FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

“Eficacia antimicrobiana in vitro del extracto etanólico de propóleo sobre

cepas de Streptococcus pyogenes”

TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE MÉDICO

CIRUJANO

AUTOR

RANDY BRYAN ESCUDERO FARRO

ASESORES

DR. SANTIAGO BENITES CASTILLO

DRA. AMALIA VEGA FERNÁNDEZ

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN

ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y TROPICALES

TRUJILLO – PERÚ

2016

ii

PÁGINAS PRELIMINARES

PÁGINA DEL JURADO

Eficacia antimicrobiana in vitro del extracto etanólico de propóleo sobre

cepas de Streptococcus pyogenes.

Mg. Jaime Polo Gamboa

PRESIDENTE DEL JURADO

Dr. Miguel Ibañez Reluz

SECRETARIO DEL JURADO

Dra. Amalia Vega Fernández

VOCAL DEL JURADO

.

FECHA DE SUSTENTACIÓN Y APROBACIÓN:

07/12/16

iii

DEDICATORIA

En primera instancia agradecer a Dios

sobre todas las cosas, además de permitir

lograr nuestras ansiadas metas que nos

hemos plasmado desde que iniciamos

esta aventura.

A las personas que me dieron la vida, mis

padres, Pamela y Elmer que son mi motor

y fuerza día a día, ya que sin su apoyo

incondicional no hubiese hecho realidad

ningún sueño.

En mención honrosa agradecer a todos

mis hermanos, de la cuales mi hermana

Darsy quien tiene como hija mi mayor

motivo de superación y de no rendirme

por nada del mundo, gracias por estar

presente en este mundo Valeria.

iv

AGRADECIMIENTO

En primer lugar me encantaría agradecer

de corazón a mi asesor de Tesis Dr.

Benitez Castillo Santiago y Dra Vega

Fernandez Amalia, gracias a su esfuerzo

y dedicación.

Me siento feliz de haber encontrado a

personas que con su manera de trabajar

me han apoyado demasiado con sus

conocimientos y orientaciones siendo

unos de los pilares fundamental para la

realización de este trabajo.

Gracias a esto estoy muy agradecido de

antemano y solo encontrado admiración

hacia ustedes durante todo el periodo del

desarrollo.

v

DECLARATORIA DE AUTENTICIDAD

Yo Randy Bryan Escudero Farro con DNI Nº 71880417, interno de medicina del

Hospital Regional Docente Trujillo por lo que ha de cumplir con el Reglamento de

Títulos de la Universidad Cesar Vallejo, Facultad de Ciencias Médicas de la

Escuela de Medicina humana, declaro bajo juramento doy mi palabra que este

trabajo es veraz y autentico.

Esta investigación ha sido realizada para la obtención de un título profesional no

ha sido antes sustentada por otra persona.

Por lo cual bajo toda la responsabilidad ante cualquier plagio, ocultamiento u

omisión sobre la información brindada en mi trabajo, seré sometido a las reglas

académicas.

____________________________

Randy Bryan Escudero Farro

vi

PRESENTACIÓN

Últimamente la medicina alternativa tiene mucho prioridad sobre los tratamientos

de miles de enfermedades, que fueron descubierto hace muchos años y

trasmitidos de generaciones en generaciones.

En cuanto al propóleo, un producto que últimamente está siendo investigado por

sus variados fines terapéuticos, el cual es recolectado de los panales de abejas

debido a que es la combinación de varios materiales de recolección de ellas que

sirve principalmente para cubrir los agujeros de sus colmenas con la finalidad de

evitar cuerpos extraños ingresen a esta.

Este producto que tiene efectos medicinales de los cuales están en estudio contra

varios microorganismos, uno es el Streptococcus pyogenes, siendo el principal

patógeno de infecciones a la garganta produciendo faringoamigdalitis, cuya

consecuencia de no ser tratadas puede llegar a presentar complicaciones como

fiebre reumática, nefritis estreptocócica, entre otras. Por ello nos planteamos este

interrogante ¿El extracto etanólico de propóleo tiene eficacia antimicrobiana in

vitro sobre cepas de Streptococcus pyogenes?, para poder observar la eficacia

del extracto etanólico de propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes se

realizará mediante un diseño experimental, donde habrá post prueba como control

vii

INDICE

CARÁTULA ...................................................................................................................... 1

PÁGINAS PRELIMINARES ............................................................................................... ii

PÁGINA DEL JURADO .................................................................................................. ii

DEDICATORIA .............................................................................................................. iii

AGRADECIMIENTO ...................................................................................................... iv

DECLARATORIA DE AUTENTICIDAD .......................................................................... v

PRESENTACIÓN .......................................................................................................... vi

INDICE ......................................................................................................................... vii

RESUMEN ...................................................................................................................... viii

ABSTRACT ...................................................................................................................... ix

I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................10

1.1. Realidad problemática .......................................................................................11

1.2. Trabajos previos ................................................................................................12

1.4. Formulación del problema .................................................................................17

1.5. Justificación del estudio .....................................................................................17

1.6. Hipótesis ............................................................................................................18

1.7. Objetivos ...........................................................................................................18

II. MÉTODO ..................................................................................................................19

2.1. Diseño de investigación .....................................................................................19

2.2. Variables, Operacionalización ...........................................................................19

2.3. Población y muestra ..........................................................................................21

2.4. Criterios de selección ........................................................................................21

2.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos ..............................................22

2.7. Aspectos éticos .................................................................................................25

I. RESULTADOS .........................................................................................................26

II. DISCUSIÓN ..............................................................................................................30

III. CONCLUSIONES .................................................................................................33

IV. RECOMENDACIONES .........................................................................................34

V. REFERENCIAS ........................................................................................................35

VI. ANEXOS ...............................................................................................................40

FICHA DE RECOLECCIÓN DE DATOS ......................................................................40

MATRIZ DE CONSISTENCIA ........................................ ¡Error! Marcador no definido.

viii

RESUMEN

Se ha determinado la eficacia antibacteriana de las distintas concentraciones de

extractos etanólicos de propóleo los cuales fueron extraídos de la región de

Lambayeque (Bosque seco de Pomac) obteniéndose por el centro de apicultura

“Honey Bee”, en Trujillo. Se utilizó cepas de Streptococcus pyogenes, Gram

positivo. Se empleó el mediante el método kirby Bauer el crecimiento bacteriano,

donde se medirá a través de observación de la presencia o ausencia, donde con

una concentración al 60% llegó a ser eficaz, con una actividad antibacteriana

significativamente dependiente de su concentración de extracto. Además se

encontró una concentración mínima inhibitoria de 806 ug/uL. En conclusión los

extractos etanólicos de propóleo tienen una actividad antimicrobiana

significativamente, la cual ha dependido de su concentración de extracto.

Palabras claves: Extracto etanólico, Kirby Bauer, concentración mínima inhibitoria

ix

ABSTRACT

It has been determined the antibacterial efficacy of different concentrations of

ethanol extracts of propolis which were extracted from the region of Lambayeque

(dry forest Pomac) obtained by the central beekeeping "Honey Bee" in Trujillo.

Streptococcus pyogenes strains, Gram positive was used. We used the by kirby

Bauer bacterial growth method, which will be measured through observation of the

presence or absence, where a concentration of 60% became effective, with

antibacterial activity significantly dependent on the concentration of extract. It was

further found an MIC of 806 ug / uL. In conclusion ethanolic extracts of propolis

have significantly antimicrobial activity, which depended on the concentration of

extract.

Keywords: Ethanolic extract, Kirby Bauer, minimum inhibitory concentration

x

11

I. INTRODUCCIÓN

1.1. Realidad problemática

El Streptococcus pyogenes (GAS), es el germen responsable más frecuente de

las faringitis según un estudio realizado en el 2004 en la ciudad de Buenos Aires,

de las cuales las infecciones respiratorias agudas ocupan el principal motivo de

consultas en todo el mundo en los servicios de bajo nivel.1,2

De acuerdo a los resultados del Centro de Control y la Prevención de

Enfermedades (CDC), aproximadamente 9,000-11,500 casos de enfermedad

invasiva por GAS de los cuales 3.2 a 3.9/100.000 habitantes se ha producido

cada año en los Estados Unidos. Más de 10 millones de infecciones por GAS no

invasivos (infecciones de garganta y superficiales de la piel) se producen

anualmente. En todo el mundo, las infecciones por GAS y sus secuelas post-

infecciosas como la fiebre reumática y cardiopatía, las cuales contribuyen a unos

500 000 decesos por año, si bien los datos no son concluyentes, se considera que

todas las frecuencias de todas las formas de infección de esta bacteria son 10

veces mayor en países en vías de desarrollo.3

La faringoamigdalitis aguda estreptocóccica es muy frecuente en menores de 18

años pero además se encuentra en adolescentes y adultos, con una declinación

importante en los mayores de 35 años.4

A nivel nacional las estadísticas en el año 2010 ubicó a las infecciones

respiratorias agudas entre las morbilidades más frecuentes, la cuales representa

un 19,2 % de las atenciones por el Sistema Integral de Salud (SIS) con un total de

5’943,551, en las cuales incluía los diagnósticos de “faringitis agudas y amigdalitis

agudas”.5

Para ella, el tratamiento de elección sigue siendo la penicilina, su alternativa en

pacientes alérgicos es la eritromicina. En los tratamientos orales se utilizan hasta

10 días para poder llegar a la eliminación de GAS, de los cuales no están exentos

de eventos adversos y requiere de alguna supervisión médica.6

12

En los últimos años la medicina alternativa complementaria es una de la más

utilizada a nivel mundial debido sus fines terapéuticos, por lo que es una

alternativa a los diversos medicamentos usados actualmente. La OMS promueve

el uso de la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades sanitarias

primarias debido a que esto genera un menor costo en uso de las terapias. En

uno de sus resultados en el año 2000 indico que un promedio de 80% de la

población africana usó tal medicina; siendo Etiopía el país con mayor consumo

(90%).7

El propóleo tiene una posible eficacia, que no está completamente definida por

falta de evidencia sobre su efecto contra el GAS. En relación al tratamiento para

esta enfermedad, existen terapias farmacológicas y no farmacológicas, dentro de

estos últimos están los remedios caseros y/o medicina alterativa complementaria

(MAC).En Lima aproximadamente el 70% la utilizó alguna vez y otro en provincias

estimo que casi la mitad de los usuarios conocen de alguna terapia tradicional y

una tercera la ha utilizado alguna vez en su vida para el tratamiento de la

faringitis, por lo cual consideramos que sería una buena propuesta como

alternativa en la faringitis estreptocócica el uso de propóleos. A pesar de que el

tratamiento es respaldado por estudios, la variedad de compuestos que se

encuentran en el mercado para combatir este problema prevalente de atención

básica, nos induce una pequeña duda sobre la mejor opción disponible y ventajas

o desventajas relativas de cada uno de ellos.6, 8,9

1.2. Trabajos previos

Torban T et al.10 (2014, Turkey); determinaron la actividad antibacteriana de

propóleo contra bacterias aisladas. Recolectaron propóleo procedente del pueblo

de Konya (Turquía) y Moscov (Rusia), además cultivaron 32 cepas de cada uno,

Staphylococcus aureus meticilino resistente (MSRA), staphylococcus aureus

meticilino sensible (MSSA), S. pyogenes, E. coli. Se halló una concentración

mínima inhibitoria (CIM) de >16,384 ug/mL. No se encontró una diferencia

estadísticamente significativa para la CIM, Gram positivas y Gram negativas para

ambas muestras de propóleo (p<0,001). Resultó que dicho extracto es más eficaz

13

en contra las bacterias Gram positivas que las Gram negativas. Concluyeron que

el propóleo tiene alta actividad antibacteriana in vitro contra el S. pyogenes.

Shinhorini W et al.11 (2014, Brasil); Evaluaron la actividad antimicrobiana in vitro

del propóleo contra algunas cepas bacterianas. Se obtuvo extracto etanólico de

propóleo con una dilución hasta 70% propóleo y 30% de alcohol, además de las

cepas Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Escherichia coli, en las

cuales se encontró cierta sensibilidad al extracto de propóleo. Para el control, se

utilizó agar Muller Hinton de alcohol a concentración 30%. La eficacia

antibacteriana de propóleo era 91% de los Streptococcus pyogenes; 80% de los

Staphylococcus aureus y 61,6% para Escherichia coli. Se concluyó por lo tanto

que las bacterias Gram positivas son más susceptibles a la acción antibacteriana

del propóleo lo que probablemente es debido a los flavonoides, ácidos aromáticos

y ésteres presentes en la resina, que actúan sobre la estructura de la pared

celular bacteriana de estos microorganismos.

Serra J et al.12 (2012, España); hallaron la actividad antimicrobiana de 19

extractos de propóleo preparados en diferentes disolventes etanol y propileno

glicol (EEP / PEP) de diferentes zonas de España contra bacterias y hongos

aislados utilizando método de difusión en agar. Los resultados revelaron que

ambos tipos de extractos de propóleo mostraron un efecto antimicrobiano

altamente sensible acción contra las bacterias Gram positivas y hongos, con un

efecto moderado contra Streptococcus pyogenes, (CIM de 17 al 26 mg / mL),

contra las bacterias Gram-negativas fue Salmonella enterica (CIM 0,6 a 1,4 mg /

mL) y contra Helicobacter pylori (CIM de 6 a 14 mg / mL), mientras que E. coli fue

resistente. Se concluyó que los propóleos vascos tenían una fuerte y dependiente

de la dosis actividad contra la mayoría de las cepas microbianas probadas, sin

diferencias entre el disolvente empleado.

Hendi N et al.13 (2011, Iraq); examinaron las actividades antimicrobianas del

extracto etanólico contra algunas bacterias aisladas por el método de difusión en

disco en agar, se recolectó propóleo en la región de Museiab (Iraq), del cual se

preparó extracto etanólico y extracto acuoso; además cultivaron varias cepas de

14

S. aureus, S. pyogenes, E. coli, H. pylori entre otras. Los resultados mostraron

gran diferencia significativa (p≤0,05) entre ambos resultados. Siendo las

concentraciones mínimas inhibitorias para el S. pyogenes en la concentraciones

del extracto etanólico de propóleo al 10%, 20% y 30% con una CIM de 1280, 1280

y 640 ug/mL respectivamente. Este estudio concluyó que extracto etanólico de

propóleo fue más activo que el extracto acuoso de propóleo para las diferentes

bacterias.

Ophori E. et al.14 (2010, Nigeria); investigaron los agentes bacterianos de la

infección del tracto respiratorio superior (URTI) y la susceptibilidad de los aislados

a propóleo. Determinó la susceptibilidad de los agentes bacterianos aislados por

el extracto propóleo, del pueblo de Delta (Nigeria) para poder producir el extracto

etanólico del propóleo con alcohol al 70% en diluciones distintas entre ellas: 0.5,

1, 2, 4,8 y 10 ug/mL cuadriplicando las muestras y teniendo como control solución

etanólica de alcohol; además se recolecto muestras de infecciones respiratorias

de las cuales se obtuvo 52 cultivos de Haemophilus influenzae, 48 de Klebsiella

pneumoniae, 30 de S. pneumoniae, 5 S. pyogenes. El extracto de propóleo

mostró eficacia contra K. pneumoniae, S. pneumoniae, M. catarrhalis y S.

pyogenes; M. catarrhalis y S. pyogenes fueron menos sensible con una MIC de

0,5 y 8,0 ug / mL, respectivamente. Se concluyó que el extracto etanólico del

propóleo tiene eficacia antimicrobiana. Su halo de inhibición fue de 10 mm a la

concentración de 25%.

Bini P et al.15 (2010, Brasil); realizaron un estudio con el fin de establecer una

preparación de extracto método para mostrar mayor actividad antibacteriana.

Obtuvieron el propóleo de Ibaiti (Brasil) con lo que preparó un extracto acuoso de

propóleo y de este se determinó el contenido de flavonoides totales, además de

cepas de microorganismos como Streptococcus mutas, Staphylococcus aureus,

Streptococcus pyogenes, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium y

Pseudomonas aeruginosa. La mayoría de cepas de bacterias dentro de ellas S.

pyogenes mostraron MIC de 36 ug / mL, mientras Staphylococcus aureus mostró

una CIM de 9 ug / mL. En conclusión el extracto etanólico de propóleo tiene

15

actividad antibacteriana para Gram positivas y negativas, sugiere que esta

sustancia es una mezcla activa compuestos bactericidas.

Oliveira A et al.16 (2010, Brasil); investigaron la composición química de extracto

etanólico de propóleo de Brasil y la susceptibilidad de Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes y Escherichia coli a esta

sustancia. Recolectaron el propóleo de Rio de Janeiro, además se obtuvo cepas

de E. coli, S. aureus y S. pyognes. Se halló actividad antibacteriana del propóleo

contra E. coli y S. pyogenes y S. aureus, siendo el primer estudio que muestra

que el propóleo tiene eficacia contra estas bacterias. S. pyogenes siendo para las

cepas de S. pyogenes la zona de inhibición entre 14 y 18 mm. Se halló una

diferencia significativa con un p<0,05. Además el estudio reportó la presencia de

linalol, metilo hidrocinamato, hidrocinamato etilo, α-ylangene y γ-elemene en

extracto etanólico de propóleo. Además, el estudio ha demostrado también la

actividad antibacteriana contra las bacterias Gram negativas (E. coli) y Gram

positivas (S. aureus, S. epidermidis, S. pyogenes).

1.3. Teorías relacionadas al tema

El Streptococo del grupo A mayormente conocido como Streptococcus Pyogenes

es uno de los principales patógenos en las enfermedades de la faringitis y de la

piel como impétigo y pioderma. Es una bacteria Gram positiva en forma de

cocoide que cuando crece produce cadenas; su virulencia depende de la proteína

M, aparte tiene gran cantidad de enzimas y toxinas incluidas las toxinas

eritrogénicas. 3

Streptococcus pyogenes (GAS) produce faringoamidalitis, escarlatina, celulitis,

erisipela, glomerulonefritis, fascitis necrotizante, fiebre reumática y mionecrosis.

Se encuentra en la piel y mucosas como huésped. Para su cultivo requiere

productos de sangre produciendo una zona completa de hemolisis por lo que se

clasifica como beta hemolítico.17

16

Se ha podido observar en España un aumento de la resistencia del GAS a los

macrólidos. En el último estudio SAUCE, se observa que el 27,6% de las cepas

aisladas en adultos, y el 22,9% en niños son resistentes a la eritromicina.18

El propóleo es una sustancia oscura y viscosa de consistencia resinosa elaborado

por las abejas que proviene de los exudados de árboles que es de color

anaranjado rojizo, siendo este muy variable de acuerdo a su procedencia, tiene el

fin de tapar las grietas y orificios de su colmena con el objetivo de impedir el paso

de corrientes de aire o de intrusos, ayuda aislando las partículas extrañas que se

encuentran dentro y produce una estabilización de esta.19

El uso del propóleo tiene una larga historia, que cuenta desde la data del antiguo

Egipto, en donde se usaba en terapias medicinales e integrante de los ungüentos.

Luego en la edad media y renacimiento se hace referencia sobre su utilización en

la guerra de los Bóer como antiséptico, en el cual era mezclado con vaselina. A

mediados del siglo XX, Prokopóvich demostró la efectividad comparada con la

cocaína y novocaína como anestésico local. Posteriormente los científicos

Derevich y Popescu en el año 1965 demuestran un efecto positivo sobre las

células tumorales. Actualmente es poco usado, pero es aplicado en una variedad

de terapias contra distintas enfermedades ya sea bacteriana o víricas.20

La composición del propóleo es de un origen principalmente vegetal con un 50%,

cera en 30%, sustancias de regurgitaciones glandulares segregadas por las

abejas y polen un 20%. Se han identificado más de 300 constituyentes del

propóleo, dentro de los cuales una gamma de variedad son componentes

fenólicos, principalmente de tipo flavonoide, además de la crisina y galangina,

pinocembrina, quetonas, vitaminas, cumarinas, y terpenoides.21

Tiene bastantes propiedades dentro de las cuales tenemos: antinflamatorias,

anestésicas, antivirales, bacteriostáticas y bactericidas. Se puede usar en formas

de ungüento o extracto alcohólicos para avanzar el proceso de cicatrizar. Estas

propiedades dependen mucho de la procedencia y mes de donde es extraído el

propóleo, siendo de mayor productividad el mes de julio hasta noviembre.22

17

La actividad bactericida y bacteriostática del propóleo es controversial, debido a

las diferentes composiciones que dependen del lugar de donde se extrae. Se

señala a sus principales componente a la galangina y pinocembrina, unas

hidroxiflavonas que tiene excelentes resultados frente a las infecciones por

bacterias gram positivos entre ellas los cocos, bacilos y anaerobios; por lo cual

posee una actividad antiséptica como remedio de boca, encías y estomatitis;

donde se utiliza como enjuague o aplicaciones locales con pequeñas torundas.

Dentro de las reacciones adversas por propóleo tenemos el eczema de los

apicultores siendo una afección rara, que no afecta más de 1 en 2000 según

Chauvin y para Caillas, que aún no ha sido certificada por el sesgo en los estudios

realizados. 23

La penicilina G sódica es un antibiótico que pertenece al grupo de la penicilina

betalactámica semisintética, con actividad bactericida, sensible a la degradación

por beta-lactamasas.24

1.4. Formulación del problema

¿El extracto etanólico de propóleo tiene eficacia antimicrobiana in vitro sobre

cepas de Streptococcus pyogenes?

1.5. Justificación del estudio

La escasez y antigüedad de estudios a nivel mundial, y la percepción de que por

conocimiento popular, la administración de propóleo en pacientes con infecciones

respiratorias altas causadas por GAS, especialmente en pacientes pediátricos,

resulta recomendable como alternativa a fármacos antibióticos que necesitan de

prescripción y supervisión médica y evaluación periódica y que luego de un

tiempo deviene en resistencia a múltiples bacterias, nos motivaron a realizar la

presente investigación.

18

El no encontrar antecedentes de investigación con el uso de propóleo a nivel local

para comprobar su eficacia y pudiendo disponer de los recursos humanos y

financieros hemos deseado profundizar sobre la incógnita ya planteada y

desarrollar la presente investigación.

Los resultados de ser satisfactorios, pudieran ser utilizados para llevar a cabo

otros estudios a fin de aportar bases científicas para aplicar posteriormente con

éxito una terapia alternativa, fomentar el progreso de la ciencias e incrementar el

consumo del propóleo, masificando su empleo en hospitales y nosocomios sobre

todo como coadyuvante de las infecciones respiratorios de naturaleza crónica que

se asocien a estas infecciones, hasta poder observar si existen o no reacciones

adversas.

1.6. Hipótesis

H1: El extracto etanólico de propóleo tiene eficacia antimicrobiana in vitro

sobre cepas de Streptococcus Pyogenes

H0: El extracto etanólico de propóleo no tiene eficacia antimicrobiana in vitro

sobre cepas de Streptococcus Pyogenes

1.7. Objetivos

1.7.1. General

Determinar la eficacia antimicrobiana del extracto etanólico de propóleo sobre

cepas de Streptococcus pyogenes.

1.7.2. Específicos

Identificar la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de

Propóleo sobre cepas de Streptococcus Pyogenes

Valorar el crecimiento bacteriano de cepas de Streptococcus pyogenes frente

al extracto etanólico de propóleo a diferentes concentraciones (60%, 70%,

80%, 90%) por el método de Kirby y Bauer.

19

II. MÉTODO

2.1. Diseño de investigación

Experimental con comparaciones múltiples

RG1: X1 - O1

RG2: X2 - O2

RG3: X3 - O3

RG4: X4 - O4

RGi: Xi - Oi

RGi+1: Xi+1 - Oi+1

RGi+2 Xi+2 - Oi+2

Dónde:

R: Asignación al azar

G: Placas Petri con Streptococcus pyogenes

Xi: i – ésimo tratamiento con Propóleo

Xi+1: tratamiento con penicilina

Xi+2: tratamiento con etanol al 70%

Oi: i – ésima observación post tratamiento con Propóleo

Oi+1: observación post tratamiento con penicilina G sódica

Oi+2: observación post tratamiento con etanol al 70%

2.2. Variables, Operacionalización

Variable independiente:

Extracto etanólico de propóleo

A las diferentes concentraciones: 90%, 80%, 70% y 60%

Variable dependiente:

Eficacia antimicrobiana

Mediante el antibiograma y Concentración mínima inhibitoria

20

2.2.1. Operacionalización de variables

Variable Definición

conceptual

Definición

operacional

Definición

operacional Indicadores

Escala de

medición

Variable

independiente:

Etanólico de

Propóleo

Extracto obtenido

a partir de

propóleo en

bruto, luego

combinado con

etanol, seguida

de la eliminación

de dicho solvente

por rotavapor.25

Extracto

etanólico del

Propóleo

Se hará la

medición

mediante la

ficha de

observación,

teniendo en

cuenta la

concentración

del extracto

etanólico de

Propóleo.25

90%

80%

70%

60%

Cuantitativa

discreta

Variable

dependiente

Eficacia

antimicrobiana

Interferencia en

el crecimiento y

la supervivencia

de los

microorganismo

mediante una

interacción

específica con

algunos de sus

componentes

celulares.25

Antibiograma

Medición del

diámetro del

halo de

inhibición de

los discos en

la prueba de

difusión en

disco, según

el estándar

CLSI_M100-

S24.26 Será

eficaz cuando

sea sensible

Resistente:

diámetro

inferior a 24

mm

Sensible:

diámetro

superior o

igual a 24

mm

Cualitativa

ordinal

Concentración

mínima

inhibitoria

Observación

del

crecimiento

bacteriano en

la prueba de

micro dilución

en tubo

según el

estándar

CLSI_M100-

S24.26 Será

eficaz cuando

haya

ausencia de

crecimiento

Presencia

Ausencia

Cualitativa

nominal

21

2.3. Población y muestra

2.3.1. Población:

El universo estuvo constituido por las cepas de Streptococcus pyogenes

obtenidas en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias

Médicas de la Universidad César Vallejo.

2.4. Criterios de selección

Los criterios de Inclusión:

Cepas de Streptococcus pyogenes de contenido puro.

Cultivos de Streptococcus pyogenes conservados sin daño externo

Los criterios de exclusión:

Cultivos de Streptococcus pyogenes contaminadas

Cepas de Streptococcus pyogenes que no pudieran ser reconstituidas en

medio de cultivo

Unidad de análisis:

La unidad de análisis será cada una de las cepas Streptococcus pyogenes

cultivadas.

Unidad Muestral:

La unidad muestral lo conformó la relación de placas Petri establecidas

estadísticamente.

2.4.1. Muestra Experimental:

Se determinó mediante esta fórmula:

𝑛 =2(𝑍𝛼

2⁄ +𝑍𝛽)2𝜎2

(�̅�1 − �̅�2)2

Dónde:

𝑍𝛼2⁄= 1.96; con un nivel de confianza del 95%

𝑍𝛽= 0.84; con una potencia del 80%

𝜎 = 40.8 variabilidad según muestra piloto

�̅�1= 24; halo promedio de inhibición según muestra piloto al 90%

�̅�2= 18; halo promedio de inhibición según muestra piloto al 70%

22

n = 28 x 5 repeticiones

n = 140 repeticiones

2.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos

2.5.1. Técnicas: Observación directa de campo – Experimental; Se observó los

cultivos de las cepas con Streptococcus pyogenes en la cual se le añadió

las distintas soluciones de extracto de propóleo, se midió el halo de

inhibición y la CIM.

2.5.2. Procedimiento:

2.5.2.1. Extracción y conservación del propóleo

Se usó propóleo en bruto procedente del distrito de Chepén en La Libertad

extraído el mes noviembre en una cantidad de 500 gramos, almacenándolo

posteriormente en frascos de vidrios transparentes cubriéndolos con las bolsas

oscuras y así evitar influencias ambientales sobre las propiedades del producto.

2.5.2.2. Preparación del extracto etanólico de propóleo en el laboratorio

Se transportó hacia el laboratorio de la Facultad de Ciencias Médicas de la

Universidad Cesar Vallejo, donde se eliminó las impurezas con pinzas estériles,

se lavó con agua hervida a temperatura ambiental, después se dejó secar a

temperatura ambiente y una vez seca, se cortó con la finalidad de obtener

partículas uniformes, 150 gramos de propóleo, luego se sometió a un proceso de

extracción exhaustiva con 200 ml de etanol al 96% a reflujo en un equipo de

soxhlet durante 1 hora y media, al cabo de este tiempo se filtró a través de papel

de filtro Whatman Nº 40 dando tres filtrados, se realizó nuevamente y se reunió

ambos, se obtuvo el extracto final.

2.5.2.3. Determinación del rendimiento y las diferentes diluciones

Su determinación del rendimiento de sustancias solubles totales se realizó cuando

los extractos de propóleo se colocaron en el matraz de un rotavapor tipo Büchi y

se esperó hasta la evaporación hasta la desaparición del solvente. El sólido

obtenido se sometió a secado en estufa a 70 °C durante 2 horas, para obtener el

denominado extracto seco total.

23

Con la siguiente ecuación se halló el rendimiento: Rendimiento (%) = P.100/m,

siendo P el peso de extracto seco (g) y m es el peso de muestra (g). Luego, se

pesó el extracto seco obtenido y con base a este resultado se preparó distintas

concentraciones de 60%, 70%, 80 % y 90% en alcohol de 70 %.

2.5.2.4. Obtención y preparación de las cepas

La bacteria se obtuvo de 7 pacientes portadores de S. pyogenes mediante un

hisopado faríngeo, los cuales se guardó en bolsas estériles. Estas fueron llevadas

al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Médicas de la

Universidad César Vallejo para su procesamiento. Se cultivó con medio agar

sangre a 37°C por 48 horas en tubos de ensayo, luego se diluyó hasta alcanzar la

turbidez del tubo 0,5 de la escala de Mac Farland.

Se sembró con un hisopo estéril, el cual fue embebido en las placas del cultivo

preparado, se colocó a una distancia de 10 cm de la llama de un mechero, luego

se sembró en placas Petri de 15 cm cada una con contenido de agar sangre

hisopando uniformemente sobre toda la superficie del agar y girando cada placa

30°C por 10 veces.

2.5.2.5. Descripción del efecto bactericida técnica de Kirby y Bauer

Para lo cual se preparó 4 diluciones de extracto etanólico de propóleo a las

concentraciones de 60%, 70%, 80%, 90%, en dichas diluciones se conservó a

4°C para dicho estudio microbiológico. Luego de realizó el sembrado de las cepa

de Streptococcus pyogenes en placas Petri de 15 cm, donde se hizo la prueba de

susceptibilidad usando el método de Kirby Bauer (difusión en discos), por lo cual

se preparó discos de papel filtro estériles (diámetro 6mm) los que fueron

sumergidos en cada una de las concentraciones de extracto etanólico de

propóleo; y después, con aguja estéril fueron colocados sobre los cultivos de

Streptococcus Pyogenes en placas Petri, preparados previamente. Se utilizó un

grupo control positivo con penicilina G sódica y un control negativo con alcohol al

70%. Luego las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas. La lectura se

realizó pasadas las 24 horas, midiendo los halos de inhibición (susceptibilidad) de

24

cada una de las concentraciones, donde se incluyó el área del disco de papel de

filtro con una regla milimetrada procediéndose de igual manera con ambos

controles, donde se le colocó 5 uL de los distintas concentraciones de propóleo.

Al final se empleó en cada caso la escala de Duraffourd para determinar

cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro, según diámetro de inhibición.

Es resistente cuando el diámetro menor a 24 mm.

Es sensible cuando el diámetro superior o igual a 24 mm.

2.5.2.6. Descripción de efecto concentración mínima inhibitoria (CMI) de la

técnica de microdiluciones

Este método permitió determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto

siguiendo las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standars Institute

(CLSI_M100-S24). Por lo que se usó diluciones seriadas (1/10), con una solución

fosfato salina tamponada (PBS 1X), que oscilan entre 900 a 600ug/ul para el caso

del extracto etanólico del propóleo. Para la realización del experimento se utilizó

placas de microtiter de 96 pocillos, a cada pocillo se le adicionó 10μL de cada

dilución y 2 μL de suspensión bacteriana (0.5 Mc. Farland) de las bacterias S.

pyogenes. Las placas que contienen la mezcla se incubarón en condiciones de

anaerobiosis controlada a 37°C durante 72 horas y se observó mediante la

técnica de densidad óptica. Mientras que la CMI para la penicilina es 12 ug/mL

según el CLSI. 25, 26, 27,28, 29, 30

2.5.3. Instrumento: Ficha de observación de campo; fue en donde se registraron

todos los datos importantes extraídos en el laboratorio (ANEXO 1).

2.6. Métodos de análisis de datos

Luego de la utilización del instrumento, los archivos se almacenaron de manera

automatizada, en una laptop CORE i5, usando los siguientes Software:

Procesador de texto Microsoft Word 2013, Microsoft Excel, Programa Estadístico

SPSS 23,0.

El análisis de la información se le realizó mediante estadística descriptiva (en

gráficos de cajas en Microsoft Excel), la estadística inferencial para la

comprobación de la hipótesis y el cumplimiento de los objetivos.

25

Para el análisis estadístico se empleó la prueba de análisis de varianza (ANOVA)

y se aplicó prueba no paramétrica t3 de Dunnett, por comprobarse que se tratan

de datos con varianzas diferentes.

2.7. Aspectos éticos

El personal de limpieza almacenara en bolsas de residuos de acuerdo a su

clasificación en el medio ambiente dispuesto, limpiar y desinfectar el ambiente y

recipientes luego su evacuación de los residuos para su disposición final según

los procedimientos del laboratorio.

26

I. RESULTADOS

A continuación se muestran los resultados en tablas y figuras.

Tabla 01. Eficacia de la concentración del extracto etanólico del propóleo

sobre cepas de Streptococcus pyogenes mediante el método Kirby bauer

Concentración del extracto etanólico del

propóleo

Cepas sensibles al extracto

etanólico de propóleo

Cepas resistentes al

extracto etanólico de

propóleo

Total de cepas utilizadas

n % n % n %

90,0 % 13 46 15 54 28 100

80,0 % 0 0.0 28 100.0 28 100

70,0 % 0 0.0 28 100.0 28 100

60,0 % 0 0.0 28 100.0 28 100

Fuente: Resultados de laboratorio

La eficacia del extracto de propóleo fue de un 46% con la concentración

máxima utilizada al 90%, siendo eficaz en casi la mitad. En concentraciones

del 60% al 80% se observaron 0 cepas sensibles al extracto etanólico del

propóleo. Esta información se puede visualizar en la figura 1.

27

Tabla 02. Concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de propóleo

sobre cepas de Streptococcus pyogenes mediante el método de

microdiluciones

Concentraciones de extracto etanólico de

propóleo

Cepas sensibles al extracto etanólico de

propóleo

El porcentaje de cepas sensibles al extracto etanólico de propóleo

90,0 % 28 100,0 %

80,0 % 22 79,0%

70,0 % 4 14,0 %

60,0 % 0 0,0 %

Penicilina 28 100,0 %

Negativo 0 0,0 %

Fuente: Resultados de laboratorio

El extracto etanólico de propóleo al 90% fue eficaz sobre las cepas de

Streptococcus pyogenes en un 100%, siendo al 70% de concentración su

eficacia de 14% sobre el total de las cepas. El cuadro muestra que la

penicilina fue eficaz en el 100% de las cepas. Muestra una CMI 806 ug/mL.

Esta información pone en evidencia en la figura 2.

28

Tabla 03. Resumen estadístico descriptivo del halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes

Concentración

N Media Desviación

típica Error típico

Mínimo Máximo

90% 28 23.1 1.38 0.26 21 26

80% 28 19.7 1.02 0.19 17 21

70% 28 15.6 0.63 0.12 14 16

60% 28 12.2 0.72 0.14 10 14

Penicilina 28 24.7 0.61 0.12 24 26

Total 140 19.1 4.75 0.40 10 26

Fuente: Resultados de laboratorio

La Penicilina tuvo una media del halo de inhibición sobre las cepas de

Streptococcus pyogenes de 24.7, mientras el que más se acercó fue el

extracto etanólico al 90% con una media de 23,1. Se puede evidenciar

intervalos cortos, con error menor a 0,5. Esta se visualiza en la figura 3.

29

Tabla 04. ANOVA del halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes

Fuente de Variación Suma de cuadrados gl Media

cuadrática F Sig.

Inter-grupos 3028.0 4 757.01 891.71 0.00000

Intra-grupos 114.6 135 0.85

Total 3142.7 139

Fuente: Resultados de laboratorio

La diferencia de medias es muy significativa entre las diferentes

concentraciones sobre el halo de inhibición. Siendo las máximas en el grupo

de penicilina, seguida del grupo de concentración de extracto etanólico al 90%.

Esta información se puede visualizar en la figura 4.

30

II. DISCUSIÓN

Para entender los resultados se debe aclarar que se concibe por CMI el valor

mínimo de dilución que inhibió parcial o totalmente el desarrollo de las

bacterias sobre las cepas de Streptococcus pyogenes, entonces de acuerdo

con los resultados obtenidos, de acuerdo a esto se puede ver cuál es la

diferencia entre ambas concentración mínima inhibitoria.

Las diferencias entre los estudios que se encuentran como antecedentes

dependen de la posibilidad de bacterias ATCC y bacterias silvestres extraídas

de pacientes como en nuestro caso, además la eficacia del extracto etanólico

de propóleo se ha visto la eficacia dependiendo de la geografía de donde se

extraen debido a que a la distintas concentraciones de flavonoides que se

encuentran en cada uno.

La concentración mínima inhibitoria de la penicilina G sódica sobre las cepas

de Streptooccus pyogenes de acuerdo al Clinical and Laboratory Standars

Institute es de 12 ug/mL, mientras que en nuestro trabajo sale 806 ug/mL,

mostrando una gran diferencia significativa, por lo que es necesario mucho

más cantidad de este extracto para poder ser eficaz.

De forma similar con el estudio realizado por Shinhorini (2014) quien reporta

una eficacia del 91% sobre Streptococcus pyogenes a una concentración del

70%, muestra una similitud a nuestro estudio quien reporta una eficacia al 90%

de un 46%, en dicho estudio enfatiza como principal a los flavonoides como

principio activo, donde este extracto fue eficaz para bacterias Gram positivas.

En el siguiente estudio de Torban et al (2014) quien reporta una concentración

inhibitoria mínima para S. Pyogenes > 16,384 ug/mL donde se utilizó bacterias

extraídas de pacientes, donde muestra una concentración mucho mayor que

en nuestro estudio, ambos estudios muestran similitudes en efecto sobre

dichas cepas extraídas de pacientes, mostrando eficacia sobre las cepas

Gram positivas.

31

Serra et al (2012) por su parte reporta una CIM para Streptococcus pyogenes

de 17 al 26 ug/mL, siendo diferente a los resultados que encontramos en

nuestra investigación, se asemeja mucho a los de Clinical and Laboratory

Standars Institute que es 12 ug/mL, mostró una gran eficacia sobre las cepas;

mientras que en nuestro trabajo se halló una eficacia al 90% del extracto

etanólico

Hendi et al (2011) demostró que el extracto etanólico de propóleo es eficaz en

la erradicación de S pyogenes en concentraciones desde 10 al 30%, este

resultado si bien al igual que el nuestro encuentra eficacia entre del propóleo

en la eliminación de S. pyogenes, difiere en las concentraciones, es importante

señalar aquí que las cepas bacterianas son oriundas de Irak lo cual puede

relacionarse con la diferencia de resultados obtenidos. Además según su

concentración minima inhibitoria muestra una variación debido a que es mucho

menor la concentración de extracto etanólico de propóleo

Otro estudio que encuentra propiedades antimicrobianas del extracto de

propóleo fue el estudio realizado por Ophori et al (2010), pero encuentra que

es mucho más eficaz como antimicrobiano contra Haemofilus influenzae,

klepsiela neumoniae, S. neumoniae, M. catarralis y finalmente S. pyogenes

quienes fueron menos sensibles con una MIC de 8,0 ug/mL, es importante

señalar que el estudio de Ophori se realizó en Nigeria, con cepas también

diferentes a las nuestras. Comparando además el halo de inhibición mostro

10 mm debido a su porcentaje de concentración, mientras que en el trabajo a

una concentración de 90%, encontramos una media de 24,7 mm.

Bini et al (2010) en Brasil determinaron que el contenido de flavonoides totales

(propóleo de Ibaiti) encontrando de las cepas de Streptococcus pyogenes

mostraron MIC de 36ug/mL, concluyendo que el extracto etanólico de propóleo

tiene actividad antibacteriana contra gram positivas y gram negativas, estos

resultados solo coinciden en la actividad anti Streptococcus pyogenes del

propóleo.

32

Otro estudio realizado en Brasil por Oliveira et al (2010) reporto que la

susceptibilidad de Streptococcus pyogenes presento un halo en la zona de

inhibición entre 14 y 18 mm solo ante el extracto etanólico en una

concentración de 50%, en nuestro estudio se encontró una variación entre 10

a 23 mm, pero con diferentes concentraciones que varían de 60 a 90%.

33

III. CONCLUSIONES

El estudio concluye afirmando que:

El extracto etanólico de propóleo tiene eficacia antimicrobiana sobre cepas de

Streptococcus pyogenes.

La concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de propóleo sobre

cepas de Streptococcus pyogenes es de 806 ug/dL.

Mediante el método kirby Bauer a diferentes concentraciones del extracto

etanólico de propóleo mostró sensibilidad a la concentración de 90%,

demostrando una diferencia significativa.

34

IV. RECOMENDACIONES

A las personas que tienen un espíritu investigador, se desearía que se amplíen

los tipos de muestra de diferentes lugares para demostrar su eficacia y ver la

variabilidad del efecto del propóleo sobre distintos microorganismos.

Utilizar propóleos de diferentes lugares, además de controles positivos con

otros antibióticos para así poder demostrar su eficacia.

35

V. REFERENCIAS

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40

VI. ANEXOS

ANEXO 1

FICHA DE RECOLECCIÓN DE DATOS

TITULO:

EFICACIA ANTIMICROBIANA IN VITRO DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE

PROPÓLEO SOBRE CEPAS DE Streptococcus pyogenes

GENERALIDADES:

Se utilizara cuatro diluciones de 90%, 80%, 70% y 60% de extracto etanólico de

propóleo y dos controles, uno positivo que será penicilina g sódica 100ug y uno

negativo de etanol al 70%.

VARIABLE DEPENDIENTE:

Inhibición del crecimiento bacteriano

VARIABLE INDEPENDIENTE:

Concentración del extracto etanólico de Propóleo

Nº de

repeticiones

Diluciones

90% 80% 70% 60% Control Positivo

Control Negativo

1

2

3

4

5

…

28

Promedio

41

Anexo 02: DATOS RECOLECTADOS PARA CMI

CONCENTRACIONES 10ul controles

CODIGO 9000ug 8000ug 7000ug 6000ug POSITIVO

100ug NEGATIVO

1 + + - - + -

2 + + - - + -

3 + + - - + -

4 + + - - + -

5 + + - - + -

6 + + + - + -

7 + + - - + -

8 + + - - + -

9 + + - - + -

10 + + - - + -

11 + + - - + -

12 + + - - + -

13 + + - - + -

14 + + - - + -

15 + - - - + -

16 + + - - + -

17 + - - - + -

18 + + - - + -

19 + - - - + -

20 + + + - + -

21 + + - - + -

22 + + - - + -

23 + + - - + -

24 + - - - + -

25 + - - - + -

26 + + + - + -

27 + + + - + -

28 + - - - + -

CMI: 806ug/dL

42

Anexo 03: DATOS RECOLECTADOS DEL DIAMETRO DE HALO (mm)

DIAMETRO DE HALO (mm)

CONCENTRACIONES %

CODIGO

90 9000ug

80 8000ug

70 7000ug

60 6000ug

CONTROL POSITIVO

CONTROL NEGATIVO

1 25 21 16 12 25 0

2 23 20 15 14 24 0

3 24 21 16 12 25 0

4 24 20 15 10 25 0

5 26 20 16 12 25 0

6 22 21 15 12 25 0

7 23 20 14 12 24 0

8 24 20 16 12 24 0

9 21 21 16 12 24 0

10 23 20 16 13 25 0

11 23 19 16 12 25 0

12 21 20 16 12 25 0

13 23 19 16 12 25 0

14 22 20 16 12 25 0

15 25 19 16 12 25 0

16 24 19 15 12 26 0

17 24 20 16 13 24 0

18 24 20 15 12 24 0

19 23 19 16 12 24 0

20 22 20 15 13 24 0

21 21 18 16 12 24 0

22 21 17 16 12 25 0

23 23 20 15 12 24 0

24 25 18 16 13 25 0

25 23 20 16 13 25 0

26 24 20 15 12 24 0

27 24 21 16 13 25 0

28 21 18 14 11 26 0

Promedio 23.1 19.7 15.6 12.2 24.7 23.1

43

Figura 1. Diagrama de barras de la Eficacia de la concentración del extracto

etanólico del propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes.

13(46,0%)

15(54,0%)

90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 90,0% 80,0% 70,0% 60,0%

0% 0% 0% 0% 0% 0%

Sensible Resistente

44

Figura 2. Diagrama de barras sobre concentración mínima inhibitoria del

extracto etanólico de propóleo sobre cepas de Streptococcus pyogenes.

Fuente: datos de la investigación.

28(100%)

22(79%)

4(14%)

0

28(100%)

0

0 5 10 15 20 25 30

"90,0 %"

"80,0 %"

"70,0 %"

"60,0 %"

Penicilina

Negativo

45

Figura 3. Diagrama de Boxplot (caja t bigote) que muestra resumen

estadístico descriptivo del halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo

sobre cepas de Streptococcus pyogenes. Fuente: Datos de la investigación.

9

11

13

15

17

19

21

23

25

27

"90 %" "80 %" "70 %" "60 %" Penicilina

46

Figura 4. Diagrama de dispersión que muestra resumen estadístico

descriptivo del halo de inhibición del extracto etanólico de propóleo sobre

cepas de Streptococcus pyogenes. Fuente: Datos de la investigación.

0

5

10

15

20

25

30

90% 80% 70% 60% Penicilina