Factores que Influyen laMicrobiologa en los

AlimentosDr. Esther Z. Vega

Microbiologa Aplicada

Bosquejo

Mtodos de deteccin y cuantificacin

Factores internos y ambientales quecontrolan el crecimiento bacteriano

Cintica de crecimiento bacteriano

Fisiologa y metabolismo de microorganismosde origen alimentario

Ecosistemas, homeostasis ytecnologa de defensa

Ecologa the study of the interactions

between the chemical, physical,and structural aspects of a nicheand the composition of its specificmicrobial population

Commission on Microbial Specificationsfor Foods

Ecosistemas, homeostasis ytecnologa de defensa

Los alimentos son ecosistemas Organismos Ambiente

Factores intrnsecos (pH, Aw, nutrientes) Factores extrnsecos (temperatura, ambiente

gaseoso, presencia de otras bacterias) Preservacin por manipulacin de los factores

Los alimentos pueden contener mltiplesmicroambientes

Microbiologa clsica y suslimitaciones

Limitaciones en la deteccin y mtodos deenumeracin Contaje de placas Medio selectivo, diferencial Mtodo nmero ms probable Tcnicas de enriquecimiento Clulas daadas Viable no cultivable Factores intrnsecos que influyen en el crecimiento

microbiano Factores extrnsecos que influyen en el crecimiento

microbiano Homeostasis y tecnologa de defensa Cintica de crecimiento

Limitaciones de contaje deplacas

Asume Cada clula forma una colonia Cada colonia proviene de una sola clula bacterial Algunas colonias puede ser originadas de una

agrupamientode bacterias Se reporta como

- Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo ml.- NO como bacterias totales

Limitaciones de contaje deplacas

Factores que afectan la formacin decolonias por una clula Estado fisiolgico de la clula Medio de cultivo utilizado en la

enumeracin Temperatura de incubacin

Limitaciones del contajede placas

Slo se consideran organismos aerbicos No se sabe el tipo de bacteria El medio de cultivo permite el crecimiento de

ciertas bacterias Limitaciones visuales/Errores humanos Difcil de distinguir entre partculas de

alimentos y bacterias No se debe utilizar en alimentos fermentados Las colonias podran ser muy pequeas para

verse

Tipos de muestra Lquidas

Lquidos no viscosos se miden con pipetas Lquidos viscosos se pesan

Slidas Pesar aspticamente

Hisopo Tomar muestra pasando un hisopo por un rea

definida Ambientales y de envases

Enjuage el interior del envase Abra una placa para tomar una muestra del aire Placas RODAC

Protocolo para Contaje enPlacas

Prepare un homogenado de la muestra Dilucin 1:10 1 parte de la muestra a 10 partes del

volumen total Mezcle en licuadora o stomacherpor 2

minutos10 g/ml muestra 90 ml of diluyente

1:10 Dilucin 10-1

Protocolo para contaje enplacas

Prepare diluciones seriadas Diluya hasta que obtenga colonias separadas

entre 25-250 en una placa Utilice una pipeta estril entre cada dilucin Ponga la pipeta usada en el rea designada

Mezcle cada botella de dilucin 25 veces enun arco de 90 grados por 7 segundos

Use amortiguador de fosfato peptona paradiluir

Diluciones

Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

(1:10) (1:100) (1:1000)(1:10000)

(1:100000)

Sample Homogenate

Placas

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml 1 ml1 ml1 ml1 ml

Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish

Protocolo Contaje de placas Aada 18-20 ml de agar (45-50oF), a la placa petri

El agar no puede estar muy caliente porque mata lasbacterias

Mtodo estndar agar de placa (Plate Count Agar) Mueve 10x en cada direccin Deje que solidifique Incube las placas invertidas a 35-37oC por 48 horas.

Atmsfera (aerbico, anaerbico, microaerfilico) Temperatura

Enumeracin Nmero de colonias promedio por placa

Placas entre 25 y 250 colonias

Contaje de placa aerbica

Provee un estimado general debacterias aerbicas vivas

Evala calidad Predictor de shelf-life Monitoreo ambiental Excluye

Anaerobos obligados Microaeroflicos

Resultados del Contaje deplaca aerbica

Evala la sanitacin de una producto Predice la durabilidad (Shelf-life) Indicador de seguridad (Safety) Monitorea el ambiente

Medio microbiolgico Provee nutrientes para

el crecimiento de losmicroorganismos Caldo

Usualmente se utilizapara crecer cultivospuros

Utilizado paraenumeracin a travsde la tcnica de MPN

Medio microbiolgicoAgar Agar slidoslido

Agar- Agar- agenteagente gelatinizantegelatinizante sin valor sin valornutricionalnutricional

LquidoLquido a 45 a 45ooC, C, slidoslido a a temperaturatemperaturaambienteambiente

ClulasClulas bacterialesbacteriales estnestn atrapadasatrapadas en el en elagar agar taltal queque puedanpuedan ser ser enumeradasenumeradas

UtilizadoUtilizado parapara aislaraislar

PuedePuede ser no- ser no-selectivoselectivo, , selectivoselectivo o o diferencialdiferencial

Medio selectivo y diferencial Selectivo

Se aade un ingrediente al medio para inhibir elcrecimiento de ciertos tipos de organismos yayudar el crecimiento de otros

Diferencial Se le aade algo para diferenciar entre

organismos diferentesi.e. cambio en color

Mtodos de Nmero msProbable (MPN)

MPN Basado en

probabilidadestadstica

NO es contajedirecto

Tcnica lquida

Mtodos de Nmero msProbable (MPN)

Estima nmero de organismos enmuestra cuando se encuentran enbajas concentraciones

Se utiliza comnmente para E. coli ycoliformes

Se aaden agentes selectivos Mtodo de 3 5 tubos Lmite ms bajo de sensitividad (3

tubos)

MPN - ContinuacinEl objetivo es diluir el organismo Seleccione la muestra ms diluda con

todos los tubos positivos y los prximosdos 3,2,1 Nuestra combinacin

Determine el MPN utilizando la tabla deMPN

Tcnicas de enriquecimiento

Cero tolerancia Salmonella Listeria monocytogenes E. coli O157:H7

No se necesita enumeracin! Deteccin

Medio de pre-enriquecimiento con medio selectivoenriquecido

Se pone en placa en medio selectivo Confirmacin bioqumica y gentica

Clulas daadas

Una clula puede ser daada en lugarde matada por niveles sub-letales decalor, radiacin, cidos o agentessanitizantes.

Resultado: Menor resistencia a agentesselectivos o aumento en susrequerimientos nutricionales.

Clulas daadas

Tabla 2.3

Valor D55C- tiempo requerido paraeliminar 90% de la poblacin a 55oC.

Figura 2.3

Clulas daadas: Causasambientales

Calor subletal Congelamiento sub-

letal Secado freeze

drying Secado Radiacin

Qumicos Tintes Sodium azide Sales Metales pesados Antiboticos Aceites esenciales EDTA Compuestos

sanitizantes

Clulas daadas: Factoresinfluyentes

La accin de daar una clula es unproceso complejo, influeciado por:

Tiempo Temperatura Concentracin de agente Cepa de organismo Metodologa experimental

L. monocytogenes crecida a

Clulas daadas:Caractersticas de las clulas

Aumento en el tiempo de la fase lag decrecimiento (efecto de reparacin)

Aumento en la sensitividad a lavariedad de agentes selectivos en elmedio de cultivo Prdida de la habilidad de formar colonias

en medio selectivo

Clulas daadas: Efecto deestresores ambientales en las

clulas Membrana celular

Daos en los componentes lpidos Enzimas de ciclo TCA Otras enzimas

Coagulasa Nucleasa termoestable

Ribosomas Prdida de Mg+2

DNA RNA

Clulas daadas: Qusignifica?

Imposible recuperar la cantidad verdadera depatgenos Eficiencia del procesamiento del alimento es

sobreestimada E.g. valor D menor

Recuperacin de patgenos daados enalimentos Problemas de seguridad Problemas de contaminacin

Agentes selectivos pueden ser ingredientescomunes de los alimentos e.g. sal

Clulas daadas: S. aureus

Clulas de S. aureus daadas por cidodurante la fermentacin para laproduccin de embutidos puede creceren TSA, pero no en TSA 7.5% NaCl.Estas clulas pueden reparse en elembutido si se mantiene a 35oC (perono a 5oC), crecer y producirenterotoxina.

Clulas daadas: Deteccin

Pre-enriquecimiento no selectivoseguido de placas con medio selectivos Agentes que reparan (e.g. piruvato,

catalasa, oxirasa) Placas de medio no-selectivo y medio

selectivo No-selectivo: daadas y no-daadas Selectivo: no-daadas

Organismos viables pero nocultivables (VBNC): caractersticas

de las clulas Organismos que no son cultivables con

medio no selectivo Activos metablicamente

Presencia de enzimas metablicas Sntesis de nuevas protenas Cambios en los lpidos celulares

Nutrient uptake Cambios morfolgicos

VNBC Campylobacter jejuni

Organismos viables pero nocultivable (VBNC): Deteccin

Metabolismo de nutrientes radioactivoso fluorognicos para viabilidad (acridinaanaranjada:DNA:RNA)

Sondas de cidos nuclicos No provee informacin de viabilidad

Contaje directo de clulas viables pormicroscopa

Patgenos de origen alimentariopueden convertirse a VBNC cuando elalimento es puesto a temperaturas frasen un medio rico nutritivamente.

Organismos viables pero nocultivable (VBNC): Deteccin

Resucitacin de clulas VNC es demostrado por unaumento en cultivilidad pero no en un aumento en elnmero de clulas.

Organismos viables pero nocultivables (VBNC): Teoras

Teora original: parte del ciclo normalde la bacteria

Resultados recientes: inducido porestrs Bajas temperaturas (

Organismos viables pero nocultivables (VBNC): Vibrio vulnificus

Figura 2.7

Organismos viables pero nocultivables (VBNC): Significado

Campylobacter jejuni Escherichia coli Vibrio vulnificus Salmonella enteritidis Shigella Vibrio cholerae

Un patgeno que no se detecta!

Factores intrnsecos que influyenen el crecimiento microbiano

Factores intrnsecos- caractersticasinherentes al alimento

pH Contenido de humedad (Aw) Potencial de oxidacin-reduccin (Eh) Contenido nutricional Constituyentes antimicrobiales Estructuras biolgicas

Rangos de pH ptimos paracrecimiento microbiano

pHOptimum Maximum Minimum

Bacteria 6.5-7.5 9.0 4.5

Hongos 4.0-6.8 8.0-11.0 1.5-3.5

Levaduras 4.5-6.5 8.0-8.5 1.5-3.5

pH El pH de un alimento es la medida de la acidez o alcalinidad

de ese producto. La escala del pH abarca valores que oscilanentre 0 y 14. Un pH inferior a 7 es cido, un pH de 7 es neutroy un pH superior a 7 es alcalino o bsico.

Actividad de agua (Aw )

Actividad de agua (Aw) -proporcin de agua presenteen un alimento. Tambin seconoce como la humedadrelativa.

Rango: 0-1.0 (agua pura)

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

Aw

Staphylococcus aureus puede crecer hasta un

Aw de 0.86

Aw de alimentos

Frutas y vegetales 0.97-1.00 Carnes 0.95-1.0 Pan 0.95-1.0 Queso 0.68-1.0 Mermeladas- 0.75-0.94 Miel 0.54-0.75

Potencial de oxidacin-reduccin(Eh)

Oxidacin prdida de electrones Reduccin ganancia de electrones Potencial de oxi-reduccin facilidad

en que un sustrato en particular gana opierde electrones (mV) Eh negativo: sistema anaerbico Eh positivo: sistema es aerbico

Un producto oxidado es +; uno reducidoes -

Potencial oxi-reductor (O-R)

El potencial oxi-reductor de losalimentos est influenciado por:Composicin qumica del

alimentoTratamiento que se aplica al

procesarloCondiciones de almacenaje

Eh de algunos alimentos

Origen vegetal: +400 mV Queso: -20 a -200 mV Carnes

Pre-rigor: +250 mV Post-rigor: +10 a -130 mV Carne molida: +300 mV

Cul de las siguientesrepresenta un Eh + ?

Rango de crecimiento microbiano enrelacin a Eh

De +100 a -250 mVDe +100 a -250 mVanaerobiosanaerobios

De +300 a +100 mVDe +300 a +100 mVAnaerobiosAnaerobiosfacultativosfacultativos

De +500 a +300 mVDe +500 a +300 mVaerobiosaerobiosRangoRango de Eh de EhOrganismoOrganismo

Nutrientes

Los microorganismos muestran diversidad ensus requisitos nutricionales.

Qu necesitan? Agua Fuente de energa Fuente de nitrgeno Vitaminas Factores de crecimiento Minerales

Factores antimicrobiales naturales

Lisozima en el huevo Aglutinina en la leche Lacteninas en la leche Eugenol en los clavos cido benzoico en los arndanos

Factores extrnsecos que afectanel crecimiento microbiano

Temperatura de almacenamiento Humedad relativa del ambiente Presencia y concentracin de gases en

el ambiente Presencia y actividades de otros

organismos

Temperatura

Humedad relativa

Muy alta: condensacin, crecimiento Muy baja: prdida de humedad,

inhibicin de crecimiento

Presencia y concentracin degases

Oxgeno o aire Atmsfera

anaerbica CO2 Ozono

Presencia y actividades de otrosorganismos

General No especfica Inhibicin o destruccin de un organismos por otro Mecanismo

No est claro Nmero de inhibidores > organismos blanco Variedad de inhibidores

Competencia por nutrientes Alteracin no-favorable del ambiente Combinacin de factores

Presencia y actividades de otrosorganismos

Antagonismo por lactato Sustancias con actividad antimicrobiana de

bacterias productoras de cido lctico Metabolitos de oxgeno Acidos orgnicos CO2 Diacetil Acetaldehdo Bacteriocinas Antiboticos

Cintica de crecimiento

Fisiologa microbiana ymetabolismo

Fermentaciones de alimentos Dao de alimentos Seguridad alimentaria

Fisiologa microbiana ymetabolismo

Bacterias aerbicas GlucosaCO2

(oxidacin) OxgenoH2O

(reduccin) 38 ATPs

Fosforilacin oxidativaen el sistema detransporte de electrones

Oxgeno es elaceptador final deelectrones

Fisiologa microbiana ymetabolismo

Bacterias anaerbicas No tienen sistema de

transporte de electrones Reduccin de

compuestos a travs defermentacin

1-2 ATP/mol de hexosa Fosforilacin a nivel de

sustrato P de compuestos

orgnicos es transferidoa nucletidos deadenina para formarATP

Gluclisis- Flujo de carbn yfosforilacin a nivel de sustrato

Embden Meyerhof pathway

fosfofructocinasa

aldolasa

Ruta EMP

2 ATP/mol glucosa Bidireccional Enzimas claves:

Fosfofructocinasa Aldolasa

Ruta Entner-Doudoroff

Zymomonas y Pseudomonas

1 ATP/mol glucosa1 3C para biosntesis

Catabolismoheterofermentativo

Leuconostoc,Lactobacillus

Basado encatabolismo depentosas

1 ATP/mol hexosaRuta heterofermentativa

Catabolismohomofermentativo

Lactococcus,Pediococcus,algunosLactobacillus

Bacterias homolcticas utilizanRuta EMP para producir piruvato

Ciclo TCA Utilizado por todos los

aerbicos Genera NADH2 and

FADH como sustratopara fosforilacinoxidativa

Genera ATP por mediode fosforilacin a nivelde sustrato

Relacionado abiosntesis de aminocidos

Aerbicos: regeneracin de NADy respiracin

Aerbico NADH2NAD

(oxidacin O2 es el aceptador

final de e- Azufre y nitrito en

respiracinanaerbica

Transporte de e-gradiente deprotonesATP

Anaerobos: regeneracin deNAD y respiracin

Anaerobos Metabolismo fermentativo

El aceptador final de e- es un compuestoorgnico