[Prctica 4: Fermentacin Alcohlica] Introduccin a la Biotecnologa

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RREESSUUMMEENN

El siguiente reporte est elaborado en miras de comprender y conocer los procedimientos

establecidos en el proceso de fermentacin alcohlica a partir de la melaza, saber la cantidad

necesaria que se necesita de sta para poder desarrollar la fermentacin, para llevarse a cabo, se

usaron los microorganismos Saccharomyces Cerevisiae, estos asimilan una determinada cantidad

de glucosa, para ello se hizo uso de una solucin de melaza al 10% m/m, se regul a su vez el pH a

4.5 aproximadamente, ya que a ese pH se obtiene un ptimo desempeo de los microorganismos

y la solucin puede estar relativamente protegida de las influencias bacterianas, se hizo uso de

tres enlenmeyer, dos de 125 ml, en el cual se coloc agua destilada en uno, para oxigenar la

solucin de melaza y agua corriente en el otro para desalojar el CO2 producto de la fermentacin

que se llev a cabo, y un erlenmeyer de 500ml donde se coloc 300 ml de solucin de melaza, se

inocul la cepa Saccharomyces Cerevisiae en rea de mechero con el asa bacteriolgica en 50 ml

de solucin de melaza contenida en un beaker de 125 ml, se dej a la solucin de melaza con la

cepa contenida en ella en un sistema junto con agua destilada en reposo durante 24 horas a

temperatura ambiente, luego en rea de mechero se agreg los 50 ml de melaza inoculada a los

300 ml de melaza contenida en el erlenmeyer de 500ml, para despus montar el sistema de tres

erlenmeyer antes descrito y se pueda llevar a cabo la fermentacin, para luego poder observar lo

que iba sucediendo en perodos de 24 horas con la solucin en pleno proceso de fermentacin.

IINNTTRROODDUUCCCCIINN TTEERRIICCAA

Fermentacin Alcohlica

La fermentacin alcohlica es un proceso biolgico anaerbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias, originado por la actividad de microorganismos que procesan los hidratos de carbono que dan como resultado liberacin de energa, obtencin de alcohol etlico, CO2 y otros productos como por ejemplo, molculas de ATP que luego digieren los mismos microorganismos. En estos productos se emplea el microorganismo Saccharomyces Cerevisae.

Hay muchos tipos diferentes de fermentacin, pero en condiciones fermentativas solamente se efecta una oxidacin parcial de los tomos de carbono del compuesto orgnico y, por consiguiente,

slo una pequea cantidad de la energa potencial disponible se libera.1

La fermentacin alcohlica tiene como objetivo biolgico proporcionar energa anaerbica a las levaduras en ausencia de oxgeno, para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentacin. Las levaduras y bacterias ocasionantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y otorgan

1 Snchez-Marroqun, A.; 1953; THE

BIOCHEMICAL ACTIVITY OF SOME

MICROORGANISMS OF PULQUE; Mxico;

Memorial del Congreso de Cientficos Mexicanos;

IV Centenario de la Universidad de Mxico; p. 49.

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en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las importantes caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico.2

El proceso de fermentacin se lleva a cabo acorde a la siguiente reaccin:

Azucares + levaduras ==> Etanol + CO2 +

Calor + Otras sustancias

Las levaduras son microorganismos mesfilos, esto hace que la fermentacin pueda tener lugar en un rango de temperaturas desde los 13-14C hasta los 33-35C. Dentro de este intervalo, cuanto mayor sea la temperatura mayor ser la velocidad del proceso fermentativo, corriendo el riesgo de una alta mortalidad en la poblacin de la levaduras interrumpiendo la fermentacin y siendo tambin mayor la proporcin de productos secundarios. Sin embargo, a menor temperatura es ms fcil conseguir un mayor grado alcohlico, ya que las altas temperaturas que hacen fermentar ms rpido a las levaduras llegan a agotarlas antes. La temperatura ms adecuada para realizar la fermentacin alcohlica se sita entre los 18-23C.

Entre los productos secundarios obtenidos en el proceso de fermentacin tenemos:

cido succnico

2 Pederson, Carl S.; 1971; MICROBIOLOGY OF

FOOD FERMENTATIONS; Wesport, Conneticut;

AVI Publishing; p. 228-229.

Snchez-Marroqun, A.;1953; THE BIOCHEMICAL

ACTIVITY OF SOME MICROORGANISMS OF

PULQUE; Mxico; Memorial del Congreso de

Cientficos Mexicanos; IV Centenario de la

Universidad de Mxico; p. 49.

Glicerina

cido actico

Butilenglicol

Acetaldehdo

cido pirvico

Etil y Vinil fenoles, entre otros.3

Parmetros a considerar en el proceso de fermentacin alcohlica y efectos sobre los resultados

1. Nutrientes y Activadores

Las levaduras fermentativas necesitan los azcares para su catabolismo, es decir para obtener la energa necesaria para sus procesos vitales, pero adems necesitan otros substratos para su anabolismo como son nitrgeno, fsforo, carbono, azufre, potasio, magnesio, calcio y vitaminas, especialmente tiamina (vitamina B1). Por ello es de vital importancia que el medio disponga de una base nutricional adecuada para poder llevar a cabo la fermentacin alcohlica.

El nitrgeno es de todos el ms importante, una deficiencia de estos nutrientes har que a la levadura no le quede mas remedio que atacar contra su pesar las gigantescas protenas, liberndose H2S.

2. Inhibidores

3 Pederson, Carl S.; 1971; MICROBIOLOGY OF

FOOD FERMENTATIONS; Wesport, Conneticut;

AVI Publishing; p. 229.

http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met4

/levaduras.htm

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Es importante evitar la presencia de inhibidores como por ejemplo: restos de productos fitosanitarios y cidos grasos saturados de cadena corta.

3. Temperatura

sta variable es afectada tanto por agentes funcionales como por dificultades materiales (prdidas debidas a la evaporacin de etanol al trabajar con temperatura elevada).

Se debe tener en cuenta que para cada levadura existe una temperatura ptima de desarrollo, en la cual se muestra activa. Adems, se tiene una zona independiente de la temperatura ptima en la cual la levadura an presenta actividad; a medida que se aleja de la temperatura ptima su actividad disminuye notablemente. Para el microorganismo Saccharomyces Cerevisae se obtiene un progreso favorable entre 28-35 C, convenientemente 30 C.

4. pH

Este factor es de elevada importancia en el control de la contaminacin bacterial como tambin al efecto en el crecimiento de las levaduras, en la rapidez de fermentacin y en la formacin de alcohol. Cuanto ms inferior el pH del entorno, tanto menor el riesgo de infeccin, pero si se ocupa un pH muy bajo, la fermentacin tomar ms tiempo, ya que la levadura no se desarrolla de la manera favorable. El pH ms apropiado para la progresin de la Saccharomyces Cerevisiae se encuentra entre 4.4 - 5.0, con un pH de 4.5 para su desarrollo ptimo.

5. Aireacin

El aire es un factor decisivo en toda fermentacin, ya que su presencia hace ms vigoroso el crecimiento de la levadura. Hay tres puntos de vista de gran importancia que favorecen el rendimiento debido a una buena aireacin:

El libre y constante abastecimiento de oxgeno de cada clula en el sustrato.

La eliminacin rpida del CO2 , porque en concentraciones relativamente bajas inhibe el crecimiento.

El conservar en suspensin las clulas de levadura, a fin de que en la tumultosidad de la mezcla se reforme constantemente el contacto entre la membrana celular y el sustrato nutritivo.

Al iniciar la fermentacin se debe cuidar que la aireacin no sea muy elevada, porque el contenido alcohlico del entorno es reducido y pueden propagarse fcilmente los mohos que atacan a las levaduras del cultivo.

6. Concentracin del sustrato

El carbono es suministrado por los azcares contenidos en la materia prima, siendo la concentracin de azcar un valor que se debe considerar ya que afecta la velocidad de la fermentacin, el comportamiento y el desarrollo de las clulas de la levadura.

Suele ser provechosa una concentracin de azcar del 10 al 18%, el valor ms comn es del 12%. Cuando se ocupan concentraciones de azcar muy altas, del orden de 22%, se aprecia una irregularidad respiratoria en la levadura y una bajada de la rapidez de fermentacin; por el contrario, al ocupar concentraciones muy bajas, el proceso resulta antieconmico ya que solicita un mayor volumen para la fermentacin. Por esto se maneja como sustrato la melaza, que tiene de 10 - 15% de azcar.4

4 Pederson, Carl S.; 1971; MICROBIOLOGY OF

FOOD FERMENTATIONS; Wesport, Conneticut;

AVI Publishing; p. 230.

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Levaduras

Las levaduras dentro de su membrana nica, se encuentran partculas densas, de polifosfato, cuando crecen en condiciones aerbicas, y en especial si la concentracin de glucosa es escasa se observan varias mitocondrias en el interior de cada clula. Cada mitocondria est rodeada por una doble membrana. Las mitocondrias albergan a los citocromos a los enzimas respiratorios y al sistema responsable de la biosntesis de adenosin trifosfato (ATP) a travs de la oxidacin completa de la glucosa. Son, por tanto, las responsables del metabolismo oxidativo de los azcares, que se degradan a dixido de carbono y agua; el ATP que sintetizan almacena la energa qumica derivada de estas reacciones.5

Estructura celular de la saccharomyces cerevisiae

La estructura celular de la saccharomyces cerevisiae es parecida a la de cualquier clula eucariota, contiene vacuolas, mitocondrias,

aparato de golgi, ncleo, etc.

5 Crueger, W., Crueger, A.; 1989;

BIOTECNOLOGA, MANUAL DE MICROBIOLOGA

INDUSTRIAL; Zaragoza, Espaa; Editorial Acribia,

S.A.; p 105-108.

http://www.cervezadeargentina.com.ar/articul

os/levadura.htm

http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met4

/levaduras.htm

http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educa

cion/cuaderno/ec_53.asp

Fig. 1: Diagrama de la seccin transversal de una clula en reposo de la

Saccharomyces Cerevisiae: ER, retculo endoplsmico; M, mitocondrias; N, ncleo; Nm, membrana nuclear; Nn, nuclolo; Pi, invaginacin; Pl, plasmalerna; V, vacuola; Vp, granulo de polimetafosiato; W, pared celular; Ws, cicatriz de gemacin; L granulo lipdico.

Las levaduras se multiplican por gemacin. Una zona debilitada de la pared permite que se forme una prolusin del citoplasma, a la que, de inmediato, se provee de pared. A medida que crece, van emigrando a la gema los orgnulos de la clula madre, incluido un ncleo (tras su divisin). Finalmente, la gema alcanza su tamao definitivo, lo que no implica necesariamente su separacin de la clula madre.

La pared celular es permeada por algunos de las enzimas segregadas por la levadura; el ms importante es la invertasa, que hidroliza la sacarosa antes de que penetre en la clula; entre ellos se encuentra tambin la fosfatasa.

Las clulas que tienen un desarrollo apresurado contienen varias vacuolas, mientras que las que llegan a su madurez, slo una. Se encuentran partculas densas dentro de la membrana que estn hechas de

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polifosfato, a stas partculas se les suele llamar grnulos de velutina. Si la concentracin de glucosa es poca y se encuentran en un entorno aerbico se aprecian diversas mitocondrias dentro de la clula.6

En condiciones anaerbicas, o cuando las concentraciones de glucosa son altas, las mitocondrias parecen atrofiarse y perder, al menos temporalmente, su actividad bioqumica, transformando la glucosa en cido pirvico siguiendo la fase de reaccin de gliclisis, lo especifico de stas levaduras es que pueden degradar el cido pirvico a etanol mediante el siguiente proceso:

Fig 2: Diagrama de la Fermentacin Alcohlica.

6 Snchez-Marroqun, A.; 1953; THE

BIOCHEMICAL ACTIVITY OF SOME

MICROORGANISMS OF PULQUE; Mxico;

Memorial del Congreso de Cientficos Mexicanos;

IV Centenario de la Universidad de Mxico; p. 49.

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MMTTOODDOOSS

Materiales utilizados:

1 Erlenmeyer de 500 ml con tapn de hule bihoradado.

2 Erlenmeyer de 125 ml con tapn de hule monohoradado.

1 Asa bacteriolgica.

2 Varillas de vidrio huecas y dobladas

1 mechero.

1 refractmetro.

1 beaker 100 ml.

pH metro.

Reactivos:

Levaduras (saccharomyces cerevisae)

cido Sulfrico.

Agua destilada.

Agua Estril.

Melaza

Procedimiento:

1. Se prepar 350 ml de solucione de melaza al 10 % m/m y se le midi su pH y los Brix.

2. Se regul el pH a 4.5 acidulando con cido sulfrico.

3. En un erlenmeyer 500 ml se coloc 300 ml de solucin de melaza y el resto se verti en otro erlenmeyer de 250 ml para poder inocular con un asa bacteriolgica esta solucin, despus de haber esterilizado todo el equipo y las soluciones. La cepa usada es la Saccharomyces Cerevisiae.

4. Se deja la solucin como muestra la figura 3, por 24 horas.

Fig 3: Disposicin del equipo para la

incubacin de la cepa por 24 h.

5. Luego de trascurrido el tiempo, se vierte la solucin de melaza inoculada con la cepa en los 300 ml de la melaza guardada para comenzar la fermentacin en su etapa efectiva. Esto se realiza en el rea del mechero para asegurar la esterilidad y la no produccin de compuestos no deseados.

6. Ahora se colocan los instrumentos de manera semejante a la figura 4, se deja transcurrir otro perodo de 24 horas.

Fig. 4: Sistema de fermentacin.

Finalmente se tomaron nuevamente los

grados Brix y el pH de la solucin de melaza.

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CCLLCCUULLOOSS YY RREESSUULLTTAADDOOSS

Los datos obtenidos a partir de la prctica

fueron:

Brix pH

Inicio 14 4.5 Final

(24 h despus) 9 3.7

Tabla 1: Datos de la prctica.

Los grados Brix miden la concentracin en

gramos de la sacarosa por 100 g de solucin,

es decir que para cada caso tenamos:

Inicio: 14 g de sacarosa por 100 g de

solucin.

Final: 9 gramos de sacarosa por 100 g de

solucin.

Entonces hubo una disminucin de 5 gramos

de sacarosa por cada 100 g de solucin. Lo

cual es esperado debido a que las levaduras

transforman el azcar en alcohol.

Para el pH, al irse produciendo la

fermentacin, la concentracin de iones

hidronio (H3O+) se incrementa debido a la

reduccin del azcar a alcohol, lo cual

acidifica la solucin de melaza.

Ambos efectos tanto de disminucin de los

grados Brix como del pH son los efectos

deseados en la fermentacin.

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFAA

2,3,4; Pederson, Carl S.; 1971; MICROBIOLOGY OF FOOD FERMENTATIONS; Wesport, Conneticut; AVI Publishing; p. 228-230. 1,2,6; Snchez-Marroqun, A.; 1953; THE BIOCHEMICAL ACTIVITY OF SOME MICROORGANISMS OF PULQUE; Mxico; Memorial del Congreso de Cientficos Mexicanos; IV Centenario de la Universidad de Mxico; p. 49. 4; Crueger, W., Crueger, A.; 1989; BIOTECNOLOGA, MANUAL DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL; Zaragoza, Espaa; Editorial Acribia, S.A.; p 105-108. Pginas de Internet consultadas: 5; http://www.cervezadeargentina.com.ar/articulos/levadura.htm consultada el da Sbado 5 de Junio de 2010 a las 23:47 horas. 3,5; http://www.biologia.edu.ar/metabolismo/met4/levaduras.htm consultada el da Sbado 5 de Junio de 2010 a las 23:58 horas. 5; http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_53.asp consultada el da Domingo 6 de Junio de 2010 a las 11:55 horas.