Facultad de Medicina - Centro Nacional de Trasplantes | … · 2012-09-17 · Se compone de...

Facultad de Medicina

DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO

Centro Nacional de Trasplantes

DIRECCIÓN DE PLANEACIÓN, ENSEÑANZA Y COORDINACIÓN NACIONAL

“Estandarización de un método de análisis de viabilidad célular para aloinjertos humanos de piel

preservados con fines de trasplante”

T E S I S

De Diplomado para la Formación de Coordinadores Hospitalarios de Donación de Órganos y Tejidos con Fines de

Trasplante. Edición XVII.

Que presenta la Bióloga

R e y n a A r a c e l i B a r r e r a L ó p e z

México D.F. 2012

Universidad Nacional Autónoma de México

“Estandarización de un método de análisis de viabilidad célular para aloinjertos humanos de piel preservados con fines de trasplante”

2 Araceli Barrera-L

Director de Tesis

D. en C. Francisco Martínez Flores

Jefe de División del Banco de Piel y Tejidos

Instituto Nacional de Rehabilitacion.

Secretaría de Salud.

Profesor Titular de Farmacología

Facultad de Medicina.

Universidad Nacional Autónoma de México.

Pofesor asociado del Diplomado para la Formación de Coordinadores

Hospitalarios de Donación de Órganos y Tejidos con Fines de Trasplante

Centro Nacional de Trasplante.



3 Araceli Barrera-L

Esta tesis se desarrollo en:

Banco de Piel y Tejidos

Dirección Quirúrgica.

Instituto Nacional de Rehabilitación.


Programa de Criobiótica y Bioterapéutica Molecular

Banco de Piel y Tejidos.

Dirección Quirúrgica.




4 Araceli Barrera-L

Instituciones que financiarón este proyecto de investigación:

Esta tesis deriva de los proyectos cientifícos financiados por el Instituto de Ciencia y Tecnología del Distrito Federal, el Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología, y el Instituto Nacional de Rehabilitación a través de los proyectos:

*ICYTDF-PIFUT-08169

**CONACYT-FOSISS-2011-1-161624

http://www.bing.com/images/search?q=imeges++concayt&view=detail&id=20DD13F2829519DA1C2561DBF15435476B461AD6&first=0

http://www.bing.com/images/search?q=imagen+icytdf&view=detail&id=3BFB59DFE9690B2313BFFE32FDF90C45681D80CB&first=0&FORM=IDFRIR


5 Araceli Barrera-L

Soporte Académico

D. en C. Hilda Villegas Castrejón

Departamento de Morfología Celular y Molecular.


Dr. Juan Antonio Madinaveitia Villanueva.

Director quirugico.


C. D.C. María Simona Ustoa



Biol. Christian Lomelí Rodríguez

Técnico Asistente de Procuración.



Biol. Bruno Escobedo Guevara

Técnico Asistente de Procuración.



QBP. Adrian Vizcaíno Dorado

Técnico Asistente de Control de Calidad.



Lic. Karina Guzmán Martínez




6 Araceli Barrera-L

Agradecimientos

Dr. Arturo Dib Kuri

Centro Nacional de Trasplantes.


Dra. Erika Rivera Durón

Coordinadora de Donación.

Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía “Dr. Manuel Velazco

Suárez”


Dr. Omar Sánchez Ramírez

Dirección de Planeación y Enseñanza.



Biol. Veronica Matuk Zarañaga



Lic. Rosario Araujo Flores



M. en E. Hugo Sandoval Zamora




7 Araceli Barrera-L

“La ciencia es una actividad humana creativa cuyo objetivo es la comprensión

de la naturaleza y cuyo producto es el conocimiento”

Dr. Ruy Pérez Tamayo


8 Araceli Barrera-L

I. ABREVIACIONES

INR : Instituto Nacional de Rehabilitación.

BPyT : Banco de Piel y Tejidos.

CENATRA : Centro Nacional de Trasplante.

ADN : Ácido Desoxirribonucleico.

UV : Ultravioleta.

FDA : Diacetato de fluoresceína.

DMEM : Medio MEM modificado de Dulbeco.

SFB : Suero Fetal Bovino.

MLC : Microscopía Laser Confocal.

PBS : Buffer Salino de Fosfatos.

LASER : del Anglo (Light Amplified by Stimulation Emission Radiation).

HeL : Laser de Helio.

NeL : Laser de Neon.

CO2 : Bioxido de Carbono.

AU : Unidad de apertura para Microscopia Confocal.

nm : nanómetro.


9 Araceli Barrera-L

íNDICE

I ABREVIACIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

II RESUMEN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

III INTRODUCCIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

IV HIPÓTESIS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

V JUSTIFICACIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

VI OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

VII MATERIAL Y MÉTODO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

VIII RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

IX DISCUSIÓN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

X CONCLUSIÓN Y PERSPECTIVAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

XI BIBLIOGRAFÍA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41


10 Araceli Barrera-L

II. RESUMEN

El Banco de Piel y Tejidos del Instituto Nacional de Rehabilitación, emplea un

modelo de procuración, recuperación y almacenamiento de piel para mantener en

condiciones óptimas la estabilidad fisiologíca, histológica y molecular del tejido a

bajas temperaturas. Por ello, el actual reto en la procuración de tejidos es de crear

sistemas que conserven viables los órganos y tejidos, que sean obtenidos de

donaciones altruistas, garantizando la seguridad y disponibilidad de estos.

El objetivo de esta tesis es estandarizar un método de análisis de viabilidad celular

para aloinjertos de piel humana criopreservada después de 24 meses. Para ello se

empleo un ensayo de hidrólisis de un compuesto soluble y empleando un ensayo

que cuantifica la fluorescencia de un compuesto que funciona como sustrato de

una enzima y permite identificar las células con actividad enzimática después de la

preservación, mediante la técnica de Microscopia Confocal Laser (MLC).

Los resultados obtenidos fuerón favorables, ya que a 24 meses de su preservación,

los aloinjertos de piel humana presentan un alto porcentaje de células viables,

aportando evidencia científica de la eficiencia del método de criopreservación,

empleado por el Banco de Piel y Tejidos. Concluyendo que la recuperación,

procesamiento y almacenamiento de la piel, en condiciones que garanticen su

disponibilidad, es clave para una viabilidad exitosa.



III. INTRODUCCIÓN

Anatomía y fisiología de la piel.

La piel es el órgano externo que se interpone entre el organismo y el medio

ambiente, lo que hace, que sea de vital importancia y de estructura compleja. Es el

órgano más grande del organismo y realiza diversas funciones esenciales para

asegurar el mantenimiento de la integridad y homeostasis del organismo.1 La piel

tiene la función de:

Barrera. Protege contra la agresión de agentes externos, como

microorganismos ambientales; agentes físicos y químicos. Controla la

pérdida de agua y de electrolitos.

Sensibilidad. Contiene receptores que detecta sensaciones como el calor,

frio, dolor, etc.

Regulación de la temperatura. Cumple un papel importante en el

mantenimiento de la temperatura corporal gracias a la acción de las

glándulas sudoríparas y de los capilares sanguíneos.

Metabolismo de moléculas. Síntesis de Vitamina D.

Función inmunológica. Vigilancia e inicio de la respuesta inmunológica,

por medio de las células de Langerhans.

La piel es el órgano más grande del cuerpo humano, tiene una superficie

aproximada de 2 m2 y su peso, representa el 16% del peso total de un adulto.2



La piel es diferente en cada individuo, su grosor promedio es de 2 mm en los

primeros 10 años de vida, y de los 35 a 40 años empieza a mostrar adelgazamiento

progresivo, menos elasticidad y pérdida de glándulas sebáceas en áreas como el

párpado, muslo medial y extremidad superior, la piel tiende a ser delgada, a

diferencia de la piel de la espalda, palmas de la mano, glúteos y planta de los pies

que es de mayor grosor.

Histología de la piel.

Histológicamente, la piel está constituida por tres capas que son: epidermis

(epitelio de cobertura), dermis (vascularizada, rica en anexos cutáneos y

estructuras nerviosas) e hipodermis o tejido celular subcutáneo (Fig. 1).3,4 Se

mencionara solo la epidermis y dermis, porque un aloinjerto de piel de grosor medio

esta constituido solo de epidermis y dermis superficial.

EPIDERMIS

DERMIS

HIPODERMIS

Figura. 1. Capas histológicas de un corte transversal de piel.



La epidermis.

La epidermis es la capa más externa de la piel y es la primera línea de defensa y

protección contra microorganismos, además interviene en la síntesis de proteinas,

así como en el inicio de los mecanismos inmunes. La epidermis suele tener

alrededor de 0.4 mm de espesor y aumenta a 3-4.5 mm en zonas como, planta de

los pies y palmas de las manos.

La epidermis consta de cuatro estratos celulares: estrato basal, espinoso, granular

y córneo, (Fig.2). Los queratinocitos son las principales células de la epidermis

(85%), el resto son células dendríticas epidermales residentes: células de

Langerhans (5-8%), melanocitos (5%) y células de Merkel (3-5%). Otras células

como linfocitos, eosinófilos y neutrófilos pueden encontrarse en la epidermis pero

no son células residentes.1-4

ESTRATO CÓRNEO

ESTRATO GRANULAR

ESTRATO ESPINOSO

ESTRATO BASAL

Figura 2. Esquema de la estratificación de la epidermis.



Estrato basal. Se caracteriza por la presencia de queratinocitos fuertemente

empaquetados en columnas celulares que estan en un estado de proliferación

activa, proporcionando un suministro continuo de células nuevas para repoblar la

epidermis. El citoesqueleto del queratinocito se compone de filamentos de actina,

filamentos intermedios de queratina y microtúbulos, que le proporcionan “fuerza

estructural”.1-3

Estrato espinoso. Se compone de queratinocitos poligonales, que sufren cambios

bioquímicos y estructurales a medida que migran hacia la superficie. Son llamadas

células espinosas porque en los cortes histológicos convencionales parece que

tienen espinas, que en realidad son desmosomas, que son puentes intercelulares

que permiten la adhesión entre células, así como la comunicación entre ellas. La

diferenciación epidérmica son los cambios estructurales y bioquímicos, este

proceso implica la formación de queratina y de la envuelta cornificada y a medida

que los queratinocitos migran hacia la superficie los filamentos son agregados en

cúmulos de queratina. Los queratinocitos de la capa basal también empiezan la

síntesis de los cuerpos lamelares. Tanto la proliferación como la diferenciación

están altamente reguladas por una compleja cadena de eventos, controlados por

factores de crecimiento, interleucinas, ácido araquidónico y sus metabolitos,

vitamina D3, calcio y retinoides. 1-3

Estrato granular. Se compone de 2 a 3 columnas de células con una forma

fusiforme y se caracterizan por la presencia de gránulos de queratohialina. Los

gránulos contienen un precursor de proteínas, la profilagrina, que cuando se

desfosforila a filagrina se incluye en la agregación de acúmulos de queratina. Los

cuerpos lamelares contienen enzimas lipídicas e hidrolíticas que son liberadas al

espacio intercelular donde son reorganizadas para formar la capa externa de la



envoltura celular cornificada y la lamela intercelular. Ambas juegan un papel

importante en la función de barrera. 1-3

Estrato córneo. Es la capa más superficial de la epidermis y esta en contacto

directo con el medio ambiente. En este estrato se encuentran las células

completamente diferenciadas. Son estructuras altamente resistente a la

degradación y su funcion es evitar la deshidratación, protegen contra los rayos UV

y costituye una barrera contra los agentes infecciosos.5-6 Experimenta cambios

estructurales, bioquímicos y están compuestas principalmente de filagrina y

queratina. Las células del estrato córneo se descaman continuamente de la

superficie de la piel por un proceso llamado descamación. En la capa externa del

estrato córneo que se pierde, los espacios intercelulares son permeables al sudor y

al sebo. El cambio de las células de la piel sana está en equilibrio con los procesos

de proliferación y diferenciación. La estructura del estrato córneo se asemeja a una

estructura de ladrillo y mortero, donde la queratina y la porción interna de la

envuelta cornificada forman los ladrillos y los lípidos forman el mortero que une los

corneocitos entre sí y proporcionan una barrera hidrofóbica.

En algunas literaturas se considera la existencia de un 5° estrato, llamado estrato

lucido, pero esté solo se ve en la piel gruesa de las palmas y planta de los pies, y

se encuentra por debajo de la capa córnea. Estas capas, son solo las distintas

formas morfologicas de los queratinocitos, es decir, que en su proceso madurativo

ascendente se van diferenciando y adquiere morfologías y funciones particulares

hasta llegar a formar la capa córnea. El tiempo de transito desde la célula basal al

corneocito y su desprendimiento final es de aproximadamente 30 días.1-3 El

desarrollo y funcionalidad de la epidermis depende del balance adecuado entre las

tasas de la proliferación y la diferenciación celular de los queratinocitos

epidermales.5



DERMIS

La dermis es el mayor componente estructural de la piel, se encuentra entre la

epidermis y el tejido subcutáneo, es altamente vascularizado, cumple funciones de

crecimiento y diferenciación en la epidermis. Proporciona una matriz para las

estructuras de soporte y las secreciones que mantienen e interaccionan con la

epidermis y sus componentes. Éstas incluyen el tejido conjuntivo, vasos

sanguíneos, linfáticos, nervios, receptores y componentes celulares.

La dermis es una estructura termorreguladora y sensorial importante, que

contribuye significativamente al almacenamiento del agua en el cuerpo. Tiene un

espesor de 0.6 mm en los párpados y hasta 3 mm en palmas y planta de los pies.1,7

Morfologíca y funcionalmente, la dermis se divide en dos compartimentos:

Dermis adventicial (papilar y perianexial): encargada de los intercambios nutritivos

y metabólicos con la epidermis.

Dermis reticular (profunda): da resistencia y dureza a la dermis.

Tejido conjuntivo de la dermis.

La matriz del tejido conjuntivo dérmico consiste principalmente de fibras de

colágeno y elástina, organizadas en un patrón análogo, principalmente haces de

colágeno rodeado de fibras elásticas. Los componentes no fibrosos consisten en

proteoglicanos, una sustancia de base y determinadas glicoproteínas.

La dermis superficial se compone de fibras delgadas de colágeno irregularmente

distribuidas, y una red de fibras de elastina. En la dermis más profunda el colágeno

es grueso y denso y las fibras tienden a ir en paralelo a la superficie cutánea; las

fibras de elastina también son gruesas pero menos numerosas.



Colágeno. Es la mayor proteína extracelular de la dermis, y forma alrededor del

80% de la matriz extracelular. Estas fibras proporcionan fuerza y elasticidad, pero

también están involucradas en la migración celular, la adhesión y la quimiotaxis.

Son secretadas por los fibroblastos cutáneos. La renovación del colágeno en la

dermis es lenta y se controla por componentes celulares dérmicos (fibroblastos y

células inflamatorias) que son capaces de responder a situaciones particulares,

como daño cutáneo. En los adultos, la mayor parte del colágeno dérmico está

formado por fibras del tipo I (87%) y III (10%); el colágeno del tipo IV, V y VII se

encuentran en la membrana basal. El colágeno de tipo V, representa

aproximadamente el 3% del colágeno dérmico, se encuentra cerca de todos los

tejidos conectivos.

Fibras elásticas. Las fibras elásticas forman una red en toda la dermis y también se

encuentran en la vaina de los folículos pilosos y en las paredes de los vasos

sanguíneos y linfáticos. La elastina es un polipéptido unido covalentemente con

una composición característica de aminoácidos, la sintetizan los fibroblastos y las

células del músculo liso.

Glicosaminoglicanos y proteoglicanos. Estas sustancias son secretadas por los

fibroblastos y forman parte de la matriz extracelular, es un gel viscoso que rodea y

sostiene los componentes de la dermis. También tiene un papel importante en

promover el crecimiento, diferenciación y migración celular.

Irrigación sanguínea y drenaje linfático.

Irrigación sanguínea. La piel tiene una irrigación sanguínea desarrollada, que

mantiene su papel en la termorregulación y en la hemodinamia; el flujo sanguíneo a



través de la piel, es mayor que el necesario para el suministro de oxígeno y

metabolitos.

Drenaje linfático. Los vasos linfáticos proveen de fluido tisular a la dermis, este

fluido se almacena en las redes capilares linfáticas y en las capas más superficiales

de la dermis.

Nervios. El patrón general de la distribución nerviosa es similar al de los vasos

sanguíneos, un plexo de nervios se encuentra de bajo de la epidermis, y

terminaciones de nervios libres penetran también en la epidermis. Las redes

nerviosas están asociadas al folículo piloso, a las glándulas sudoríparas, sebáceas

y al músculo piloerector; las terminaciones nerviosas encapsuladas se encuentran

en mecanorreceptores, como son los corpúsculos de Pacini, que se encuentran en

la dermis profunda.

Componentes celulares de la dermis.

En la dermis se encuentran células como fibroblastos, mastocitos, células

dendríticas, células de los tejidos glandulares, musculares, nerviosos y vasculares.

Estas células son capaces de realizar una amplia variedad de funciones como

interactuar con la matriz dérmica y con componentes de la epidermis y la dermis.

Fibroblastos. Son células mesenquimatosas responsables de la síntesis y la

degradación del tejido conjuntivo fibroso y no fibroso de la matriz protéica. La

adhesión de los fibroblastos a la matriz fibrosa es mediada por la fibronectina y el

colágeno. Los fibroblastos segregán varias citocinas e intervienen en la actividad

proliferativa de la epidermis.



Mastocitos. Los mastocitos se encuentran en toda la dermis y estan asociados con

el plexo vascular superficial y los anexos de la epidermis. Contienen abundantes

gránulos secretores y citoplásmicos lisosomales basófilos. Son importantes

mediadores de las reacciones de hipersensibilidad inmediatas.

Células dendríticas. Incluyen melanocitos y células dentríticas presentadoras de

antígeno que están presentes en el espacio perivascular de los vasos cutáneos

superficiales dérmicos.

Las lesiones de la piel como causa de morbilidad y discapacidad.

Al ser el órgano más expuesto, también es el que más lesiones sufre. Esto hace

que varios procesos de tratamiento y recuperación, usen algún tipo de cubierta

cutánea para acelelerar la cicatrización. En el caso de las quemaduras, el uso de

aloinjertos frescos o criopreservados de piel, han demostrado tener mejores

resultados terepéuticos y de recuperación con el empleo de aloinjertos frescos

preservados.

Metodos de preservación de aloinjertos de piel en Bancos de Tejidos.

En 1665, Boyle publicó New experiments and observations touching cold, en el que

describía el efecto del frío sobre derteminados seres vivos. En el último cuarto del

siglo XIX, los estudios de Cailletet, Pictet, Omnes y Dewar aportarón metodologías

para la licuación de gases, estableciendo un marco idóneo para la cosecución de

muy bajas temperaturas. En 1880, Roux fue capaz de cultivar tejidos de embrión de

pollo durante algunos días, utilizando solo solución salina. En 1907, Harrison

demostró que el crecimiento in vitro de tejidos animales era posible (cordón espinal

de anfibio extensión del axón). Años después, Burrows y Carrel cultivaron



explantes de tejidos animales adultos, proporcionando una base científica para el

desarrollo de líneas celulares. En 1949, Polge descubrió el efecto crioprotector del

glicerol. Pero no fue hasta 1950 que Falt y Marragonni describierón los primeros

procedimientos para el almacenamiento de piel cadavérica, mediante medios

suplementados con 10% de suero como agente preservante.8-10

A partir de ahí, se ha buscado la creación de establecimientos capaces de

almacenar tejidos (actualmente llamados Bancos de Tejidos), la investigación para

el desarrollo de protocolos, que combinen diferentes diluyentes crioprotectores,

tasas de enfriamiento y congelación.9

Actualmente hay diferentes tipos de células y tejidos que pueden ser almacenados:

tejido músculo-esquelético (hueso, tendón y cartílago), piel, válvulas cardíacas,

segmentos vasculares, glándula paratiroideas, corteza ovárica, membrana

amniótica, córnea, células precursoras hematopoyeticas (médula osea, sangre

periferica, cordon umbilical), concentrados de hematíes.8

Estos tejidos, son sometidos a estándares de control de calidad que garanticen su

estabilidad durante los tiempos conservados o mantenidos a temperaturas bajas.

En el caso de los aloinjertos recuperados y preservados, la temperara y los agentes

criopreservantes, producen cambios osmóticos, de integridad de membrana y

cristales de agua, que repercuten directamente en la calidad biológica y la

disminución de células vivas en el tejido.

Es importante reiterar que el éxito del BPyT, es su modelo de recuperación de

aloinjertos de piel humana, que se fundamenta en bloquear o retrasar los

mecanismos de muerte celular inducidos por hipoxia y la depleción de nutrientes,

antes de la procuración del tejido o antes de su almacenamiento.



Además es importante contar con un medio de cultivo adecuado que garantice

mantener las características estructurales, sus propiedades biomécanicas e incluso

la presencia de sustancia bioactivas para una viabilidad y funcionalidad celular.

Hay diferentes tipos de métodos (Tabla 1) para el almacenamiento de tejidos, que

se resume en la siguiente tabla:

Método Procesos involucrados Viabilidad celular

Liofilización Deshidratación Sin células vivas

Glicerolización Desinfección isotónica

+ Glicerol

Menos del 50% de células vivas.

Factores de crecimiento presentes.

Radiación

Gamma

Desinfección isotónica

+ Radiación Gamma

Sin células vivas.

Desnaturalización parcial de

proteínas.

Preservación y

criopreservación

Desinfección isotónica

+ Antisépticos

+ Antibióticos

+Agentes criopreservantes

Más del 75% de células vivas.

Conservación de factores de

crecimiento y citocinas

proinflamatorias.

Tabla 1. Tabla comparativa de los métodos de preservación.

*Fuente Banco de piel y tejidos del INR.

Viabilidad celular

La viabilidad celular se define como la identificación de células vivas o

muertas en una muestra total. La viabilidad celular se puede identificar cualitativa o

cuantitativamente por:

1. Cambios morfológicos.

2. Cambios en la permeabilidad de la membrana.

3. Cambios en la actividad enzimática.

4. Metodos colorimétricos e inmunoensayos.



Técnicas para determinar la viabilidad célular.

Existen varias técnicas para evaluar la viabilidad celular, entre los que

destacan la evaluación de la integridad de la membrana, los ensayos funcionales,

los ensayos de viabilidad a través de biosensores de fluorescencia y estudios de

morfología celular (Tabla 2).11

Tipo de ensayo Método de evaluación

Evaluación de la integridad

de la membrana

1. Colorantes o sustancias fluorescentes.

2. Tinciones catiónicas.

3. Deteminación de liberación de moléculas.

Ensayos funcionales

(enzimáticos)

1. Medición del ATP.

2. Tasa de ADN.

3. Sintesís de proteínas.

Ensayos con pruebas de

fluorescencia

Utilización de Biosensores de fluorescencia.

Ensayos morfólogicos Basados en la observación microscópica.

Microscópia electrónica

analítica

Microanálisis por energía dispersiva de rayos X.

Determinación de la

expresión génica global

Microarrays de ADNc.

Microarrays de oligonucleótidos.

Tabla 2. Ensayos usados para el análisis de viabilidad celular.

En este trabajo nos enfocaremos en los colorantes con propiedades de

fluorescencia. Los cuales se dividen en ensayos de exclusión y de inclusión.

Entre los primeros encontramos los colorantes orgánicos, como el azul tripán,

eosina, rojo Congo y eritrosina B, así como el Ioduro de propidio o el Bromuro de

etidio.



Los ensayos de inclusión evalúan la integridad de la membrana celular, siendo los

más utilizados el Dicetato de Fluoresceína (FDA) o la calceína. Estos se

caracterizan por atravesar la membrana plasmática, se hidrolizan por las esterasas

y dan lugar a una fluorescencia dentro de la célula, siempre que ésta se encuentre

en estado funcional.12

Otra técnica para determinar la viabilidad en suspensiones celulares, es el método

del Cloruro de 2,3,5-trifenil tatrazolio (TTC) también conocido como MTT. Este

método se basa en la reducción del TTC, por la actividad mitocondrial de las

células vivas, a trifenilformazán (un compuesto rojo e insoluble en agua). Este

compuesto puede solubilizar con etanol y medir espectrofotométricamente a 530

nm.13 El MTT, es un ensayo colorimétrico cuantitativo que mide la actividad

metabólica de las células en fase de proliferación activa. Este método se basa en la

capacidad que presenta la succinato deshidrogenasa mitocondrial de las células

eucariotas vivas para convertir el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5

difeniltetrazolio (MTT) que es de color amarillo y actua de sustrato, en un producto

azul oscuro (formazano), lo cual se traduce en un incremento en los valores de

absorbancia de la muestra.14



IV. HIPÓTESIS

La implementación de un modelo de procuración, recuperación y

almacenamiento de aloinjertos de piel que provea de nutrientes esenciales al tejido,

permitirá conservar la viabilidad celular del tejido mantenido a temperatura de -

80°C durante 24 meses, y podrá ser identificada con la técnica de hidrólisis de DCF

en células vivas y cuantificado por Microscopia Lonfocal laser.

V. JUSTIFICACIÓN

En la actualidad, el uso de aloinjertos de piel humana, se ha incrementado por

grandes sectores de la sociedad mexicana, como son los Centros de Atención para

Quemados. Este interés ha dado el auge a un amplio y minucioso estudio sobre la

obtención, procuración y criopreservacion de este tejido, en condiciones que

aseguren la integridad de sus propiedades biológicas.

Así, estudios histopatológicos han demostrado que el uso de aloinjertos de piel

como cubierta temporal en pacientes quemados, presentan una acelerada

recuperación. Tomando en cuenta lo anterior y con el fin de aportar mayor

información acerca de la importancia de mantener viable el tejido, se estandarizará

un método para el análisis de viabilidad celular en aloinjertos de piel humana

almacenados por 24 meses en el BPyT.



VI. OBJETIVO GENERAL

Evaluar los resultados de viabilidad celular de aloinjertos de piel humana

procurados, recuperados y preservados durante 24 meses a una temperatura

de -80°C, en el Banco de Piel yTejidos.

OBJETIVOS PARTICULARES

a) Estandarizar y evaluar los ensayos de viabilidad celular de aloinjertos de piel

humana, procesados por el BPyT.

b) Evaluar mediante ensayos de viabilidad la presencia de células vivas en

tejido procesado por el BPyT, con un reactivo fluorescente (colorante vital),

Cell Tracker (Invitrogen Co).

c) Evaluar mediante ensayos de viabilidad la presencia de células vivas en

tejido procesado después de 24 meses, con el colorante vital, Cell Tracker

(Invitrogen Co).



VII. MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de aloinjertos de piel humana. La recuperación del tejido se realizó

acorde al modelo estandarizado por el Banco de Piel y Tejidos del INR (Figura 3) y

cumpliendo el Reglamento en materia de disposición de órganos y tejidos de

donadores cadávericos de la Ley General de Salud, y los lineamientos emitidos por

el Centro Nacional de Trasplantes (CENATRA).

Figura 3. Modelo operativo del Banco de Piel y Tejidos del INR.

PROCURACIÓN

(Donador)

PROCESAMIENTO

Recuperación de tejido

PRESERVACION

Análisis microbiológico y molecular.

LIBERACIÓN

USO QUIRÚRGICO

(Seguimiento del Receptor)



Los aloinjertos de piel humana se obtuvieron a partir de potenciales donadores,

identificados por Coordinadores de Donacion en instituciones con autorización para

la procuración de órganos y tejidos con fines de trasplante; y de conformidad con la

normatividad vigente de la Ley General de Salud, y los lineamientos de la

COFEPRIS. Para llevar a cabo este proceso se tomaron en cuenta los siguientes

criterios de inclusión y exclusión (Tabla 3).

Criterios de inclusión de donantes de aloinjertos

El donante de aloinjertos cumplió con los criterios de inclusión para donación de

órganos y tejidos, establecidos en el protocolo de rutina para la calificación de

donantes de aloinjertos de piel (Tabla 3).

CRITERIOS DE INCLUSIÓN CRITERIOS EXCLUSIÓN

Mayores de 18 años.

(Rango de 18 a 75 años)

Hiperglucemia

Septicemia.

Hombre o mujer.

Infeccion o Serologia (+) para VIH, Sífilis,

VHB o VHC; Cáncer (excepto tumores

intracraneales).

Muerte Cerebral (Donador

Multiorgánico).

Causa de muerte desconocida.

Muerte por parada

Cardiaca.

Tatuajes, perforaciones no documentados.

Tabla 3. Criterios de inclusión y exclusión para la procuración de aloinjertos de piel

humana, establecidos en el programa de donación altruista de piel.



El consentimiento informado se obtuvo de familiares de donadores multiorgánicos y

con parada cardiaca que cumplieron con los criterios de inclusión y en el caso

específico de la piel, los procesos de desinfección superficial se realizan con

soluciones de Iodo y alcoholes en diferentes concentraciones, en sala quirúrgica y

con técnica aséptica.

Viabilidad celular. El estudio de la viabilidad celular es un parámetro que evalua el

BPyT, para registrar la calidad de células vivas que presentan los aloinjertos de piel

durante y después de su almacenamiento. Segmentos de tejidos obtenidos y

procesados con el protocolo del BPyT, se usaron para descongelación a los 12

meses y nombrados como Tejidos Centinela, con el objetivo de evaluar la viabilidad

celular y las pruebas de estabilidad.

En este caso, para determinar la viabilidad de los aloinjertos de piel humana, se

usó el reactivo Cell Tracker green (derivado del Diacetato de fluoresceina FDA). El

reactivo Cell Tracker es un colorante que se adiciona directamente a la placa de

cultivo. El colorante es permeable a través de la membrana celular y una vez

dentro de la célula, la actividad enzimática permite un cambio químico

conformacional que precipita el compuesto y lo vuelve insoluble, cuando el

compuesto es detectado por un sensor que permite detectar la fluorescencia en las

células vivas.

Esto se logra por que el reactivo tiene un grupo Clorometilo o Bromometilo (los

cuales tiene una excelente retención, fuerte fluorescencia y una tinción citoplásmica

relativamente uniforme) que reaccionan con tioles en una reacción mediada por

glutatión S-tranferasa.



En la mayoria de las células, los niveles de glutatión son altos, además de que el

glutatión transferasa esta presente.

Aunque el colorante puede reaccionar primero con el glutatión, el producto no da

fluorescencia hasta que esté actue sobre las esterasas (Fig. 4). La fluorescencia se

observó en un Microscopio Confocal (Zeiss LSM 510), laser de 488 nm de

excitación.

Figura 4. Reacción con el glutatión y esterasas.

Ensayo de viabilidad celular

Un fragmento de tejido descongelado se mantuvo en medio DMEM con 10% de

SFB y antibiótico-antimicótico a concentraciones estandarizadas, durante una hora.

Fragmentos de aproximadamente 0.5 mm X 0.5 mm, se colocaron en un pozo de

35 mm de diámetro (six well plates, Costar, Madeson USA) con 2 mL de medio

Retino HIQ (Hyclone) con 10 nm de Cell Tracker por mL de medio.

El tejido se incubo por dos horas en condiciones de cultivo celular, inmediatamente

se sometieron a lavado con medio (1X) y DPBS (2X) durante 10 minutos.



La muestra se documento en un Microscopio Laser Confocal LSmeta100 de CARL

ZAISS (Germany), para una absorbancia de 480 nm y 530 nm de longitud con

Laser de He y Ne.

Los barridos se realizarón a 5 y 10 micras para la construcción tridimensional por el

software la intensidad de fluorescencia fue gratificada por el Software del equipo, la

zona sin emisión de fluorescencia fue visualizada por una emisión de color (verde)

y graficado de manera inversa.



VIII. RESULTADOS

Obtención de aloinjertos de piel.

Los aloinjertos de piel se han utilizado desde hace 3000 años, en la

India, por ejemplo, cuando los médicos trataban amputaciones de naríz empleaban

injertos de piel de la región glútea. En el siglo XVI, Tagliocozzi realizó

autotrasplantes de piel para reconstrucciones faciales.

Actualmente los centros para atención y tratamiento a quemados, son donde más

se usan aloinjertos de piel, es por ello el interes por incrementar la disponibilidad de

aloinjertos de piel, asegurando la integridad de sus propiedades biológicas.

El protocolo para la obtención de aloinjertos de piel, del Banco de Piel y Tejidos del

INR, plantea un modelo médico-cientifico en un marco normativo y de regulación

nacional e internacional, el cual asegura la sanidad y calidad biológica de los

aloinjerto de piel para futuros trasplantes (Fig. 5).

De un donante con estatura y peso promedio, se obtienen aproximadamente 2500

cm2 de piel (Fig.6); los aloinjertos que se obtuvierón consisten en epidermis y

dermis superficial con un grosor aproximado de 0.5 mm.



Fig. 5 Aloinjertos de piel en proceso de criopreservación y control de calidad.

Figura 6. Aloinjerto de Piel.



Viabilidad celular

El creciente interes por el trasplante de células y tejidos, ha sucitado el

interés por el desarrollo de modelos preservantes eficientes durante largo tiempo,

en condiciones que asegurarán la integridad de sus propiedades biológicas. Esto

asegura una aceptable viabilidad celular, así como el mantenimiento de las

caracteristicas estructurales, propiedades bioquímicas e incluso la presencia de

sustancias bioactivas. Sin embargo, es importante contar con un proceso e

insumos que garanticen la viabilidad y funcionalidad celular.15-16

Los tejidos procesados en el BPyT, con 24 meses de almacenamiento a

temperatura de 80°C bajo cero, fueron descongelados y analizados previamente,

para evaluar la viabilidad celular mediante el colorante vital. De acuerdo a los

resultados obtenidos en este proyecto, el modelo de criopreservación que

estandarizó el BPyT, mantiene las caracteristicas propias del tejido, además

asegura cierto grado de viabilidad celular. En la figura 7, se muestra la viabilidad

celular de la piel antes de ser preservada, la imagen fue observada por Microscopia

Confocal Laser: 516nm/0.7 AU 20 X. La imagen indica la incorporación del

fluoroforo dentro de las células.



Figura 7. Viabilidad celular de aloinjertos de piel antes de la preservación. Microscopía Confocal

Laser: 516 nm/0.7 AU 20X.



En la figura 8, se observa la viabilidad celular del tejido criopreservado a un año, en

el cual se logra ver la fluorescencia por Microscopia Confocal Laser: 488nm/0.7 AU

20 X.

Figura 8. Viabilidad celular de tejidos criopreservados (1 año después). MCL

Microscopia Confocal Laser: 488nm/0.7 AU 20 X.



Para demostrar la presencia de células vivas, el tejido fue disgregado por medio

enzimático y las células se mantuvieron en condiciones de cultivo. En la figura 9 se

observan células vivas en suspensión que se ailsaron de la piel; la imagen fue

observada por Microscopia Confocal Laser: 488nm/0.7 AU 20 X.

Figura 9. Células vivas aisladas de aloinjertos de piel.



IX. DISCUSIÓN

La recuperación de tejidos con fines de trasplante y sus estándares, es la tendencia

mundial establecido en los estándares internacionales (EATB, 2008).

La eficacia terapéutica de los tejidos es dependiente de la calidad biológica,

factores de crecimiento y las vías de señalización por citocinas para mejorar la

respuesta inflamatoria y con ello, la aceleración de la cicatrización ya

reepitelización.

En la experiencia del Banco de Piel y Tejidos, son importantes dos factores durante

la procuración de piel: la asepsia (para minimizar el riesgo de contaminación), y la

temperatura. Asegurando así un cierto grado de viabilidad celular y largo periodo

de caducidad. Sin embargo el uso de insumos que mejoren preserven la viabilidad

de tejidos no se ha explorado en mexico, y mucho menos en los tejidos con fines

de trasplante.

Por ello, la criopreservación es un procedimiento complejo que requiere de un

proceso controlado y el uso de insumos formulados para tal fin. Lo anterior con el

objeto de mantener el balance de pH intracelular, evitar el edema por los cambios

osmóticos, y la destrucción del tejido por cristales de agua durante el proceso de

congelación.

En el mundo existen varios métodos para evaluar estos factores y principalmente la

viabilidad celular, el ensayo propuesto, permite obtener resultados rapidos,



confiables sin la necesidad de manipular el tejido y con ello la posible

contaminación. Más aun permitirá al cirujano evaluar de manera más objetiva los

resultados del uso clínicos de los tejidos.

Adicionalmente, hemos observado que de los pacientes ( n=7) que han usado este

tipo de cubiertas, su estado hemodinamico mejora de manera dramática. (Datos no

mostrados). Esto puede ser explicado por la presencia de factores de crecimiento

locales que permiten una mayor estabilidad tisular y con ello la mejora de la

homeostasis general.

La prueba de confirmación para conocer la presencia de celulas vivas en los tejidos

analizados, fue realizado mediante la disgregación del tejido descongelado, el cual

mostro una población celular que también capto el fluoroforo.

Dado que la disgregación enzimática, tambien lesiona las células, se requiere de

estudios adicionales para determinar la participación de este daño inducido por la

disgregación con el objeto de documentar de manera precisa los resultados por

Microscopia Confocal Laser.



X. CONCLUSIONES

El protocolo de recuperación, procesamiento y almacenamiento de los

aloinjertos de piel en el Banco de Piel y Tejidos del INR, fundamenta su

almacenamiento en un proceso fisicoquímico de congelamiento (controlada en un

equipo automatizado y monitorizado las 24 horas); y en mantener la piel en un

medio con nutrientes necesarios.

Considerando que el éxito de los aloinjertos con fines terapéuticos se vincula

estrechamente con los procesos de recuperación y mantenimiento de la viabilidad

celular de los tejidos, mismos que permiten generar hoy en dia productos de alta

calidad biológica, seguridad sanitaria y de mayor valor terapéutico.

Este estudio es indudablemente una contribución para determinar de manera

cuailitativa y cuantitativa el porcentaje de viabilidad en elalmacenamiento de

Tejidos.

Los resultados preliminares de esta tesis permitirán los estudios futuros que den

certeza a las funciones proporcionadas al cierre de heridas por quemaduras, con el

uso de las cubiertas cutáneas biológicas a partir de aloinjeros de piel cadáverica.

Además, estudios complementarios de la histología (Figura 10), asi como viabilidad

celular, permitirán conocer el efecto de los aloinjerto de piel humana.

El estudio sistematizado usando, el modelo de centinelas para evaluar la

estabilidad de los tejidos procesados con fines de trasplante, constituye una



innovación en las actividades de trasplante en Méexico, dentro del Instituto

Nacional de Rehabilitacion es potencialmente aplicable a otros tejidos.

Figura. 10 Histología de la Piel por la técnica de Masson.



XI. REFERENCIAS BIBILIOGRÁFICAS.

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