HIBRIDACIN IN SITU(o FISH)(o FISH) DEFINICINNueva tecnologa que utiliza secuenciasde ADN marcadas (sondas) para detectaro confirmar anomalas gnicas ocromosmicas que generalmente estn cromosmicas que generalmente estnms all del poder de resolucin de lacitogentica de rutina.HIBRIDACIN IN SITU La Hibridacin es el proceso de unindedoshebrascomplementariasdecidos nucleicos de origen distinto: - El ADN diana (monocatenario) - Un fragmento de nucletidosdenominado sonda (monocatenario) La tcnica se basa en la hibridacinde una sonda de ADN marcada conun compuesto fluorescente, sobre susecuencia complementaria en elgenoma en metafase o en interfase.SONDAS EN FISH Las sondas pueden ser fragmentos de ADN ode ARN cuya secuencia es complementaria alADN diana (blanco). Las sondas son modificadas qumicamente, ya Las sondas son modificadas qumicamente, yasea con sustancias radioactivas (fsforo, tritio)o flourocromos (rodamina, tintes ciano).SONDAS EN FISH.Estosfragmentosdebencubrir una regin de porlo menos 100Kb parapoder ser detectado almicroscopio. microscopio.TIPOS DE SONDASSegn el marcador utilizado, las sondas pueden ser:1. Radioactivas2. No RadioactivasDirectas: La sonda est marcada con un fluorocromo queseunencovalentemente al ADN. Losfluorocromosson seunencovalentemente al ADN. Losfluorocromossonmolculasque, al ser excitadaspor unaondadeluzdeterminada, emiten los electrones de su ltima rbita, yse expresa como una sealluminosa de un colordeterminado.Indirectas: La sonda est marcada con una molculadetectable mediante una reaccin inmunoqumica.(mecanismo homlogo al ELISA).TIPOS DE SONDAS segn su deteccin: SONDAS QUE DETECTAN CENTRMEROS ESPECFICOS DE CADA CROMOSOMA SONDAS QUE RECONOCEN UN CROMOSOMA COMPLETO O PINTADO CROMOSMICO SONDAS DE SECUENCIA NICA O DE LOCUS ESPECFICO o UNILOCUS o GENICAS. TIPOS DE SONDASEsta clasificacin se basa en el lugar cromosmicoque se utiliza.SONDAS QUE DETECTAN CENTRMEROSESPECFICOS DE CADA CROMOSOMA: Estas secuencias se llaman de ADNsatlite, que son Estas secuencias se llaman de ADNsatlite, que sonsecuencias de ADN que se encuentran en elcromosomarepetidos en tndemy miden cerca de 171 pb o demonmeros de 5pb.TIPOS DE SONDAS SONDAS QUE RECONOCEN UN CROMOSOMACOMPLETO O PINTADO CROMOSMICO. Sonunamezcladesondasquereconocemuchos Sonunamezcladesondasquereconocemuchosfragmentos de ADN (alelos, genes, seudo-genes) a lolargodeuncromosomadeterminado, generalmenteson obtenidos de bibliotecas genmicas. La tcnica para reproducir el cromosoma se conocecomo: Multiplex FISH.TIPOS DE SONDAS SONDAS DE SECUENCIA NICA O DE LOCUSESPECFICO o UNILOCUS o GENICAS. Detectansecuenciasquesoloseencuentranuna vez o dos veces en el genoma. una vez o dos veces en el genoma. Las sondas de este tipo se clonan encromosomas artificiales de levadura (YACs) ypueden medir cientos de pb.USOS DE LAS SONDASLAS SONDAS PUEDEN Detectar anormalidades cromosmicas directamente en una muestra clnica. Confirmar la identificacin deunpatgenoenun cultivo,LAS SONDAS PUEDEN SER UTILIZADAS PARAunpatgenoenun cultivo,que por otros mtodostardara mucho ms. Para determinar la extensindelainfeccinmedianteelestudio de muestras detejidos de varios rganos.OBJETIVO DE FISHDetectar secuencias especficas de cidosnucleicos en cromosomas metafasicos(divisin celular), o en clulas en interfase, yen secciones de tejidos morfolgicamentepreservados. preservados.POR LO TANTO, CON BASE EN LA TECNICA SE DIVIDE EN:FISH DE METAFASE Y FISH DE INTERFASEPara ver animacin:http://www.sciencemuseum.org.uk/exhibitions/genes/158.aspMETODOLOGA O ETAPAS1 fasePREPARACIN DE LA SONDA:Una sonda es un segmento de ADNmarcado con fluorescencia que escomplementario a la regin cromosmica de complementario a la regin cromosmica deinters.TCNICA FISH2 faseDESNATURALIZACIN:Para realizar la hibridacin entre las dos molculas de ADN, esnecesario desnaturalizar tanto las sonda como el ADN blanco;queseconsigueincrementandolatemperaturapor abajodelpunto de fusin.TCNICA FISCH3ra faseHIBRIDACIN:Los cromosomas desnaturalizados, seincubana37Cpara que las molculas de ADN puedan unirse de maneracomplementaria.Cunto tiempo dura una hibridizacin? Para asegurarnos de obtener unacoplamiento ptimo entre la sonda yel ADN diana se precisa alrededor de1-2horasparasondasbiotiniladaso 1-2horasparasondasbiotiniladasoconjugadas con fluorocromos y hasta12 horas paras sondas conjugadascon digoxigenina.TCNICA FISH4 faseVisualizacin:Tras la hibridacin, se lava y se procede a detectar lasonda, por ej: por medio de avidina conjugada afluorescena, en caso de sonda marcada con biotina, ose observa directamente cuando la sonda estmarcadaconfluorocromo. El anlisissepracticaen marcadaconfluorocromo. El anlisissepracticaenmicroscopio de fluorescencia. Las sealesfluorescentes indican la presencia de ADNcromosmico complementario.EJEMPLOS DEEn este caso particular, la sonda es una mezcla bicolor de dos s En este caso particular, la sonda es una mezcla bicolor de dos s En este caso particular, la sonda es una mezcla bicolor de dos s En este caso particular, la sonda es una mezcla bicolor de dos sondas distintasondas distintasondas distintasondas distintas para el cromosoma 22. La se para el cromosoma 22. La se para el cromosoma 22. La se para el cromosoma 22. La se al verde es un control interno situado en 22q13.al verde es un control interno situado en 22q13.al verde es un control interno situado en 22q13.al verde es un control interno situado en 22q13. Permite identificar r Permite identificar r Permite identificar r Permite identificar r pidamente los dos cromosomas 22.pidamente los dos cromosomas 22.pidamente los dos cromosomas 22.pidamente los dos cromosomas 22. para el cromosoma 22. La se para el cromosoma 22. La se para el cromosoma 22. La se para el cromosoma 22. La se al verde es un control interno situado en 22q13.al verde es un control interno situado en 22q13.al verde es un control interno situado en 22q13.al verde es un control interno situado en 22q13. Permite identificar r Permite identificar r Permite identificar r Permite identificar r pidamente los dos cromosomas 22.pidamente los dos cromosomas 22.pidamente los dos cromosomas 22.pidamente los dos cromosomas 22. La se La se La se La se al roja est al roja est al roja est al roja est situada en la regi situada en la regi situada en la regi situada en la regi nnnn DiGeorge DiGeorge DiGeorge DiGeorge, en 22q11.2. Puesto que, en 22q11.2. Puesto que, en 22q11.2. Puesto que, en 22q11.2. Puesto que ambos cromosomas 22 tienen la se ambos cromosomas 22 tienen la se ambos cromosomas 22 tienen la se ambos cromosomas 22 tienen la se al roja, en esta c al roja, en esta c al roja, en esta c al roja, en esta c lula no haylula no haylula no haylula no hay microdeleccion microdeleccion microdeleccion microdeleccion en la regi en la regi en la regi en la regi nnnn DiGeorge DiGeorge DiGeorge DiGeorge y este paciente no tendr y este paciente no tendr y este paciente no tendr y este paciente no tendr a el s a el s a el s a el s ndromendromendromendrome DiGeorge DiGeorge DiGeorge DiGeorge. .. .Esta metafase se ha hibridado con una sonda "depintado"paraelcromosoma4,quehacequeel cromosomacompletoemitafluorescencia.Unodelos cromosomas4deestepacienteeraanormal,peroeracromosomas4deestepacienteeraanormal,peroera difcildeterminarconlacitogenticaderutinasitena unapequeadeleccinterminalen4qosierael resultadodeunareordenacinmscompleja.Puesto que ambos cromosomas 4 son fluorescentes en toda su longitudynohaymaterialfluorescenteenningnotro cromosoma, no se detecta anomala. Esta metafase del mismo paciente anterior se ha hibridado conuna sonda para la parte terminal del cromosoma 4q.Puesto que slo hay una seal verde, se confirma que en uno de los cromosomas 4 falta material del extremo terminal del brazo q. Esto sugiere que la anomala es una deleccin terminalEsto sugiere que la anomala es una deleccin terminal pequea.Este caso es un buen ejemplo de cmo la citogentica de rutina y la FISH pueden usarse conjuntamente para diagnosticar con exactitud anomalas cromosmicas sutiles.Verde = cro. 13Rojo = cro. 21Azul claro = cro. 18Verde = cro. XRojo =cro. Y