pmkard, R.N., Ludwig, J.C. y McManus, L.M. Platelet-activating factors. En: Idhumtion: Basic principles and clinical correlates, ed. Gallin, J.I., Goldstein, I.M. y Snyderman, R. Raven Press, New York, 1988, pp. 139.

104.- Gefiker, J.R., Schattner, M. A., Lazzari, M. A. y Isturiz, M. A. Gamma interferon enhances PAF-acether production by stimulated human polymorphonuclear leukocytes. Scand. J. Immunol. 33: 575, 1991.

105. - Berm, G., Zeni, L., Cassatella, M. A. y Rossi, F. Gamma interferon is able to enhance the oxidative metabolism of human neutrophlls. B idem. Biophys. Res. Commun. 138: 1276,1986.

106.- McManus, L.M., Hanahan, D. J. y Pmckard, R.N. Human platelet stimulaticm by a w l glyceryl ethyl-phosphoryl-choline (AGEPC). J. Clin. Invest. 67: 903, 1981.

107. - Lad, P.M., Olson, C .V. y Grewall, I. S. Platelet-activating fbctor mediated e6xt.s cm human neutrophil function are inhibited by pertussis toxin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 129: 632,1985.

108.- Shaw, J.O., Pinckard, R.N., Ferrigni, K.S., McManus, L.M. y Hanahan, D. J. Activation of human neutrophils with 1 -0hexadecyl-octadecyl-2-acetyl-sn-gyceryl-3- phosphorylcholiue (PAF). J. Immunol. 127: 1250, 1981.

109.- Ingraham, L.M., Coates, T.D., Allen, J.N., Hoggins, C.P., Bachner, R.I. y Boxer, L.A. Metabolic, membrane and fimcticmal respanses of human polymorphonuclear leukocyte to platelet-activating factor. Blood 59: 1259,1982.

1 1 0. - Findley, S.R., Lichtmstein, L.M., Hanahan, D. J. y Pinckard, RN. The amtraction of guinea pig ileal s m d muscle by acetyl glyceryl ether phosphoryl- choline. Am. J. Physiol. 241: C130, 1981.

1 1 1 .- m e r , J.R. Antibodydependent cell mediated cytobxicity. h: Encyclopedm of Immunology, ed. Roitt, LM. y Delves, P. J. Academic Press, Londres, 1993, pp. 100.

112.- Key, M.E. y Haskill, S. The role of macrophage-medmted ADCC in dehse against disease. A patential antitumor defense mechanism. En: Macrophage mediated ADCC, ed. Koren, H.S. Marcel Dekker, Inc., 1983, pp. 237.

1 13 .- Shore, S.L., Black, C.M., Mewicz, F.M., Wood, P.A. y Nahmias, J . ADCC to target cells inf&ed with type 1 and type 2 HSV. J. Immunol. 116: 194, 1976.

114.- Thomas, J.M, Thomas, F.T., Kaplan, A.M. y Lee, H.M. Antibodydependent cellular cytatocicity and chronic renal allograft rejection. Transplantation 22: 94,1976.

1 1 5.- Sayers, T.J. y Wiltrout, R.H. w o n and fimctions of natural killer cells. En: Immunop~cology, ed. Gilman, S.C. y Rogers, T. J. The Telibrd Press, Caldwell, New Jersey, 1989, pp. 343.

1 16.- Katz, P., Simone, C.B., Henkart, P.A. y Fauci, A.S. Mechanism of antibodydependent celular qhtoxicity. J. Clm. Invest. 65: 55, 1980.

117.- Clark, R.A. y Klebanoff, S.A. Studies on the mechanism of antibodydepmdent polymorphonuclear leukocyte mediated qtutoxicity. J. Immunol. 119: 1413, 1977.

1 18.- Kushner, B.H. y Cheung, N.V. Clinically effectuve monoclonal antibody 3F8 mediates nonoxidative lysis of human neuroedodmd tumor cells by polymorphonuclear leukocytes. Cancer Research 5 1:4865, 1991.

1 19.- M~II& M. Pathophysiology of circulating immune complexes. Arthr.Rheumat. 25:783,1982.

120.- Nydegger, V.E., Kaa&d&e, M.D. y Lambat, P.H. Involvemat ofimmuue complexes m Diseases. En: Progress in Immunology IV, ed. Fougmau, M. y Daussd, J. Academic Press, New York, 1980, pp: 1025.

121.- Haynes, B.F. y Katz, P. The spectnun of vasculitis. Ann. Intern. Med. 89: 660, 1978.

122.- Hason, P., Fantone, J.C. Ward, P. y Dreisin, R.B. Immune complex injury of the lung. Blood reviews 2: 738, 1981

123 .- Galh, J. IUfhmmon. En: Fundamental Immunology III, ed. Paul, W.E. Raven Press, New York, 1993, pp. 1015.

124. - Perlmutter, D.H. y C o h , H.R. Molecular immunology of complement biosynthesis: a model fbr single cell control of e%&tor inhibitor balance. Annu. Rev. Immunol. 4: 231, 1986.

125.- Takai, T., Li, M., Sylvestre, D., Clynes, R y Ravelch, J.V. FcRy chain deletion results in pleiotropic d%ctor cell d e h . Cell 76: 5 19,1994.

126.- Sylvestre, D.L. y Ra-, J.V. Fc receptors initiate the Arthus Reaction: Redefining the immfbatory cascade. Sciance 265: 1095, 1994.

127. - Zhang, Y., Rarnos, B.F. y Jakduk, B. Neutrophil recruitment by tumor necrosis hctor from mast cell immune complex p e M 1 s . Science 258: 1957, 1992.

128. - Zhang, W., Voice, J. y Lacham, P. J. A systematic study of neutrophil degranuhtion and respiratory burst in vitro by defined immune complexes. Clin. Exp. Immunol. 101: 507,1995.

129.- Crock&-Torabi E. y Fantone, J.C. Soluble and insoluble immune complexes activate human neutrophil NADPH oxidase by distinct Fcy receptors-specrfic mechanisms. J. Immunol. 145: 3026, 1990.

130.- Lund-Johansen, F., Olweus, J., Symiugtm, F.W., Arli, A., Thomson, J.S., Vilella, R.,Skub&z, K. y Horejsi, V. Activation of human mmocytes and granulocytes by monoclcmal antibodies to gly~~~ylphosphatidyh~~itol-anchored adgem. Eur. J. Immunol. 23: 2782, 1993.

13 1 .- Salmon, J.E., Edberg, J.C., Brogle, N.L. y Kimberly, R.P Allelic polymorphisms of human phagocyte function. J. Clin. Invest. 89: 1274, 1992.

132.- Graziano, R.F. y Fanger, M.W. FcyRI and FcyRII on monocytes and granulocytes are cytotoxic trigger molecules for tumor cells. J. Immunol. 139: 3536, 1987.

133.- Geflber, J.,Giordano,M., Mmsky,G.yJsturiz,M. The role of reactive oxygen intermediates in n-c monoqde cytatoxicity induced by immune complexes. Clin. E q . Immunol. 67: 646, 1987.

134.- G d h r , J. Giordano, M. Serebnnsky, G. Palenno, M. y kturk M. NeutrqhilmxWd qtdmiuty triggered by imrnun-h: the role of reactive oxygen nletabok. Clin. Exp. Immunol. 69: 668,1987.

135.- Giordano, M., Gefher, J. Wnnsky, G. Palmno, M. y Isturiz, M. IXiSmnt reqkm&s fbr the hiucticm of antibodydqmdent and immune complexes triggered cytatoxicity mediated by monocytes. Immunol.Le&~~ 17: 109, 1988.

136.- Gefber, J.,Giodano, M., Serebm&y,G.yIsturiz, M. DifBnnt activation pathways involved m a u t i i d q m d e u t and immune complexes tnggeredcytatoxicitymediatedbyneuhuphils. Clin.Exp.Immunol.74: 471, 1988.

137.- Istunz, M.A., m e r , J.R., Pizzolato, M. Two cMkrent Fc receptor depmdent qtdmic mechanisn triggered by m o c l d i tnmmoglob~. h n m m o l . ~ . (USA) 29:271, 1991.

138.- Boyum, A. Separation of leukocytes fiom blood and bone marrow. Scan. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Supl. 97): 77, 1968.

139.- Cy, L., Lam, K.W. y Yam, L.T. Estearases in human 1eukacyt.m. Histochem. Cytochem. 21: 1,1973.

140.- McCrae, K.R., Shattil, S . J. y Cines, D.B. Platelet activation induced Fc receptor expression. Immunol. 144: 3920,1990.

141 .- Avrameas, S . y Temynck, T.H. The cross-linking of proteins with glutaraldehyde and its use for the preparations of the immmoads0rbents. Immunochemistry 6: 53,1969.

142.- Gauthier, V.J., Manu&, M. y Stricker, G.E. Effect of cationized antibodies in preformed immune complexes on deposition and persistences in r e d glomeruli. J. Exp. Med. 156: 766, 1982.

143.- 0debW.D. y Heber,D. Radioiodiuatian of peptides and pr&ins &r radioimmmmys or radioreceptor assays. En: Manual of Clinical Imtnuuology, ed. Rose, N.R and Fnclman, H. American Society fir Microbiology, Wadmgtm, 1980, pp: 329.

144 .- Oite, T., Batsford, S .R., Mibtsch, M.J ., Takamiya, H. y Vogy, A. QuantitAve studies of in situ immune complex glomerulonephritis in the rat induced by planted caticmized antigen. J. Exp. Med. 155: 460,1982.

145.- Istunz, M.A., Fmk, S. yBracm, M.M.E. Reversal of immune complex inhibiticm of antibody dependent cell- cytobxicity by normal human serum. Clin.Exp.Irmnunol.48: 685, 1982.

146.- TI&, MA, W m M . E . y Van -5. The geoeratian of c h e m i l w c e by m c cells. En: IMdhods in Imtmmology, Vol.LW, Biolumhismce and chmhmmm

. . . ce, ed. De

Luca M.A.. Academe Press, New York, 1978, pp. 462.

147.- Kramps, J. A., van Th& C. y van der Linden, A.C. L P y r o g l ~ - L p r n l y l - L ~ e - p ~ , a highly substrate fir granulocyte elastase. h d . J. Clin. Lab. Invest. 43: 427, 1983.

148.- Harvath, L., Falk, W. y leonard, E.J. Rapid quantitation of neutrophil chemotaxis: use of a polyvinylpyrrolidone-fiee polycarbonate membrane in a multiwe11 assembly. Immunol. Methods 37: 39, 1980.

149.- Zigmond, S. y Hirsch, J. Leukocyte locomotion and chemotaxis: New methods fir evaluation and demostration of cell-derived chernotadic fBctor. J. Exp. Med. 137: 387, 1973.

150.- Sandor, M., Fust, G., M-i, G.A y Gergely, J. Isolaticm and hcterization of Fc recept~n shed h n human peripheral mcmmuclear cells. Immmo1ogy 35: 559,1978.

15 1 .- Bom, G.V.R y Cross, M.J. 'Ihe aggqptim ofblood platelets. J.Physi01. 168: 178, 1%3.

152.- Cochrane, C.G. Immunologtic tissue injury mediated by neutmphilic leukocytes. Adv. Immunol. 9: 97, 1968.

1 53 .- Henson, P.M. y Johnston, R.B. Tissue injury in hfhnmation: oxidants, proteinases and cationic proteins. J. Clin. Invest. 79: 669, 1987.

154.- Vischer, T.L. S m c m ofmouse B lyuphocytm bytrypsin. J. Immunol113: 58,1974.

155.- Glemr, K.C. y Cunntngham, D. Thrombin-stim& cell division involves protdysis of i t . cell surhce receptor. Natme 278: 71 1,1979.

1 56.- Kramer, M.D. y Siman, M.M. Are proteiuases fimcticnal melecules ofT lymphocytes? Immunol Today 8: 140,1987.

157.- Meri, D.C. y Stamnes, S.J. -dent T cell advation: hgabm of edktor cell protease receptor-1 (EPR-1) stimulates lymphocyte p m ~ o n . Cell. Immunol. 155: 372, 1994.

158.- Van de Winkel J.C.J., Van Ormnar R, Hwbga T.W.J., de Raad M.AH.V.M., Tuijnarn W.B., Groeua P.J.T.A., Capel P.J.A., Koeue RA.P. y Tax WJ.M. Fkhmlysis induces increased bindmg afhity ofthe mcmocyk type II fir human IgG. J.Immuu01. 143: 571, 1989.

159.- Debeb J.M.H., Van de Winkel J.C.J., Ceuppeas J.L., Dieteren I.E.M. y Buurman, W.A. Cross-lmking o f m FqRI and FcyRII iuduced d o n oftumor necrosis factor by human mcmacytes requiring hq& af€hty Fc-FcyR interadicms. Functional activity of FcyRII by treatment with pmteases or neuroarninidase. J.Immuuol. 144: 1304,1990.

160.- Tax W.J.M. yVande Winkel J.G.J. Human Fcy receptor II:a standby receptm activated by p d y s i s ? Immunol.Today 1 1: 308,1990.

1 6 1 .- Fleit H.B. y Kuhnle M. Biochemical h e m of a Fc reaptor purifkd h human neutrophlls. J.Immuuo1. 140: 3120, 1988.

162.- Tosi M.F. y Berger M. Funct id di&mces between the 40 kDa and 50 to 70 kDa IgG Fc mepbrs cm human neutqhils d e d by elastase tmatmmt and antireceptor antibodies. J.Immuuo1. 141: 2097, 1988.

163 .- Cheuug, K., Archibald, A.C. y Robinson, M.F. The origin of chemilumines~edlce produced by neutrophils stimulated by opsonized zym-- J. Immunol. 130: 2324, 1983.

164.- Hugli, T.E. y Muller-Heberbard, H.J. Anaphylatoxins: C3a and C5a. Adv. Immunol. 26:l-53, 1978.

165 .- Johnston, RB., Lehmeyer, J.E. y Guthrie, L.A. Generation of superoxide anion and &emiluminis~~nce by human monocyks during phagocytosis and on contact with surfhce-bound immunoglobulin G Exp. Med. 143: 1551,1976.

166.- Golbus, J. y McCune, J. Lupus nephritis: Clasification, prognosis, immunopathogenesis and treatment. En: R h d c disease clinics ofNorth Ameaica, vol20, ed. McCune, J. pp.228.

167.- Steinberg, A.D., Smolen, J.S., Sakane, T., Kumagai,S.,Marimato, T., Chused, T.M., Green, I.J.Iirata, F., Siminovit&, K.A. y Stemberg, R.T. Immune regulatory abnormalities in systemic lupus eritematosus. En: Innnune mechanisms m Rend Disease, ed. Cumrnings, N.B., Michael, A.F. y Wilson, C.B. Plenum Publishing, New York, 1982, pp.529.

168.- Hahn, B.H., Ebling, F.M. Suppression of NZB/NZW murine nephritis by administration of syngeneic monoclonal antibody to DNA: posible role of anti-idiotypic antibodies. J. Clin. Invest. 71: 1728, 1983.

169.- Ebling, F. y Hahn, B.H. Restricted subpopulations of DNA autihdies in kydneys of mice wah systemic lupus: cumparism of antibodies in serum and renal eluates. Arth&s Rheum. 23:392,1980.

170.- Datta, S.K., Patel, H. y Berry, D. Induction of a cationic shl& in IgG anti-DNA autoantibodies. J. Exp. Med 165: 1252,1987.

1 7 1. - Shivakumar, S., Sokos, G.C. y Datta, S.K. T cell receptor alfs/beta expressing double negative (CD4-ICD8-) and CD4' T helper cells in humans augment the production of pathogenic anti-DNA autoantibodies associated with lupus nephritis. J. Immunol. 143: 103, 1989.

172.- Rajagopalan, S., Zordan, T., Tsokos, G. y Datta, S. Pathogenic anti-DNA autoantibody-inducing T helper cell lines fiom patients with adive lupus nephritis: Isolation of CD4-8- T helper cell lines that express the gd T-cell antigen receptor. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87: 7020, 1990.

173 .- Gavalrhtn, J., Nicklas, J.A., EastmU, J.W., Madaio, M.P., Stellar, B.D., Schwartz, R.S. y Datta, S.K. Lupus prone (SWR x NZB)F 1 mice produce potentially nep-enic autoantibodies inherited fiom the normal SWR parent. J. Immmol. 134: 885, 1985.

174.- Gallo, G.R., Caulin-Glaser, T. y Lamm, M.E. Charge of circulating immune complexes as a fidor in glomerular basement membrane localization in mice. J. Clin. Invest. 67: 1305,1981.

1 75. - Renuke, H.G., Cotran, R.S. y Venkatachb, M. A. Role of molecular charge in glomerular permeabihty. Tracer studies with cationized ferritin. Cell. Biol. 67: 638, 1975.

176.- Kanwar, Y.S. y Farquhar, M.G. Anionic sites in the glomerular basement membrane. In vivo and in vitro localization to the laminae rarae by cationic probes. Cell. Biol. 81: 137, 1976.

Pcigina 13 7

1 77. - Gauthier, V. J. y M& M. A small proportion of cationic antibodies in immune complexes is sficient to mediate their deposition in glomeruli. J. Immunol. 145: 3348, 1990.

1 78.- Clark, R.A. y Klebanoff, S.J. Neutrophil-mediated tumor cell cytotoxicity: role of peroxidase system. J. E q . Med. 141: 1442, 1975.

179.- Skosey, J.L., Chow, D., Damgaad, E. y Sorensen, L.B. Effect of cytochalasin B on mponse of human polymorphonuclear leukocytes to zymosan. Cell. Biol. 57: 237, 1973.

1 80.- Goldstein, I., HofWein, S., Gallin, J.y Weissmann, G. Mechanisms of lysosomal enzymes release ficnn human leukocytes: microtubule assembly and membrane hsion induced by a wmponent of complement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2916, 1973.

18 1 .- m e r , J.R., Minucci, F. y Isturiz, M.A. Inte&ron gamma is unable to increase m0nocyt.e and neutrophil-mediated nonspecific cytotoxicity induced by immune complexes. Immunol. lett. 33: 21, 1992.

1 82. - Basu, S.K., Goldstem, J.L., Anderscn, RG.W. y Brown, M.S. Degradation of caticmized low c b & y h p o p h and regdat~on ofcholestmol metabolism m homoygcxls &mild hypercholesteroW &robMs. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 73: 3178,1976.

183.- Shen, W.C. yRyser,H.J.P. C o n e m of poly-Glysine to albumin and horseradish peroxidase: a novel method of h c i u g t h e cellularuptake ofproteins. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 75: 1872,1978.

184.- Bergmaml P., Kacenelembogen, R y Viaet, A. Plasma clearance, tissue distributim and catabolsim of catimbd albumins with increasing hekdr ic points in the rat. Clin. Sci. 67: 35, 1984.

185.- Clark, J.M., Vaughan, D.W., Aikea, B.M. y Kagan, H.M. Elastase-like enzymes m human neutrophds localized by ultrastrum1 cytmhemistry. Cell. Biol. 84: 102, 1980.

186.- Israeds, E.D., Nisli, G., Pamskems, F. e Israels, L.G. Platelet Fc receptor as a mechanism 6 r Ag-Ab complex-induced platelet injury. 'Ihrombos. Diathes. Haanonh. 29: 434,1973.

187.- Keltan, J.G., Smith, J.W., Santos, A.V., Murphy, W.G. yHormvood, P. Platelet IgG receptor. Am J Hemato1 25: 299,1987.

1 88.- Mueller-Eckhard, C.L. y Liischer, E.F. Immune reactions of human blood platel&. I. A comparative study on the e&cts on platelets on heternlogous anhplateld antkmm, autigtmantibody complexes, aggregated gamma globulins, and dumbin. ?hnanb.Diath.Haemonh. 20: 155, 1968.

189.- pfueller, S.L. y Liischer, E.F. The e f l h of aggregated immmoglob& on human blood platelets m relation to their complemmt-iixmg abilities. I. Studies ofImmunoglobulins ofdi€krenttypes. J lmmunoll09: 517,1972.

190.- PfUeIler, S.L. y Likher, E. The e&& of aggregated immunoglobulins on human blood platelets in relation to their cmplemeut-iixmg abilities. It. Strucbal nqukmmt ofthe jmmunoglobulin. J.Irmnunol. 109: 526, 1972.

19 1 .- Hensan, P.M. y Spiegelberg, H.L. Release of serotmin fkom human platelets induced by agpgakd i m m u n ~ u l i u s of ~ c l a s s e s a n d s u b c ~ . J.Clin.Invest. 52: 1282, 1973.

192.- Colaco, C.B. y Elkon, K.B. The lupus anticoagubt. A disease marker m antinuclear antibody negative lupus that is cross reactive with autmutibodies to double4xmded DNA. Arthritis Rheum. 28: 67,1985.

193.- Koike, T., Tomioka, H. y Kumagai, A Antibodies cross-reactive with DNA and cardiohpm m patients with systemic lupus etythematmus. Clin.Exp.Immunol.56: 193,1984

194.- Craig Stocks, S., Ken, M. A., Has&& C., M l d , I. ClXMepmdent neutqhjlactivasion: a posible medmism 6 r vascular s e l e c t i u ~ reguhon ofneutrophil adhesion. J. Leukoc. Biol. 58: 40, 1995.

195.- HdWh, S.T., F r i a RS. y W- G. Degraaulation, membrane additiaa, and shape change durmg chemdactic fkctor-induced agpgationofhumann~hi ls. Cell Biol. 95: 234, 1982.

196.- Spiro, RG. Studies ofthe renal glomerular basemat membrane. Cell. Biol. Chem 242: 1915, 1976.

197.- Kanwar, Y.S. y Faquhar, M.G. Presmce ofhqarau sultate in the glomsrular basemart meinbraue. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 1303,1979.

198.- Kanwar, Y.S. y Farquhar, M.G. Anialic sites m the g l d basement membrane. h vivo and m vitro lcxxhtion to the lamina rarae by catianic probes. Cell. Biol. 81: 137, 1979.

199.- Stan- R. y leibovich, S.J. 'The negative charge of articular mtdage surf8ces: an electnu micmsccpic study using cationizedferritin. h e Joint Surg. 64: 388,1982.

200.- Hen- B. y Edwards, J.C.W. Biuchemshy and metabolism ofthe n o d synod lmmg. En: The synod lmmg m heaith and disease, ed. Hen- B. y Fdwards, J.C.W. Cambridge Univew Press, Cambridge, UK, 1987, pp. 103.

201.- Bonk, W.A., Ward, H.J., Kamd, E.S. y Cohen, A.H. Inducfian ofa membrauous nqhmpaty m &bits by -an of an exogenous catianic antigen. Damshtion ofa pathogac role fbr electrical charge. J. Clin Invest. 69: 45 1,1982.

202.- Batsfbrd, S.R, Takamja, H. y Vogt, A. A model of in situ complex glomedoneahrieis m the rat employhg catimbd ~~. Clin. Nqhrol. 14: 21 1,1980.

203 .- Turner, R A., Turner, S.R y Jahnson, J. A. N e u h u p h i l c h d . En: Jinmunopharmaco1ogy, ed. G h m , S.C. y Rogers, T. J. The TeMbrd Press, hc, New Jersey, 1989, pp. 105.

204.- Cassimeris, L. y Z-d, S.H. C h m W stimulation ofpolymqhonuclear leukocyte locomotion. Sem. Cell. Biol. 1: 125, 1990.

205.- Whrted, S.C. y G a b , J.I. Neuhqhil chemotaxis. ht. J. Dermatol. 19: 130,1980.

206.- Z i i S.H. Chemobxk by polymorphonuclear leukocytes. Cell. Biol. 77: 269, 1978.

207.- Wayne Smdh, C., Hollers, J.C., Patrick, R A y Hassle C. Mathty and adhesimess in humau muhqhb. J. Clin. Invest. 63: 221,1979.

208.- K e k , H.U. y Sorkm, E. Studies on &emataxis. IV. The influence of serum fictors on granulocyte l d o n . Imtmmology 10: 409,1966.

209.- Ward, P.A., Ckhme, C.G. y Miller-Ebehad, H.J. The role of serum comphnmt m c h d of PMNs. J. Exp. Med. 122: 327,1965.

210.- Shm,H.S. S n ~ R , F r i ~ E . , M ~ A y M a y e r , M . M . Chemdactic and anaphylatmx fra,gmart slaved from the fiib component of guinea pig cofnpleaneot. Science 162: 361,1968.

21 1.- Webster, RO., Hong, S.R, Jahnston, RB. y Henson, P.M. Biological efEds of the human cnmpleaneot hgmeuts C5a and C5a A, an neuhqhil function. Immunopharmawlogy 2: 201,1980.

212.- s c M b m q E., Cawran, B.A. yWahl, S.M. N-ibrmyl-danyl peptides as ch- fix leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 1059,1975,

213.- Showell, H.J., Freer, R.J., Z4pm4 S.H., schfhm, E., Anvadmm, S., Cornran, B.A. y Becker, E.J. The shucture activity relations ofsynth&c peptda as chematactic fhctors and inducers of l y s o s o m a l ~ s e c r e l i o n f i x ~ h i l s . J. Exp. Med. 143: 1154,1976.

214.- Ward, P.A., Remold, H.G. y David, J.R The production by antigendimdated lyqhccytes of a leukatactic factor distinct from migration inhibitory M r . Cell. Immunol. 1: 162, 1970.

215.- -I, E., Brash, A.R, Tauber, AI., Oaks, J.A y)Iubbard, W.C. Modulation of human neutmphil fmcticu by monohydroxyeicxmtdmnoic acids. Immunology 39: 491,1980.

216.- Dahmdeq C.A., Clancy, RM., Hugli, T.E. Stemspedicity of l M e n e Bq and stmdue-functim r e l a t i w s ibr ch- of humanneubqhils. J. Imrmmol. 133: 1277, 1984.

217.- Hugh~, T.E., Muller-EMd, H.J. Anaphyldoxim C3a and C5a. Adv. Immmol. 26: 1, 1978.

218.- Jchsm,K.J., Anderscm,T.P. and Ward, P.A. Supremica of immune complex-induced idhmdi rn by the c h d c &&r inactivator. J.Clin.Invest. 59: 95 1, 1977

219.- Willanson, P.C. E&ds of human IgG an locamdm af human neutrophils ls to IgG bmndtng of a hydrophobic probe. Immunology 41: 457, 1980.

220.- Am& M., Sibille, Y., Merrill, M., Ras, M., Bazin, h. y Vaerman, J.P. Cheamtactic p r w e s ofrat immunoglobulins and imnnme complexes. Mbct. Immuu. 57: 452,1989.

22 1 .- Sibille, Y., Delamix, D.L., Memll, M., Chatelam, B. y Vaennau, J.P. IgA induced chemokbesis human polymorphmuclear neutrophils: Requueanent of their Fc *ha Mol. Immunol. 24: 55 1, 1987.

222.- JWe, I., Kolb, G. y Havematm, K. Inhibition ofneutrophil c h d by e- IgG fi-. Scaud. J. Immuuol. 34: 359,1991.

223.- Font& P.A., Amura, C.R, Garcia, V.E., CsrqueetZ M.C. y Sordelh, D.O. Prelimmary dmacteizttion of Psedomom aeruginosa peptde ch- fbr polymor- phonuclear leukocytes. hkt. Immun. 60: 2465,1992.

224.- Hirschhom, R Lysosamal mechanisms m the idammabry process. En: 'Ihe hlhmatory process, ed. Z;werEich, B. Academic Press, New York, 1974, pp. 259.

225.- Carcklla, C.J., Davies, P. y Alhsm, A.C. Immune complexes induce selectiw release oflysasomal hydrolases from macqhages. Nature 247: 46,1974.

226.- Massan, D. y Tschapp, J. A W y of serine estearases m lybc granules ofcytdytic T lymphocytes. Cell. 49: 679, 1987.

227.- Bleakley, R.C., Lobe, C.G., Duggaq B., hmaq N., Fregeay C., Meier, M., et al. The idation and chamdaidon uf a b d y uf serine proteases genes m activated w x i c T lymphocytes. Iuummol. Rev. 103: 5, 1988.

228.- Row, S.J., Hartmarm, T. yCh@ey, G.H. Mastcelltryptaseisamitogenfbrabredfkoblast. J. Clin. Invest. 88: 593, 1991.

229.- Davie, E.W., Fughwa, K. y Kisiel, W. 'Ihe caguhan cascade. initiation, mdenance, and regdaban. Biochemistry30: 10363,1991.

230.- Furie, B. y Furie, B.C. Molecular and cellular biology of blood caqphtm. N. Engl. J. Med. 326: 800,1992.

23 1 .- Patthy, L. Evolution ofthe proteases of blood coaguhcsu and fibrinolysis by assembly fiom modules. Cell 41: 657,1985.

232.- Munger, W.E., Berrebi, G.A. yH* P.A. Possible mvolxment of CTL granule proteaseff m tar@ cell DNA bmkdown. Immunol. Rev. 103: 99, 1988.

233.- Hayes, M.P., Berrebi, G.A. yHenkart, P.A. Induction of target cell DNA release by the qtabxic T lymphocyte granule protease k ? = w = A . J. Exp. Med. 176: 1521, 1989.

234.- Altie D.C. hateases and prdease nxqt.ors in moddatian ofleukocyte efEcbr hctians. J. Leukoc. Biol. 58: 120, 1995.

235.- Liesveld, J.L.C., Abboud, C.N., Looney, R.J., Ryan, D.H. y Brennan, J.K. Expression of IgG Fc receptors in myeloid leukemic cells lines. E W of colony- stimulating tkctors and cytokines. J. Immunol. 140: 1527, 1988.

236. - Geflher, J.R., Trevani, A.S., Malchiodi, Serebrinsky, G.P. y Istunz, M.A. Neutrophil cytotoxicity induced by immune complexes prepared with cationized antibodies. Scand. J. Immunol. 37: 187, 1993.

237.- Lidrtman, M.A. y Weed, R.I. Electrophoretic moblhty and N-aceeyl neuraminic acid content of human normal and leukemic lymphocytes and granulocytes. Blood 35: 12, 1970.

238.- Weiss, L. Studies on cell deformabhty. I. Effect of surface charge. Cell Biol. 26: 735, 1965.

239.- Wilkinson, P.C. Action of sphyngomielinase C and ather bid-specific age& as inhibitors of Fc binding and locomotion in human leukocytes. Immunology 33: 407,1977.

240.- Henricks, P.A.J, van Eme-van der Tol M.E. y Verhoef, J. Partial removal of sialic acid enhances phagocytosis and the generation of chemiluminescence by polymorphonuclear leukocytes. J. Immunol. 129: 745, 1982.

24 1. - Travis, J. y Salvesen, G.S. Human plasma proteinase inhibitors. Ann. Rev. Biochem. 52: 655,1983.

252.- Suzuki, N., Harada, T., Mizushima, Y. y Sakane, T. Posible pathogenic role of cationic anti-DNA autoantibodies in the development of neph&s in patients with systemic lupus erythematosus. J. Immunol. 151: 1128, 1993.

253 .- Suenaga, R. y Abdou, N.I. Cationic and high a m serum IgG anti-&DNA antibodies in active lupus nephritis. Clin. Exp. Immunol. 94: 418,1993.

254.- Radic, M.Z. y Weigert, M. Genetic and structural evidence for antigen selection of anti-DNA antibodies. Ann. Rev. Immunol. 12: 487, 1994.

255 .- Kalsi, J.K., Martin, A.C.R. y Isenberg, D.A. Structure-function relatiadups of anti-DNA antibodies. Lupus 4: 245, 1995.

256.- Martin, W.J., Gadek, J.E., Hunninghake, G.W. y Crystal, R.G. Oxidant injury of lung pamchymal cells. J. Clin. Invest. 68: 1277,1981.

257.- Johnson, K.J., Fantone, J.C., Kaplan, J. y Ward, P.A. In vivo damage of rat lungs by oxygen metabolites. J. Clin. Invest. 67: 983,1981.

258.- Johnson, K.J. y Ward, P.A. Role of oxygen metabolites in immune complex injwy of lung. J. Immunol. 126: 2365, 1981.

259.- McCord, J.M. Free radicals and hfhmation: Protection of synovial fluid by superoxide dismutase. Science 185: 529, 1974.

260.- Plow, E.F. Comparative immunochemical characterization of products of plasmin and leukocyte protease cleavage of human fibrinogen. Thromb. Res. 12: 473,1978.

261 .- Snyderman, R., Shin, H.S. y Damenberg, A.M. Macrophage prateinase and inflammaton: the production of chemotactic activity from the fifth component of complement by macrophage proteinase. J. Immunol. 109: 896, 1972.

262.- Ossanna, P. J., Test, S.T., Metheson, N.R., Re&, S. y Weiss, S. J. Oxidative regulation of neutrophilela-alpha-1-*ratehe inhibitor interactions. J. Clin. Invest. 77: 1939,1986.

263.- Opie, E.L. Intracelular digestion: the enzymes and antiazymes concerned. Physiol. Rev. 2: 552, 1922.

Pdgina 145

264.- Petroni, K.C., Shen, L. y Guyre, P.M. Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc receptors and Fc-receptors mediated functions by IFN-gamma and glucocortcoids. J. Immunol. 140: 3467, 1988.

265.- Selvaraj, P., Carpen, O., Silber, R. y Springer, T.A. Natural killer cell and granulocyte Fcy receptor III (CD16) diGr in membrane anchor and signal trasduction. J. Immunol. 143: 3283, 1989.

266.- Selvaraj, P., Rose, W.F., Silber, R. y Springer, T.A. The major Fc receptor in blood has a phosphatidyllnositol anchor and is deficient in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Nature 333: 565,1988.

267.- Huizinga, T., van Kemenade, F., Koeinderman, L., Dolman, K., van dem Borne, A., Tetteroo, P.A.T. y Roos, D. The 40-kDa receptor (FcRU) on human neutrophils is essential for the IgG-induced respiratory burst and IgG-induced phagocybsis. J. Immunol. 142: 2365, 1989.

268.- Shen, L., Guyre, P.M. y Fanger, M.W. Polymorphonuclear leukocyte function triggered through the hgh aflhty Fc receptor for monomeric IgG. J. Immunol. 139: 534, 1987.

269.- Bredius, R.G.M., De Haas, C.A.P., Kuijper, E.J., Weening, R.S., van de Winkel, J.G.J. y Out, T.A. Role of neutrophil FcyRII (CD32) and FcyRUI (CD16) polymorphic forms in phagocytmis of human IgGl and IgG3~saPlized bacteria and erythrocytes. Immunology 83: 624,1994.

270.- Hundt, M. y Schmidt, R.E. The gly~~~ylphosphatidylinositol-linked Fcy receptor 111 represents the dominant receptor structure for immune complex activation of neutrophils. Eur. J. Immunol. 22: 881, 1992.

271 .- Hooks, J.J., Moutsopoulos, H.M., Geis, S.A., Stahl, N., Decker, J.L. y Notkins, A.L. Immune interferon in the circulation of patieuts witn autoinmune disease. N. Engl. J. Med. 301: 5, 1979.

272.- Hammes,M. y Singh, A. EExt of polycatians on permeab* of glomerular epithelial cell monolayers to albumin. Lab Clin. Med. 123: 437, 1994.

273.- Guinsburg, I. Cationic polyelectrolytes: A new look at their possible roles as opsonins, as stimulators of respiratory burst in leukocytes, in bacteriolysis, and as moddabrs of immune complexes diseases. (A review hypathesis). Inflammation 11: 489,1987.

274.- Guinsburg, I., Borinski, R., Sadovnic, M., Ellam, Y. y Rainford, K. Poly LWdine: A potent stimulator of superoxide generation in human blood l e u k w . Inflammation 11: 253,1987.

275.- Guinsburg, I., Mitra, M., Gibbs, D.F., Varani, J. y Kohen, R. KiUing of endothelial cells among hydrogen peroxide, membranedamaging agents, cationic substances and proteinases and their modulation by inhibitors. Inflammation 17: 295, 1993.

276.- Simionescu, N., .- Simionescu, M. y Palade, G.E. Difl-krenthted microdamins on the luminal sudkce of the capillary edldothilium. I. Preferential distribution of anionic sites. Cell Biol. 90: 605, 198 1.

277.- Simionescu, N., .- Simionescu, M. y Palade, G.E. Dd%rentiated microdomains on the luminal sudbce of the capillary endathihum. 11. Partial characterization of their anionic sites. Cell Biol. 90: 614, 1981.

278.- Triguero, D., Buciak, J.B., Yang, J. y Patridge, W.M. Blood-brain barrier transport of cationized immunoglobulin G: Enhanced delivery compared to native protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4761, 1989.

279. - Sugisaki, T. y Takase, S. Composition of immune deposits present in glomeruli of NZBIW F1 mice. Ciin. Immunol. Immunopathol. 59: 296, 1991.

280. - Clark, W .F ., Lintm, A.L. y Cordy P .E. Immunologic jindmgs, throm- and disease activity in lupus nephritis. Can. Med. Assoc. J. 118: 1391,1978.

28 1 .- Parbtani, A., Framptm, G. y Yewdall, V. Platelet and plasma s e r e in glomerulmephritis III: the nephritis of systemic lupus erythematosus. Clin. Nephrol. 14: 164, 1980.

282. - Kasi, N., Parbtaui, A. y Cameron, J.S. Platelet-aggregating itmnune-umplexes and intraplatelet seratonin in idiopathic glomerulmephritis and systemic lupus. Clin. E q . Immunol. 43: 64,1981.

283 .- Martinez-Hernandez, A. y Amenta, P.S. The basement membrane in pathology. Lab. Invest. 48: 656,1983.

284.- Cameron, J.S. Pathogenesis and treatment of membranous nephropathy. Kidney Int. 15: 88,1979.

285.- Kant, K.S., Pollak, V.E. y Weiss, M.A. Glomerular thombosis in systemic lupus erythematosus: prevalence and sigtdicance. Medicine 60: 71, 198 1.

286.- Lung, A.A., Ginsberg, J.S., Brill-Edwards, P., Johnston, M., Turner, C., Denburg, J.A., et al. The relationship of antiphosphohpid antibodies to thromboembolic disease in systemic lupus erythematosus: A c r o s s - d a d study. Thromb. Haemost. 66: 520,1991.

287.- Feinstein, D. Lupus anticoagulant, antiwdiolipin antibodies, fetal loss, and systemic lupus erythemahsus. Blood 80: 859,1992.

288.- Metzger, H. Transmembrane signaling: The joy of aggreption. J.Immun01. 149: 1477, 1992.

289. - Horsewood, P., Hayward, C.P.M., Warke, T.E. y Keltpn, J.G. Investigation of the mechanisms of monoclonal-antibody-induced platelet activation. Blood 78: 1019, 1991.

290.- Rubinstein, E., Boucheix, C., Urso, I. y Carrol, R.C. Fcy-receptor mediated interplatelet activation by a monoclonal antibody against P2 microglobulin. J. Immunol. 147: 3040, 1991.

291 .- Morel, M.C., Lecompte, T., Champeix, P., Favier, R., Potevin, F., Sarnarna, M., Salmon, C. y Kaplan, C. PL2-49, a monoclonal antibody against glycoprotein IIb which is a platelet activator. Br. J. Haematol. 71: 57, 1989.

292.- Barnes, J.L., R a w R.A., Gilchrist, E.P. y Venkatachalam, M. A. Size and charge selective permeabrlity defkcts induced in glomerular basement membrane by a polycation. Kidney Int. 25: 11, 1984.

293.- Schmiedeke, T.M.J., Stuckl., F.W., Weber, R., Sugwla, Y., Batsfbrd, S.R. y Vogt, A. Histone have high aBuity fbr the glomerular basement membrane. Exp. Med. 169: 1879,1989.

294.- Camussi, G., Tett., C., Segoloni, G., Coda, R y Vercellone, A. Loahation of neutropid cationic prateins and loss of anionic charges in glameruli of patients with systemic lupus erythematosus glomerulonephritis. Clin. Immunol. Immunopathol. 24: 299, 1982.

295.- Waga, S., Tan, E.M. y Rubin, R.L. Identification and isolation of soluble histcmes fiom bovine milk and serum. Bidem. J. 244: 675,1987.

296.- Rumore, P.M. y Steiman, C.R. Endogenous circulating DNA in systemic lupus erythematosus. Occurrence as multimeric complexes bound to histans. J. Clm. Invest. 86: 69,1990.

297.- Bustos, A. Boimorto, R, Sibuza, J.L., Pereira, L.F., Marco, M., Figueredo, M.A. y De La Concha, E.G. Inhibition of histonelanti-histone reativity by histone-binding serum components; &rential eEect on anti-H1 versus anti-H2B antibodies. Clin. Exp. Immunol. 95: 408,1994.

298.- Rubin, R.L. . . Anthtme antibodies. En: Systemic lupus erythematosus, ed. Lahita, R.G., 1st. edition. John Willey & Sons, 1987,271.

299.- Konstantinov, K., Russanova, K. y Russeva, V. Antibodies to histone and disease activity m systemic lupus erythematosus: i. comparative study with an enzyme-hked immunhrbent assay and immunobloting. Arch. Dermatol. Res. 278: 410,1986.

300.- Vogt, A., Mertz, A., Bastford, S. y Rodriguez-Iturbe, B. Cationic extracellular streptococcal antigen; affindy 6 r the renal glomerulus. En: Recent advances in Stregtococci and streptococcal diseases. Reedbooks Ltd, Bracknell, Berkshire, 1985, pp. 170.

301 .- Vogt, A., Bastford, S., Rodqpez-Iturbe, B. y Garcia, R. Cationic antigens in poststreptococcal glomerulonephritis. Clin. Nephrol. 20: 271, 1983.

302.- VanderBerg, W.B.,Vandehrtte, L.B.A.,Zwarts, W.A. y Joosten, L.A.B. Electrical charge of the antigen determines &faarticular antigen handling and chrinicity if arthritis in mice. Clin. Invest. 74: 1850, 1984.

303 .- Brackertz, D., W e l l , G.F. y Mackay, 1.R Antigen induced arthritis m mice. I. Induction of arthritis m various strains of mice. Arthritis Rheum. 20: 841,1977.

304.- Van Lent, P.L.E.M., Van der Berg, W.B., Schalkwijk, J., Van de Putte, L.B.A. y Van Den Bersselaar, L. Allergic arthritis induced by cationic antigens: r e l a t i d p of chronic* with antigen retention and T-cell reactivity. Immunology 62: 265,1987.

3 05. - Van Lent, P.L.E.M., Dekker, C., Mastered, J., Van Den Bersselaar, L. y Van der Berg, W.B. Allergic arthritis induced by cationic proteins: role of molecular weight. Immunology 67: 447,1989.

3 06. - Mertz, A.K., Batsford, , S.R., Curschellas, E., Kist, M.J. y Gondolf, K.B. Cationic Yersinia antigen-induced chronic allergic arthritis in rats. A model fbr reactive arthritis ih humans. J. Clin. Invest. 87: 632, 1991.

307.- Adler, S.G., Wang, H., Ward, H.J., Cohen, A.H. y Border, W.A. Electrical charge. Its role in the pathogenesis and prevention of experimental membranous nephropathy in the rabbit. J. Clin. Invest. 71: 487, 1983.

3 08. - Triguero, D., Buciak, J. L. y Patridge, W .M. Cationization of immunoglobuli G results in enhanced organ uptake of the protein &r iutravenous administration in rats and primate. Pharm. Exp.Ther. 258: 186,1991.

309.- Pardridge, W.M., Bickel, U., Buclak, J., Yaug, J. y Diagne, A. ~ c e d endocytosls and antihuman -mcy virus type I activity of anti-rev a n t i i e s after cationization. J. hdkt. Dis. 169: 55,1994.

3 10.- Padridge, W.M., Bickel, U., Bu& J., Yaug, J., Dmgne, A. and Aepmus, C. C a t i e d a monoclonal autibody to the human immmMciency virus REV p& h c e s cellular uptake but does n d impair antigen bmdmg ofthe antibody. Immmol. Let&. 42: 191,1994.

311.- Bickel, U., Lee,V.M., Trojanowsky, J.Q. yPadndge, W.M. Developmeut and in vhro charactenzatKn

. . ofacatinizudmauicld antibody against beta A4 protein: a potmtial probe fbr Ahhekm's disease. Bioconjug. Chem 5: 1 19,1994.

3 12. - Snydennan, R., P u s , J. y Meqphgen, S .E. Polymorphonuclear leukocyte chemotactic activity in rabbit serum and guinea pig serum treated with immune complexes: Evidence fbr C5a as the major chemotactic fictor. Inf;ect. Immun. 1: 521,1970.

3 13. - Laster, C .E. y Gleich, G. J. Chemotaxis of eosinophils and neutmphils by aggregated immunoglobulins. Allergy Clin. Immunol. 48: 297, 1971.

3 14. - Kew, R., Grimaldi, C.M., Furie, M.B. y Fleit, H.B. Human neutrophils FcyRIIIB and hmy l peptides receptors are functionally linked during fbrmyl-methionyl-leucylphenylalanine-indu chemotaxis. J. Immunol. 149: 989, 1992.

3 15.- Bignold, L.P. Measurement of chemotaxis of polymorphonuclear leukocytes in vitro. Irnrnunol. Methods 108: 1,1988.

3 16.- Fries, L.F. y Frank, M.M. Conplemmt and related prokhs: inherited det ic ies. En: Jdhmation: Basic principles and clinical oomlates, ed. Gallm, J.I., Goldstein, I.M. y Snyderrnan, R New Ycnk Raven Press, 1988, pp. 89.

3 17.- Tanoue, M., Ysbizawa, Y., Sarto, T., Yano, H., Knnula, Y. y Mryanwto, K. The role of complemeatderived c h d fgctars in lung injury induced by p&rmed immune CQmplexes. Int. Arch. Allergy -01. 101: 47, 1993.

318.- Lacsen, G.L., W e l l , B.C. y Hensoa, P.M. The puhnamq response ofC5 sufEcient and de&imt mice to immune complexes. Am. Rev.respir.Dis. 123: 434,1981.

8.- PUBLICACZOAES PARCMES DEL ZRABAJO REAUZADO Y R E m O EN ESTA ll?SIS

1 .- Getber, J.R, Trevani, AS., Malchiodi, E., Serebinsky, G. y Isturiz, M. A. Neutrophil cytotoxicity induced by immune complexes prepared with cationized antibodies. Scand. J. Immunol. 37: 187, 1993.

2.- Ge&er, J.R, Trevani, AS., Schattner, M., Machiodi, E., Upez, D.H., Lazzari, M. y Isturiz, M.A Activation of human neutrophils and monocyks by immune complexes prepared with cati0nhx.I antibodies or antigens. Clin. Immunol. Immunopath. 69: 9, 1993.

3.-Schattner, M., Lazzari, M., T r e e AS., Malchiodi, E., Kempfer, A, Isturiz, M.A y GefFher, J.R Activation of human platelets by immune complexes prepared with cationized human IN. Blood 82: 3045,1993.

4.-Trevani, AS., Isturiz, M.A, Schatner, M., Serebrinsky, G. y m e r , J.R EExt of proteolyix enzymes on neutrophil FcyR 11 activity. Immunology 82: 632, 1994.

5 .- Trevani, AS., Fontin, P., Andonegui, G. A, Isturiz, M. A Geilher, J.R Neutrophil chemotaxis induced by immune complexes. Clin. Immunol. Immunopathol. 74: 107, 1995.

6.-Trevani, AS., Andonegui, G., Kempfer, C., Malchiodii E. y Gefher, J.R. Activation of human neutrophils induced by immune complexes prepared with cationic and anionic fractions of normal IgG antibodies. Scand. J. Immunol. (en prensa).