Factores implicados en la ausencia de regeneración axonal...

RESUMEN

El sistema nervioso central (CNS) muestra una ausencia completa de re-generación axonal después de una lesión en contraste al sistema nervioso pe-riférico (PNS). Muchos estudios han indicado que la pérdida de regeneraciónen el CNS se debe a la creación de un ambiente hostil al crecimiento axonalmás que a una incapacidad intrínseca de la neurona lesionada a recrecer suaxón después del trauma. No obstante, cuando se provee a las neuronas le-sionadas del CNS con factores apropiados o modificamos el ambiente inhibi-torio que las rodea, pueden recrecer sus axones y establecer contactos sináp-ticos funcionales con las células diana. Algunos estudios han indicado quealgunas conexiones del CNS no muestran esta potencialidad regenerativa,como por ejemplo la conexión entorrino-hipocámpica (EHC). En el presenteestudio hemos analizado el uso potencial de las células presentes en el hipo-campo responsables del desarrollo de la EHC como promotores de regenera-ción axonal en el adulto. Para llevar a término este estudio hemos empleadocultivos organotípicos entorrino-hipocámpicos y un modelo de lesión poraxotomía in vitro. Este tipo de cultivo muestra un crecimiento organizado yuna diferenciación histológica y citológica importante debido al manteni-miento de un número elevado de relaciones intercelulares intrínsecas. Nues-tros resultados demuestran que las neuronas pioneras de la conexión EHC:las células de Cajal-Retzius, presentes durante el desarrollo perinatal en lazona de terminación de los axones entorrinales, tienen la capacidad de recre-cer los axones lesionados del córtex entorrinal.

ABSTRACT

It is well known from the early anatomical studies, that the CentralNervous System (CNS) shows a virtual absence of axonal regeneration incontrast to the peripheric nervous system (PNS). Many studies have sugges-ted that the regeneration failure in the CNS is most likely due to an inhospi-table environment rather than to an intrinsic incapability of neurites to re-growth after axotomy. Thus, when provided with appropriate trophic factorsor a suitable environment, injured CNS neurons can regrow their axons andestablish functional synaptic contacts with cells in the target area. Neverthe-less, several studies illustrated that other CNS projection pathways do notdisplay this potential of regeneration after lesion as for example the entorri-no-hippocampal connection (EHC). In the present study we address the po-tential of factors residing in the developing hippocampus as promoters ofaxonal regeneration by using organotypic slice culture approaches. This cul-ture method displays an organized growth, with progressive histological andcytological differentiation, due to the maintenance of significant intercellularrelationships. Our results demonstrate that pionner neurons of the EHC: theCajal-Retzius cells, which reside in the termination field of the entorrino-hip-pocampal fibers could restore the damaged EHC in the adult.

Factores implicados en la ausencia deregeneración axonal en el sistema nerviosocentral adulto: la conexión entorrino-hipocámpicacomo modelo experimental

Factors involved in the failure of axonal regenerationin the central nervous system: theentorhino-hippocampal pathway as a model

Departamento de Biología CelularInstituto de Investigación Biomédica de BarcelonaUniversidad de Barcelona

Solé M, Martínez A, Soriano E, Del Río J AFactores implicados en la ausencia de regeneración axonal enel sistema nervioso central adulto: la conexiónentorrino-hipocámpica como modelo experimentalMapfre Medicina, 2004; 15: 273-284

Solé M, Martínez A, Soriano E, Del Río J AFactors involved in the failure of axonal regeneration inthe central nervous system: the entorhino-hippocampalpathway as a modelMapfre Medicina, 2004; 15: 273-284

ORIGINAL

47 MAPFRE MEDICINA, 2004; vol. 15, n.º 4 273

Correspondencia:

José A. del RíoDesarrollo y Regeneración del Sistema NerviosoDepartamento de Biología CelularParque Científico de Barcelona-I.R.B.B.Universidad de BarcelonaJosep Samitier, 1-508028 BARCELONAE-mail: [email protected]

Fecha de recepción: 2 de julio de 2003

Trabajo realizado con una Beca de Investigaciónde la Fundación MAPFRE MEDICINA

Palabras clave: Regeneración axonal, axotomía experimental, conexión en-torrino-hipocámpica, microscopía electrónica.

Key words: Axonal regeneration, experimental axotomy, entorhino-hipo-cámpal pathway, electron microscopy.

Solé M.

Martínez A.

Soriano E.

Del Río J. A.*

INTRODUCCIÓN

El desarrollo de las conexiones neuronales esun proceso complejo que requiere los efectoscoordinados de numerosas señales de guía axo-nal (quimioatractivos y repulsivos) que actúanen fases concretas del desarrollo neural. Duran-te los últimos años se han descrito un gran nú-mero de estas señales en el sistema nerviosocentral (CNS) y periférico (PNS) (25). Por ejem-plo, el factor quimioatractivo Netrina I intervieneactivamente en el desarrollo de las conexionescomisurales de la médula espinal (10). Por elcontrario, la semaforina IIIA induce una respues-ta quimiorepulsiva sobre grupos concretos deaxones durante el desarrollo prenatal (14). Mu-chos de estos factores se generan en poblacio-nes neuronales transitorias que se localizan en lazona diana de la conexión (por ejemplo, las cé-lulas de la placa del suelo floor plate se localizanen la porción ventral de la medula espinal y se-cretan Netrina 1, en el lugar de tránsito de las co-nexiones comisurales (10, 25).

Durante el desarrollo de la arquicorteza, losaxones del córtex entorrinal y las fibras comisu-rales/asociacionales contactan de forma específi-ca en segmentos dendríticos diferentes de lasneuronas principales del hipocampo propio y elgiro dentado (células piramidales y granularesrespectivamente, Figura 1A). Estos aferentesmuestran esta elevada especificidad postsinápti-ca desde etapas muy tempranas de su desarrolloya que alcanzan su estrato diana desde las pri-meras fases del mismo (24). Este desarrollo or-questado sugiere la presencia de factores celula-res y/o moleculares que regulen y guíen estosaxones hasta su destino. En este sentido, estu-dios in vivo e in vitro han demostrado que unapoblación neuronal transitoria localizada en la zo-na marginal/estrato lacunoso molecular (zm/slm)del hipocampo (las células de Cajal-Retzius) esesencial para el correcto desarrollo de la cone-xión entorrino-hipocámpica (EHC) (1, 4, 24). Ade-más, se ha demostrado recientemente que su eli-minación selectiva in vitro con neurotoxinas(p.e., hidroxidopamina, OHDA) conduce a la au-sencia de un desarrollo normal de la EHC ya queen estas condiciones los axones del córtex ento-rrinal no pueden entrar en el hipocampo (4).

Desde una perspectiva clínica, el CNS mues-tra una ausencia virtual de regeneración y plasti-cidad axonal tras una lesión en el adulto. Mu-chos estudios han sugerido que el fracaso de la

regeneración en el CNS es debido a la creaciónde un ambiente inhóspito al crecimiento axonalmás que a una incapacidad intrínseca de la neu-rona lesionada para recrecer su axón despuésde la axotomía (7). No obstante, algunos estu-dios han propuesto que para la EHC, el estadode maduración del axón lesionado es el respon-sable de la ausencia de recrecimiento axonal(11). Así pues, las neuronas de la corteza entorri-nal lesionadas solamente son capaces de recre-cer su axón hacia su diana natural si la lesión se

M. Solé, A. Martínez, E. Soriano et al.

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Figura 1. Desarrollo y regeneración de la EHC in vitro.A) Esquema del modelo de axotomía empleado en el pre-sente estudio. Nótese la disposición laminar de las afe-rencias axonales del hipocampo. Después de la sección(linea de puntos) de las conexiones entorrino-hipocámpi-cas se dejan los cultivos 15-21 DIV, tras los que se analizael estado de la conexión mediante una inyección de bio-citina en el córtex entorrinal.B) Estado de la EHC a los 21 DIV en cultivos control des-pués de la técnica de trazado axonal con biocitina. Losaxones de la corteza entorrinal (flechas) inervan masiva-mente el slm y el ml.C) Ejemplo de la ausencia de la capacidad regenerativa dela EHC después de una lesión a los 15-21 DIV. Nótese laausencia de axones regenerantes en el hipocampo y lasneuronas marcadas retrógradamente en el subiculum.Abreviaturas: EC: córtex entorrinal, DG: giro dentado;CA1-CA3: Divisiones del hipocampo propio; S: Subicu-lum; SLM: Estrato lacunoso-molecular; SR: Estrato radia-do; SP: Estrato piramidal; GL: Estrato granular; SO: Estra-to oriens.Barras de calibración: B = 200 micras

produce en el animal joven (durante la primerasemana de vida), no así en el adulto (11, 15, 26).

En los últimos años se han realizado esfuer-zos importantes con el fin de desarrollar terapiasreparadoras en el SNC lesionado. Por ejemplo,el trasplante de nervio periférico o células deSchwann (2, 12, 16, 20) o células de «glía envol-vente» de bulbo olfativo (13, 17, 18, 19) promue-ven la reparación y regeneración nerviosa de-pendiendo del área adulta lesionada. Además,su uso combinado con la aplicación de anticuer-pos bloqueantes (p.e., de derivados de mielina),factores de crecimiento neuronal o inhibidoresde matriz extracelular (p.e., quelantes de hierro,22) potencian el recrecimiento axonal y la sinap-togénesis (7).

En el presente estudio hemos abordado laaplicabilidad de una nueva estrategia de repara-ción neuronal. Hemos analizado el uso potencialde las células de la zm/slm del hipocampo (célu-las de Cajal-Retzius) como promotores de la re-generación axonal de la EHC. Esta estrategia im-plica la utilización de las células responsablesdel desarrollo de una conexión para intentar re-pararla tras lesión en el adulto. Como modeloexperimental de estudio empleamos cultivos or-ganotípicos entorrino-hipocámpicos confeccio-nados a partir de rebanadas de tejido perinatalde ratón. Nuestros datos indican que este tipode cultivo muestra un desarrollo organizado,con una progresiva diferenciación histológica ycitológica que le convierte en un modelo idóneo.Además hemos podido comprobar que sufre al-teraciones celulares y moleculares tras lesión si-milares a los modelos de lesión in vivo. De losresultados obtenidos podemos concluir que fac-tores no identificados expresados por las célulasde Cajal-Retzius tienen la capacidad de induciruna recapitulación del programa de desarrolloen las neuronas lesionadas de la corteza entorri-nal provocando el recrecimiento axonal y la si-naptogénesis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Para la preparación de los cultivos organotí-picos se emplearon un total de 500 ratones peri-natales (P0-P1; P0 día de nacimiento) de la cepaOF-1 (CRIFFA, Lyon, Francia). Todas la manipula-ciones de los animales de experimentación se

realizaron siguiendo los procedimientos experi-mentales aprobados por el Comité Ético de Ex-perimentación Animal de la Universidad de Bar-celona (CEEA) siguiendo la normativa Europea.Además, todo el personal de investigación queha intervenido en el presente trabajo tiene lapertinente acreditación como personal investi-gador o experimentador de la Generalitat de Ca-talunya.

Cultivos organotípicos entorrino-hipocámpicos

Las crías de ratón fueron anestesiadas por hi-potermia en hielo y decapitadas. Se practicó uncorte a lo largo del eje rostrocaudal de la cabezadel animal separando el cráneo y exponiendo elcerebro. Con posterioridad, el cerebro se retiróde la cavidad craneal y se sumergió en una pla-ca de Petri que contenía medio de disección(50% Medio mínimo esencial de Eagle (MEM),25 mM HEPES, 2mM glutamina, pH 7,3). Se di-seccionó el hipocampo con la corteza entorrinaladyacente y se cortaron en rebanadas de 325mm de grosor en un seccionador de tejido fres-co (McIlwain, Mickle Laboratory Eng, UK). Las re-banadas se recogieron en medio de disecciónfresco donde se separaron del resto de las me-ninges.

Las rebanadas se depositaron sobre la mem-brana de cestillos de cultivo Millicell (Millipore,con 0,4 mm de diámetro de poro (Millipore, Bed-ford, Massachusetts, USA) y se traspasaron auna placa de cultivo de 6 pocillos (Nunc, Roskil-de, Dinamarca). El medio de cultivo consistió en25% MEM, 25 mM HEPES, 25% solución salinade Hank’s (HBBS), 25% suero de caballo, 2 mMglutamina y 0,044% NaHCO3 (GIBCO Life Techno-logies, Merelbeke, Bélgica). El medio de cultivose renovó cada 48 horas. En estas condiciones deincubación, el medio de cultivo envuelve ligera-mente el cultivo organotípico en una fina interfa-se líquida que favorece el intercambio gaseoso(23). Un total de 178 cultivos organotípicos se ela-boraron en el presente estudio.

Axotomía de la EHC in vitro

Después de 7, 15 o 21 días in vitro (DIV), laEHC se axotomizó con la ayuda de una aguja detungsteno seccionando el cultivo a nivel de lasustancia blanca separando la corteza entorrinaldel hipocampo (15, Figura 1A). Durante las 12

Factores implicados en la ausencia de regeneración axonal en el sistema nervioso central


horas siguientes a la axotomía, se practicaronvarios cambios de medio de cultivo para elimi-nar posibles restos celulares y mantener las con-diciones del medio de cultivo lo más establesposibles. Los cultivos lesionados se dividieronen tres grupos: 1) análisis de la proliferación ce-lular, 2) estudio de la reactividad glial y 3) eva-luación de la regeneración axonal de la EHC contrazado anterógrado de biocitina.

Estudio de la proliferación celular in vitro

tras axotomía de la EHC

Para determinar la proliferación celular en loscultivos organotípicos después de lesionar laEHC, los cultivos se incubaron con el análogo dela Timidina, 5´-Bromodeoxiuridina (BrdU, 3). Serealizó un único pulso de una hora con el análo-go (1 mM disuelto en el medio de cultivo) du-rante el primer y el cuarto día post-lesión. Des-pués de la incubación se renovó varias veces elmedio de cultivo por medio fresco. Tres días des-pués de la incubación con BrdU, los cultivos sefijaron con paraformaldehido tamponado (PFA)durante 15 minutos, y se procesaron para la de-tección inmunocitoquímica de la BrdU en culti-vos organotípicos (3).

Detección de antígenos neuronales, gliales

y derivados de la mielina en los cultivos

organotípicos

En la Tabla I se describen los anticuerpos pri-marios empleados en este trabajo. Los cultivosdestinados a la detección inmunocitoquímica sefijaron durante 1 hora con PFA al 1%. Despuésde varios lavados con PBS 0,1 M; pH 7,3, las sec-ciones de 50 mm de grosor obtenidas por vibra-tomo fueron incubadas 48 horas a 4º C con unode los anticuerpos primarios. Con posterioridad,

las secciones se incubaron con sus correspon-dientes anticuerpos secundarios biotinilados(cabra-anti-conejo o caballo-anti-ratón; dilución1:200, 2 horas; Vector Labs) y después con strep-tavidina-peroxidasa (dilución 1:400, 2 horas;Amershan Biosciences, Buckinghamshire, UK).Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS 0,1;gelatina 0,2 % conteniendo un 5 % de suero bo-vino fetal. La actividad peroxidasa se reveló conDAB 0,03% y agua oxigenada al 0,01%. Tras el re-velado, los cortes se montaron sobre portaobje-tos gelatinizados, se deshidrataron y montaroncon Eukitt (Merck, Darmstadt, Alemania). Algu-nos cultivos se procesaron para el revelado his-toquímico de la nucleótido difosfatasa (NDPasa;marcador microglial).

Experimentos de trasplante de

tejido perinatal

Tras la axotomía de la EHC, los co-cultivos or-ganotípicos destinados a trazado axonal se sub-dividieron en cuatro grupos experimentales. Un

primer grupo de cultivos axotomizados a 7, 15 y21 DIV se destinó al análisis del potencial intrín-seco de regeneración de la EHP tras axotomía(n = 64). Un segundo grupo lesionado a 15 y 21DIV se trasplantó en la zona de la lesión el mis-mo día del experimento con pequeños fragmen-tos de zm/slm microdiseccionados a partir de hi-pocampos de animales recién nacidos (n = 36).A un tercer grupo lesionado a los 15 o 21 DIV seles retiró el hipocampo «maduro» de la mem-brana por aspiración y se restituyó con una re-banada de hipocampo «joven» (P0-P1) (n = 81).Finalmente a un cuarto grupo se retiró el hipo-campo «maduro» por aspiración y se trasplantócon un hipocampo joven carente de zm/slm(n = 34). Después de la manipulación, los co-cul-tivos se mantuvieron in vitro durante 15 días y seanalizó el estado de la EHC.



TABLA I

Anticuerpo Antígeno reconocido Dilución de uso Casa comercial

BrdU 5´-Bromodeoxiuridina 1/100 Dakopatts, Glostrup, DinamarcaCALR Calretinina 1/2000 Swant Antibodies, Belinzona, SuizaGFAP Proteína acídica fibrilar Glial 1/2000 Dakopatts, Golstrup, DinamarcaMAG Glucoproteína asociada a la mielina 1/3000 Chemicon, Temecula, USANG2 Proteoglucano inhibidor oligodendroglial 1/2000 Chemicon, Temecula, USA

Listado de los anticuerpos empleados en el estudio. En cada caso se indica su origen comercial y su dilución de uso.

Análisis de la regeneración de la EHC

con trazado axonal anterógrado con biocitina

Con tal de analizar el estado de la EHC en ca-da uno de los grupos experimentales, se deposi-tó un cristal de biocitina sobre la corteza entorri-nal del cultivo con la ayuda de una micropipetade vidrio. Tras 12-24 horas in vitro, los co-cultivosse fijaron con Paraformaldehido (PFA) al 4 % entampón fosfato 0,1 M (pH 7,3) durante 4 horas a4 ºC. Tras la fijación, los cultivos se desengancha-ron de la membrana, se englobaron en albúmi-na/gelatina al 1% y se cortaron con la ayuda deun vibratomo en secciones horizontales de 50mm de grosor.

Las secciones obtenidas se lavaron breve-mente con PBS 0,1 M y se permeabilizaron condimetilsulfóxido (DMSO) al 40% en tampón fos-fato 0,1 M (pH 7,3) durante 40 minutos. Tras lapermeabilización, las secciones se incubaronpor flotación con el complejo avidina-biotina-pe-roxidasa (ABC-elite complex) a la dilución indi-cada por el fabricante (Vector Labs). Después dela incubación, las secciones se revelaron condiaminobenzidina (DAB) al 0,03% y Agua Oxige-nada al 0,01 %. En ocasiones, el revelado de laDAB se intensificó con Cloruro de Cobalto al 1%y Sulfato Amónico de Níquel al 1%. Con poste-rioridad, los cortes se montaron en portaobjetosgelatinizados, se deshidrataron, contrastaroncon violeta de cresilo y se montaron finalmentecon Eukitt (Merck). Algunos cultivos se procesa-ron para la detección inmunocitoquímica de lacalretinina (CALR) un marcador de las células deCajal-Retzius. Para los estudios de microscopíaelectrónica, las secciones trazadas con biocitinay reveladas con DAB se contrastaron con tetraó-xido de osmio y se incluyeron en Araldita. Conposterioridad se obtuvieron secciones ultrafinasque se procesaron para su observación en losservicios científico técnicos de la Universidad deBarcelona.

RESULTADOS

Desarrollo de la conexión

entorrino-hipocámpica in vitro

El desarrollo y maduración de la EHC en culti-vos organotípicos y las funciones que juegan lascélulas de Cajal-Retzius durante su desarrollohan sido analizados en estudios previos del gru-po (4). Brevemente, el marcaje anterógrado con

biocitina mostró que tras 5-7 DIV, los axones dela corteza entorrinal inervan de forma específicael slm del hipocampo propio y la porción más ex-terna del ml del giro dentado (Figura 1A-B). Estadistribución de los axones entorrinales se solapaplenamente con la localización de las células deCajal-Retzius (identificadas con anticuerpos anti-CALR) en el hipocampo (no mostrado, ver (4) pa-ra detalles). Además, el estudio en microscopíaelectrónica en los cultivos doblemente marcadosreveló la existencia de contactos sinápticos entrelas neuronas de Cajal-Retzius y los axones de lacorteza entorrinal in vitro (no mostrado).

Potencial regenerante de la EHC después de

la axotomía experimental in vitro

Después de la sección de la EHC a los 15-21DIV, solo 7 de un total de 24 cultivos mostraronla presencia de algún axón marcado con biociti-na (n < 10) en el hipocampo 15 días después dela axotomía (Figura 1C, Tabla II). No obstante,ninguno de los axones inervó el slm/ml del hi-pocampo. Por el contrario, células del subiculumen número variable se marcaron en todos loscultivos lesiondos del grupo 1. No se determinóla presencia de cavitación en la zona de la lesióny además como resultado de la misma se pudoconstatar la presencia de engrosamientos termi-nales en los axones lesionados típicos de este ti-po de lesiones (no mostrado). Por el contrario, silesiones similares se realizan durante la primera



TABLA II

N.º de Regeneración Regeneración

Experimento cultivos positiva negativa

Axotomía 31 7 (22 %) 24 (76 %)**15-21 DIVsin trasplanteTrasplante 36 29 (80 %)** 7 (20 %)slm/mlTrasplante 81 56 (69 %)** 25 (31 %)HipocampojovenTrasplante 34 9 (26 %) 25 (74%)**hipocampo jovensin slm/ml

Resultados cuantitativos del estudio. La presencia de la slm/mljoven (en graft o en hipocampo completo) induce el crecimientoaxonal de los axones del córtex entorrinal lesionados.La presencia de significación estadistica se indica con dosasteriscos (**) (p < 0,05, ANOVA test)

semana in vitro (5-7 DIV), se obtiene un elevadoporcentaje de regeneración de la EHC (85 %) conun patrón de distribución similar al control no le-sionado. Esto nos indica que los factores res-ponsables de la regeneración de la EHC estánausentes en el cultivo organotípico después dedos semanas in vitro.

Proliferación celular tras la axotomía de la EHC

Diversos estudios han demostrado que la le-sión de la EHC in vivo induce proliferación celu-lar en dos áreas: una zona de respuesta rápida(12-24 horas) se localiza en la propia lesión yconduce a la formación de la denominada cicra-tiz glial (6, 7). Una segunda zona proliferativa deaparición posterior (3-4 días) se localiza en la zo-na denervada del hipocampo y giro dentado, cu-ya función es la de fagocitar restos de los axoneslesionados (9). En ambos casos, las células pro-liferantes corresponden a células gliales y me-níngeas. La aplicación de la BrdU en los cultivoslesionados demostró que ambas zonas de proli-feración se generaban en nuestro modelo de le-sión (Figura 2). Así pues, 3 días después de laaplicación de la BrdU durante el primer día post-lesión se observó un número muy elevado decélulas BrdU-positivas en la zona de la secciónmecánica (Figura 2B). La mayoría de las célulasBrdU-positivas se encontraban en la trayectoriade la lesión, para después disminuir en númeroradialmente hacia la corteza entorrinal y el hipo-campo propio (Figura 2B). El marcaje con BrdU4 días después de la lesión demostró una dismi-nución importante en el número de células in-munorectivas en la zona de la lesión y zonas ad-yacentes (Figura 2C); así como un incrementoconsiderable en la zona denervada del hipocam-po propio (no mostrado). Estos datos concuer-dan plenamente con los resultados aportados enla literatura in vivo e indican que los factores in-ductores y moduladoras de proliferación celulardespués de la lesión se mantienen in vitro ennuestro modelo experimental.

Inmunolocalización de células gliales

y proteínas asociadas a la mielina tras

la lesión de la EHC in vitro

La presencia de una cicatriz glial, con elevadocontenido en células gliales (astroglía fundamen-talmente) y derivados de la mielina y/o matriz ex-tracelular, constituye una barrera física para el re-

crecimiento axonal en lesiones del SNC (6). Delconjunto de componentes derivados de la mieli-na, la glucoproteína asociada a la mielina o MAGha sido propuesta, conjuntamente con el antíge-no NI-250 (Nogo-A), como uno de los compo-nentes con mayor poder inhibitorio (7, 8). Debidoa que nuestro modelo de cultivo deriva de unanimal recién nacido al que se lesiona y que porlo tanto puede presentar un grado de reactividadbasal elevado, nos interesó determinar la distri-bución y morfología de las células gliales en cul-tivos control en las fechas a las que se axotomíz-rá la EHC, para con posterioridad analizar susposibles modificaciones tras la lesión (Figura 2).

Las células astrogliales (identificadas con laGFAP; Figura 2A), microgliales (no mostrado) yprecursoras de oligodendroglia (NG2-positivas;no mostrado) cubren la práctica totalidad delcultivo control a los 15-21 DIV. No se observarondiferencias significativas en el número y la mor-fología de las poblaciones gliales in vivo e in vi-tro (Figura 2A), a excepción de un porcentaje re-ducido de células microgliales (10-15%) conmorfología ameboide (no mostrado). 5 dias des-pués de la axotomía de la EHC a los 15-21 DIV, seobservó un incremento importante en el núme-ro de células GFAP-positivas en la zona de la le-sión (Figura 2D). Las células inmunoreactivasmostraron una hipertrofia celular acompañadade una mayor inmunoreactividad para la proteí-na del citoesqueleto (Figura 2D). De la mismaforma pudimos comprobar que las células mi-crogliales próximas a la lesión, identificada conla técnica de la NDPasa, mostraban una hiper-trofia de su citoplasma con características ame-boideas, típicas de células reactivas (Figura 2E).Resultados similares se obtuvieron con el antí-geno NG2 (no mostrado). Además se observóun incremento de células gliales en la zona de-nervada del slm y ml. No obstante, 15 días des-pués de la axotomía no se observó la formaciónde una cicatriz glial (astroglia/microglía) como laque se observa en el animal in situ tras lesión (6).

En la Figura 2F podemos ver el resultado dela inmunodetección de la MAG in vitro en culti-vos control de 21 DIV. El marcaje define clara-mente la conexión entre el córtex entorrinal me-dial y el hipocampo propio y giro dentado. Estepatrón de marcaje es muy parecido al mostradoin vivo (9). 5 días después de la axotomía de laEHC, se produce una pérdida de global de in-munoreactividad para la MAG en el hipocampopropio y giro dentado (Figura 2G). Además, y deforma paralela, se incrementa notablemente el





Figura 2. Reacción celular después de la axotomía in vitro de la EHCA) Visión panorámica de una sección de cultivo organotípico de 21 DIV después de la detección inmunoctoquímica de laGFAP. Nótese que los astrocitos se localizan en la práctica totalidad del cultivo y adoptan una disposición perpendicular alestrato piramidal (SP) y al estrato granular del giro dentado (GL).B-C) Ejemplo de los procesos proliferativos en la zona de la lesión analizados mediante la técnica inmunocitoquímica de laBrdU después de la lesión de la EHC a los 15-21 DIV. El primer dígito de la imagen indica el día postlesión en que se incubóel cultivo lesionado con la BrdU y el segundo dígito el tiempo de supervivencia post-incubación. Ver resultados para detalles.D-E) Ejemplos de la morfología glial reactiva en el córtex entorrinal, 5 días (D) y 1 día (E) después de la lesión de la EHC. Lascélulas GFAP positivas (D) muestran una hiperplasia celular y un elevado contenido de la proteína del citoesqueleto. Lasflechas en E, señalan células microgliales con morfología ameboide identificas con la técnica de la NDPasa.F) Visión panorámica de los tractos de mielina, identificados con la inmunocitoquímica contra la MAG, en un cultivo orga-notípico después de 21 DIV. Los axones mielinizados del córtex entorrinal entran en el hipocampo por el denominado hazangular (flecha hueca) e inervan el SLM y el ML del hipocampo (flechas). G-I) Ejemplo de las alteraciones en la detección de la MAG que tienen lugar 5 días post-lesión como resultado de la axoto-mía de la EHC. Nótese en I la ausencia de las prolongaciones de los axones mielínicos del córtex entorrinal (flechas huecas)y la presencia de células ameboides (microglía fagocítica) con contenido inmunopositivo granulado/disperso en su interior.Abreviaturas: como en la Figura 1. Barras de calibración: A: 200 micras; B-E: 100 micras; F-G: 200 micras, I: 75 micras.

marcaje en células con morfología ameboideaen las áreas denervadas (Figura 2I). Estas carac-terísticas morfológicas corresponden a micro-glía reactiva con morfología ameboide en pro-ceso de fagocitosis de los debrís de mielina(Figura 2I). Además, se observó una notable in-munoreactividad en el espacio extracelular de lazona de la lesión en forma de restos de mielina(Figura 2I). Los resultados obtenidos indican quelos fenómenos de activación y proliferación glialtiene lugar en el modelo in vitro de manera si-milar a in vivo, si bien no parecen conducir a laformación de una cicatriz glial.

Efecto del trasplante de zm/slm

o hipocampo joven

Como se ha comentado en la introducción,las células de Cajal-Retzius presentes en lazm/slm son las responsables de guiar los axonesentorrinales durante su desarrollo hasta sus es-tratos diana del hipocampo. Por esta razón, nospropusimos determinar el efecto del trasplantede pequeños fragmentos o «grafts» de zm/slmderivados de hipocampos jóvenes en cultivosentorrino-hipocámpicos axotomizados (grupo 2). Como podemos observar en la Figura 3A-B, lostrasplantes se realizaron en la interfase de la le-sión delante de los axones lesionados de la cor-teza entorrinal. 7-10 DIV después del trasplante,se observaron numerosas fibras del córtex ento-rrinal marcadas con biocitina que invadían eltrasplante (Figura 3A-C). Sorprendentemente, es-casos axones cruzaban la zona del trasplante pa-ra entrar en el hipocampo axotomizado y la ma-yoría de ellos permanecían retenidos en elinterior del «graft» (Figura 3B). A mayores au-mentos, se comprobó que los axones recorríancon mayor frecuencia las zonas del trasplantedonde las células de Cajal-Retzius eran más nu-merosas (Figura 3C). Esta inervación no fue ob-servada cuando se trasplantaron otras áreas delhipocampo perinatal como el estrato radiado o elestrato piramidal (no mostrado). Estos resulta-dos nos indican que la zm/slm presenta factoreslocales que inducen el crecimiento de los axoneslesionados del córtex entorrinal y que estos pue-den estar asociados a las células de Cajal-Retzius.

Para determinar en que manera los axonesentorrinales lesionados retenían la capacidad deinervar de forma específica las neuronas dianadel hipocampo, se desarrollaron experimentosde cultivo de trasplante heterocrónico en los que

el hipocampo maduro axotomizado era repuestopor un hipocampo joven (grupo 3). Después de15 días del trasplante, el grado de regeneraciónfue evaluado por trazado anterogrado con bioci-tina. Los resultados obtenidos mostraron que enun 69 % de los casos se obtuvo un grado de re-generación similar a los controles (Figura 3D, Ta-bla II). Por el contrario en un 31% el grado de re-generación fue nulo o solo se observó algunafibra regenerante dispersa en el hipocampo tras-plantado. Aunque la conexión se establecía co-rrectamente, se observó un ligero estrechamien-to de la zona de proyección sobre el tejido dianaen los casos con regeneración positiva (compareFiguras 3D y 1B) Además, las observaciones enmicroscopía electrónica demostraron la presen-cia de contactos sinápticos entre axones regene-rantes marcados con biocitina tras inyección enel corteza entorrinal y las dendritas de las neuro-nas piramidales en el slm del hipocampo (Figura3E-F). Por el contrario, en los experimentos detrasplante con hipocampos reseccionados sin lazm/slm (grupo 4), solo un 26% mostró algúnaxón en el hipocampo reseccionado (Figura 3G,Tabla II). Estos resultados refuerzan la idea quelos factores que promueven el recrecimiento delos axones lesionados están localizados en lazm/slm. En la Tabla II se incluye los datos cuanti-tativos obtenidos del presente trabajo.

DISCUSIÓN

Los principales conclusiones que se despren-den del presente estudio son las siguientes:

1. El modelo in vitro de la conexión entorri-no-hipocámpica es un buen modelo experimen-tal para desarrollar estudios de regeneración.

2. Las células de Cajal-Retzius tienen la capa-cidad de promover el recrecimiento axonal deneuronas axotomizadas del córtex entorrinal.

3. Los axones regenerantes del córtex ento-rrinal son capaces de reconocer el estrato natu-ral de la proyección en el hipocampo perinatal yde reestablecer contactos sinápticos con las cé-lulas diana.

Proliferación celular y reactividad glial

en cultivos control y después de la axotomía

de la EHC

Los resultados obtenidos del marcaje con laBrdU nos indican que las células gliales presen-





cia de procesos de proliferación microglial en zo-nas concretas de cultivos organotípicos cortica-les tras una lesión focal (5). Nuestro trabajo de-

Figura 3. Experimentos de trasplante in vitro.A-C) Ejemplos de los trasplantes de fragmentos de slm/ml en cultivos organotípicos axotomizados a los 15 DIV. Los culti-vos han sido procesados para revelado del trazado axonal con biocitina y la identificación de las células de Cajal-Retziuscon anticuerpos anti-CALR. El trasplante se indica en A con un asterisco y el límite del mismo se indica con la línea de pun-tos. Nótese en A-C la ausencia de axones regenerantes en el hipocampo. Los axones (flechas en C) inervan el trasplante ytienden a localizarse sobre las células de Cajal-Retzius (flechas huecas), pero nunca sobrepasan el límite del mismo (A-B)D) Ejemplo de regeneración positiva después del trasplante de un hipocampo joven (grupo 3). Los axones regenerantes in-ervan sus estratos diana naturales del hipocampo. Compárese esta microfotografía con la Figura 1B (control) y la Figura 1C.(en la que no se había realizado ningún trasplante)E-F) Ejemplos de contactos sinápticos (TA) de los axones regenerantes sobre elementos no identificados del hipocampotrasplantado. El elemento postsináptico se indica con flechas.G) Ejemplo de la ausencia de regeneración (flechas) en los experimentos del grupo 4, en los que se trasplanta un hipo-campo carente de la ml/slm. Nótese la presencia de células retrógradamente marcadas del subiculum.Abreviaturas: como en Figura 1. Barras de calibración: A: 200 micras; B: 100 micras; C: 50 micras; D: 200 micras; E-F: 0,5 mi-cras; G: 200 micras.

tes en el cultivo son capaces de reaccionar y se-guir con un patrón de reactividad similar a in vi-vo. Recientemente se ha demostrado la existen-

muestra que no solo existe una proliferación lo-cal en la zona de lesión, sino que se genera la se-gunda área de proliferación en la zona de dener-vada del hipocampo. Además nuestros estudiosindican que las células gliales pueden adquirirun estado reactivo similar a lo que acontece invivo. No obstante, un porcentaje bajo de célulasgliales (p.e., microglia) presenta, en condicionesbasales no lesionados, una morfología similar aun estadio reactivo (p.e., morfología amorfa re-dondeada, etc), con lo que no podemos descar-tar que parte de las células gliales que se activantras la lesión no deriven de este subgrupo de cé-lulas gliales pseudoreactivas. No obstante, nues-tros datos indican que en los cultivos organotí-picos no se forma una «cicatriz» glial tal y comose ha descrito en el animal in situ (6), ya que hayelementos estructurales de la cicatriz que estánausentes in vitro. (p.e., células meníngeas o ele-mentos séricos). Por esta razón pensamos queotras moléculas pueden ser las responsables dela inhibición axonal en nuestro modelo de lesión(ver más adelante)

Regeneración de la EHC in vitro

Nuestros datos indican que la EHC es incapazde regenerar si se lesiona a los 15-21 días en cul-tivo. Resultados similares han sido aportados enotros estudios empleando modelos experimen-tales similares (11, 15). No obstante, nuestros re-sultados también demuestran que las neuronasde la corteza entorrinal adulta pueden recapitu-lar su proceso de desarrollo enfrente de lasseñales apropiadas (slm/ml) y recrecer. Estosresultados están en clara discrepancia con estu-dios anteriores que soportaban la hipótesis con-traria e indicaban que el estado de la madura-ción neuronal/axonal es el responsable de laausencia de regeneración de la EHC (11). En estesentido, es importante reseñar que los casos enlos que se ha obtenido regeneración axonal po-sitiva, p.e., en médula espinal; siempre ha sidogracias al aporte de factores exógenos a las neu-ronas axotomizadas: p.e., inhibiendo el desarro-llo de una cicratiz glial (22), aportando neurotro-finas y bloqueantes de moléculas inhibidoras demielina (21) o bien mediante el uso de célulaspromotoras de crecimiento axonal (17, 18, 19).Además, las únicas diferencias entre nuestro tra-bajo y el de Li y colaboradores residen en quenuestro trabajo permite la maduración de la EHCin vitro, mientras que Li y colaboradores realizan

cultivos heterocrónicos a partir de rebanadas decerebro obtenidas de animales de diferente eda-des (11). Desde el punto de supervivencia delcultivo, la edad del tejido neural a la hora de con-feccionar el cultivo es fundamental ya que el gra-do de supervivencia y viabilidad neuronal y, porello, su potencial regenerante puede ser muchomás variable lo que puede enmascarar o falsearlos resultados (23).

Los factores responsables de la pérdida de lacapacidad regenerativa no están determinadosen la actualidad. No obstante, sin descartar otrosfactores, existe una coincidencia temporal entrela perdida de potencial regenerante y la desapa-rición por muerte celular programada de las cé-lulas de Cajal-Retzius responsables del desarro-llo de la EHC (4). Por otro lado, la pérdida deregeneración es coincidente con el inicio de lamielinización de la EHC in vivo e in vitro (ver (11)para detalles). No obstante, estudios del grupoen fase de publicación demuestran un incre-mento elevado de moléculas inhibidoras (prote-oglucanos sulfatados) en el cultivo organotípicodespués de la lesión a los 15 DIV. Estos proteo-glucanos (p.e., condroitin sulfatos) pueden serlos responsables de la inhibición axonal ya queel bloqueo de otros factores solubles como losderivados de mielina o el bloqueo de la señali-zación derivada de semaforinas/neuropilinas(Solé y cols., en preparación) no conducen a unincremento notable de la regeneración axonal.No obstante, no podemos descartar un procesode sumación o compensación entre estos facto-res inhibidores.

Factores celulares y/o moleculares implicados

en la regeneración de la EHC in vitro

Células de Cajal-Retzius

Con los datos mostrados en este trabajo, to-do parece indicar que la ausencia de factoresmoleculares expresados por las células de Cajal-Retzius juega un papel importante en el fracasode regeneración de la EHC, ya que el aporte exó-geno de células de Cajal-Retzius mediante tras-plante potencia el recrecimiento axonal. En la ac-tualidad, desconocemos cual puede ser elfactor/factores potenciadores de este crecimien-to axonal. Desconocemos también si el efecto deese «factor» se puede circunscribir específica-mente a estimular el recrecimiento axonal o bienafectar favorablemente la supervivencia de la



neurona axotomizada, o si es una mezcla de am-bos. No obstante, nuestros estudios indican quelas células de Cajal-Retzius son fuente de facto-res implicados en la regulación del crecimientoaxonal (1, 4).

Diversos estudios indican que las neuronasde Cajal-Retzius presentan receptores de neuro-trofinas (p.e., trkB receptor de la neurotrofinasBDNF y NT4). Además, Prang y colaboradoreshan demostrado recientemente que la aplica-ción crónica de las neurotrofinas NT4 o GDNF acultivos axotomizados durante la primera sema-na in vitro potencia el recrecimiento axonal de laEHC (15). Posiblemente el tratamiento con estasneurotrofinas potencie la supervivencia de lasneuronas de Cajal-Retzius en el cultivo (vía el re-ceptor trkB) o se afecte directamente las neuro-nas de la corteza entorrinal o sus axones lesio-nados (vía NT4 o GDNF). De cualquier modo, enel estado actual de los datos no podemos des-cartar ninguna posibilidad, ni siquiera un efectopotenciador indirecto mediante la inhibición demoléculas inhibidoras del crecimiento axonal ola proliferación glial reactiva.

Glía y derivados de la mielina

Como se ha comentado anteriormente estu-dios del grupo en fase de publicación demues-tran que Nogo-A (NI-250) no es el único respon-sable de la inhibición axonal in vitro después dela axotomía de la EHC (Mingorance y cols., enpreparación). En la actualidad no podemos des-cartar que otros elementos de la mielina puedanjugar esta función inhibitoria (p.e., MAG). Noobstante, el papel de la MAG en procesos de in-hibición del crecimiento axonal está en debateen la actulidad. Diversos estudios han demos-trado que los derivados de la mielina y, concre-tamente, la MAG inhibe el crecimiento de losaxones de la formación hipocámpica (7). Por elcontrario, otros estudios han demostrado queanimales deficientes para la MAG o Nogo-A nomuestran un incremento notavle en la regenera-ción axonal (7, 8). Muy probablemente el hipo-campo joven trasplantado afecte la presencia deMAG de manera indirecta al afectar la prolifera-ción celular de oligodendrocitos que tiene lugartras lesión de la EHC. Es interesante constatar,que desde antiguo se conoce que el tejido neu-ral joven contiene factores que pueden inhibir laproliferación glial (6) lo que globalmente puedefavorecer al recrecimiento axonal. No obstante,

se requieren experimentos adicionales que clari-fiquen el posible papel funcional de la MAG enla lesión de la EHC.

Uso potencial de factores reguladores del

desarrollo de conexiones en las terapias

reparadoras en el SNC

En el presente estudio hemos empleado lascélulas responsables de la formación de una co-nexión para reparar la misma en el adulto. La hi-pótesis de trabajo se basa en que las célulastrasplantadas van a producir aquellos factorescapaces de inducir la recapitulación del progra-ma de desarrollo de la neurona adulta lesionada.Creemos que este abordaje es novedoso e inte-resante ya que, hasta la fecha, la mayoría de es-trategias reparadoras se basan en la aplicaciónde poblaciones celulares facilitadoras del creci-miento axonal no involucradas en su desarrolloinicial., pe., células de Schwann o células de glíaenvolvente (11, 17, 18, 19). Si bien el uso de ma-terial perinatal en terapías reparadoras conllevamúltiples problemas éticos y sociales, la identifi-cación y caracterización de los factores presen-tes en estas poblaciones neuronales y su apor-tación a la zona lesionada podrá constituir unanueva aproximación en la reparación neuronal.En este sentido, el empleo de células madre mo-dificadas genéticamente para la secreción defactores neurotróficos ya se está empleando enla actualidad para algunos modelos de neuro-degeneración del SNC con relativo éxito (7).

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