Proyecto de Innovación Tecnológica2015

DATOS DEL PROYECTOTítulo del Proyecto: Desarrollo de un sistema autónomo de multifrecuencia óptica para la detección, conteo y determinación del grado de genotoxicidad presente en fases mitóticas de especies allium. Disciplina: Genotoxicidad

Tiene una solicitud de patente: No ( X ) Si ( ) Número de solicitud:

Título de la invención:

Sistema autónomo de multifrecuencia óptica para la detección, clasificación, conteo y determinación índice mitótico en ensayos genotoxicos por el método estadarizados de especies Allium Cepa.

Nombre del Responsable: Dr. Fernando Hernández Aldana.

Si colaboran más integrantes mencionarlos:

Dr. Ivl Tonahtiuh Rendón Romero.

Nombre del estudiante becario: Claudia Mejía Morales.Matricula: 214470704

Programa Académico: Maestría en Ciencias Ambientales

Nombre del estudiante becario: Sandra Esmeralda García TolentinoMatricula: 213470968Programa Académico: Maestría en Manejo Sostenible de Agroecosistemas

INFORMACIÓN DEL PROYECTO

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Indique el Área de aplicación

( ) Salud ( X ) Energía y Medio Ambiente

( ) Electrónica, Computación y Comunicaciones

( ) Agroalimentación ( ) Biotecnología ( ) Materiales

( ) Otro ______________

Resumen:

Se plantea el desarrollo de un sistema (prototipo) autónomo de adquisición y procesamiento de imágenes digitales por multifrecuencia óptica, como una solución económica, rápida y precisa, para la detección, clasificación y conteo de fases mitóticas existentes en muestras histológicas de especies Allium Cepa, durante la aplicación de ensayos genotóxicos para sustancias químicas, o la mezcla compleja de ellas, disueltas en aguas residuales.

El sistema integrará diversos sistemas opto-mecatrónicos, así como algoritmos que implementen metodologías estadísticas validadas tanto para el procesamiento y reconocimiento de patrones en imágenes digitales multiespectrales, como para el procesamiento de datos con miras de evaluar y determinar el grado de toxicidad existente en las muestras de estudio.

La validación del prototipo permitirá contar con un sistema comercial -adaptable a cualquier microscopio electrónico del mercado-, que facilite y agilice la evaluación del grado de toxicidad y riesgo ambiental presente en un cuerpo de agua residual con, o sin tratamiento, con la misma precisión y confiabilidad con la que lo haría un experto en la materia. Se espera que la implementación del sistema en diversos laboratorios de investigación y agencias gubernamentales del orbe, coadyuve a la adquisición de nuevos conocimientos relacionados con el uso e incorporación de nuevos productos en el mercado, el establecimiento, o reajuste, de los niveles de concentración considerados como permisibles en la normatividad vigente, además de permitir el monitoreo y la reutilización de los afluentes residuales con procesos de acondicionamiento, en la industria agrícola, esto es: para riego de cosechas, estableciendo prácticas que garanticen la inocuidad del recurso para los cultivos y la salud de sus consumidores finales.

Palabras Claves: Conteo de fases mitóticas (mitosis counts), ensayos de genotoxicidad, índice mitótico, reutilización de aguas residuales

Planteamiento del problema a resolver:

La determinación del índice de fase mitótica, dentro de los ensayos de genotoxicidad en la metodología estandarizada para las especies Allium Cepa, es un procedimiento central, moroso, manual y repetitivo, que aun debe ser realizado bajo el criterio visual de un experto en la materia.

Debido a la gran número de células presentes en cortes histológicos de los tejidos vegetales en estudio (cerca de 8000 por grupo de estudio), a los diferentes estados de mitosis o aberraciones cromosómicas que pueden presentarse en una imagen digital y al volumen de información existente y documentada, con referencia a las características visuales y de composición orgánica de estos sistemas biológicos, es factible proponer el desarrollo de sistemas autónomos de adquisición y procesamiento de imágenes digitales, de tipo multiespectral, para la detección, clasificación y conteo de fases mitóticas existentes en cortes histológicos de tejidos vegetales, de forma automática, rápida, económica, y precisa.

Con este tipo de sistemas, se pretende agilizar la evaluación del grado de genotoxicidad ocasionado por una determinada concentración compuestos químicos liberados en el medio ambiente, permitiendo canalizar las competencias del especialista en otros aspectos de igual o mayor relevancia en su área de conocimiento y que no resultan ser

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un procedimiento repetitivo.

La implementación de dichos sistemas, en laboratorios y agencias gubernamentales de todo el planeta, se estiman como capaces de agilizar la evaluación de impacto ambiental ocasionados por un contaminante, o la mezcla compleja de éstos, sistemas públicos y privados de tratamiento de agua residual, garantizando la inocuidad del recurso, para su descarga o empleo en sistemas de riego en el sector agropecuario.

Antecedentes del Proyecto a desarrollar:

La utilización de aguas residuales en la agricultura, es considerada hoy en día como una ruta alternativa para el abastecimiento de agua en aquellas regiones que presentan un déficit hídrico o que mantienen en una fuerte competencia por el recurso con zonas urbanas e industriales de alta demanda [1].

Con un adecuado tratamiento, el agua residual puede generar un valor agregado para los usuarios urbanos, los agricultores y el medio ambiente [2]; por una parte, la eliminación de infraestructura y procesos de extracción, bombeo y transporte del recurso, desde su fuente natural, puede representar un ahorro significativo en los costos fijos de los consumidores; por otro lado, el aporte de nutrientes puede mejorar la fertilidad del suelo, dado los altos contenidos de materia orgánica usualmente presentes en la misma [3], además de disminuir el uso de pesticidas y elevar la calidad y la cantidad de la producción; finalmente, la filtración de dichos nutrientes en el ecosistema pueden fortalecer las funciones vitales de los organismos vegetales de la biósfera, favoreciendo con ello, de manera colateral, el desarrollo de las cadenas tróficas que dependan de ellos.

El consumo anual de los sistemas agrícolas representa cerca del 70% de la demanda mundial [4]. Se estima que alrededor de 20 millones de hectáreas de tierra (casi el 7% del área total) en el mundo son regadas con aguas residuales; En México, particularmente, las aguas residuales son clasificadas dentro de dos grupos, municipales e industriales [5]. De las municipales alrededor del 40.5% son tratadas, y de las industriales un 15.8%; el agua residual de actividades como la refinería altera la calidad del agua en el país; sumado a esto, no toda el agua que es tratada cumple con la normatividad correspondiente. (Jiménez C. B., 2014, págs. 314,329). En Puebla, por ejemplo, sólo 38 plantas realizan algún tratamiento a sus aguas residuales; un 81% recibe tratamiento primario y un 17% recibe tratamiento secundario o convencional con filtros biológicos, lodos activados y sistema dual.

Este tipo de prácticas detonan un conjunto de problemas de salud, que se ocasionan no sólo por la presencia de microorganismos patógenos disueltos en los cuerpos de aguas residuales, a conto plazo, sino también a su alto contenido de sales, metales pesados y mezclas complejas de compuestos orgánicos, e inorgánicos, que, a mediano y largo plazo, cambian la química del suelo, afectando la fertilidad del suelo [3] y por ende, la propiedades biológicas de las cosechas debido al desarrollo de procesos de bioacumulación [6].

De acuerdo al Procedimiento de Uso Seguro de Aguas Residuales en la Agricultura [4], estos inconvenientes pueden ser controlados mediante la operación de sistemas de tratamiento de agua que operen pertinentemente bajo la dirección de tres componentes interdependientes: a) un sistema de valoración, b) un sistema de administración y C) un sistema de verificación y monitoreo.

Sobre este último, los ensayos de biotoxicidad en sus diferentes ramas: genotoxicidad, citotoxicidad, mutageneidad, etc., representan un medio sencillo, económico e idóneo para determinar el efecto real de impacto biológico y riesgo ambiental (gestado incluso

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por la presencia de niveles bajos de contaminantes o mezclas complejas de ellos disueltos en las aguas tratadas, considerados como permisibles, dentro de la normatividad vigente), en comparación con otras técnicas o instrumentos físicos, ópticos o químicos disponibles en el mercado [7].

Las plantas, a su vez, han demostrado poseer una mayor sensibilidad en los ensayos de biotoxicidad, con respecto al empleo de células provenientes de microorganismos o mamíferos [8-9]. Gracias a su larga cadena de cromosomas, algunas especies permiten el desarrollo de análisis de tipo citológico, presentando además una adecuada correlación con todos los sistemas biológicos conocidos [7]. Por ende, el potencial efecto mutagénico y citotoxico de los compuestos químicos presentes en las aguas residuales, el efecto más grave de un compuesto químico liberado en el medio ambiente, pueden ser medidos a través del análisis anatómico (crecimiento de las raíces, deformaciones, torceduras) y de los parámetros microscópicos (aberraciones cromosómicas, alteración del índice mitótico o formación de micronúcleos) [10] presentes en los tejidos vegetales.

Particularmente, la especie Allium Cepa es considerada como un eficiente bioindicador y método estandarizado en estudios de genotoxicidad, debido a su cinética de proliferación celular, el rápido crecimiento de raíces, su largo número de células en división, la elevada tolerancia que presenta ante diferentes condiciones de cultivo, su disponibilidad anual, su fácil manejo y a su reducido número de largos cromosomas (2 n = 16) [11-12].

Dentro de su metodología estandarizada, el punto medular del estudio deviene de la precisa evaluación de aberraciones cromosómicas o alteraciones presentes en el ciclo mitótico de la especie, a través del estudio de imágenes digitales (obtenidas mediante microscopio electrónico a 20, 200, 400 o 100X de amplificación), provenientes de cortes histológicos de las raíces.

El desafío de este procedimiento manual, repetitivo y siempre realizado por un especialista, se encuentra en la correcta y precisa identificación, clasificación y contabilización de las diferentes fases o estados de mitosis presentes en las células visibles en la imagen digital (un promedio de 8000 células por grupo [13], y el subsecuente cálculo que permite determinar el índice mitótico del bioensayo y, con ello, definir el grado de toxicidad generado por la concentración de las sustancias químicas, o la mezcla compleja de ellas, en estudio.Debido a las características visuales documentadas tanto de los diferentes estados de mitosis (interfase, profase, matafase, anafase o telofase), como de los tipos de aberraciones cromosómicas observables en muestras histológicas, es perfectamente factible plantear el desarrollo de sistemas autónomos de procesamiento de imágenes y evaluación del índice mitótico, que permitan elevar la precisión y la rapidez en la aplicación de un bioensayo de toxicidad y que agilicen la generación de información pertinente y necesaria, para la implementación o corrección de indicadores de impacto ambiental, dentro de la normatividad establecida en sistemas de monitoreo y mejoramiento de los procesos de tratamiento de aguas residuales, así como para la aprobación de producción y comercialización de nuevos productos en el mercado global [14].

En base a lo expresado, el presente proyecto de innovación propone el desarrollo de un sistema autónomo de multrifrecuencia óptica (prototipo inicial), capaz de adquirir y procesar imágenes digitales provenientes de cortes histológicos, visualizados con un microscopio electrónico. El objetivo final de dicho proyecto es de obtener un sistema comercial, a mediano plazo, que permita evaluar el grado o nivel de toxicidad presente en las muestras de estudio, de una manera rápida, económica y precisa.

Los detalles de la propuesta, se incluyen en las diferentes secciones del presente documento.

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Fundamentación del Proyecto:

- Posibilidad de usar sensores para detectar, clasificar y cuantificar imágenes, introducir estos datos en un sistema estadístico para evaluar la genotoxicidad de las muestras acuosas.

Objetivo:

Desarrollo de un sistema autónomo de adquisición y procesamiento de imágenes digitales por multifrecuencia óptica (prototipo), para la detección, clasificación y conteo de fases mitóticas presentes en muestras histológicas de especies Allium Cepa, provenientes de ensayos de genotoxicidad aplicados en sistemas de tratamiento de aguas residuales.

Se plantea además el procesamiento autónomo de datos para el cálculo y determinación del índice mitótico, y por ende grado de toxicidad, presente en las muestras de estudio.

Objetivos específicos:

1. Diseño y construcción de un sistema opto-mecatrónico autónomo de multifrecuencia óptica, montado en un microscopio electrónico, para la adquisición de imágenes digitales provenientes de cortes histológicos de las raíces de especies del género Allium Cepa.

2. Desarrollo de algoritmos e implementación de metodologías estadísticas validadas para la detección, segmentación y clasificación de aberraciones cromosómicas observables en las imágenes adquiridas y procesadas digitalmente.

3. Integración de métodos estadísticos en algoritmos de conteo de fases mitóticas, para la determinación del grado de toxicidad del ensayo genotóxico.

4. Creación de una interfaz gráfica para el control y configuración del sistema autónomo.

Metodología:

A continuación de describe la metodología a desarrollar, en relación con el objetivo particular que le corresponde.

1. Objetivo particular uno.a. Se contempla el diseño asistido por computadora (CAD), de todos los

elementos opto-electrónicos (cámaras, tarjetas arduino, motores, óptica, sensores, mecanismos, etc.) que permitirán el montaje e implementación del sistema de adquisición de imágenes digitales de multifrecuencia óptica (SAIMO), en un microscopio electrónico.

b. Obtención física los elementos mecánicos del inciso anterior, en plástico ABS, mediante el uso de una Impresora 3D.

c. Empleo de diferentes programas de software para el diseño y simulación

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de sistemas electrónicos (circuitos), protocolos de comunicación y sistemas de integración y control autónomo (programación con el ID de Arduino) de los elementos constitutivos del SAIMO

d. Construcción de circuitos opto-electrónicos. e. Realización de pruebas y validación de los sistemas de control opto-

mecatrónico conceptualizados en los puntos c y d. f. Obtención de muestras de agua residual antes y después de recibir algún

tratamiento de acondicionamiento y/o la preparación de alícuotas con diferentes concentraciones de un contaminante conocido.

g. Implementación del método estándar de genotoxicidad aplicable en especies del género Allium Cepa, para la adquisición de cortes histológicos de raíces irrigadas con las muestras de agua descritas en el inciso anterior.

h. adquisición de imágenes digitales de multifrecuencia óptica, provenientes de los cortes mencionados en el inciso g.

2. Objetivo particular dos.a. Se plantea el desarrollo de algoritmos que incorporen diferentes

metodologías estadísticas validadas: laplaciana, Gausiana, thresholding-bayesiana, morfología, contorno activo, etc., así como el uso de estrategias de selección multiespectral, para lograr una detección, segmentación y clasificación precisa de las aberraciones cromosómicas presentes en las imágenes histológicas procesadas digitalmente.

b. La validación de la precisión alcanzada por los algoritmos creados en este punto, se realizará mediante la comparación de los resultados obtenidos por el sistema, versus aquellos generados por el análisis de un especialista, con respecto de los mismos cortes histológicos.

3. Objetivo particular tres:a. Se contempla el diseño de un algoritmo de análisis de fases mitóticas, que

incorpore el método estadístico “Probit”, durante la determinación del grado de genotoxicidad de las sustancias en estudio.

4. Objetivo particular cuatro:

Desarrollo de una interfaz gráfica para el control y/o ajustes de los parámetros o procesos de análisis realizados por el sistema autónomo de adquisición y procesamiento de imágenes digitales por multifrecuencia óptica, objetivo de la presente convocatoria

Desglose de presupuesto:

Descripción CantidadMicroscopio electrónico con campo claro y campo obscuro

USD $ 7,155.00

Lap top $ 19,000.00Material opto-mecatrónico $ 23,675.00

Total: $150,000.00

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Bibliografía:

1. James Winpenny, Ingo Heinz, Sasha Koo-Oshima. Reutilización del agua en la agricultura: ¿Beneficios para todos?. Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura; Roma 2013

2. http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/rlc/utf017arg/estudio/aguasresiduales/ REUSO_SEGURO_DE_AGUAS_RESIDUALES_EN_ARGENTINA.pdf. FAO. (ultima consulta: 19 Enero 2015).

3. James Winpenny, Ingo Heinz, Sasha Koo-Oshima. Efecto del riego con aguas residuales sobre propiedades químicas de suelos de la planicie de Coro, Estado Falcón. Bioagro 20(3): 193-199, 2008

4. Safe Use of Wastewater in Agriculture; Proceedings Series No. 11. Published by UNW-DPC, Bonn, Germany, August 2013

5. Estadísticas del Agua en México, Comisión Nacional del Agua. Edición 2012. 6. Tomer Malchi, Yehoshua Maor, Galit Tadmor, Moshe Shenker, and Benny Chefetz. Irrigation

of Root Vegetables with Treated Wastewater: Evaluating Uptake of Pharmaceuticals and the Associated Human Health Risks. Environ. Sci. Technol. 2014, 48, 9325−9333

7. Agnes Barbério, Bioassays with Plants inthe Monitoring of Water Quality. InTech 2013.8. Hongxia Gao, Yidian Dong, Chunyan Meng ,Weijun Guan, Yingli Liu and Guizhi Xing.

Investigation of organic pollutants in wastewater-irrigated soiland its DNA damage and oxidative damage on mice. Environ Monit Assess (2013) 185:2475–2482.

9. Namita Khanna and Sonia Sharma. Allium Cepa Root Chromosomal Aberration Assay: A Review. Indian J. Pharm. Biol. Res Vol. 1 (3), Sep., 2013.

10. Celik M., Yuzbasioglu D., Unal F., Arslan O., Kasap R. Effects of dinocap on the mitosis of Allium cepa L. Cytologia, 2005; 70: 13-22.

11. Chakraborty R., Mukherjee A.K., Mukherjee A. Evaluation of genotoxicity of coal fly ash in Allium cepa root cells by combining comet assay with the Allium test . Environmental Monitoring and Assessment, 2009; 153: 351-357.

12. Sik L., Acar O., Aki, C. Genotoxic effects of industrial wastewater on Allium cepa L. African Journal of Biotechnology, 2009; 8: 1919-1923

13. W.M. Howell, G.E. Keller III, J.D. Kirkpatrick, R.L. Jenkins, R.N. Hunsinger and E.W. McLaughlin. Effects of the plant steroidal hormone, 24-epibrassinolide, on the mitotic index and growth of onion (Allium cepa) root tips. Genet. Mol. Res. 6 (1): 50-58 (2007).

14. Rand, G. & S. Petrocelli. Fundamentals of aquatic toxicology. Hemisphere Corporation, Washington, D.C. 1985; 665 p.

Otros:

METAS COMPROMISO A LA CONCLUSIÓN DEL PROYECTO

Los compromisos del proyecto son:

1. Contar con un prototipo opto-mecatrónico físico portable, de laboratorio, para su implementación en microscopios electrónicos.

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2. Obtención de algoritmos específicos para la detección, segmentación y

clasificación precisa de las aberraciones cromosómicas presentes en las imágenes histológicas procesadas digitalmente, así como el conteo del índice mitótico de las muestras y la evaluación del grado de impacto ambiental mediante en la implementación del método Probit.

INFORMACIÓN DE POTENCIAL COMERCIALVENTAJAS POTENCIALES

Se perciben tres, inicialmente:1. Contar con un sistema comercial opto-mecatrónico compacto, portable, de

tipo plug and play, el cual permita su rápida y sencilla implementación en microscopios electrónicos de cualquier marca.

2. La precisión, rapidez y confiabilidad de sus algoritmos de evaluación de índices mitóticos y grado de toxicidad, aunados al desarrollo de una interfaz gráfica accesible y de manejo sencillo, permitirá posicionar el prototipo, en el mercado, como un dispositivo de uso cotidiano en laboratorios y centros de investigación públicos o privados, alrededor del mundo.

3. El prototipo inicial constituirá un sistema capaz de integrar nuevos y diferentes análisis de laboratorio, conforme se dé seguimiento al proyecto y

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METAS COMPROMISO DE TIPO DE DESARROLLO

( ) Proceso o metodología ( ) Equipo o dispositivo

( X ) Otro (especificar)

Prototipo inicial del sistema autónomo descrito

INDIQUE EL GRADO A ACANZAR DEL ENTREGABLE AL FINALIZAR

( ) Metodología ( ) Diseño ( X ) Prototipo de laboratorio

( ) Diseño industrial o para escalamiento ( ) Modelo escala real ( ) Otro ______________

se perciban necesidades específicas del mercado actual.

COMPARACIÓN CON OTROS DESARROLLOS TECNOLÓGICOS O INNOVACIONES RELACIONADAS

A diferencia de los sistemas existentes en el mercado, los cuales presentan una amplia batería de algoritmos y métodos de análisis (no sólo para el cálculo de índice mitótico), enfocados la adquisición y procesamiento de análisis de las imágenes digitales, el sistema propuesto plantea la posibilidad de contar con un dispositivo sencillo, confiable y portable, capaz de ser implementado en microscopios de diferentes marcas, como un aditamento extra de su equipo actual. Esto, comercialmente, permite amplificar las prestaciones de su infraestructura, sin la necesidad de adquirir voluminosos elementos de hardware o costosos programas de software que incluyan métodos de análisis que no son de utilidad para los objetivos del programa o los procedimientos de análisis habituales de laboratorio.

Al integrar sistemas de adquisición y procesamiento de imágenes por mutifrecuencia óptica, se pretende posibilitar la eliminación de marcadores que eleven el contraste de las imágenes, simplificando así el los pasos de preparación de las muestras, para su posterior análisis bajo el microscopio.

Junto con el sistema propuesto, a mediano plazo podría ofertarse el desarrollo o adición de módulos de análisis independientes, software, que satisfagan las necesidades específicas del mercado objetivo.

NECESIDADES DEL MERCADO QUE CUBRE LA TECNOLOGÍA O INNOVACIÓN

Determinación automática de conteos de fase mitóticos, con la correspondiente determinación de grado de toxicidad resultantes de la práctica de ensayos biotóxicos, independientemente del tipo de sistemas empleado como bio-indicador (vegetales, mamíferos o microorganismos).

Obtención de un equipo opto-mecatrónico sencillo, preciso y portable, para su adaptación en microscopios de cualquier marca.Su utilización coadyuva al desarrollo de investigación en laboratorios públicos y privados de todo el mundo, con respecto de las áreas de toxicidad, medio ambiente y ramas de la biología, así como al establecimiento de parámetros pertinentes en la publicación, dentro de las normas nacionales e internacionales.

ANÁLISIS DE COMPETENCIA (Información sobre competidores, así como de productos y/o tecnologías competitivas)

En el mercado existen algunos equipos comerciales que, como ya se mencionó, contienen un amplio rango de metodologías y algoritmos para la adquisición y análisis de imágenes digitales, con y sin implementación de métodos ópticos de tipo multifrecuencial; su orientación principal, se encuentra enfocada en el análisis de

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tejidos humanos, la detección de neoplastias o el análisis de cultivos celulares. Al momento de presentar esta propuesta, no se han encontrado sistemas comerciales específicos para la determinación del grado de toxicidad presentes en sistemas vegetales, incluida la incorporación del método Probit. Todos los desarrollos en esta línea, se encuentran actualmente en fase de desarrollo experimenta.

Además, como se expresó en la sección anterior, los equipos comerciales carecen de portabilidad, lo que restringe su capacidad de uso, en locaciones diferentes ubicación actual.

Las características específicas de los equipos comentados, se pueden encontrar en las siguientes ligas:

Equipo: imagenXpres.micro-XlS, de la marca: Molecular Devices.http://www.moleculardevices.com/systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-xls-widefield-high-content-analysis-system equipo: Biostation CT, marca: Nikonhttp://www.nikoninstruments.com/es_AMS/Productos/Sistemas-de-Microscopia/Observacion-de-incubadora-de-celulas/BioStation-CT

USUARIOS Y/O CLIENTES POTENCIALES

Nacional: Laboratorios y centros de investigación públicos y privados que realicen ensayos de biotoxicidad en los compartimientos de aire, suelo y agua.

En el extranjero:

Laboratorios y centros de investigación públicos y privados que realicen ensayos de biotoxicidad en los compartimientos de aire, suelo y agua.

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