FECUNDACIN IN VITRO EN CERDOS

FFA

CONTENIDO

I. ANTECEDENTES

II. IMPORTANCIA

III. PREREQUISITOS PARA LA FECUNDACIN IN VITRO

IV. OVOCITOSIV.I OBTENCIN DE OVOCITOSIV.II TRANSPORTE DE OVARIOSIV.III EXTRACIN DE OVOCITOSIV.IV SELECCIN DE OVOCITOSIV.V MADURACIN DE OVOCITOSIV.VI CONDICIONES DE CULTIVOIV.VII EVALUACIN DE RESULTADOS DE MADURACIN

V. ESPERMATOZOIDESV.I ORIGEN DE LOS ESPERMATOZOIDESV.II CONCENTRACIN DE LOS ESPERMATOZOIDESV.III CAPACITACIN DE LOS ESPERMATOZOIDESV.IV LIMPIEZA DE LOS ESPERMATOZOIDESV.V CONDICIONES DE INCUBACIN

VI. MEDIOS DE CULTIVOVI.I MEDIO DE MADURACIN DE OVOCITOVI.II MEDIO DE MADURACIN DE ESPERMATOZOIDESVI.III. MEDIOS DE CULTIVO DE EMBRIONES

VII. FECUNDACIN IN VITRO VII.I CONDICIONES DE CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONESVII.II POLISPERMIA VII.III MADURACIN IN VITRO DE EMBRIONES

VIII. CONCLUSIN

IX. BIBLIOGRAFIA

I. ANTECEDENTESLas investigaciones sobre fertilizacin in vitro (FIV) se iniciaron al final de la dcada de 1950, cuando se produjo el nacimiento de conejos por esta tcnica (Ducolomb et al., 2005), en la especie porcina la primera obtencin de descendencia viva mediante fecundacin in vitro (FIV) se llev a cabo hace 28 aos (Romar,2001), mientras en Mxico los primeros cerdos nacidos a partir de embriones producidos in vitro se realiz en el 2004 (Ducolomb et al., 2005), estos aos de retraso fueron consecuencia de problemas metodolgicos, ya que las condiciones requeridas para la capacitacin espermtica, la maduracin in vitro (MIV) de ovocitos y el desarrollo embrionario preimplantacin, difieren entre las diversas especies de mamferos. Sin embargo, en cerdos todava existen una serie de problemas asociados a esta especie que impiden que el rendimiento de los sistemas actuales de FIV sea plenamente satisfactorio.

Los dos problemas clsicos que han acompaado a la FIV en la especie porcina han sido los bajos porcentajes de formacin de proncleo masculino (PNM) tras la fecundacin y la polispermia, que en esta especie sigue siendo elevada (Romar, 2001).

II. IMPORTANCIA

La tcnica de fecundacin in vitro (FIV) consiste bsicamente en la exposicin de ocitos maduros a espermatozoides capacitados de forma que produzca la fecundacin fuera del tracto reproductor femenino. Utilizando ocitos que se hayan madurado in vivo o in vitro. Los espermatozoides podrn ser capacitados in vivo en teros u oviductos intactos o aislados mediante procedimientos in vitro, la tecnologa actual tiende a que la totalidad del proceso se realice in vitro. El cultivo de los huevos resultantes durante este periodo de tiempo variable y su transferencia a hembras receptoras, completa esta tcnica (Martnez et al., 1989).La fecundacin in vitro es utilizada en la valoracin de la capacidad fecundante de los gametos masculinos y es una herramienta que permite la obtencin de embriones a partir de gametos de alto valor gentico. La produccin de embriones mediante la FIV puede ofrecer una gran ayuda a los programas de mejora y conservacin del patrimonio gentico, al permitir la utilizacin de gametos que de modo natural, seran inviables (Gadea et al., 1998).

III. PREREQUISITOS PARA LA FIVExisten algunos prerrequisitos para la fecundacin In vitro:

1. Maduracin nuclear y citoplasmtica de los gametos en las gnadas.2. Desarrollo de la capacidad fecundativa de los gametos en los aparatos reproductores masculino y femenino.3. Un nmero ptimo de espermatozoides fecundables con motilidad vigorosa.4. Un vulo fecundable con el primer cuerpo polar (Hafez, 2002).

IV. OVOCITOSIV.I OBTENCIN DE OVOCITOSLa obtencin de los ovocitos se realiza a travs de dos procedimientos bsicos:

1. Ocitos post ovulatorios: A partir de animales vivos utilizando la aspiracin transvaginal ecoguiada (OPU) (Herradn et al., 2007). Se localizan en el oviducto poco despus de la ovulacin. Normalmente, y con el fin de aumentar el nmero de oocitos a recoger, se somete a la hembra a tratamientos de superovulacin. La obtencin a partir del oviducto de los oocitos se efecta mediante laparotomia o tras el sacrificio de los animales (Lorenzo, 2002).

2. Ocitos preovulatorios: A partir de hembras sacrificadas en el matadero, mediante la obtencin de sus ovarios y la aspiracin de los folculos (Gil et al., 2010).Hay dos tipos de ocitos pre ovulatorios, los que casi han completado su maduracin y les falta un corto espacio de tiempo para terminar la maduracin y aquellos ocitos foliculares que son totalmente inmaduros (Lorenzo, 2002).

Como hembras donantes se diferencian 3 grupos con diferentes estados reproductivos: cerdas prepberes, las cuales nos han mostrado actividad cclica, cerdas cclicas y cerdas despus del destete. Todas las donantes deben tener buena salud general y sexual. El valor gentico debe estar claramente sobre el valor de la media poblacional para que justifique el trabajo de la produccin in vitro. Los ovocitos inmaduros se obtienen de folculos de 2mm a 5mm de dimetro. (Zhan et al., 2006).IV.II TRANSPORTE DE OVARIOSEl transporte de los ovarios se lleva a cabo en un termo que contiene en su interior una bolsa plstica estril. Entre la pared interna del termo a temperatura de 32 C (Palma, 2001). Los medios de transporte que se utilizan para la movilizacin desde la planta de sacrificio hasta el laboratorio han sido reportados en distintos trabajos de manera distinta: NaCl al 0.9% suplementado con antibitico (10 g/ml de estreptomicina y 100 UI/ml de penicilina) y mantenidos a una temperatura de 30 37C.

PBS con 100 UI/ ml penicilina y 100 g/ml de estreptomicina, a una temperatura entre 30 y 35C.

Solucin salina estril (0,9%) suplementada con penicilina y estreptomicina (0,75 g/L) de 30 a 37 C (Hernndez et al., 2012).

IV.III EXTRACCIN DE OVOCITOSUsualmente las formas de extraccin de complejos cmulo-ovocitos (COCs) de los folculos que se emplean son por puncin o aspiracin con jeringa, corte de folculos y perfusin de oviducto, cada una de estas formas de extraccin presenta ventajas y desventajas El principal factor limitante para la obtencin de los COCs es el tamao de los folculos, de los cules se extraen. Una vez obtenidos el dimetro del ovocito y la morfologa de los COCs, son buenos indicadores de la competencia para producir embriones(Fernndez et al., 2010)IV.III.I MTODO DE ASPIRACIN (OVUM PICK-UP)

La puncin se lleva a cabo por medio de un set de aspiracin. A la bomba de aspiracin se conecta un sistema de tubuladura cuyo extremo se conecta a un tubo de 50 cm por medio del tapn adaptador. El tapn contiene, junto con la conexin al tubo de goma, una conexin cnica para una cnula de 18G. La presin negativa se regula de forma que circulen 20 ml de lquido/min. Con 6 lugares de aspiracin se pueden puncionar 800 a 1000 ovarios en un hora. El lquido folicular aspirado se lava 2 veces con una solucin PBS (Dulbeccos USA) a 38C. Posteriormente el lquido folicular se deja sedimentar durante 10 min. Y el sobredante se elimina. El sedimento se re-diluye con 25 ml de medio de lavaje y la suspensin se distribuye en varias placas de Petri (Palma, 2001).

IV.III.II MTODO SLICING Consiste en la realizacin de cortes longitudinales y transversales con una hoja de bistur, en la superficie del ovario para liberar el contenido folicular en una placa de cultivo. Se observan los complejos cmulo- ovocito al microscopio y se seleccionaron aquellos que presenten una o ms capas de las clulas del cmulos no expandidas y un citoplasma ovocitario homogneo (Hernndez et al., 2012)Con las tcnicas descritas se recuperan similar cantidad de ovocitos por ovario y similar cantidad de ovocitos de calidad por ovario. Por tanto, es posible utilizar cualquiera de estas tcnicas de recuperacin, pero los ovocitos deben ser tomados de folculos de 2-8 mm de dimetro y solamente de aquellos que se encuentren en la superficie del ovario (Gmez et al., 2012).

IV.IV SELECCIN DE OVOCITOSLa seleccin de los ovocitos se realiza generalmente en base a tres criterios: el dimetro del ovocito, el aspecto de su citoplasma y las caractersticas del cmulo que los rodea. El dimetro de los ovocitos condiciona su capacidad para madurar, los ovocitos grandes (ms de 5 mm de dimetro) tienen ms capacidad de convertirse en embriones de los que ovocitos pequeos (