FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA - core.ac.uk · Byrsonima crassifolia (Indano) evidenció la...

“UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA”

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL EXTRACTO

ETANÓLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia (Indano) FRENTE A

Cándida albicans Y Trichophyton rubrum, POR EL MÉTODO DE

MACRODILUCIÓN”

TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO

PRESENTADO POR:

Bach. Scavino Doñez, Roy Roger

Bach. Saldaña Sanjurjo, Claudio Andre

ASESORES:

Ing. Alenguer Gerónimo Alva Arévalo. Dr.

Blga. Jessy Patricia Vásquez Chumbe

Q.F. Henry Vladimir Delgado Wong

IQUITOS – PERÚ

2015

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS:




MACRODILUCIÓN”

Página de Aprobación:

Miembro del Jurado

----------------------------------

M.C.CHARLES OCAMPO

FALCON (PRESIDENTE)

----------------------------------

ING. GLADYS CARDENAS

DE REATEGUI (1ER MIEMBRO)

----------------------------------

ING. CLETO JARA

HERRERA (2DO MIEMBRO)

Asesores:

--------------------------------

ING. ALENGUER G.

ALVA AREVALO

--------------------------------

BLGA. JESSY P.

VASQUEZ CHUMBE

--------------------------------

Q.F. HENRY V.

DELGADO WONG

3

INDICE:

Titulo……………………………………………………………………………… 08

Resumen…………………………………………………………………………...09

Dedicatoria………………………………………………………………..………. 11 y 12

Agradecimiento……………………………………………………………...…….13

I. INTRODUCCIÓN…………………………………..……………. 14

II. OBJETIVOS…………………………………………………...…. 17

2.1 General……………………………………………………...… 17

2.2 Específico…………………………………………………….. 17

CAPITULO N° 01………………………………………………………………….18

III. MARCO REFERENCIAL...............................................................19

3.1 Antecedentes………………………………………………..... 19

3.2 Clasificación taxonómica…………………………………….. 23

3.3 Sinonimia……………………………………..……………… 24

3.4 Descripción botánica…………………………..……………... 24

3.5 Distribución y producción…………………………………… 26

3.6 Usos del Indano……………………………………………… 26

3.7 Composición química………………………………………... 27

3.8 Farmacología…………………………………………………. 28

3.9 Metabolitos principales………………………………………. 29

IV. MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS……….…. 30

a. Principios del método………………………………………….. 30

4.1 CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS EN ESTUDIO…….. 31

A. Fenotipo de la cepa Candida albicans……………. 31

B. Fenotipo de la cepa Trichophyton rubrum………. 32

V. DEFINICIONES OPERACIONALES…………………………… 33

a. Variables……………………………………………………… 33

I. Independiente……………………………………... 33

II. Dependiente…………………………………... 33

VI. INDICADORES…………………………………………………... 33

a. Independiente (X): Concentración del extracto…………....33

SCAVINO DOÑEZ, ROY ROGER & SALDAÑA SANJURJO, CLAUDIO ANDRE

4

VII. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES……………... 34

CAPITULO N° 02…………………………………………………………………36

VIII. METODOLOGÍA………………………………………………… 37

a. Tipo de investigación………………………………………… 37

IX. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN…………………………….. 38

a. Procedimiento experimental……………………... 38

a. Recolección de la muestra vegetal……………….. 38

b. Identificación de la muestra vegetal……………… 38

c. Obtención del extracto etanólico…………………. 38

X. TAMIZAJE FITOQUÍMICO………………………………………. 41

a. Ensayos de identificación de los metabolitos secundarios….. 41

1.Identificación de Alcaloides………………………………….. 41

Ensayo de Dragendorff……………………………………….. 41

2.Identificación de Triterpenos y Esteroides……………………. 41

Ensayo de Liebermann-Buchard……………………………… 41

3.Identificación de Quinonas……………………………………. 42

Ensayo de Borntrager…………………………………………. 42

4.Identificación de Cumarinas…………………………………... 42

Ensayo de Baljet………………………………………………. 42

5.Identificación de Saponinas…………………………………… 42

Ensayo de la Espuma………………………………………….. 42

6. Identificación de Fenoles y Taninos…………………………... 42

Ensayo de Cloruro Férrico……………………………………. 43

7. Identificación de Aminoácidos y Aminas…………………….. 43

Ensayo de Ninhidrina…………………………………………. 43

8. Identificación de Flavonoides…………………………………. 43

Ensayo de Shinoda…………………………………………….. 43

XI. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR EL

MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS……………. 44

A. Preparación de los antifúngicos: Ketoconazol y

Fluconazol………………………………………………... 44


5

B. Controles positivos y negativos………………………….. 44

C. Cepas de hongos empleadas para estudio………………… 45

D. Crecimiento y preparación de la solución madre de los hongos

en estudio……………………………………………......... 45

I. Candida albicans……………………………………… 45

II. Trichophyton Rubrum………………………………… 45

E. Preparación del inóculo………………………………..….. 46

F. Interpretación de los resultados…………………………… 46

G. Lectura de los resultados de la concentración mínima

inhibitoria (CMI)…………………………………………. 46

XII. POBLACIÓN Y MUESTRA………………………………………. 47

a) Población vegetal…………………………………. 47

b) Muestra vegetal…………………………………… 47

c) Población microbiológica………………………… 47

d) Muestra microbiológica…………………………... 47

e) Criterios de inclusión……………………………... 47

f) Criterios de exclusión…………………………….. 47

XIII. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS………………………. 48

a. Material de vidrio…………………………………. 48

b. Material de metal………………………………….. 48

c. Otros materiales…………………………………... 48

d. Equipos……………………………………………. 49

e. Reactivos………………………………………….. 49

f. Medios de cultivo………………………………… 49

g. Material de bioseguridad………………………….. 49

XIV. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA………………………………………………… 50

XV. CUESTIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN…………. 51

CAPITULO N° 03………………………………………………………………52


6

XVI. RESULTADOS…………………………………………………….. 53

a) Tamizaje fitoquímico……………………………… 55

b) CIM encontrado de candida albicans……………… 55

c) CIM encontrado de trichophyton rubrun………….. 55

XVII. DISCUSION…………………………………………………….... 57

XVIII. CONCLUSIONES………………………………………………... 60

XIX. RECOMENDACIONES………………………………………….. 61

XX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………… 62

XXI. ANEXOS…………………………………………………………. 68

1. ANEXO Nº 01……………………………………. 68

Imagen satelital de la ubicación geográfica de la reserva

natural ALLPAHUAYO – MISHANA

2. ANEXO Nº 02……………………………………. 69

Ficha de especies de las plantas medicinales en estudio

3. ANEXO Nº 03......................................................... 70

Muestra botánica

4. ANEXO Nº 04......................................................... 71

Descripción de cepas en estudio

5. ANEXO N° 05......................................................... 72

Secado y molienda de la muestra vegetal

6. ANEXO N° 06……………………………………. 73

Obtención de la extracto etanólico

7. ANEXO Nº 07......................................................... 74

Tamizaje fitoquimico

8. ANEXO N° 08……………………………………. 75

Certificación INS – Hongos

9. ANEXO N°09…………………………………….. 76

Incubación de Hongos

Periodo de crecimiento de los hongos

10. ANEXO N°10…………………………………….. 77

Preparación de antifúngicos

11. ANEXO N°11…………………………………….. 78


7

Resultados de la actividad antifungica

12. ANEXO N°12…………………………………….. 79

Resultado de controles positivos

13. ANEXO Nº13…………………………………….. 80

Metodología de macrodilución para hongos

14. ANEXO N°14…………………………………….. 81

Diluciones de controles positivos:

15. ANEXO Nº15…………………………………….. 82

Preparación del estándar (0,5 mc. farland) para el inóculo

16. ANEXO N° 16……………………………………. 83

Esterilización de materiales

17. ANEXO N° 17……………………………………. 83

Medios de cultivo utilizados

XXI. INDICE DE CUADRO

Cuadro N°01………………………………………. 53

Cuadro N°02………………………………………. 53

Cuadro N°03………………………………………. 53

Cuadro N°04………………………………………. 55

XXII. INDICE DE GRAFICOS

Grafico N° 01……………………………………... 54

Grafico N° 02……………………………………... 54

Grafico N° 03……………………………………... 55

Grafico N° 03……………………………………... 56

XXIII. INDICE DE ESQUEMAS

Esquema N° 01…………………………………… 39

Esquema N° 02…………………………………… 40


8

XXIV. INDICE DE FICHA

Ficha N° 01……………………………………….. 69

Ficha N° 02……………………………………….. 80

XXV. INDICE DE IMÁGENES

Imagen N°01………………………………………. 71

Imagen N°02………………………………………. 71

Imagen N°03………………………………………. 71

Imagen N°04………………………………………. 80

Imagen N°05………………………………………. 80

Imagen N°06………………………………………. 81

Imagen N°07………………………………………. 81

XXVI. INDICE DE FOTOS

Foto N°01…………………………………………..70

Foto N°02…………………………………………..72

Foto N°03…………………………………………..73

Foto N°04…………………………………………..74

Foto N°05…………………………………………..75

Foto N°06…………………………………………..76

Foto N°07…………………………………………..76

Foto N°08…………………………………………..76

Foto N°09…………………………………………..77

Foto N°10…………………………………………..77

Foto N°11…………………………………………..77

Foto N°12…………………………………………..77

Foto N°13…………………………………………..77

Foto N°14…………………………………………..78

Foto N°15…………………………………………..78

Foto N°16…………………………………………..79

Foto N°17…………………………………………..79

Foto N°18,19, 20, 21, 22 y 23…………………….. 83


9

TITULO:




MACRODILUCIÓN”


10

“EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA In Vitro DEL

EXTRACTO ETANÓLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia (Indano)

FRENTE A Cándida albicans Y Trichophyton rubrum, POR EL MÉTODO DE

MACRODILUCIÓN”

Bach. Roy Roger, Scavino Doñez & Bach. Claudio Andre, Saldaña Sanjurjo*

RESUMEN:

El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antifúngica In Vitro mediante el

Método de macrodilución para hongos, con el extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia (Indano). La muestra fue recolectada en la Zona Reservada

Allpahuayo -Mishana; la muestra se identificó taxonómicamente en el Herbarium

Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP) y fue

depositada para su conservación en la xiloteca de la Facultad de Ingeniería Alimentarias

– UNAP. La determinación del screening fitoquímico se realizó en el laboratorio de la

Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias - UNAP. Las dosis del extracto fueron

50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.39063 y 0.1953 mg/mL, se utilizó como

control positivo ketoconazol obteniendo un CIM de 2.5 ug/mL y fluconazol obteniendo

un CIM de 3.12 ug/mL. El screening fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia (Indano) evidenció la presencia de Taninos, flavonoides,

lactonas y azucares reductores; para el estudio de la actividad antifúngica In Vitro

mediante el Método de macrodilución para hongos se utilizó cepas de Candida albicans

ATCC 90028 y Trichophyton rubrum ATCC 28188. El extracto etanólico de la corteza

de Byrsonima crassifolia (Indano) permitió evaluar la actividad antifungica Candida

albicans ATCC 90028 que evidenció un CIM de 1.5625 mg/mL en comparación con la

otra cepa en estudio Trichophyton rubrum ATCC 28188 que evidenció como resultado

un CIM de 0.39063 mg/mL.

PALABRAS CLAVES: Byrsonima crassifolia (Indano), Método de macrodilución,

hongos, Candida albicans, Trichophyton rubrum.


11

"EVALUATION OF IN VITRO ANTIFUNGAL ACTIVITY OF ETHANOL

EXTRACT OF BARK nanche (indane) against Candida albicans and

Trichophyton rubrum, by the method macrodilution"

Bach. Roy Roger Scavino Doñez& Bach. Claudio Andre, Saldaña Sanjurjo *

ABSTRACT:

The aim of this study was to evaluate the antifungal activity in vitro by the method

macrodilution for fungi, with the ethanol extract of the bark of nanche (indane). The

sample was collected in Allpahuayo -Mishana Reserved Zone; the sample is

taxonomically identified in the Amazonian Herbarium of the National University of the

Peruvian Amazon (UNAP) and was deposited for preservation in the xiloteca of the

Faculty of Food Engineering - UNAP. Determining the phytochemical screening it was

conducted in the laboratory of the Faculty of Engineering of Food Industries - UNAP.

Extract doses were 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.39063 and 0.1953 mg /

mL, was used as positive control to obtain a CIM ketoconazole 2.5 ug / mL and obtaining

a MIC of fluconazole 3.12 ug / mL. The phytochemical screening of the ethanol extract

of the bark of nanche (indane) showed the presence of tannins, flavonoids, lactones and

reducing sugars; for studying the in vitro antifungal activity by macrodilution method of

fungal strains Candida albicans ATCC 90028 and Trichophyton rubrum ATCC 28188.

The ethanol extract of the bark of nanche (indane) was used to evaluate allowed antifungal

activity Candida albicans ATCC 90028 which showed a MIC of 1.5625 mg / mL

compared with other strain ATCC 28188 Trichophyton rubrum study that showed results

in CIM 0.39063 mg / mL.

KEYWORDS: Nanche (indane), Macrodilution method, fungi, Candida albicans,

Trichophyton rubrum.


12

“DEDICATORIA”

“A Dios sobre todas las cosas y por cada cosa que nos regala en la vida…”

Roy Roger Scavino Doñez: Dedico este trabajo a mi angelito que desde el

cielo me cuida y guía siempre, mi PADRE

ROGER CONSTANTE SCAVINO GONZALES

y a mi otra inspiración, aquella mujer que nunca

me ha dejado, luchadora incansable, que es

también mi guerrera invencible, y siempre tendrá

sus brazos abiertos para mi MAMÁ ROSITA

EMERITA DOÑEZ PIZANGO.

A mi gran inspiración, de hacer todo día a

día de la mejor manera, el pilar más grande

que tengo, mi pequeña hija: CAMILA

LUCIANA SCAVINO MENDOZA, quien

es todo para mí, es el regalo más grande

que Dios me pudo dar.

A mi hermana, la única persona que siempre

estuvo para mí, que a pesar de estar muy lejos, es

decir en otro país, siempre influenció en mí, desde

la manera de pensar y actuar, para formar y ser

profesional, la cual es y siempre será una gran

inspiración para mi ELLEN CRISTINA

SCAVINO RIVERA.

A mis hermanos CESAR REAÑO, Q.F.

WALTER POZO,Q.F. JESSY

GUERRA,Q.F. LIMBERGH ARBILDO,

Q.F. PERCY GUERRA,Q.F. JESSYCA

MAITA, KAREN FLOREANO, MIJAIL

SHAPIAMA, JULIO TELLO,Q.F. NERIO

MORI, EDSON CURITIMA,Q.F.

MARCK RODRIGUEZ, CAMILA

SCAVINO, CYNHTIA PAOLA, MARY

AYALA, MARTIN RIOS y a mi otra

angelita que me cuida mucho desde el cielo

PAOLA MELISSA RUIZ GONZALES, y

al gran Prof. JUAN ELISEO RIOS DEL

AGUILA, por todas las cosas, la amistad y

enseñanzas, que me han transmitido, en el

transcurso de mi formación como

profesional.


13

Claudio André, Saldaña Sanjurjo: Dedico este trabajo de tesis a mis queridos

padres Isabel Sanjurjo Vilchez y Rusbel

Saldaña Saldaña, por el apoyo

incondicional que me brindaron a lo largo

de toda mi formación profesional,

logrando así que uno de mis más grandes

sueños se haga realidad.

A mis hermanos Fatima Cecilia y Bruno que

son mi motivación y la razón para seguir

adelante siendo un ejemplo constante para

ellos.

A toda mi familia sin excepción; mis

queridos tíos Manuel, Marjorie, Carolina,

Martin, mis abuelitos que siempre han

estado pendientes de mi durante esta etapa

de mi vida.

A Tatiana, una persona muy especial en mi

vida, gran amiga y compañera, que me

apoyo y estuvo a mi lado en los buenos y

malos momentos durante toda esta etapa.


14

“AGRADECIMIENTO”

“Que mejor que escalar la montaña, si te detienes, puedes

ver todo, pero a la vez te puedes caer, mejor es llegar a la

cima y verlo todo, más tranquilo, sintiendo deleite de un

logro más…”

Dedicamos este trabajo de investigación especialmente a todas aquellas

personas que de una u otra forma estuvieron compartiendo con nosotros, tanto

en el ámbito profesional como en el personal, conocimientos, experiencias,

anécdotas e intercambios de opinión.

La culminación de esta presente tesis no habría sido posible sin la ayuda de

las siguientes personas:

Al Ing. ALENGUER GERONIMO, ALVA ARÉVALO DR, por la

ayuda inconmensurable. Por ello queremos expresarle nuestra gratitud por

habernos aceptado en su sitio de trabajo. Gracias a sus ganas de querer

empezar pero siempre con la mira de culminar y su crítica rápida pero

acertada nos llenaron de entusiasmo y al querer hacer.

Al Blga. JESSY PATRICIA. VASQUEZ CHUMBE, por haber

dedicado una importante parte de su tiempo en compartir sus conocimientos,

por abrirnos las puertas de su centro laboral.

A la Ingeniera TANY, por habernos apoyado de manera desinteresada

en la parte microbiológica durante el desarrollo de la tesis.

Al Q.F. HENRY VLADIMIR DELGADO WONG, por su apoyo

durante la redacción y culminación de la tesis.

Al Q.F. JEAN PIERRE LOPEZ MESIA, por su ayuda en puntos muy

críticos de la tesis, y ayudarnos con ello a lograr un objetivo de ser Químico

Farmacéutico.

A todas aquellas personas que de una y otra forma colaboraron en la

realización de la presente tesis.

....Muchas gracias!!!


15

I. INTRODUCCION:

Durante las últimas décadas la utilización de las plantas medicinales y

productos que se originan de ellas se han extendido en el mundo y han

ganado una gran popularidad, sin embargo, muy pocas especies y

productos se han estudiado con fines médicos y un número menor

cuenta con estudios realizados sobre su seguridad eficacia y calidad.1

Se calcula que cerca del 10 por ciento de las más de un cuarto de millón

de especies de plantas que se conocen en la actualidad tienen

propiedades medicinales, es decir, para el año 2020 la población

mundial, habrá alcanzado la cifra de 7,5 mil millones de habitantes, de

los cuales el 75% vivirá en países de vía de desarrollo que hoy

consumen menos de 15% del mercado farmacéutico.2

El Perú lleno de riquezas naturales en donde las mismas han sido la

base para el desarrollo de generación tras generación, las

investigaciones científicas son un gran aporte para la población, gracias

a la valiosa información brindada los recursos naturales son mejor

aprovechados.3

El incremento en las infecciones fúngicas invasoras se ha mantenido

constante en el ambiente hospitalario, debido fundamentalmente a un

mayor número de pacientes con patologías de riesgo, tales como

leucemias, cáncer con neutropenia inducida, pacientes con trasplante

de precursores hematopoyéticos sometidos a terapias

inmunosupresoras y pacientes con SIDA. 4 Los dermatofitos son un

grupo de hongos filamentosos taxonómicamente relacionados que

tienen la capacidad de producir infecciones en la piel, el pelo y las uñas

tanto del ser humano como de los animales.5


16

Los dermatofitos son hongos queratinolíticos; es decir, tienen la capacidad

de digerir y utilizar la queratina como sustrato. 6 Las infecciones

producidas por estos hongos se denominan dermatofitosis, aunque

comúnmente también son llamadas tiñas, término que procede del latín

tinea y que significa gusano o polilla. Esta palabra se usa de forma

descriptiva dado el aspecto de serpentina o anular que presentan las

lesiones cutáneas con una apariencia de gusano enterrado en la piel.7

Las infecciones por Candida son un problema de salud pública, que

abarcan desde alteraciones en la flora normal hasta infecciones sistémicas

graves en pacientes inmunodeprimidos. Candida es parte de la flora

normal del tracto gastrointestinal pero es un patógeno oportunista capaz de

causar infecciones que comprometen la vida de los pacientes infectados.8

La micosis es una enfermedad que provoca a escala mundial entre 300

a 500 millones de casos clínicos cada año. Esto se debe a que la mayoría

de la población mundial está distribuida en zonas altamente endémicas

correspondientes a zonas subtropicales y tropicales.9

Algunas dermatofitosis son también llamadas “tiñas”, y según su

distribución corporal se clasifican en tiña de la cabeza, tiña del cuerpo,

tiña de la mano, tiña de los pies, tiña de la ingle, tiña del área del pañal

y tiña de las uñas.10 Trichophyton rubrum es el agente causal más

frecuente en tiñas del cuerpo, de la ingle, de los pies, así como de las

uñas.11

La prevalencia de Tinea capitis varía de 0,4% a 30% en las diferentes

partes del mundo.11 En Estados Unidos, en un estudio multicéntrico

realizado entre 1999 y 2002, encontró también que Trichophyton

rubrum fue el hongo patógeno más prevalente entre su población.

Además, hicieron notar que la incidencia de este patógeno ha


17

aumentado en los últimos años como causa de tiña de las uñas, tiña del

cuerpo, tiña de la ingle, tiña de la mano y tiña del pie.12

Al igual que en otros estudios, se ha observado que la piel lampiña

suele afectarse fácilmente; el cuero cabelludo, en cambio, rara vez se

ve afectado por este dermatofito. 13 En Europa, la afección por hongos

del cuero cabelludo se ha descrito con una incidencia menor al 1%.

Generalmente se asocian a esta entidad clínica otros dermatofitos, como

Mycrosporum canis, Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton

tonsurans. Este último dermatofito es el más prevalente en las tiñas de

la cabeza en Estados Unidos.14

En el Perú, los microorganismos aislados con mayor frecuencia son

Trichophyton tonsurans, de 54 a 78%, y Microsporum canis, de 7 a

26%.6 Sin embargo, Cárdenas et al. en un estudio realizado en la ciudad

de Trujillo, Perú, encontraron mayor frecuencia de Microsporum canis

(84,7%) que de Trichophyton mentagrophytes (9,1%) y Trichophyton

rubrum (3,1%).12 Otro estudio realizado por el Instituto de Medicina

Tropical de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM

- 2000), resalta que en el grupo de hongos dermatofitos, el

Trichophyton mentagrophytes es la especie de mayor incidencia

(38.06%), seguido de Trichophyton rubrum (6.71%). En el mismo

estudio se resalta que la frecuencia de dermatofitos y levaduras es

mayor en el sexo masculino (62.68%) que en el femenino (37.33%).13

En la Región Amazónica, el elevado porcentaje de humedad y las altas

temperaturas, condicionan en los lugareños a una alta prevalencia a

infecciones cutáneas producidas por dermatofitos (epidermofitos,

tricofitos, microsporosis) entre otras dermatomicosis (levaduras),

constituyendo una de las causas importantes de consultas en Hospitales

y Centros de salud en toda la región amazónica, ocupando el 10mo y el

14vo lugar dentro del perfil epidemiológico regional.14


18

II. OBJETIVOS:

a. General

Evaluar la actividad antifúngica del extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia (Indano), por el método de macrodilución In Vitro

frente a Cándida albicans y Trichophyton rubrum

b. Específicos

Obtener el extracto etanolico de la corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)

Realizar el tamizaje fitoquímico de la corteza de Byrsonima crassifolia,

(Indano)

Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico

obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia, (Indano), por el método de

macrodilución In Vitro frente a Cándida albicans

Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico

obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia, (Indano), por el método de

macrodilución In Vitro frente a Trichophyton rubrum

Comparar la actividad antifúngico de la corteza de Byrsonima crassifolia,

(Indano), contra Cándida albicans frente a Ketoconazol y Trichophyton

rubrum frente a Fluconazol respectivamente usándolos como control

positivo


19

CAPITULO 1


20

III. MARCO REFERENCIAL:

3.1 ANTECEDENTES:

El hombre amazónico a través de toda su historia, ha logrado identificar

y utilizar una buena cantidad de especies vegetales, llegando a conocer

y usar unas dos a tres mil plantas medicinales. Pocos estudios químicos

y farmacológicos sobre las propiedades medicinales y tóxicas de estas

plantas han sido realizados. De las 1516 especies (distribuidas en 145

familias y 594 géneros), un 50% tienen alguna investigación y la

mayoría han sido examinada por su utilidad como maderas, para la

confección de pulpa de papel o por sus aplicaciones en la alimentación

humana o en la industria.14

La importancia de los conocimientos etnobotánicas y de la medicina

tradicional se confirma cuando se ha encontrado que de los 119

fármacos derivados de plantas en uso actual, hay 88 (74%) que fueron

descubiertos como resultado de estudios químicos para el aislamiento

de las sustancias activas que motivaron el empleo de las plantas de

origen en la medicina tradicional.15

BRACK (1995), estimo el número total de especies vegetales en el Perú

en 25 000 especies; de éstas, se utilizan no menos de 3 140 especies

nativas, de las cuales 1005 especies son utilizadas para diversos fines,

como la artesanía.14

BRAKO y ZARUCCHI (1993), reporta para el Perú un total de 17 mil

144 especies conocidas, de las 150 000 que se conocen en el neo trópico

y las 450 000 que se han identificado en el mundo, agrupadas en 2 mil

458 géneros y 224 Familias, con 5 mil 354 especies endémicas.15

GENTRY (1988), basado en inventarios de árboles con diámetros

mayores a 10 cm y de lianas, identifica en el Perú, en el Departamento


21

de Loreto, uno de los bosques tropicales más diversos del mundo, como

los de Yanamono con 300 especies, por su parte Ha y Mishana con 289

especies maderables.16

La corteza de Byrsonima crassifolia se utiliza en el tratamiento de

llagas, vaginitis y tiña. Se ha demostrado que es activa contra entero

bacterias 19, levaduras y dermatofitos además de ser astringente,

cicatrizante e antiinflamatorio. Los compuestos responsables de la

actividad son proanticiadinas y heterosidos.16

El nanchi se distribuye desde México hasta Brasil en los bosques secos,

bosques húmedos y sabanas, desde los 0 a los 2000 msnm; diversas

partes de la planta se emplean para tratar diarreas e infecciones de la

piel, mientras que su fruto se recomienda contra la fiebre.17

CACERES, A. (1996): En un estudio de tres grupos de personas con

lesiones confirmadas de candidiasis oral, agrupadas y tratadas

aleatoriamente, se demostró mejoría negativización del exámen

microscópico en 70% de los tratados con trociscos a base del extracto

etanólico de corteza, 90% de los tratados con un enjuague a base de

tintura de corteza y 83% en el grupo tratado con clotrimazol.18

MARTINEZ M, GONZÁLEZ R, CAZARES L, MORENO M,

GARCÍA A. (1999): Se realizaron extractos con diferentes tipos de

solventes de Byrsonima crassifolia encontrando que el extracto de la

raíz con acetato de etilo fue el que presento mayor poder

antimicrobiano, teniendo efecto sobre K. pneumoniae, P. aeruginosa,

S. typhi, S. flexneri, S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae y M.

luteus.19

RIVERO F.(2009): el Departamento de Farmacia y el Departamento de

Bioquímica de la Facultad de Química de la Universidad Autónoma de


22

México en un esfuerzo conjunto con el Laboratorio de Investigación

Química y Farmacológica de Productos Naturales de la Universidad

Autónoma de Querétaro, desarrollaron el proyecto de investigación

denominado “Antibacterial Compounds Isolated From “Byrsonima

crassifolia” en cuyo resultado se logró el aislamiento de ocho

compuestos conocidos, β-amirina, betulina, ácido betulínico, ácido

oleanolico, quercetina, (-)-epicatequina, ácido gálico y β-sitosterol de

la fracción de diclorometano derivada del extracto metanólico de

Byrsonima crassifolia Todos los compuestos aislados se evaluaron para

determinar su actividad antibacteriana contra un panel de doce bacterias

y Cándida albicans. Los compuestos aislados inhibieron el crecimiento

de las bacterias a concentraciones en el rango de 64 a 1088 μg/mL. 20

MORALES J. (2011): Los extractos utilizados fueron: Acalypha

pseudoalopercuroides, Bourreria huanita, Byrsonima crassifolia,

Cassia grandis, Cornutia pyramidata, Lippia graveolens, Phlebodium

pseudoaureum, Piper aduncum, Piper jacquemontianum, Rhizophora

mangle, Smilax domingensis, Solanum nigrescens, Ternstroemia

tepezapote, Valeriana prionophylla y Wigandia urens var. Caracasana.

El ensayo se realizó basándose en la metodología descrita por Brancato

y Golding modificado por McRae adaptado a las condiciones de

crecimiento de Nocardia brasiliensis (incubación a 37ºC durante 3-5

días). La validación del método se realizó por medio de una

concentración inhibitoria mínima (CIM) del tratamiento de elección,

trimetoprim sulfametoxazole, contra los tres aislamientos clínicos de

Nocardia brasiliensis utilizando concentraciones dos puntos por debajo

y por arriba del punto de corte (2/38mg/mL) obteniendo resultados

satisfactorios que validan el presente estudio. Los extractos que

presentaron actividad significativa (p = 0.0312), en la fase de tamizaje

fueron el etanólico de corteza de C. grandis, etanólico de hoja de C.

pyramidata, metanólico de hoja de P. jacquemontianu y, metanólico de

raíz de V. prionophylla. A los extractos con actividad significativa se les


23

determinó la CIM mostrando C. grandis la mejor actividad

(0.25mg/mL). Los extractos de C. pyramidata, P. jacquemontianum y

V. prionophylla presentaron actividad de 1 mg/mL. Aunque se

esperaban mejores resultados, una CIM de 0.25 mg/mL puede ser

considerada como aceptable para futuros ensayos para validar el uso

popular de la raíz de C. grandis en afecciones subcutáneas causadas por

N. brasiliensis, L. graveolens, P. pseudoaureum, P. aduncum, R.

mangle, y W. urens var. caracasan presentaron actividad contra al

menos uno de los tres aislamientos clínicos. Esta variabilidad puede ser

debida a la procedencia de las Nocardias ya que se tratan de

aislamientos clínicos. 21

MONROY R. (2011): Evalué la actividad antimicótica in vitro de extractos

de las plantas Byrsonima crassifolia, Cassia reticulata, Gliricidia sepium,

Lippia graveolens, Litsea glaucescens y Psidium guajava contra los

hongos dermatofitos Microsporum canis, Microsporum gypseum y

Tricophyton mentagrophytes; y la actividad antilevadura In Vitro contra las

levaduras Candida albicans y Malassezia pachydermatis; estos

microorganismos se obtuvieron del cepario del Laboratorio de

Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria, dichos

microorganismos fueron aislados de casos clínicos de perros provenientes

del hospital veterinario de la misma casa de estudios. En la CIM el extracto

etanólico de Byrsonima crassifolia y Gliricidia sepium presentaron

actividad contra Malassezia pachydermatis a la concentración de 500

μg/ml. El extracto etanólico de Cassia reticulata presento actividad contra

Malassezia pachydermatis a la concentración de 1000 μg/ml, siendo estos

los extractos que obtuvieron mayores valores CIM.22

PIO LEON J., DIAZ S., LOPEZ M., URIBE M., LOPEZ G.,

DELGADO F. (2013): Nanchi (Byrsonima crassifolia), arrayán

(Psidium sartorianum) y ayale (Crescentia alata) son plantas silvestres

subutilizadas de México. En este trabajo se determinó, ensayo de micro-


24

dilución en caldo, la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y

Concentración Mínima Bactericida (CMB), de los extractos de frutos

(hexánico, EH; clorofórmico, EC; y metanólico, EM) contra 21

bacterias patógenas humanas. Los EH de Arrayán y Ayale mostraron la

mayor actividad (CMI 0.25-2 mg/mL; CMB 0.5-16 mg/mL) contra

enterobacterias (Escherichia coli, Salmonella spp. y Shigella spp.). El

EM de arrayán fue el más activo contra bacterias Gram positivas,

presentando Staphylococcus aureus la mayor sensibilidad (CMI 2

mg/mL; CMB 2-4 mg/mL).23

QUIÑÓNEZ Y. (2014): Se utilizaron seis cepas de hongos dermatofitos

los cuales fueron, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis,

Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton

rubrum y Trichophyton tonsurans, un hongo filamentoso el cual fue

Aspergillus flavus y dos levaduras de la especie Cándida albicans.

Estos hongos fueron aislados de muestras clínicas provenientes de

ceparios de Micología, Candelaria e Instituto de Dermatología y

Cirugía de la Piel (INDERMA). Los resultados indicando con los

extractos activos, el extracto etanólico de Byrsonima crassifolia

(Corteza), para las dos cepas de Cándida albicans las cuales

presentaron un CIM de 0.0312 y 0.0625 mg/mL y Trichophyton

metagrophytes una CIM de 0.0625 mg/mL; y el extracto etanólico de

Smilax domingensis (Rizoma), presentó actividad inhibitoria solamente

para las dos cepas de Cándida albicans con una CIM de 0.312 y 0.0078

mg/mL. Según el diseño estadístico, se realizó la prueba de hipótesis

binomial (p=0.0312).24


25

3.2 Clasificación taxonómica:

LA CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA ES LA SIGUIENTE 25

Reino : Plantae

Subreino : Embryobionta

División : Magnoliophyta.

Clase : Magnoliopsida

Orden : Polygalales.

Familia : Malpighiaceae

Género : Byrsonima

Especie : Byrsonima crassifolia.

N. científico: Byrsonima crassifolia L.

N. común : Nanche

3.3 Sinonimia:

La sinonimia de Byrsonima crassifolia (L) H.B.K es amplia, los que más

se emplean son: Byrsonima cumingana Juss.; Byrsonima fendleri

Turkz.; Byrsonima panamensis Beurl.; Byrsonima pulcra Sesé.;

Malpighia crassifolia L.; Malpighia pulcra Sesé. 20 Byrsonima

cotinifolia Kunth, Byrsonima cubensis Juss; Byrsonima Karwinskiana;

Byrsonima lanceolada dc., Byrsonima rufescens Bertol. Byrsonima

cynerea Dec., y Byrsonima ferruginea, entre otros.25

3.4 Descripción botánica:

Árbol caducifolio de 2 a 15 metros de altura, con tapa abierta redonda

o extendida, a veces irregular; el tronco es cilíndrico con diámetro

normal de 30 a 40 cm con ramas ascendentes, la parte externa de la

corteza tiene escamas, que se desprende en fracciones rectangulares, es

color café oscuro a moreno claro; corteza interna de color crema rosado,


26

que cambia a pardo rosado, fibrosa y amarga; grosor total de la corteza

de 12 a 25 mm, y de madera, dura, rojiza, flexible, fuerte y pesada; la

albura es de color más claro (crema amarillento) con vasos grandes,

radios numerosos y estrechos; no toman un acabado lisio y natural.25

Las ramas cuando jóvenes son de color gris pardo, con cicatrices

anulares de las hojas y estipulas caídas; lenticelas escasas, pubescentes

en las hojas más jóvenes. Las hojas generalmente son alargadas,

decusadas, simples; láminas de 5 por 2 hasta 15 por 7.5 cm, de forma

elíptica, margen entero, ápice agudo o redondeado y base aguda, color

verde oscuro y casi glabras en el haz y verde amarillento grisáceos con

abundantes tricomas en el envés; peciolos pubescentes de 5 a 25 mm de

largo; las yemas miden de 3 a 7 mm agudas y cubiertas por dos estipulas

ferruginosas.25

Presenta flores en racimos terminales de hasta 12 cm de largo; cáliz con

cinco sépalos de forma oval – triangular 23, cada uno con dos

prominentes glándulas en la base. Son pubescentes; los pedicelos de 7

a 15 mm de largo. Las flores son de 1.5 cm de diámetro con cáliz de 5

mm de largo, cupular en la base, con cinco lóbulos ovados, agudos o

redondeados, pubescentes en la superficie externa, con 10 glándulas

grandes, oblongas, glabras en la base de la superficie externa. La corola

consta de cinco pétalos amarillos anaranjados, libres, alternos respecto

a los lóbulos del cáliz, de 1 cm de largo, orbiculares o reniformes, con

la parte superior cóncava, con márgenes ondulados o dentados,

unguiculados y glabro.26

El limbo circular, cóncavo, con la base unguiculada. Gineceo con

ovario súpero, formado por tres carpelos, lóbulos uniovulares, ovoides

y glabros. Presenta tres estilos de 3 a 4 mm. El androceo consta de 10

estambres de 5 mm de largo, filamentos amarillos, pilosos en la parte


27

inferior. Anteras pardas, alargadas, basifijas con filamentos glabros,

insertados en un torus hirsuto.25

Los frutos presentan infrutescencias péndulas de 10 a 15 cm de largo;

son drupas globosas de 1.2 a 2 cm de diámetro. El exocarpio es delgado,

de color amarillo, verde o rojizo cuando el fruto está maduro; el

mesocarpio (la parte comestible) es de consistencia pastosa, de color

amarillos y de unos 5 mm de espesor; el endocarpio es redondeado u

oval, rígido y reticulado.26

La semilla se encuentra encerrada en el endocarpio que es duro y

leñoso; de forma ovoide o subglobosa arrugada, gruesa o ligeramente

comprimida, de 4 a 4.5 mm de diámetro; la testa es de color café claro,

lisa, lustrosa, membranosa, muy delgada. El embrión es curvo,

enrollado, color amarillo verdoso y ocupa toda la cavidad de la semilla.

Las semillas contienen dos cotiledones grandes, largos, planos,

carnosos, frecuentemente desiguales, enrollados a manera de espiral; la

radícula es corta, superior, oblonga, endospermo nuclear escaso o

ausente.26

3.5 DISTRIBUCIÓN Y PRODUCCIÓN:

El género Byrsonima, se distribuye desde México hasta el Norte de

Sudamérica debido a la tolerancia de los arboles a un amplio rango de

condiciones ambientales.26 La especie se distribuye en altitudes

comprendidas entre los cero y 1600 metros, pero preferentemente de los

ceros a los 500 metros.26

3.6 USOS DEL INDANO:

Se consume como fruta fresa, en bebidas refrescantes, bebidas

alcohólicas embotelladas, helados, paletas y pasteles.27


28

El fruto es nutritivo y complementa la dieta de la población local, por

su alto contenido de vitamina A y C (más de 369 g/ 100 g y 650 mg.g-

1, respectivamente).28

En medicina tradicional es importante su uso; la infusión de hojas y

corteza funciona como eficaz anti diarreico, antipirético, astringente,

antiinflamatorio y expectorante; es un excelente antídoto para

mordedura de víbora, corrige la dismenorrea, ayuda a expulsar la

placenta, atenúa las contracciones durante el parto y es eficaz en casos

de colitis aguda 29, además es útil en las afecciones renales y en la

diabetes.30

El cocimiento de corteza y flores se usa por vía oral para tratar

afecciones respiratorias (amigdalitis, bronquitis, fiebre, tos), digestivas

(cólicos, diarrea, disentería, estreñimiento, indigestión), dolor de

muelas, hemorragias, parásitos, y favorece el parto y la expulsión de la

placenta.31

El fruto se usa para tratar fiebre y las semillas para disentería. Por vía

tópica se usa para tratar afecciones dermatomucosas (estomatitis,

leucorrea, piodermia, tinea, ulcera, vaginitis), tumores.32

3.7 Composición química:

La corteza contiene taninos (20-30%), ácido oxálico (2.7%),

glucósidos, flavonoides, saponinas, sesquiterpenlactonas y triterpenos

(β-amirina). 33

El tamizaje fitoquímico de hojas indica la presencia de saponinas,

esteroles insaturados, cardenòlidos, bufadienólicos, flavonoides,

leucoantocianinas, taninos, polifenoles y triterpenoides (birsonimol);


29

contiene terpenos (betulinaldehido, betulina, ácido betulínico, lupeol,

ácido oleanólico, ursenaldehido), esteroles (β sisterol y su glucósido).33

Las hojas contienen 6% de grasa, β-sisterol, ácido maslínico y elágico,

flavonoides (catequina, epicatequina, guayaverina, hiperina,

quercetina, y galoilgalactosido), ésteres aromáticos (metil galato),

amino ácidos (alanina, ácido aspártico, prolina, valina, ácido pipecolico

y 5-hidroxipipecólico) y sulfonoglicolipido. La raíz contiene

flavonoides, glucósidos cardiotónicos, sesquiterpenlactonas, taninos y

triterpenos.33

3.8 Farmacología:

Estudios antimicrobianos demuestran que el extracto acuoso de hojas,

corteza y raíz es activo contra Escherichia coli, Staphylococcus

aureus. La tintura de corteza es activa contra Shigella flexceri,

Salmonella typhi, Vibrio cholerae.33

La decocción de la corteza tiene actividad contra Epidermophyton

floccosum, Microsporum canis, Microsporum gipseum, Trichophyton

mentagrophytes y Trichophyton rubrum, Concentración Mínima

Inhibitoria (CMI) de 200 mg/ml .La corteza es la más activa contra

bacterias y el etanol es el mejor disolvente por bioactividad y

rendimiento (6.8%); las bacterias más sensibles son Pseudomonas

aeruriginosa, Staphylococcus aureus, Shigella flexceri y

Streptococcus pyogenes, el extracto de la planta completo no tiene

actividad insecticida. El extracto etanólico tiene buena actividad

nematicida.34


30

3.9 Metabolitos principales:

Los metabolitos principales son los taninos, especialmente en corteza.

Los responsables de la actividad farmacológica son los galatos de

proantocianidinas ß2, que en este caso se utilizan como antifúngicos,

antiinflamatorios y nematicidas. 33

Estudios recientes en España han mostrado que los galatos de

proantocianidinas ß2, encontrados en otras plantas como ruda y mirtilo,

mejoran la irrigación coronaria, aumentan la tolerancia miocárdica a la

deficiencia de oxígeno, disminuyen la resistencia vascular periférica y

mejoran la función cardiaca en general.35


31

IV. MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS

En 1998 el National Committee for Clinical Laborator y Standards

(NCCLS) publicó el Método de macrodilución para hongos

filamentosos.35 donde se describe un método provisional para la

realización de pruebas de sensibilidad antifúngica a los hongos

filamentosos formadores de conidias.36

A pesar de todo, las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos no están

tan desarrolladas como las de los antibacterianos. Los puntos de corte y

los criterios de sensibilidad y resistencia de las levaduras para los

antifúngicos fluconazol, itraconazol y 5-fluorocitosina, sólo están

determinados para las micosis orofaríngeas de enfermos con SIDA. Por

lo tanto, estos datos pueden variar en el futuro y hay que prestar

atención a las nuevas normas que vayan publicando los comités de

estandarización de ensayos In Vitro, tanto europeos (EUCAST) como

americanos (NCCLS). 36

a. Principios del método

Básicamente consisten en cuantificar la inhibición de crecimiento

producida por el antifúngico, comparada con el crecimiento del moho

en el mismo medio pero sin antifúngico (control). Teniendo en cuenta

que el medio de cultivo, pH, tampón, inoculo, tiempo y temperatura de

incubación deben ajustarse estrictamente a lo recomendado en dicho

protocolo puesto que cualquier variación en estos parámetros puede

afectar los resultados.36


32

4.1 Características de las cepas en estudio:

A. Fenotipo de la cepa Cándida albicans:

Cándida albicans es considerada un hongo patógeno oportunista en

mamíferos, entre ellos el hombre, que puede causar varias formas de

candidiasis, desde infecciones superficiales en mucosas hasta

enfermedades sistémicas que comprometen la vida. 37

predominantemente, en individuos con el sistema inmune debilitado.

Cándida albicans al igual que otros patógenos tiene la capacidad de

adherirse y formar biopelículas en aparatos implantados, especialmente

catéteres intravasculares lo que les confiere mayor resistencia a

antifúngicos.38

Cándida albicans es capaz de sobrevivir como comensal en distintas

localizaciones, y por ello está sometido a distintas presiones

medioambientales. Esta habilidad amplía el espectro de enfermedades

causadas por Cándida albicans y otras especies de Cándida, siendo su

incidencia mayor que la de otros microorganismoscomensales.37

Cándida albicans es una levadura comensal, presente en las mucosas

de los de seres humanos y los animales de sangre caliente, siendo

habitualmente aislada de la cavidad oral, 38 el tracto gastrointestinal y

urogenital, y su conversión en agente patógeno depende principalmente

de la alteración del equilibrio entre la micro biota y el sistema

inmunitario del hospedador. Es considerada por ello un patógeno

oportunista. El estado fisiológico del hospedador es el primer factor que

gobierna la etiología de las candidiasis, variaciones de este estado

pueden desencadenar que las levaduras comensales se conviertan en

patógenas, causando infecciones.40


33

B. Fenotipo de la cepa Trichophyton rubrum

Trichophytum rubrum es un hongo dermatofito moniliaceo, hialino,

con estructuras de fructificación que infecta a tejidos queratinizados

como uñas, pelo y estrato córneo de la piel. 41

Macroscópicamente, las colonias son de color blanco algodonoso y de

consistencia dura.40 La cepa granular se caracteriza por colonias planas

que carecen de micelio aéreo, y semejan polvo de azúcar. 41

El reverso de la colonia suele tener un color rosado a rojo, pero en

ocasiones puede ser amarillo a marrón, rojo a vino o violeta e, incluso,

puede carecer de pigmento. Si se realiza un examen del cultivo se

observan hifas largas, delgadas, abundantes microconidias de

piriformes a redondeadas de 3,0-5,5 x 2,0-3,5 μm, rara vez hay

macroconidias, en forma de puro o cigarrillo, de tamaño variable de

pared delgada y multiseptadas. 41


34

V. DEFINICIONES OPERACIONALES:

a. Variables:

I. Independiente:

Extracto etanólico de la corteza de Byrsonima

crassifolia, (Indano)

II. Dependiente:

Actividad Antifúngica

VI. INDICADORES:

a. Independiente (x): concentración del extracto

Concentración alta: 50 mg/mL*

Concentración media: 3.125mg/mL*

Concentración baja: 0.1953mg/mL*

35

VII. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES:

Variable Independiente

Definición

Conceptual

Definición Operacional

Indicador

Índices

Escala de

Medición

Tipo de

Variable

Extracto etanólico de la

corteza de Byrsonima

crassifolia (Indano)

Producto que se

obtendrá mediante

el método de

extracción con

etanol por

rotavapor.

Tipos de metabolitos

secundarios presentes

en el extracto obtenidos

mediante extracción en

rotavapor a una

temperatura de 70° C

durante 3 horas

Concentración

Inhibitoria

Minina del

extracto

etanólico de la

corteza de

Byrsonima

crassifolia.

(Indano)

Concentración

baja:

0.1953 mg/ml

Concentración

media:

3.125mg/ml

Concentración

alta:

50 mg/ml

Nominal

Cualitativa


36

Variable

Dependiente

Definición

Conceptual

Definición

Operacional

Indicador

Índices

Escala de

Medición

Tipo de Variable

Actividad

antifúngica

Constituida por el

cambio en la pared y

membrana celular

de los hongos

Cándida albicans y

Trichophyton

rubrum causado por

agentes químicos

externos

produciendo una

inhibición en el

crecimiento del

mismo.

Consiste en

cuantificar la

inhibición del

crecimiento micótico

producido por el

extracto etanólico en

estudio, comparada

con el crecimiento

del hongo en el

mismo medio pero

sin el extracto.

Grado de turbidez

que presentan los

medios de cultivos

inoculados con

Cándida albicans y

Trichophyton

rubrum expuesta al

extracto.

Presencia o ausencia

de turbidez en los

cultivos de las cepas

ensayadas

Nominal

Cualitativa


37

CAPITULO 2


38

VIII. METODOLOGÍA

a. Tipo de investigación

Se empleara el Diseño descriptivo, longitudinal y prospectivo:

Descriptivo: Porque el estudio se realizó en forma clara y detallando los hechos

obtenidos en la investigación.

Longitudinal: Porque permitió la recolección sistemática de las variables

involucradas en función del tiempo.

Prospectivo: Porque se desarrolla a través del tiempo.


39

IX. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN:

Se agregó 2 g del extracto etanólico total de corteza de Byrsonima

crassifolia. (Indano) en 10 ml de Dimetilsulfóxido (DMSO), para obtener

una concentración de 200 mg/ml. Posteriormente se procederá a realizar

el método de las diluciones dobles seriadas aditivas, para obtener

diferentes concentraciones del mismo. 42

I. Procedimiento experimental:

a. Recolección de la muestra vegetal:

Las muestras de corteza de Byrsonima crassifolia. (Indano) fueron

recolectadas en la Reservada Natural Allpahuayo - Mishana, Iquitos,

PERÚ.

b. Identificación de la muestra vegetal:

Parte de la muestra vegetal de corteza de Byrsonima crassifolia,

(Indano) fue estudiada en la xiloteca de la Facultad de Ingeniería

Forestal, de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP)

la materia prima restante fue transportado al laboratorio de Ingeniería de

Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la misma universidad ubicado

en la Av. Freyre N° 610 – Iquitos. La identificación taxonómica de la

especie vegetal fue otorgada por el Herbarium Amazonense de la

Universidad Nacional de la Amazonia Peruana.

c. Obtención del extracto etanólico

Para cada extracción se maceró 663.15 g de materia prima (Indano), en

1500 ml de etanol, durante 7 días. La concentración del extracto se

realizò por eliminación del disolvente a presión reducida en un rotavapor,

a una temperatura de 60ºC y a una presión de 690 mmHg.


40

ESQUEMA N° 01

Flujograma del Procedimiento Experimental de la Obtención del Extracto Etanólico del

corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)

Preparación de la extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia

Identificación Taxonómica

Recolección de Muestras

Evaluación actividad antifúngica In Vitro

Test de Macrodilución

Cándida albicans cepa ATCC 90028

Trichophyton rubrum cepa ATCC 24953

ScreeningFitoquímico

Obtención del Extracto Etanólico


41

ESQUEMA N°02

OBTENCION DEL EXTRACTO ETANOLICO

MATERIA

PRIMA

(CORTEZA)

SECADO (EN

ESTUFA A 37 °C)

MOLIENDA MACERACION

(ETANOL 96 %)

CONCENTRACION

(ROTAVAPOR A 40°C)

EXTRACTO

ETANOLICO

(POLVO)

ACTIVIDAD

ANTIFUNGICA

SCREENING

FITOQUIMICO

SELECCIÓN

(CORTEZA SIN

HONGOS NI

BACTERIAS)


42

X. TAMIZAJE FITOQUÍMICO

a. Ensayos de identificación de los metabolitos secundarios

1. Identificación de Alcaloides

Ensayo de Dragendorff.- A 2g de la muestra disolver en 1 ml. de

solución de ácido clorhídrico al 1%, en ausencia de solvente orgánico se

mezcla con una gota de reactivo, si hay opalescencia se considera (+),

turbidez definida (++), precipitado (+++) de color rojo ladrillo. Si el

extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico

concentrado y se procede de la misma forma.

2. Identificación de Triterpenos y Esteroides

Ensayo de Liebermann-Buchard.- A 2g de la muestra disolverán 1ml

de anhídrido acético y mezclar bien. Por la pared del tubo de ensayo se

dejan correr 2 o 3 gotas de ácido clorhídrico concentrado, sin agitar: Un

ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración:

Rosado a azul muy rápido

Verde intenso a visible aunque rápido

Verde oscuro a negro final de la reacción

A veces el ensayo queda en fases o desarrollo de color. Muy pocas veces

puede observarse el primer cambio. El tercer cambio ocurre

generalmente cuando el material evaluado tiene cantidades importantes

de estos compuestos.

Esta reacción se emplea también para diferenciar las estructuras

esteroidales de los Triterpenoides; las primeras producen coloración azul

o azul verdosa, mientras que en las segundas se observa rojo, rosado o

púrpura.

Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por

carotenos, xantofilas y esteroides saturados que pueden estar presentes.


43

3. Identificación de Quinonas

Ensayo de Borntrager.- La fracción disuelta en 1 ml de cloroformo se

agita con 1 ml de solución de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o

hidróxido de amonio al 5% en agua. Si la fase acuosa alcalina (superior)

se colorea de rosado o rojo, el ensayo se considera positivo (naftaquinona

y antraquinona).

Un ensayo no excluye la presencia de quinonas, ya que pueden

encontrarse en forma de glicósidos, siendo necesaria la hidrólisis previa

de los mismos para su posterior detección.

4. Identificación de Cumarinas

Ensayo de Baljet.- Permite reconocer en un extracto la presencia de

compuestos con agrupamientos lactónicos, en particular cumarinas,

aunque otros compuestos lactónicos pueden dar positivo el ensayo: como

las lactonas sesquiterpénicas, cardiotónicos, etc.

Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe

evaporarse el solvente en baño maría y disolverse en la menor cantidad

de alcohol (1 ml).En estas condiciones se adiciona 1ml de reactivo,

considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o

precipitado rojo.

5. Identificación de Saponinas

Ensayo de la Espuma.- Permite reconocer la presencia de saponinas

tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que si la alícuota se

encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita

la mezcla fuertemente durante 2 minutos. El ensayo se considera positivo

si aparece espuma de 2mm de altura en la superficie del líquido y persiste

por más de 2 minutos.


44

6. Identificación de Fenoles y Taninos

Ensayo de Cloruro Férrico.- A la fracción disuelta en 1 ml de etanol se

añade 0.5 ml de una solución de cloruro férrico al 5% en solución salina.

La aparición de un color o precipitado verde oscuro indica la presencia

de fenoles y/o taninos. En el extracto acuoso se adiciona acetato de sodio

previo al ensayo.

7. Identificación de Aminoácidos y Aminas

Ensayo de Ninhidrina.- Se toma una alícuota de extracto en alcohol. Si

el extracto se encuentra en otro solvente orgánico, éste se evapora a

sequedad. En ambos casos, se mezclan con 2 ml de solución al 0.2% de

ninhidrina en alcohol. La mezcla se calienta de 5 a 10 minutos en baño

de agua. Este ensayo se considera positivo cuando se presenta un color

azul violáceo.

8. Identificación de Flavonoides

Ensayo de Shinoda.- A 2 ml de la fracción acuosa o el residuo disuelto

en 2ml de agua, se le adiciona 1ml de ácido clorhídrico concentrado y

una lámina pequeña de magnesio metálico o zinc. Cuando la reacción

termina, se añade 1 mL de alcohol amílico y se agita. El ensayo se

considera positivo cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo,

naranja, carmelita o rojo; color intenso en todos los casos.42


45

XI. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA POR

EL MÉTODO DE MACRODILUCIÓN PARA HONGOS:

Esta técnica fue utilizada para determinar la sensibilidad antifúngica del

extracto etanólico obtenido de la corteza de Byrsonima crassifolia.

(Indano) frente a Cándida albicans y Trichophyton rubrum. 43

El método ensayado fue realizado según los procedimientos establecidos

en el Protocolo M38 - P, elaborado por la NCCLS y modificado por

Espinoza et al (2007). En el ensayo se utilizó como control negativo

dimetilsulfóxido (DMSO) y como control positivo se utilizó el

Ketoconazol y Fluconazol.43

A. Preparación de los antifúngicos: Ketoconazol y Fluconazol

El antifúngico usado y recomendado en el estudio se combinó con

DMSO, posteriormente se procedió a realizar el método de las diluciones

dobles seriadas aditivas, para obtener diferentes concentraciones, siendo

para Ketoconazol 1280ug/mL la más alta hasta y 1.25ug/mL la más baja.

Y para Fluconazol las concentraciones fueron 1600 ug/mL y la más baja

3.12 ug/mL. Posteriormente se procedió a repartir en alícuotas de 0.5 ml

en el primer tubo, y luego 0.5 ml a tubos restantes, siendo un total de 10

tubos usados. 43

B. Controles positivos y negativos:

Pueden emplearse otras sustancias adecuadas para los controles

positivos. En dichos controles deberá considerarse la utilización de

sustancias de clases químicas afines, cuando sea posible.

Extracto Control positivo Control negativo

Etanólico

Etanólico

Ketoconazol

Fluconazol

Dimetilsulfóxido (DMSO)

Dimetilsulfóxido (DMSO)


46

C. Cepas de hongos empleadas para estudio:

Se emplearon dos (02) cepas, Cándida albicans y Trichophyton rubrum,

las cuales fueron proporcionadas por el Instituto Nacional de Salud (INS-

Perú), se realizó el control de calidad de la solución madre y se

comprobaron de igual manera otras características fenotípicas de las

cepas.

D. Crecimiento y preparación de la solución madre de los hongos en

estudio:

XII. Cándida albicans:

Se dejó crecer la cepa de Cándida albicans agar glucosado de sabouraud

por 24 horas hasta obtener levaduras, para luego ser estudiadas. 44

XIII. Trichophyton Rubrum:

Se prepara a partir de un cultivo de 7 días de crecimiento a 35 °C en agar

glucosado de patata (PDA), medio que induce la formación de conidias

o esporangiosporas. 44

Para las especies del género Trichophyton Rubrum se parte de un cultivo

de 48 a 72 h a 35 °C y posteriormente a 25-28 °C hasta completar siete

días, en PDA

1. Para facilitar la recogida de conidias, introducir el asa de cultivo en

Tween 20 y pasarla por encima de las conidias; después suspender en

solución salina.

2. Dejar sedimentar las partículas durante 3-5 min, transferir el

sobrenadante a otro tubo y agitar vigorosamente durante 15 segundos.

3. Debido a que el tamaño de los conidios es distinto para cada especie,

para obtener una concentración de 1-5x106 variará con la especie.42


47

E. Preparación del inóculo

A partir de la solución madre, se tomara varias colonias y se deposita en

un tubo conteniendo 9 ml de solución salina estéril al 0.9%; de esta

suspensión ajustada a la escala 0,5 de Mc Farland 43 se diluye en medio

Caldo RPMI 1640 (concentración 0,4 a 5x104 UFC/ml).43

F. Interpretación de los resultados:

El procedimiento experimental, se realizó 3 veces, para poder

compararlos CMI, encontrados en los resultados diversos. La lectura se

realizó visualmente a las 24 horas de incubación para Cándida albicans

y 72 horas de incubación para Trichophyton Rubrum comparando la

turbidez de los tubos con la del control. 45

G. Lectura de los resultados de la concentración mínima inhibitoria (CMI):

La concentración más baja a la que se produzca el cambio de turbidez se

tomó como el valor de la CMI. El promedio de tres valores fueron

calculados y se reportaron como la CMI. (Veces que repite el

experimento)Para una correcta lectura se siguió las recomendaciones de

Wiegand I. y col. 45

Se consideró que los extractos tenían una actividad antifúngica

significativa cuando el CMI ≤ 1600 μg/mL. La actividad significativa se

clasifica así:

Débil actividad antifúngica: CMI de 500 a 1600 μg/mL

Moderada actividad antifúngica: CMI de 100 a < 500 μg/mL

Buena actividad antifúngica: CMI < 100 μg/mL

En cuanto a los controles de Fluconazol y Ketoconazol la interpretación

se realizó teniendo en cuenta la normativa del CLSI M27-A2. 45


48

XII. POBLACIÓN Y MUESTRA:

a) Población vegetal

La población vegetal en estudio estaba constituido por la especie vegetal

de Byrsonima crassifolia (Indano)

b) Muestra vegetal

Corteza de Byrsonima crassifolia (Indano)

c) Población microbiológica

La población microbiológica lo constituyen los hongos

d) Muestra microbiológica

Las muestras microbiológicas están constituidas por los hongos del

género:

Cándida albicans cepa ATCC 90028

Trichophyton rubrum cepa ATCC 28188

e) Criterios de inclusión

Sólo serán empleadas hongos jóvenes

f) Criterios de exclusión

Cepas que presentarán contaminantes u otro defecto


49

XIII. MATERIALES,EQUIPOS Y REACTIVOS:

a) Material de vidrio

Embudos GERMANY

Erlenmeyers de 250 y 500 ml GERMANY

Frasco ámbar con tapa rosca TYREX

Matraz 1000 ml GERMANY

Micro pipeta Pasteur DIFCO

Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml ANUX

Probetas de 10, 100, 250 y 1000 ml ANUX

Tubos con tapa rosca (75 x 120 mm.) GERMANY

Tubos de ensayo de 5 y 7 ml DEX

Vasos de precipitado de 5, 10, 20, 50 y 100 ml GERMANY

Bagueta GERMANY

b) Material de metal

Asa de Kolle para siembra bacteriológica STAN

Cuchillo mediano STINLES

Escobillas lava tubos DEX

Espátulas medianas STINLES

Gradilla metálica MERCK

Pinza estéril DIFCO

c) Otros materiales

Algodón INKAFARMA

Detergente ARIEL PODER LIMON

Guantes quirúrgicos INKAFARMA

Hisopos para medios de cultivos NENITOS

Mascarillas QUALITY

Papel de despacho WHON

Papel secante ELITE

Papel tissue ELITE

Plumón marcador FABER CASTELL


50

d) Equipos

Autoclave AUTESTER

Balanza analítica SARTORIUS

Baño termostático SELECTA PRECISTERM

Cámara de flujo laminar POLIANRE CLASS II

Cámara fotográfica profesional SONY

Centrifuga CHRIST

Estufa SELECTA

Potenciómetro - pH meter CORNING PR 15

Refrigeradora FRIOLUX

Rotavapor BÜCHI

e) Reactivos:

Q.P. Ketoconazol AVANTOR

Q.P. Fluconazol AVANTOR

Ácido Sulfúrico 0.2M AVANTOR

Agua destilada MEDIFARMA

Carbonato de sodio ALDRICH

Dimetilsulfóxido (DMSO) AVANTOR

Etanol 96º INKAFARMA

f) Medios de cultivo

Agar Glucosado de Sabouraud OXOID

Agar Papa Dextrosa MERCK

Caldo RPMI 1640 DIFCO

g) Material de bioseguridad

Mandiles MEINZ

Guantes quirúrgicos descartables Nº7 ½ QUALITY

Lentes de protección LENZ


51

XIV. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA:

El área de microbiología donde se realizan los ensayos experimentales,

constituye un medio ambiente de trabajo especial que puede presentar

riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en el

laboratorio o cerca de él. Por ello se contará con estrictas medidas de

bioseguridad.46

Normas generales

La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de

manipulación a la que es sometido. Por ello es básico:

1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el

laboratorio.

2. Conocer la metodología de trabajo de cada sección del laboratorio.

3. Conocer el equipamiento del laboratorio.

4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia

Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la

inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la

percutánea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son

posibles.

Medidas a aplicar

• El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.

• El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las

normas de seguridad.

• Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo

biológico y su nivel de contención.

• Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.

• Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de

salpicaduras y/o aerosoles.46


52

XV. CUESTIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN

El experimento se realizó siguiendo los principios de las 3 R (Reducción,

Refinamiento, Reemplazo), en la cual se pudo Reducir a cero el número

de animales; se refinaron las pruebas experimentales por un método

alternativo de mayor sensibilidad (permite ensayar mayor concentración

de muestra, hasta 75% V/V) y se reemplazaron por un método

alternativo In Vitro.47


53

CAPITULO 3


54

XVI. RESULTADOS:

A. Rendimiento de la droga en estudio:

Se obtuvo de la siguiente manera

𝑥 =R x 100%

w

R= Peso de muestra inicial – peso del extracto concentrado

W= Peso seco (después de haberlo puesto en estufa)

𝑥 =(1200g − 500g) x 100%

1050g

𝑥 = 66.6 %

Equivalente a 799.2 gramos de muestra.

B. Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia “Indano”

Cuadro N°01

Byrsonima crassifolia" INDANO"

PRUEBAS PARA RESULTADOS

Alcaloides -

Saponinas -

Esteroides -

Triterpenos -

Taninos +++

Fenoles -

Flavonoides +++

Quinonas -

Lactonas +++

Aminas y Aminoácidos -

Cumarinas fijas -

Azúcares Reductores +++

Leyenda: (-) Ensayo Negativo; (+) Ensayo positivo, Contenido: (+++)

Abundante; (++) mediano; (+) poco


55

Se encontraron los siguientes metabolitos secundarios en el extracto

etanolico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” taninos,

flavonoides, lactonas y azucares reductores.

C. Descripción de la actividad mostrada por el extracto etanólico de la

corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” en relación al tiempo contra

el hongo en estudio “Cándida albicans”

Cuadro N°03

Grafico N°01

Grafico N°02

1 REPETICION

2 REPETICION

3 REPETICION

0

20

40

ENCONTRADO

HORAS N° DE TUBO CIM

RESULTADO DE CIM: Candida albicans

1 REPETICION 2 REPETICION 3 REPETICION

N° VECES

REALIZADAS

HORAS N° DE

TUBO

CIM

ENCONTRADO

1 REPETICION 24 06 1.5625 mg/mL




56

Se compararon los CMI encontrados en 3 repeticiones realizadas al mismo

tiempo, al hongo Cándida albicans, teniendo como resultado 1.5625 mg/

mL

D. Descripción de la actividad mostrada por el extracto etanólico de la

corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” en relación al tiempo con el

hongo en estudio “Trichophyton Rubrum”

Cuadro N°04

N° VECES

REALIZADAS

HORAS N° DE

TUBO

CIM

ENCONTRADO




Grafico N°03

Se compararon los CMI encontrados en 3 repeticiones realizadas al mismo

tiempo, al hongo Trichophyton Rubrum, teniendo como resultado 1.56

mg/ mL


57

Cuadro N°05

HONGO N(VECES) MEDIA

Cándida albicans 3 1,5625 mg/ml

Trychophyton rubrum 3 0.39063mg/ml

Resumen de los CMI encontrados a los hongos en estudio en el mismo

tiempos y 3 repeticiones.

Grafico N°04

CONCENTRACIONES mg/Ml

Trichophyton rubrum

0

10

20

30

40

50

1 2 3 4 5 6 7 8 9

CIM

CONCENTRACIONES mg/Ml Candida albicans Trichophyton rubrum


58

XVII. DISCUSION:

Los resultados del tamizaje fitoquímico de la corteza de Byrsonima

crassifolia “Indano”, se realizó en el laboratorio de Fitoquimica de la

Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias, siguiendo el

procedimiento de acuerdo a los protocolos estandarizados del área de

fitoquímica del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales

Antiparasitarios - LIPNAA de la UNAP los resultados obtenidos fueron

los siguientes: taninos, flavonoides, lactonas y azúcares reductores.

Los resultados aportados por muchos autores, han atribuido la actividad

antifúngica a los flavonoides identificados en varias especies vegetales,

de las cuales se afirmó que poseen actividad antifúngica y actividad

antibacteriana.

Para el control positivo se usó Ketoconazol y Fluconazol, que son

antifungicos de primera línea según las especies de hongos en estudio,

además son antifungicos más usados para diferentes pruebas de

sensibilidad, presentando para Cándida albicans un CIM de 2.5 µg/mL

encontrado en el tubo n° 10 y para Trychophyton rubrum un CIM de 3.12

µg/mL encontrado en el tubo n° 10 respectivamente dentro de este estudio.

El rendimiento del extracto de la corteza de Byrsonima crassifolia

“Indano” (aproximadamente 66.6 %), para obtener el máximo posible de

extracto bruto.

En el estudio del extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia

“Indano”, se demostró que presenta actividad antifúngica contra hongos

levaduriformes (Cándida albicans) a una concentración de 1,5625

mg/mL, al igual que CACERES A. (1996) con la misma especie de planta,

presentó actividad antifúngica contra Cándida albicans realizadas en

personas, distribuidas en 3 grupos, teniendo como resultado 90% de

efectividad, al igual que RIVERO F. (2009) aislando 8 compuestos de

Byrsonima crassifolia encontró muy buena actividad antifúngica del

extracto etanólico contra Cándida albicans. MONROY R. (2011), evaluó


59

una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, encontrando

un CIM de 500 ug/mL Cándida albicans, con el extracto etanólico de

Byrsonima crassifolia. QUIÑONEZ Y. (2014) que con la misma especie

de planta, presentó actividad antifúngica contra dos especies de Cándida

albicans, aisladas de muestras clínicas provenientes del Instituto de

Dermatología y Cirugía de Piel (INDERMA), encontrado un CIM 0.312

mg/mL y 0.0078mg/mL

La corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” macerado en etanol

mostraron buena actividad antifúngica, frente al hongo dermatofito

Trychophyton rubrum, 0.39063 mg/mL, en el caso de MONROY R. (2011)

evaluó una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, donde

se obtuvo un extracto etanólico de Byrsonima crassifolia y de Malassezia

pachydermatis encontrando un CIM de 500 ug/mL respectivamente,

QUIÑONEZ Y. (2014) que con la misma especie de planta, presentó

actividad antifúngica contra Trichophyton metagrophytes con un CIM

encontrado de 0.0625 mg/mL, aisladas de muestras clínicas provenientes

del Instituto de Dermatología y Cirugía de Piel (INDERMA).

En el presente estudio se mostró que el extracto etanólico de la corteza de

Byrsonima crassifolia “Indano” presentaron efecto antifúngico,

inhibiendo el crecimiento in vitro de los hongos Cándida albicans y

Trychophyton rubrum por el método de macrodilución, estos resultados se

acercan a los encontrados, RIVERO F. (2009) aislando 8 compuestos de

Byrsonima crassifolia encontró muy buena actividad antifúngica del

extracto etanólico contra Cándida albicans. MONROY R. (2011), evaluó

una actividad antimicótica In Vitro de 6 extractos de plantas, encontrando

un CIM de 500 ug/mL Cándida albicans, con el extracto etanólico de

Byrsonima crassifolia, también evaluó una actividad antimicótica In Vitro

de 6 extractos de plantas, encontrando un CIM de 500 ug/mL Malassezia

pachydermatis, con el extracto etanólico de Byrsonima crassifolia,

QUIÑONEZ Y. (2014) que con la misma especie de planta, presentó

actividad antifúngica contra dos especies de Cándida albicans, encontrado


60

un CIM 0.312 mg/mL y 0.0078mg/mL, también demostró actividad

antifúngica contra Trichophyton metagrophytes con un CIM encontrado

de 0.0625 mg/mL, aisladas de muestras clínicas provenientes del Instituto

de Dermatología y Cirugia de Piel (INDERMA).

Teniendo en cuenta todos esto resultados podemos afirmar que el extracto

etanólico de la corteza Byrsonima crassifolia presenta metabolitos

secundarios como lactonas, flavonoides, taninos y azucares reductores,

los flavonoides pueden ser responsables de la actividad antifúngica In

Vitro.


61

XVIII. CONCLUSIONES:

o El análisis fitoquímico del extracto etanólico de la corteza de Byrsonima

crassifolia. “Indano”, presentó los siguientes metabolitos secundarios:

taninos, alcaloides, lactonas y azucares reductores.

o La concentración inhibitoria mínima de la Ketoconazol fue de 2.5µg/mL

tanto para Cándida albicans y Fluconazol fue de 3.12µg/mL


o El extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia. “Indano”,

presentó actividad antifúngica In Vitro sobre Cándida albicans y


o Existen diferencias significativas entre los promedios del crecimiento de

los hongos Cándida albicans y Trichophyton rubrum con relación al

extracto etanólico de la corteza Byrsonima crassifolia. “Indano”; esto en

comparación con el control positivo de cada hongo evaluado.


62

XIX. RECOMENDACIONES:

Se debería desarrollar el ensayo antifúngico con los extractos macerados

en diferentes solventes

Se recomienda realizar diseños de ensayos antifúngico con diferentes

controles positivos y cepas de hongos a esta especie vegetal con el objetivo

de profundizar su estudio.

Desarrollar otros ensayos como disco difusión, micro dilución, E – test,

para corroborar la sensibilidad antifúngica de esta especie y así validar los

resultados obtenidos en este estudio.

Las pruebas de sensibilidad antifúngica son influenciadas por un gran

número de factores como el tamaño del inóculo, temperatura, composición

del medio y tiempo de incubación, por ello se debe controlar

adecuadamente durante el desarrollo de la evaluación de sensibilidad

antifúngica, para evitar la contaminación de otros hongos ambientales que

puedan interferir en el ensayo.

Realizar pruebas para identificación de flavonoides, buscando que

flavonoide le da la propiedad antifúngica al extracto estudiado


63

XX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

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69

XXI. ANEXOS:

ANEXO Nº 01

IMAGEN SATELITAL DE LA UBICACIÓN GEOGRÁFICA DE LA RESERVA

NATURAL ALLPAHUAYO – MISHANA

IMAGEN Nº 01: ubicación geográfica deZona Reservada Allpahuayo - Mishana


70

ANEXO Nº 02

DATOS DE PASAPORTE DE COLECCIÓN DE ESPECIES DE LAS PLANTAS MEDICINALES EN ESTUDIO

Nº de Ficha: ……………….

FICHA DE CAMPO

DATOS GENERALES:

Lugar de colección:……………..…..Distrito:……………..…….Provincia:…………...….… Fecha:………………………………..Tipo de Bosque:……………………………………….. Coordenadas UTM: (X)…………………..………… (Y)…………………………………..….. Tipo de Suelo:……………………………..Otras características:………………………….... Nombre del Colector:……………………………………………..Nº Colección:……………..

TAXONOMÍA:

Familia Vegetal:………………..……………Nombre Científico:………………….…………. Nombre Vulgar:…………………………………………………………………………………..

CARACTERÍSTICAS VEGETALES:

Hábitat:…………………………..Estadio Productivo………………………………….…….. Posición de Hojas:……………….Presencia de Órganos Accesorios en Hojas:…………. Forma del Tallo:………………….Órganos Accesorios en Tallo:…………………………… Características de la Corteza:………….…Látex:………….Color de Látex:………….….... Tipo de Inflorescencia:………….Posición de Inflorescencia:………….............................. Tipo de Flor por Sexo:.................Nº de Pétalos:................Unión de Sépalos:…….…….. N de Estambres:..........................Posición de Estambres:……......................................... Posición de Ovarios:…………....................Nº de Carpelos:…………………….…..……… Tipo de Fruto:…………………….Consistencia:…………..…..Dehiscencia:…….……..….

DATOS ETNOFARMACOLÓGICOS:

Uso Medicinal 1:………………………….…Parte Usada:…………………….................. Cantidad Usada .:…………………………… Forma de Preparación:…………................. Uso Medicinal 2:………………………….…Parte Usada:…………………….................. Cantidad Usada .:…………………………… Forma de Preparación:…………................. Uso Medicinal 3:…………………………… Parte Usada:……………………................... Cantidad Usada .:…………………………… Forma de Preparación:………….................

COLECTA DE MATERIAL BIOLÓGICO:

Peso:……………………………………………………………………………………... Parte Colectada:………………………………………………………………………... Observaciones:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Ficha N°01


71

ANEXO Nº 03

MUESTRA BOTÁNICA

FOTO Nº 1: Ramas terminales y hojas de Indano


72

ANEXO Nº 04

DESCRIPCIÓN DEL FENOTIPO DELAS CEPAS ESTUDIADAS

IMAGEN Nº 02: Imagen de colonias pertenecientes a Cándida albicans

IMAGEN Nº 03: Imagen de colonias pertenecientes a Trichophyton rubrum


73

ANEXO N° 05

SECADO Y MOLIENDA DE LA MUESTRA VEGETAL

FOTO Nº 02: Corteza de secado y listo para moler en el laboratorio de Ingeniería de

Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Facultad de Ingeniería en Industrias

Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP)


74

ANEXO N° 06

OBTENCIÓN DE LA EXTRACTO ETANÓLICO

FOTO Nº 03: Obtención del extracto etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia

“Indano” realizados en el laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta

Piloto de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional

de la Amazonia Peruana (UNAP)


75

ANEXO Nº 07

TAMIZAJE FITOQUIMICO

FOTO Nº 04: Resultados del tamizaje fitoquímico del extracto etanólico del extracto

etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano”, realizados en el Laboratorio

de Fitoquimica de la Facultad de Ingeniería Alimentarias (F.I.A.) de la Universidad

Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP)


76

ANEXO N° 08

CERTIFICACION INS – HONGOS

FOTO Nº 05: Cepas certificadas de hongos proporcionados por el Instituto Nacional de

Salud (INS) – Perú.


77

ANEXO N°09

INCUBACION DE HONGOS

FOTO 06: Se incubaron a 37 °C

PERIODO DE CRECIMIENTO DE LOS HONGOS

FOTO 07: Por 2 días para Cándida albicans

FOTO 08: A los 14 días de crecimiento de Trichophyton rubrum

08

07


78

ANEXO N°10

PREPARACION DE ANTIFUNGICOS

(Ketoconazol y Fluconazol)

FOTO N°09: Preparación de controles positivos

FOTO N°10: Disolución de muestra

FOTO N°11: Preparación de baterías para pruebas

FOTO N°12: Preparación de caldo RPMI 1640

FOTO N°13: Comparación con el parámetro de Mc Farland

09

10

11

12

11

13

11


79

ANEXO N°11

RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA DEL

EXTRACTO ETANOLICO DE LA CORTEZA DE Byrsonima crassifolia

“Indano”

FOTO Nº 14: Resultado de la evaluación de la actividad antifúngica del extracto

etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” frente a Cándida albicans, el

CIM encontrado es 1.5625 mg/mL en el tubo numero 06

FOTO Nº 15: Resultado de la evaluación de la actividad antifúngica del extracto

etanólico de la corteza de Byrsonima crassifolia “Indano” frente a Trichophyton

rubrum, CIM encontrado es 0.39063 mg/mL en el tubo numero 08


80

ANEXO N°12

RESULTADO DE CONTROLES POSITIVOS

FOTO Nº 16: Resultado de la evaluación de la actividad antifúngica del Ketoconazol

frente a Cándida albicans, obteniendo un CIM = 2.5 ug/mL encontrado en el tubo

numero 10

FOTO Nº 17: Resultado de la evaluación de la actividad antifúngica del Fluconazol

frente a Trichophyton rubrum, obteniendo un CIM de 3.12 ug/mL encontrado en el

tubo numero 10


81

ANEXO Nº13

METODOLOGIA DE MACRODILUCION PARA HONGOS

IMAGEN N°04: De la solución standard se pasa 0.5 ml del tubo n°02 al tubo n° 10, del

tubo n° 10, se extrae 0.5 ml y es desechado, quedando todos los tubos con 0.5 ml

IMAGEN N°05: De la suspensión de hongos, que previamente fue comparada de manera

visual con el parámetro de turbidez de Mc Farland, se extrae 0.5 ml para agregar a cada

tubo en estudio, que contiene muestra diluido en DMSO y caldo RPMI 1640, con esto

cada tubo tiene un volumen final de 1ml.


82

ANEXO N°14

Esquema de diluciones de controles positivos:

IMAGEN N°06: Ketoconazol (disoluciones en ug/ mL)

IMAGEN N°07: Fluconazol (disoluciones en ug/ mL)


83

ANEXO Nº15

Ficha N°02

PREPARACIÓN DEL ESTÁNDAR (0,5 MC. FARLAND) PARA EL INÓCULO

1. Preparación del estándar de turbidez.

a. Agregar 0,5 ml de una solución de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al

1,175% P/V) a 99,5 mL de una solución de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1%

V/V) en constante movimiento para mantener la suspensión.

b. Verificar la densidad correcta del estándar usando un fotocolorímetro

o espectrofotómetro, cuya absorbancia a 625 nm es 0,08 a 0,10 para el

estándar 0,5 de Mc. Farland..

c. Ajustar bien las tapas o tapones y conservarlos en la oscuridad a

temperatura ambiente y anotar la fecha de preparación.

d. Verificar mensualmente la densidad de los estándares de sulfato de

bario, y reemplazarlo cuando sea necesario.41

Se extrae las colonias de los hongos en estudio, hasta llegar a la turbidez de Mc Farland


84

ANEXO N° 16

ESTERILIZACION DE MATERIALES

FOTO N°18 y 19: Esterilizando materiales de vidrio (tubos y placas)

FOTO N°20 y 21: Esterilizando caldo y agar

ANEXO N° 17

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS

FOTO N°22: Agar Glucosado de Sabouraud

FOTO N°23: Caldo RPMI1640

18 19

20 21

22 23

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA - core.ac.uk · Byrsonima crassifolia (Indano) evidenció la...

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