Fermentaciones aeróbicas especiales

BIOTECNOLOGIA

FERMENTACIONES

AEROBICAS ESPECIALES Producción de: ácido acético, ácido cítrico, ácido glucónico. Cepas utilizadas. Substratos

técnicos. Condiciones de los procesos. Rendimientos. Controles de los procesos. Recuperación

de los productos. Usos. Producción de vinagre. Nociones sobre la tecnología de elaboración.

BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES

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INDICE

INTRODUCCION A LAS FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES…………………………………..3

Producción de ácido cítrico………………………………………………………………………………………………...4

Introducción. Biosíntesis del ácido cítrico. Cepas utilizadas. Sustratos técnicos.

Condiciones y controles de los procesos. Procesos en superficies. Procesos

sumergidos. Rendimientos. Recuperación del producto. Usos.

Producción de ácido glucónico………………………………………………………………………………………….11

Introducción. Biosíntesis del ácido glucónico. Cepas utilizadas. Condiciones y

controles de los procesos. Recuperación del producto. Rendimientos. Usos.

Producción de ácido acético……………………………………………………………………………………………...15

Introducción. Biosíntesis del ácido acético. Cepas utilizadas. Sustratos técnicos.

Recuperación del producto.

Producción de vinagre……………………………………………………………………………………………………...17

Introducción. Nociones sobre la tecnología de elaboración. Procesos en

superficies. Método de Orleáns o método lento. Generador de goteo o método

alemán. Procesos sumergidos. Diagrama de flujo.

Fuentes de Información……………………………………………………………………………………………………24


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INTRODUCCION A LAS FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES

Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a cabo en un

recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante el cual determinados

sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en

metabolitos y biomasa. El microorganismo va aumentando en su concentración en el transcurso

del proceso al mismo tiempo que el medio se va modificando y se forman productos nuevos

como consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas. Los dos fenómenos crecimiento y

formación de producto, tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultáneamente o no

según los casos.

Los procesos de fermentación juegan un papel importante en la producción de la mayor

parte de los ácidos orgánicos, y se abordarán estos temas en este trabajo porque estos ácidos

encuentran amplio uso como aditivos en la industria de alimentos y también como aditivos

químicos en piensos.

Todos los ácidos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos pueden ser producidos

microbiológicamente con alto rendimiento. Otros ácidos orgánicos derivan directamente de la

glucosa (por ejemplo el ácido glucónico) o se forman como productos finales a partir del

piruvato o del etanol (por ejemplo los ácidos láctico y acético).

Excepto la producción de ácido cítrico, que se produce enteramente por fermentación, para

algunos ácidos como el acético y el láctico, se utilizan simultáneamente métodos químicos y

microbiológicos para su preparación. Para otros ácidos (cetoglutárico, málico) se han

desarrollado procesos de fermentación que no se utilizan comercialmente, bien debido a la

insuficiente demanda del ácido o por razones económicas.

En este trabajo se expondrán los detalles de la producción de sólo tres ácidos orgánicos

obtenidos mediante métodos microbiológicos: Ácido Cítrico, Ácido Glucónico y Ácido Acético.

También se tratarán los diferentes procesos de elaboración de vinagre.


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Producción de ácido cítrico

Introducción

El ácido cítrico ha sido conocido como una sustancia natural de las plantas desde finales

del siglo XIX, y desde entonces se sabe que era producida por hongos filamentosos. En 1923 se

inició la primera fermentación práctica para la producción de este ácido orgánico utilizando

microorganismos que crecían sobre la superficie de los cultivos. Actualmente más del 99% de la

producción mundial de ácido cítrico se produce microbiológicamente.

Biosíntesis del ácido cítrico

El ácido cítrico (ácido 2 hidroxipropano-1,2,3 tricarboxílico) es un producto metabólico

primario y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal fuente de

carbono utilizada para la producción de este ácido.

En muchos microorganismos el 80% de la glucosa utilizada para esta biosíntesis se

metaboliza por reacciones de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y 20 % por reacciones

del ciclo de la pentosa fosfato. Durante la fase de crecimiento la relación entre estas dos vías es

de 2:1.

En los microorganismos productores de ácido cítrico las enzimas de la vía EMP están

presentes a lo largo del proceso de fermentación y la actividad de la vía está regulada en forma

positiva por la fosfofructoquinasa y en forma negativa por la piruvato quinasa. Cuando el

piruvato es descarboxilado con formación de acetil-CoA, el residuo de acetato se canaliza hacia el

ciclo de los ácidos tricarboxílicos.

Durante la idiofase (fase en el crecimiento de una bacteria en la que se producen

metabolitos secundarios, que son productos no fundamentales en el metabolismo bacteriano) se

expresan todas las enzimas del ciclo de Krebs excepto la -cetoglutarato deshidrogenasa. La

actividad de la citrato sintasa (enzima condensante) aumenta por un factor 10 durante la

producción del ácido cítrico, mientras las actividades de las enzimas que catabolizan ácido

cítrico, como la aconitasa y la isocitrato deshidrogenasa, se reducen drásticamente en

comparación con su actividad durante la trofofase (fase en la vida de las colonias de

microorganismos en que crecen de forma exponencial). Una de las tres isoenzimas, la isocitrato

deshidrogenasa, una enzima mitocondrial que es específica para NADP, se inhibe por el glicerol

que se acumula durante el proceso de germinación de las esporas. Además, la producción de

ácido cítrico es inhibida por concentraciones altas de amonio.


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La citrato sintasa no puede ser solamente responsable del mantenimiento de la actividad

del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, ya que el ciclo se detendría si el ácido cítrico fuera

removido. Por lo tanto deben existir durante la fase de producción distintas secuencias que

rellenan los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (secuencias anapleróticas),

como se ve en la Figura 1.

La primera enzima anaplerótica presente en Aspergillus es una piruvato carboxilasa

(Reacción 4) que convierte piruvato y CO2 en oxalacetato, fosfato inorgánico y ADP (mientras

consume ATP). La reacción depende de iones Mg2+ y K+; no se necesita acetil-CoA para la

reacción, en contraste con sus requerimientos en las reacciones metabólicas de otros

microorganismos. La piruvato descarboxilasa es la enzima clave para la producción de ácido

cítrico.

La segunda secuencia anaplerótica implica una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa

(Reacción 2), que convierte PEP y CO2 en oxalacetato y ATP en presencia de ADP. El sistema

requiere Mg2+ o Mn2+ y K+ o (NH4)+.

Si se utilizan como fuente de carbono acetato o compuestos alifáticos superiores, como n-

alcanos (C9-C23), se encuentra en Aspergillus niger una tercera secuencia anaplerótica. En

Figura 1. Reacciones anapleróticas que conectan el ciclo de los ácidos tricarboxílicos.


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ausencia de glucosa opera el ciclo del glioxilato (Reacción 6); la isocitrato liasa se induce, y está

presente la malato sintasa. Si se añade glucosa el ciclo del glioxilato se reprime, aunque la

isocitrato liasa es todavía parcialmente activa.

Cepas utilizadas

Muchas cepas excretan trazas de ácido cítrico como producto del metabolismo primario.

Como ejemplos están Aspergillus niger, A. wentii, A. clavatus, Penicillium luteum, P. citrinum,

Mucor piriformis, Paecelomyces divaricatum, Citromyces pfefferianus, Candida guillermondii,

Saccharomycopsis lipolytica, Trichoderma viridae, Arthrobacter paraffineus y Corynebacterium sp.

Sin embargo, para la producción comercial

sólo se utilizan mutantes de A. niger (se muestra en

la Figura 2). Comparado con las cepas de

Penicillium, los aspergillus producen más ácido

cítrico por unidad de tiempo. Además la formación

de productos laterales no deseados, como ácido

oxálico, ácido isocítrico y ácido glucónico puede ser

más fácilmente suprimida en estos mutantes.

Sustratos técnicos

Fuente de carbohidratos

Una solución de 15-25% de azúcar es utilizada durante la fermentación. Como fuente de

carbohidratos pueden ser utilizados una serie de materias primas tales como almidón de papa,

hidrolizados de almidón, jarabe de glucosa de almidón sacarificado, sacarosa de diferentes

niveles de pureza, jarabe de caña de azúcar con dos tercios de la sacarosa convertida en azúcar

invertido, melazas de caña de azúcar y de remolacha.

Si se utiliza almidón, este es hidrolizado a azúcares por las amilasas formadas por el hongo

productor, o añadidas al caldo de fermentación. Si se utilizan jarabes o hidrolizados debe ser

llevado a cabo un tratamiento preliminar con precipitantes o cambiadores de iones para separar

cationes.

Las cepas de producción se optimizan en base a la fuente de carbono utilizada. Una cepa

que produzca bien con una fuente de carbono no puede generalmente ser utilizada con otro

material de partida sin que se produzca una sustancial reducción del rendimiento.

Figura 2. Morfología de A. niger.


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Elementos trazas

El cobre, manganeso, magnesio, hierro, zinc y molibdeno son necesarios para el

crecimiento óptimo en el rango de las ppm. Sin embargo, un exceso respecto de las

concentraciones óptimas puede tener un efecto tóxico.

El papel del hierro es particularmente interesante. Mientras el crecimiento óptimo

requiere concentraciones más altas de hierro (entre otras cosas como cofactor para la

aconitasa), sólo 0,05 – 0,5 ppm son necesarias para la producción máxima de ácido cítrico. La

concentración óptima de hierro depende del material de partida que se utilice.

La sensibilidad de las cepas a metales pesados como zinc, hierro, manganeso y cobre

desciende al descender la temperatura. Además, el cobre revierte el efecto inhibitorio del hierro.

Además de la composición de la solución de nutrientes (contenido en azúcares,

concentración de metales y sales, contenido de fosfato y nitrógeno), el pH del medio influye en el

rendimiento.

Durante la idiofase el pH debe estar por debajo de 3 a fin de suprimir la formación del

ácido oxálico y del ácido glucónico, pero durante la trofofase, el pH desciende hasta por debajo

de 3 como resultado del metabolismo de los iones amonio. Para controlar mejor el rendimiento

en cultivos sumergidos, la trofofase y la idiofase pueden ser separadas reduciendo el pH por

debajo de 2, una vez que ha cesado el crecimiento.

Otro beneficio del bajo pH es el descenso en el riesgo de contaminación, ya que a estos

valores bajos solamente Penicillium y las levaduras pueden producir contaminación. La

frecuencia de contaminación es un factor significativo, especialmente en las fermentaciones en

superficie.

Condiciones y controles de los procesos

El ácido cítrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Los

procesos en superficie pueden ser subdivididos a su vez de acuerdo con el estado del medio de

cultivo que se utilice: sólido o líquido. De procesos sumergidos se utilizan dos tipos:

fermentadores agitados o fermentadores de elevación por aire (air-lift).

Varios factores afectan la elección del tipo de proceso: la existencia de capital de inversión,

la abundancia de energía, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de técnicas

para la medida y la regulación.


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El material utilizado como inóculo para la producción de ácido cítrico es una suspensión

de esporas, las cuales germinan en el medio de cultivo a 32ºC, y se forma micelio en forma de

bolillas o pellets (para los sistemas sumergidos). Es necesario tener el cultivo de la cepa bien

desarrollado en estría (agar Sabouroud o papa dextrosa), bien esporulado y de 10-20 días de

edad.

Procesos en superficie

Medio sólido

Plantas de baja producción, muy limitadas, unas 500 toneladas al año. Se usa sustrato

sólido, como migas de pan o pulpa de almidón. El pH del medio se reduce hasta 4 o 5 antes de la

esterilización. Después se inocula con esporas, extendiéndolo sobre bandejas en capas de 3 a 5

cm de grosor y se incuba a 28ºC. El proceso dura unas 90 h, al final de las cuales la solución

entera se extrae con agua caliente para aislar el ácido cítrico.

Medio líquido

Es el método más antiguo de producción. Actualmente se produce el 20% del total de

ácido cítrico con este método. Permanece en uso todavía debido a la baja inversión que requiere

para su funcionamiento, ya que la tecnología es sencilla y el costo en energía para los sistemas de

refrigerado es bajo. El mayor costo viene por la mano de obra, más grande que en los reactores

sumergidos, pero es mano de obra no especializada. En reactores sumergidos se requiere menos

mano de obra, pero capacitada.

En los sistemas modernos, el medio se esteriliza en continuo. La solución nutritiva estéril

fluye automáticamente por un sistema de distribución sobre las bandejas. La inoculación se hace

en cámaras de inoculación a 30–40ºC, diseminando esporas secas o pulverizando una

suspensión de esporas. La temperatura se mantiene constante mediante un sistema de corriente

de aire. La ventilación es muy importante también, para el flujo de gases. La velocidad de

producción de ácido cítrico baja si la concentración de CO2 pasa del 10%. Al cabo de 24 h de la

inoculación, las esporas germinan y forman una fina capa de micelio sobre la superficie de la

solución. Al cabo de 30 h empieza la idiofase. La fermentación se detiene al cabo de 8 a 14 días.

Si hay demasiado hierro se producirá ácido oxálico, produciéndose una sustancia

amarillenta que dificulta el proceso de recuperación. Durante la recuperación se separa el

micelio de los nutrientes por filtración. En algunos casos se usan prensas para obtener más

cítrico a partir de las células. En los procesos en sólidos se hace así.


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Procesos sumergidos

El 80% de la producción mundial de ácido cítrico se hace mediante procesos sumergidos.

Aunque dura más días que los otros métodos presenta varias ventajas: menor inversión en la

construcción y menor inversión total, es necesaria menos mano de obra. También presenta

algunas desventajas respecto de los métodos anteriores: mayor costo de energía, la tecnología

de control es más sofisticada, con lo que se requiere un personal más especializado, la formación

de espuma también es un problema en la producción de ácido cítrico, pero se soluciona por la

adición de antiespumantes. En resumen, el rendimiento es mayor en la producción sumergida.

Existen 3 factores especialmente importantes para los procesos sumergidos:

La calidad del material para construir el fermentador: El fermentador debe estar protegido

de la acción de los ácidos o bien ser de acero inoxidable, porque de no ser así, cuando se

alcancen valores de pH de 1 ó 2, se liberarán metales de las paredes del fermentador, que

podrán inhibir la formación de ácido cítrico.

La estructura del micelio: Si el micelio es largo y filamentoso, la producción de ácido cítrico

en la idiofase desciende. Para conseguir una velocidad óptima de producción el micelio debe

estar formado por pellets sólidos muy pequeños. La relación Cu/Fe determina la estructura del

micelio.

Suministro de O2: Aunque A. niger requiere poco oxígeno, es sensible a su ausencia. Por lo

tanto, es necesaria la presencia de oxígeno a una concentración solo del 20–25% de su valor de

saturación.

Rendimientos

En la trofofase, parte de la glucosa añadida se utiliza para la producción de micelio y se

convierte a través de la respiración en CO2. En la idiofase el resto de la glucosa se convierte en

ácidos orgánicos y existe una pérdida mínima por la respiración.

El rendimiento teórico es de 123 g de ácido cítrico 1-hidrato (o 112 g de ácido cítrico

anhidro) por cada 100 g de sacarosa.

Sin embargo, tales rendimientos no se obtienen en la práctica debido a las pérdidas

durante la trofofase.


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Recuperación del producto

Si se llega a formar ácido oxálico como producto lateral debido a un bajo control de la

fermentación, se precipita como oxalato de calcio a pH bajo, dejando el ácido cítrico en la

solución como citrato monocálcico. Se utilizan filtros rotatorios o centrífugas para separar el

micelio y el precipitado de oxalato cálcico del líquido. A pH 7,2 y 70-90ºC, precipita el ácido

cítrico, lo que permite a su vez que sea separado mediante filtros rotatorios y secado.

Para algunos usos especiales, el ácido cítrico es purificado por adición de ácido sulfúrico

para disolver el ácido cítrico, formándose un precipitado de sulfato cálcico. Las etapas

subsiguientes de recuperación incluyen el tratamiento con carbón activado, cambiadores de

iones y la cristalización como ácido cítrico o ácido cítrico monohidratado.

Por encima de 40ºC el ácido cítrico cristaliza como ácido anhidro y por debajo de 36,5ºC

como monohidrato. La pureza requerida del producto depende del uso para el que se prepare.

Cuando se destina a la industria de los alimentos debe ser más puro que el que se necesita para

usos industriales.

Usos

El ácido cítrico se comercializa como ácido cítrico monohidratado o como anhidro. La

mayor parte se utiliza en las industrias de alimentos y bebidas. El sabor de los jugos de frutas,

caramelos, helados y mermelada se aumenta o se preserva por adición de este ácido.

La industria farmacológica utiliza citrato de hierro y ácido cítrico como preservativos de la

sangre almacenada, en tabletas, pomadas y en preparaciones cosméticas.

En la industria química se utiliza como agente antiespumante, reblanquecedor y para el

tratamiento de textiles. También se lo utiliza en los detergentes porque puede reemplazar a los

polifosfatos.

En la industria metalúrgica los metales puros se producen como citratos metálicos.


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Producción de ácido glucónico

Introducción

El ácido glucónico es un producto de gran demanda por su diversidad de aplicaciones a

nivel industrial; se emplea en pequeñas cantidades para preparados antianémicos de gluconato

ferroso, pero el uso principal de este ácido es como agente de limpieza y moldeado en las

industrias de metal, así como para la eliminación de depósitos de calcio en instalaciones de

tratamiento y elaboración de cerveza. El gluconato sódico se utiliza como agente secuestrante en

muchos detergentes.

En la producción de ácido glucónico sólo participa una enzima microbiana, la glucosa

oxidasa, que se encuentra en A. niger. Este hongo crece en condiciones óptimas en el líquido de

maceración del maíz pero cuando el crecimiento se ve limitado por el nitrógeno, las células en

reposo transforman la glucosa restante en ácido glucónico.

Biosíntesis del ácido glucónico

La biosíntesis de ácido glucónico a partir de glucosa por medio de la glucosa oxidasa es

una reacción sencilla que puede ser llevada a cabo por muchos microorganismos (Figura 3).

Durante la transferencia de hidrógeno desde FADH2 a oxígeno se produce peróxido de

hidrógeno (H2O2) que la enzima catalasa convierte inmediatamente en agua. Se ha demostrado

para A. niger que tanto la glucosa oxidasa como la catalasa se encuentran en peroxisomas

evitándose de esta forma la toxicidad por H2O2.

La gluconolactona formada en la primera etapa se hidroliza espontánea o

enzimáticamente por intermedio de una lactonasa (que se halla presente en A. niger) a ácido

glucónico. La acumulación de la lactona reprime la producción de ácido glucónico. La hidrólisis

Figura 3. Producción de ácido glucónico a partir de glucosa.


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de la lactona ocurre espontáneamente a alta velocidad a pH neutro o alcalino. A pH ácidos es

importante la actividad de la lactonasa.

El pH también es importante para favorecer la ruta metabólica que lleva a la producción

de ácido glucónico, ya que a valores de éste neutros o alcalinos A. niger produce este ácido casi

exclusivamente. Además, a valores de pH entre 1 y 3, el glucónico es rápidamente metabolizado

por A. niger.

Cepas utilizadas

Se utilizan A. niger, o la bacteria Acetobacter suboxydans, en procesos sumergidos. En estos

procesos se generan ácido glucónico, gluconatos sódico y cálcico y glucosa oxidasa.

Otros organismos que han sido optimizados para producir este ácido, pero que no se han

utilizado comercialmente, son los hongos Penicillium, Scopulariopsis, Gonatobotrys,

Endomycopsis y Pullularia, y las bacterias Vibrio y Pseudomonas.

Condiciones y controles de los procesos

La fermentación, que se lleva a cabo a pH 4,5, requiere un medio de crecimiento en el que

sean limitantes tanto el fosfato como el nitrógeno. Si se va a producir gluconato cálcico no puede

ser añadida mas de 13-15% de glucosa como sustrato debido a la baja solubilidad del gluconato

cálcico; concentraciones más altas de sustrato permitirían concentraciones más altas de

gluconato que cristalizaría espontáneamente dificultando la purificación. En la producción de

gluconato sódico, puede ser utilizada una concentración de hasta 28-30% de glucosa, ya que la

solubilidad es más alta.

En general, se siembra el reactor con esporos. En el inóculo se trata de obtener una

elevada masa microbiana y favorecer la síntesis de la glucosa oxidasa, enzima clave en la

oxidación de la glucosa. Para ello se trabaja con un medio con elevada concentración de fuentes

nitrogenadas y factores de crecimiento, siendo en general utilizados urea o sulfato de amonio y

agua de hidrolizado de maíz o su forma deshidratada. Se utiliza glucosa o el monohidrato de ésta

como fuente de carbono para inducir la glucosa oxidasa.

Las fermentaciones se llevan a cabo durante 20 h a 28-30ºC con una alta velocidad de

aireación. Elevando la presión en el sistema puede ser aumentada la solubilidad del oxigeno y

por tanto los rendimientos de ácido glucónico. Los rendimientos comerciales actualmente son

del 90-95%.


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Recuperación de los productos

Gluconato de calcio

El efluente del medio de cultivo se decolora con carbón activado, se concentra evaporando

el 15-20% del agua y se deja cristalizar a temperaturas cercanas a 0ºC. La sal se filtra y se lavan

los cristales con agua fría. Se puede obtener de esta manera un producto con un adecuado grado

de pureza. Si se requiere una sal de alto grado de pureza se recristaliza en agua o agua-alcohol.

Gluconato de sodio

La forma comercial de esta sal se puede preparar concentrando el efluente del cultivo a

40-45% de sólidos, ajustando el pH a 7,5 con NaOH y luego secando en tambor rotatorio. Un

producto de mejor calidad se puede obtener decolorando con carbón activado el concentrado

caliente luego de la evaporación y luego recristalizando el producto resultante del secado por

tambor rotatorio.

Acido glucónico

La solución al 50% de ácido glucónico que se encuentra en el mercado se obtiene

concentrando por evaporación la solución del ácido (que puede haber sido obtenido tratando

con H2S04 una solución concentrada de gluconato de calcio previamente purificado).

Las lactonas se obtienen por precipitación de soluciones saturadas a diferentes

temperaturas, como ya se indicó.

Rendimientos

El rendimiento teórico en la producción de ácido glucónico a partir de glucosa, asumiendo

que no hay formación de C02, es de 109 g de ácido/100 g de azúcar. En la práctica se obtienen

rendimientos superiores al 90% de este máximo.

Usos

El ácido glucónico no se comercializa en forma cristalina sino que se ofrece en soluciones

al 50%. La lactona es comercializada en forma cristalina.

Tanto el ácido, como sus lactonas, se utilizan fundamentalmente como acidulantes para

alimentos. La lactona es usada universalmente como un ácido latente en polvos para hornear,

sustancias leudantes para panificación y mezclas para preparar tortas.


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La sal sódica del ácido glucónico es el derivado con mayor importancia comercial. Debido a

sus excelentes propiedades como agente complejante se lo utiliza en soluciones lavadoras de

material de vidrio, soluciones alcalinas de NaOH, particularmente en el caso de botellas

retornables. Los carbonatos de metales di y trivalentes son fácilmente removidos por estas

soluciones.

También se utiliza el gluconato de sodio en cementos mezclas donde modifican las

propiedades de fraguado e incrementan la dureza y resistencia al agua del cemento.

El gluconato de calcio es ampliamente usado para el tratamiento de enfermedades que

producen déficit de calcio o para suplir este metal durante el embarazo. El gluconato ferroso es

utilizado para suministrar este metal en casos de anemia.


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Figura 4. Oxidación de etanol a ácido acético.

Producción de ácido acético

Introducción

La producción de ácido acético a partir de líquidos alcohólicos ha sido conocida desde

hace tanto tiempo como la producción de vino (unos 10.000 años). Los romanos y los griegos,

que utilizaban el vinagre diluido como bebida refrescante, producían vinagre dejando el vino

abierto al aire. Los primeros vinagres fabricados industrialmente eran producidos en vasijas

planas abiertas. Eran procesos lentos en los que flotaba una película de bacterias sobre la

superficie del vino. En el siglo XIX se modificaron los procesos en superficie hacia métodos más

rápidos. Uno de éstos, el proceso del generador de goteo se utiliza todavía en la actualidad

debido al mejor sabor en los productos que se obtienen.

Biosíntesis del ácido acético

La producción de ácido acético es una oxidación incompleta más que una auténtica

fermentación, debido a que el poder reductor que se produce se transfiere al oxígeno. La

primera etapa de oxidación a partir del etanol conduce a acetaldehído mediante una alcohol

deshidrogenasa específica de NAD o NADP. Luego existe una hidratación a acetaldehído hidrato

y una segunda oxidación con acetaldehído deshidrogenasa a ácido acético, como se ve en la

Figura 4.

Durante la oxidación se produce 1 mol de ácido acético por mol de etanol. A partir de 1

litro de alcohol del 12% (v/v) se produce 1 litro de ácido acético del 12,4%.

Para la producción óptima se requiere suficiente oxígeno, que se reduce a través de la

cadena respiratoria. Se producen 6 ATP por mol de ácido acético. Si no existe suficiente oxígeno,

en presencia de altas concentraciones de ácido acético y etanol, las células mueren. Por esto,

tanto el ácido acético como el etanol deben estar presentes para el óptimo crecimiento de

Acetobacter.


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Figura 5. Morfología de Acetobacter aceti

Cepas utilizadas

Aunque el ácido acético es producido por muchas bacterias fermentativas, sólo miembros

de un grupo especial, las bacterias del ácido acético, se utilizan en la producción comercial. Estas

bacterias se dividen en dos géneros, Gluconobacter y Acetobacter, el primer grupo oxida etanol

solamente a ácido acético, y el segundo, las superoxidantes, son capaces de oxidar el etanol

primero a ácido acético y luego adicionalmente a CO2 y H2O.

Los miembros del género Acetobacter son bacterias

Gram negativas y ácido tolerantes. Las cepas utilizadas

comercialmente pertenecen a las especies Acetobacter aceti

(como se ve en la Figura 5), A. pasteurianus y A. peroxidans. Los

miembros del género Gluconobacter no son superoxidantes.

Gluconobacter oxydans y varias subespecies de esta especie

son utilizadas comercialmente.

Podría parecer que Gluconobacter es el ideal para producir el ácido acético, pero en

realidad no es así, porque produce cetonas y otros productos que dificultan la purificación del

producto final. Se usa Acetobacter, pero vigilando que no se agote el alcohol, porque en ese caso

empezaría a degradar el acético.

El inóculo puede provenir de cultivos puros o de vinagre de lotes previos.

Sustratos técnicos

Los materiales de partida con bajo contenido en etanol como vino, suero de leche, malta o

sidra, no requieren ningún componente adicional para constituir una solución completa de

nutrientes. Sin embargo, si se utilizan alcohol técnico o licores de papa o de grano, deben ser

añadidos nutrientes en muchos casos, para obtener el crecimiento y la producción de ácido

acético óptimos.

En la fermentación sumergida la concentración de los nutrientes debe ser cinco veces

superior debido a la mayor biomasa que se saca del biorreactor con el vinagre.

Recuperación de los productos

El ácido acético que se obtiene en el proceso sumergido es turbio debido a la presencia de

bacterias y el producto debe ser clarificado por filtración. Una vez que se obtiene el filtrado,

cuando se desea, se utiliza K4[Fe(CN)6] para decolorar el producto final.


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Producción de vinagre

Introducción

Se denomina vinagre al producto obtenido por fermentación acética en contacto con el

aire de líquidos alcohólicos de todas clases o de diversas disoluciones azucaradas o amiláceas

que hayan experimentado la fermentación alcohólica. Claridad, brillo y edad, son atributos de un

buen vinagre.

Por fermentación acética, es posible elaborar vinagres a partir de alcohol, vino blanco o

tinto, manzana, sidra, melaza, malta y frutas. Los mejores vinagres de vino son los obtenidos con

vinos de buena calidad. Los varietales se procesan a partir de un sólo tipo de uva.

Los vinagres saborizados se elaboran a partir de vinos blancos, con el agregado de hierbas

frescas como romero, albahaca, tomillo y estragón y, también, con pimiento Cayena, chiles, ajo,

nuez moscada, frambuesa, pieles de limón y miel.

Los acetos o vinagres balsámicos se obtienen a partir del mosto de uvas y se añejan en

cascos de madera noble como roble, castaño, cerezo, fresno y mora. El añejamiento se realiza

como mínimo durante diez años.

Los vinagres argentinos están elaborados a partir de alcohol, vino blanco o tinto y

manzana. Con 1 L de alcohol (96º) se elaboran 89 L de vinagre; con 1 L de vino, 1,75 L de vinagre

y con 1 L de jugo de manzana se obtiene 920 cm3 de vinagre. Los de vino contienen una acidez

del 6%, los de alcohol, 5% y los de manzana, 4%.

Nociones sobre la tecnología de elaboración

En general, existen en el mercado dos tipos de vinagres de calidad. El primero se obtiene

como producto de la fermentación o acetificación con cultivo superficial, donde las bacterias

acéticas se encuentran en contacto directo con oxígeno gaseoso situadas en la interface líquido-

gas, o bien fijadas a soportes de materiales tales como virutas, elaborándose así la mayoría de los

vinagres tradicionales.

El segundo tipo se elabora por la acetificación o fermentación con cultivo sumergido,

donde las bacterias acéticas están sumergidas libremente en el seno del líquido a fermentar, en

el que constantemente se introduce aire, solo o enriquecido con oxígeno, en condiciones que

permitan la máxima transferencia posible desde la fase gaseosa a la fase líquida. Así se obtienen

de forma rápida los vinagres comerciales actuales de menor precio.


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Procesos en superficie

Pese al éxito de los procesos sumergidos, los procesos en superficie se utilizan aún de

manera amplia en la producción de vinagre, especialmente en la fabricación de vinagre casero.

Existen dos métodos básicos de producción en superficie:

Método de Orleáns o método lento.

Es uno de los métodos más antiguos para fabricar vinagres. Emplea toneles de

aproximadamente 250–300 litros de capacidad, que se colocan tumbados en filas horizontales y

superpuestas (como se ve en la Figura 6), provistos de dos agujeros de aproximadamente 5 cm

en cada extremo de los fondos de cada barril a 2/3 de la altura del fondo, que se rellenan con

estopa para evitar la entrada de las moscas del vinagre, pero que dejan pasar aire.

Además, en el lateral superior se hace otro orificio que se tapa con un tapón de corcho por

donde penetra un tubo de vidrio recto que llega casi hasta el fondo del líquido permitiendo

renovar el sustrato sin alterar el velo bacteriano situado en la superficie (como se muestra en la

Figura 7).

Figura 6. Pilas de toneles para la acetificación en una fábrica de vinagre por el método de Orleans.

Figura 7. Acetificación por el método de Orleans.


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Este método se trata de un procedimiento estático donde el líquido a acetificar es una

mezcla de vino de bajo grado alcohólico con un 20% de vinagre turbio. Los rendimientos de

transformación de etanol en acético son bajos y el proceso dura de 8 a 10 días una vez

comenzada la acetificación.

Se comienza añadiendo 60 litros de un buen vinagre, y después de 8 días se adiciona una

quinta parte de este volumen de vino, que se transformará en vinagre. Inmediatamente se

inocula el tonel con un cultivo de un tonel vinagrero en marcha o con una telilla especialmente

criada. Esta operación se lleva a cabo con la varilla de vidrio recta, y se tapa el tonel.

El género Acetobacter es aerobio, y por lo tanto si pasa más de 2 min sin oxígeno muere.

En este método, al principio se usa Acetobacter xylinum, porque produce celulosa que le permite

flotar, a diferencia que la mayoría de las bacterias que se hunden.

Estos toneles se mantienen en locales a temperaturas de 20-25ºC, y al cabo de 8 días se

añaden poco a poco por el tubo recto otros 12 litros de vino; estas adiciones se reiteran cada 8

días hasta que el líquido llegue casi al borde inferior del orificio de entrada de aire, quedando

entonces en marcha normal el tonel vinagrero. A partir de este momento, semanalmente se

sacan por el tubo de nivel 12 litros de vinagre ya hecho, que se sustituyen por 12 litros de vino,

continuándose así indefinidamente la elaboración.

El plazo de una semana entre cada adición no es exacto y depende de la temperatura, de la

clase y capacidad de las bacterias acetificantes, del grado alcohólico y composición del vino. Pero

en general para producir 12 litros de vinagre es necesario esperar 7 semanas.

Generador de goteo o método alemán.

El fundamento de este método y su diferencia con el método de Orleáns está en emplear

virutas de haya que periódicamente quedan sumergidas en el líquido que está acetificándose. Así

se consigue aumentar la superficie de acetificación de la bacteria y mejorar la transferencia de

oxígeno, por lo que aumenta la velocidad de acetificación.

La cuba giratoria más elemental se prepara con un orificio grande en el centro de uno de

los fondos, para procurar la entrada de aire. En uno de los costados de esta cuba, en la parte más

alejada de la abertura, se practica un orificio estrecho, que puede obturarse con un tapón; es una

canilla de madera o de vidrio para vaciado del envase.

El tonel está dividido en dos partes desiguales por un falso fondo, agujereado con

numerosos y finos orificios. La parte menor del tonel está llena de virutas de haya. En este


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compartimento penetra un largo termómetro para

controlar la temperatura. Se obtienen cantidades de

vinagre, que pueden llegar como máximo, cada 48 h, a

la cuarta parte del contenido de un tonel. El vinagre

elaborado, que se extrae de las cubas, se sustituye por

porciones iguales de vino, continuando la elaboración

indefinidamente.

Se emplean toneles verticales de encina con

doble fondo, como se ve en la Figura 8. Sobre el

primero, agujereado, se colocan capas de virutas de

madera de haya, impregnadas de vinagre de buena

calidad. Sobre el borde superior se lleva un diafragma

perforado, con los orificios obturados con algodón.

Al pasar el vino por el diafragma, burbujea el aire que existe entre las virutas. El vinagre se

extrae por la parte inferior. Se pueden emplear barriles giratorios de roble, parcialmente llenos

de virutas, consiguiéndose así una mejor aireación.

Las ventajas que se destacan en este proceso son la regulación de oxígeno y su uso para la

producción continua de vinagre. El vinagre obtenido con el método de cultivo superficial tiene el

aroma y el gusto propio de la lentitud de la acetificación que se ve favorecido por el simultáneo

envejecimiento.

Los principales inconvenientes de estos métodos que utilizan virutas como soporte son: la

acumulación de bacterias muertas sobre las virutas, debido a la falta de aireación y aumentos de

temperaturas; el desarrollo de bacterias productoras de celulosa (Acetobacter xylinum); la

infección por anguílulas (pequeños nematodos) que son imposibles de combatir una vez que se

desarrollan; los aumentos de temperatura difícilmente controlables, con perdidas de alcohol por

evaporación en la corriente ascendente de aire caliente, y descenso del rendimiento; la

necesidad de gran espacio (generadores de relleno).

Procesos sumergidos

Se entiende por fermentación sumergida aquella en la que no se utiliza material poroso o

soporte, sino que se hacen circular pequeñas burbujas de aire a través de la biomasa, con lo que

se favorece el proceso fermentativo. Emplea toneles de madera o tanques de acero inoxidable

Figura 8. Diagrama de un generador de filtro de goteo para vinagre.


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quedando siempre una parte del vinagre de la operación anterior como inóculo para iniciar el

ciclo siguiente.

Se llena con vino, y se introduce posteriormente una fuerte corriente de aire. La

acetificación es muy rápida. Este proceso se utiliza ampliamente en la actualidad. Los

rendimientos de la transformación del alcohol en ácido acético resultan ser muy elevados, y la

velocidad a la que se desarrolla el proceso es mayor, así como la uniformidad del producto y,

sobre todo, se puede lograr la acetificación de iguales volúmenes de alcohol en mucho menor

volumen de instalación, con el consiguiente ahorro de espacio. Se puede trabajar con

dispositivos automáticos que no sólo regulen el control de la aireación, sino también los ciclos de

carga y descarga.

El fundamento es la presencia de cultivo sumergido en el seno del líquido a acetificar, que

se satura constantemente de pequeñas burbujas de aire. Una mayor población bacteriana así

como la disponibilidad de oxígeno por los microorganismos permiten obtener un mayor

rendimiento de la transformación de etanol en ácido acético (rendimientos del 94%) y una

mayor velocidad del proceso (25-30 h). Este procedimiento requiere el estricto control de tres

parámetros: la temperatura, la presión parcial de oxígeno y los ciclos de carga y descarga.

La bacteria acética es viable entre 28-33ºC, pero la velocidad de fermentación varía en

función de la temperatura. La temperatura de la fermentación debe estar comprendida dentro

del intervalo 30-31ºC que es la óptima para un mejor rendimiento. La oxidación de etanol a

ácido acético es una reacción exotérmica que eleva la temperatura del depósito. Por lo tanto

cuando la temperatura se eleva, aumentan las pérdidas de alcohol y productos volátiles y, en

menor cantidad, de ácido acético, aunque lo más importante es que ocurra la parada del proceso

por la muerte de las bacterias.

Un elevado suministro de aire puede causar el fenómeno de sobreoxidación y arrastre de

los componentes volátiles, y por otro lado, su carencia puede paralizar la acetificación dado el

carácter aerobio de las bacterias. Además de la cantidad de aire, se debe tener en cuenta su

calidad y pureza, ya que las bacterias acéticas son sensibles a los contaminantes de este.

Todos los parámetros están interrelacionados en la acetificación. El etanol no debe llegar a

agotarse totalmente ya que las bacterias mueren rápidamente y se pierde el cultivo. Por ello en

este tipo de sistema de producción de vinagre, se suele llevar a cabo la acetificación en forma

discontinua realizándose ciclos de descarga-carga. Así se impide que las bacterias acéticas

metabolicen el ácido acético formado convirtiéndolo en CO2 y agua.


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Se descarga aproximadamente el 40-45% del volumen del líquido, que se repone con

nueva materia prima suministrándole sustrato a la bacteria. Por eso, se puede trabajar de forma

automatizada con dispositivos que regulen el control de la temperatura y de la aireación, así

como los ciclos de carga y descarga.

En la Figura 9 se muestra un esquema del acetificador, que esta constituido por un

depósito de acero inoxidable de entre 10.000 y 30.000 litros. Los conductos están rodeados por

un intercambiador de calor de agua para disipar el calor producido en el proceso y mantener la

temperatura a 30ºC.

Para evitar las pérdidas de compuestos volátiles se ha desarrollado un sistema cerrado,

mejorando sensiblemente los resultados del proceso fermentativo. El fermentador consta de un

sistema de recirculación de aire y un sistema de control automatizado que inyecta oxígeno en

dicha corriente a medida que este es consumido por la biomasa.

Figura 9. Fermentador sumergido para la producción de ácido acético.


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Diagrama de flujo

A continuación se representa el diagrama de flujo de la producción de vinagre:


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Fuentes de Información

- CRUEGER, W; CRUEGER, A. Biotecnología. Manual de microbiología industrial. Editorial

Acribia S.A. Zaragoza, 1993. (Capítulo 8: Ácidos Orgánicos)

- http://www.uco.es/dptos/ing-quimica (Cátedra Enología - Tema 2)

- http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema22MI.html

- http://es.wikipedia.org/wiki

- http://www.alimentosargentinos.gov.ar (Cadenas Alimentarias – Vinagre)

http://www.uco.es/dptos/ing-quimica

http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema22MI.html

http://es.wikipedia.org/wiki

http://www.alimentosargentinos.gov.ar/

Fermentaciones aeróbicas especiales

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