fitomejoramiento tecnicas

7/28/2019 fitomejoramiento tecnicas

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295Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II

PARTE III

Mtodos para acelerar

programas de mejoramiento

e identifcacin varietal


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296 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II


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III. CAPTULO 1

Obtencin de PlantasDoblehaploidesPolci, Pablo; Conti, Vernica; Miranda, Rubn;Gear, Nicols

1 IntroduccinComentarios generales sobre loshaploidesPara referirnos al trmino haploide es nece

sario conocer previamente el origen de dichadenominacin, y denir algunos conceptos bsicos sobre el tema. Si consideramos haploideal individuo que posee un solo juego de cromo

somas de la especie, no estaramos incluyendo en esta clasicacin a aquellos individuosderivados de especies poliploides, cuya constitucin gentica es igual a la de los gametosnormales de dicha especie. Por ejemplo, unautopoliploide AAAA (2n = 4x) dara lugar a individuos haploides AA (n = 2x), que por tenerdos juegos cromosmicos (AA) no podran serincluidos en la denicin. Por lo tanto, una solucin sera denominar como haploides a losindividuos originados a partir de especies di-ploides, que posean un solo juego de cromosomas (n = x), llamandopolihaploides a aquellosindividuos con una composicin cromosmicaigual que la gamtica normal de la especie,que tengan dos o ms juegos cromosmicos(n > x). Otra posibilidad sera considerar el trmino haploide en un sentido ms amplio, coms amplio, comprendiendo en ste a todos los individuos queposean una constitucin cromosmica igual ala de los gametos normales de la especie (n =

2n/2). Llamaramos de esta manera monoploi-des ypolihaploides a los individuos provenientes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides(2n> 2x) respectivamente. De aqu en adelante, a los nes prcticos y en concordancia conla segunda denicin, nos referiremos al trmino haploide indistintamente del nivel de ploidade la especie en cuestin, como a aquellosindividuos que poseen la mitad del nmerocromosmico normal contenido en las clulassomticas de la especie.

Identifcacin de HaploidesVarios procedimientos facilitan la bsqueda

de haploides en muestras grandes en nmerode individuos. Algunos de ellos son:

Morfologa: las plantas haploides son,en general, ms pequeas que las diploides, tanto en sus partes vegetativascomo orales. Esto se debe principalmente a la disminucin en el tamao desus clulas. Es lgico pensar que el fenotipo ms pequeo de las plantas puede ser una primera aproximacin en labsqueda de haploides. Si esta disminucin de tamao fuera notable en las semillas, sera muy fcil realizar una seleccin mecnica, aunque esto sucede enpocas especies.

Poliembriona: la presencia de poliembriona facilita la deteccin de embriones

haploides. No obstante, debe realizarseel control citolgico correspondiente. Elporcentaje de embriones gemelos observados vara con la especie y el genotipo.

Genes marcadores: con este n puedeutilizarse cualquier par de alelos cuyosfenotipos dominante y recesivo seanfcilmente distinguibles. En la prctica,conviene utilizar marcadores que poseanmanifestaciones fenotpicas claras ensemilla o en plntula y de esta manerahacer una seleccin ms econmica entiempo y esfuerzo. Para identicar haploides en una variedad que se suponehomocigota, se realizan cruzamientoscon otra variedad que sea homocigotapara el alelo alternativo. La mayor parte de la descendencia ser heterocigota(diploide), con fenotipo dominante. Losindividuos que aparezcan con el fenotiporecesivo seran haploides, obtenidos porpartenognesis o andrognesis, segnsea el fenotipo recesivo materno o pater

no, respectivamente.AntecedentesEl valor de los haploides se conoce desde

1922, cuando se descubri la produccin espontnea de los mismos, siendo superior acien el nmero de especies vegetales capacesde producirlos in-vivo. Sin embargo, la frecuencia con la cual se producen es muy baja, convalores que van de 0,001 a 0,01%.

Entre los casos de haploida espontnea escomn la poliembriona, que, con una gran va


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riacin entre los distintos genotipos, ocurre enuna amplia gama de especies, gneros y familias. En estos casos es frecuente la aparicinde haploides procedentes de una sinrgida delsaco embrionario, puesto que se ha comprobado en muchas especies que las clulas antpodas degeneran antes de la fecundacin.

En 1966, Guha y Maheshwari descubrieronque las anteras de Datura innoxia Mill. generaban plantas haploides al ser cultivadas in-vitro.Este proceso, conrmado posteriormente porNitsch y Nitsch (1969) en tabaco, se ha utilizado para producir haploides en numerosasespecies. En el caso de Datura innoxia, las frecuencias de induccin son casi del 100% y elrendimiento es de ms de mil plntulas o callospor antera en condiciones ptimas (gura 1).

En estudios de andrognesis in-vitro se ha

detectado especial facilidad para regenerar haploides a partir de anteras aisladas o de granosde polen en miembros de la familia de las solanceas Tambin se han encontrado resultadossorprendentes en numerosos gneros de lascrucferas, gramneas y ranunculceas, aunque resulta comn observar diferencias signicativas, incluso dentro de un mismo gnero.No se ha logrado, sin embargo, el mismo xitoen especies arbreas y arbustivas.

para hacer frente a las demandas mundiales deproduccin. A pesar de que cada ao se liberanal mercado numerosas variedades, estas nopersisten demasiado. Los objetivos de mejoramiento a largo plazo no podrn ser alcanzadosa menos que se genere mucha variabilidad gentica que pueda ser utilizada con estos nesy que existan mtodos que acorten el tiemponecesario para la obtencin de variedades.

El advenimiento de las tcnicas biotecnolgicas y los avances en biologa molecular hanpermitido el desarrollo de nuevas herramientasde gran utilidad en el mejoramiento vegetal.Entre stas, la produccin de haploides y doblehaploides son herramientas interesantes yaque permiten acortar el tiempo requerido parala obtencin de nuevas variedades, siendo unbuen complemento para los programas de mejora tradicionales. Al carecer de genotipos hete

rocigotas, las poblaciones doblehaploides (DH)necesarias para encontrar genotipos raros pueden ser mucho menos numerosas, especialmente en el caso de caracteres recesivos, yaque stos no quedan enmascarados por los alelos dominantes. Las poblaciones DH, si se lascompara con poblaciones segregantes, presentan mayor variacin gentica aditiva y ausenciade varianza gentica debida a la dominancia.Es decir que cuando se utilizan poblaciones doblehaploides se eliminan las complejidades del

estado heterocigota y se facilita enormementeel anlisis gentico. De esta manera puedendistinguirse las mutaciones recesivas de formainmediata, haciendo que el proceso de seleccin sobre una poblacin de haploides resultems eciente (gura 2).

La produccin de haploides es una alternativa biotecnolgica de gran importancia y haresultado exitosa en varios cultivos, entre elloscebada, arroz, maz y trigo.

Un sistema de produccin de DH debe cumplir con tres requisitos bsicos para su utilizacin en programas de mejoramiento:

1. Debe producir lneas DH ecientemente apartir de todos los genotipos.

2. Los DH obtenidos deben ser normales yestables.

3. stos deberan representar una muestra alazar del conjunto de gametos parentales.

Entre las aplicaciones ms importantes de

los doblehaploides en el mejoramiento vegetalpodemos citar:

Figura 1. Obtencin de plantas haploides por cultivo de anteras.

Importancia de los haploides yaplicaciones en el mejoramiento vegetalLos mtodos tradicionales para el mejora

miento vegetal han sido practicados por cientosde aos. Actualmente se ha llegado a una etapa en donde estos mtodos son insucientes


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1. Acortamiento de los programas de me-

jora: el desarrollo de nuevos cultivares por losmtodos tradicionales actuales comprende tres

etapas fundamentales: a) generacin de variabilidad gentica, ya sea por medio de hibridaciones sexuales intra e interespecca, por

induccin de mutaciones, o por transformacingentica; b) recuperacin de progenies homocigotas a travs de generaciones repetidas deautofecundacin o retrocruzamiento, seleccionando a favor de los caracteres de inters; c)evaluacin del comportamiento de los nuevosmateriales en ensayos comparativos a campo.Estos pasos son bsicos en un programa de

mejora, pudiendo existir otras etapas en funcin del modo reproductivo de la especie. Aspor ejemplo, el tiempo requerido para la obtencin de un nuevo cultivar de trigo de cicloinvernal es de aproximadamente diez aos, atravs del mejoramiento tradicional (gura 3).

La biotecnologa se presenta como una alternativa atractiva, no slo para reducir el tiempode obtencin de los genotipos deseados, sinotambin para lograr una economa de mano deobra y espacio en el campo experimental.

En las plantas autgamas, con losmtodos convencionales de mejoramiento, la homocigosis prcticase logra recin luego de seis a ochogeneraciones de autofecundacin.Mientras que con una tcnica deproduccin de haploides seguida

de duplicacin cromosmica, esposible llegar a homocigosis completa en solo una generacin.

En las plantas algamas, la produccin de homocigotas resulta degran importancia. Al trabajar conespecies de polinizacin cruzadase favorece naturalmente la heterocigosidad, y, de ser posible laautofecundacin, la obtencin dehomocigotas se ve dicultada por laFigura 2. Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento

cuando los cultivares parentales dieren, tericamente, endos pares de genes. Si el genotipo buscado es, por ejemploel doble recesivo aabb, por autofecundacin convencionalse tiene una probabilidad de 1/16 de encontrarlo. Si se induce haploida, el mismo genotipo tendr una probabilidadde ocurrencia de 1/4 porque no se producirn los genotiposheterocigotas.

endogamia. En plantas bulbosas, rboles fru-

tales y forestales la homocigosisjuega un rol muy importante en elaceleramiento de los programas demejora. Debido al prolongado tiempo requerido para alcanzar la faseadulta, el proceso de mejora resultaextremadamente largo, an siendoposible la autopolinizacin.

2. Generacin de poblaciones de mapeo:

para el mapeo gentico de plantas, diversos tipos de poblaciones pueden ser utilizadas. Laseleccin del tipo de poblacin a usar se realiza en funcin de los objetivos de la investigacin y del tiempo y recursos disponibles. Laspoblaciones de mapeo con el mayor contenidode informacin son aquellas obtenidas a partirdel cruzamiento entre dos individuos homocigotos contrastantes. En las plantas F1 obtenidas,

el desequilibrio de ligamiento es mximo, y laspoblaciones derivadas a partir de estas plantasF1 procuran explorar este desequilibrio. Para

especies de autofecundacin o que toleran laautofecundacin pueden utilizarse poblacionesF2, Fn, RILs (Recombinant Imbred Lines), derivadas de retrocruzas y doblehaploides. Laspoblaciones de doblehaploides representanla variabilidad gentica entre los progenitoresluego de ocurrida una sola meiosis (F1), y son

especialmente indicadas cuando se realizanestudios con QTL (Quantitative Trait Locus), ya


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que al obtenerse genotipos 100% homocigotas

se dispone de poblaciones estables o inmortales de mapeo, permitiendo analizar la misma poblacin en diferentes aos y localidades,debido a la constante disponibilidad de semilla.

3. Estudio de especies poliploides: la induccin de haploides en plantas poliploidesfacilita el trabajo de investigacin y mejora, yaque permite manejar niveles de ploida menores para los estudios de herencia y la combinacin de caracteres de inters.

4. Fusin de protoplastos: al fusionar dosprotoplastos haploides se origina uno diploideque puede duplicarse y llevar a la obtencin deun hbrido interespecco o intergenrico, siendo esto una ventaja importante cuando se trabaja en hibridacin somtica.

5. Variacin gametoclonal: la andrognesisin-vitro provee un excelente sistema para analizar, a nivel esporoftico, la variacin debida arecombinacin y segregacin meitica. Las variantes gametoclonales expresan el carcter re

cesivo en la R0, a diferencia de las somaclonales, que requieren de autofecundacin y anlisis de progenie. Algunos logros de esta tcnica:

Frutos de tomate con mayor contenido de

slidos. Plantas enanas de arroz con granos ms

largos y con elevados niveles de protenas de reserva y ms macolladoras.

Plantas de Datura innoxia con contenidosms elevados de alcaloides en las hojas.

Plantas de tabaco con mayor resistencia

a bajas temperaturas. Plantas de Brassica napus con mayor

contenido de aceite del cido ercico enlas hojas. Este aceite se usa como lubricante en la industria.

6. Mutagenesis: si se aplica mutagnesisa un sistema de haploides, se obtienen mu

tantes slidos, logrndose la homocigosis delmutado rpidamente luego de la duplicacincon colchicina. Entre los agentes mutagnicosms frecuentemente utilizados se encuentra laN-metil-N-nitrosurea (20 mM), los rayos (0,5krad) y el etil metil sulfonato.

7. Transformacin gentica: rige el mismoprincipio que para mutagnesis. La transformacin de haploides permite la obtencin deltransgn en homocigosis luego de la duplicacin con colchicina. Puede realizarse con PEG

(polietilenglicol), microinyeccin o utilizandoAgrobacterium tumefaciens.

8. Produccin de plantas homogamti-cas: Asparagusofcinalises una especie cultivada, dioica, en la cual las plantas femeninasson XX y las masculinas son XY. De esta manera, para obtener una poblacin de plantasdeben cruzarse ambos tipos, lo que dar unaprogenie constituida por 50% de plantas XXy 50% de plantas XY. Sin embargo, desde elpunto de vista del productor, es deseable la obtencin de una poblacin constituida solamente por plantas XY, que tienen un menor contenido de bra y son, por lo tanto, preferidas porlos consumidores. Para solucionar este problema y obtener 100% de plantas masculinas seide un sistema que consiste en el cultivo deanteras y diploidizacin de plantas YY, llamadas supermachos. La ventaja de estas plantases que, al ser cruzadas con plantas XX darn100% de plantas XY, como se muestra en el

esquema 1.Con este sistema, en 1990 fue liberada unavariedad llamada Andrea (un hbrido obtenidocomo se mencionara anteriormente). Andreaes una variedad muy homognea, de alto rendimiento y de excelente calidad.

Obtencin de Haploides

Como se mencionara anteriormente, lasplantas haploides aparecen en muy baja frecuencia en la naturaleza, siendo necesaria la

Figura 3. Representacin esquemtica de los pasos requeridos para la obtencin de lneas puras enun programa de mejoramiento tradicional.


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posterior ocurrencia de duplicacin cromosmica para la obtencin de semillas. Por ello, laproduccin articial de haploides resulta siempre ms efectiva.

- Origen de los haploidesI. Ginognesis: desarrollo de un gameto fe

menino no fecundado. Se logra por:1. Castracin y aislamiento de las ores.

Por este tratamiento se han obtenido haploides de Triticum monococcum.

2. Polinizacin retrasada: la castracin delas ores y la posterior polinizacin en ellmite de la madurez receptiva del estig

ma permiten obtener hasta un 30% dehaploides en trigo.3. Presencia de dos clulas espermticas

con diferente velocidad de desarrollo: elmecanismo involucrado en la generacinde haploides estara basado en la faltade fertilizacin de la oosfera durante ladoble fertilizacin.

4. Polinizacin con polen inviable: a) utilizando polen extrao (tpico de cruzamientos interespeccos), incapaz de fe

cundar a la especie en cuestin, puedeservir de estmulo para inducir haploida,como sucede en el cruzamiento entreSolanum tuberosum x S. phureja (papasilvestre). El polen de la papa silvestrecontiene slo un ncleo generativo, producto de una gametognesis anormal,por lo cual la fertilizacin doble no lograproducirse, pero se forman embrioneshaploides por partenognesis; b) utilizando polen previamente irradiado.

5. Cultivo de ovarios: puede ser ecaz paraobtener haploides a partir de cruzamientos interespeccos.

II. Andrognesis: desarrollo de un gametomasculino. Se logra por:1. Cultivo de anteras: se ha inducido ha

ploida en mono y dicotiledneas, siendoms fcil en las ltimas. Es una tcnicasimple que, dependiendo del genotipoy de las condiciones de cultivo permiteobtener elevados nmeros de plantasen tiempos relativamente cortos. Ha sidoms difcil en los cereales, no obstantese obtuvieron haploides de arroz, trigo,

Esquema 1.


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cebada con diferentes grados de dicultad.

2. Cultivo de microsporas: en 1974 Nitschindujo la regeneracin de plantas haploides de Nicotiana terbium y Datura inoxiaa partir de cultivos en suspensin de microsporas, previo choque trmico a baja

temperatura de las ores. Este mtodotiene la ventaja de producir haploidesmasivamente (ms de 7000 plantas porbotn oral en tabaco), y de permitir laaplicacin de diferentes tratamientos alas microsporas como transformacin omutagnesis para luego obtener plantaspor embriognesis partiendo de una nica clula inicial. Para conseguir diferenciar plantas a partir de microsporas esnecesario quebrar el mecanismo respon

sable de la asimetra en la primera mitosis del polen.

3. Tcnica de gametoto indeterminado(ig): en 1969 J L Kermicle desarroll unatcnica en maz basada en la ocurrenciade una mutacin espontnea, encontrada en la lnea W23. El gen igprovoca unadisrupcin en el desarrollo del gametotofemenino, generando, luego del procesode polinizacin, que los ncleos espermticos ocasionalmente se desarrollenandrogenticamente. El desarrollo embrionario de los ncleos espermticos enel citoplasma materno resulta en la formacin de haploides androgenticos, ohaploides paternos.

III. A partir de alguna clula haploide delsaco embrionario distinta del gameto feme-nino (sinrgidas o antpodas).

IV. Cruzamientos interespecfcos o inter-genricos con eliminacin cromosmica:

se produce la fertilizacin de manera de que seforme un cigoto diploide, que a lo largo de lassucesivas divisiones mitticas, va perdiendoel genoma del individuo que aport el gametomasculino, como sucede en los cruzamientosentre Hordeum vulgare y H. bulbosum.

V. Interaccin ncleo-citoplasma: utilizando lneas de sustitucin y restauracin nuclearse encontr que los individuos con citoplasmadeAegilops caudata y ncleo de Triticum aes-tivum o Triticale mostraban una frecuencia de

haploida del 3,1% y del 52,9% respectivamente. Esto se debe a que ciertas interacciones entre un citoplasma y un ncleo extrao inducenhaploida.

VI. Semigamia: el ncleo del gameto masculino penetra en la ovoclula pero sin fusionarse con el ncleo femenino. Ambos ncleos

comienzan a dividirse independientemente,produciendo un individuo haploide con tejidosde origen materno y paterno.

- Mtodos ms utilizados para la obten-cin de plantas haploides

Entre los mtodos disponibles actualmentepara la obtencin de doblehaploides, los msutilizados son la hibridacin interespecca eintergenrica, la andrognesis, y recientemente la ginognesis en maz.

I. Cultivo de Anteras: consiste en el cultivo deanteras inmaduras en un medio de induccindonde las microsporas competentes originarncallos, que sern luego transferidos a un medioapropiado para la regeneracin de plantas (gura 1). En algunas especies de dicotiledneasel nmero de plantas obtenidas por cada cienanteras cultivadas es muy elevado. En cambio,en las gramneas la tcnica no ha sido tan exitosa. Sin embargo, los progresos en los mtodosde cultivo in-vitro durante las ltimas dcadashan permitido obtener buenos resultados congramneas (gura 4), an en aquellas consideradas recalcitrantes. La capacidad de respuesta al cultivo de anteras, denominada capacidadandrognica, puede ser evaluada a travs dela produccin de callos y de plantas verdes, ysu eciencia es altamente dependiente de:

1. El genotipo: es quizs el factor ms importante que afecta al cultivo de anteras.En la naturaleza, la haploida es contro

lada por el gen hap, llamado gen inhibidor de la haploida. Existe suciente evidencia que sugiere que la andrognesisin-vitro tambin est bajo control gnico,y que este carcter puede ser transferidodesde clones con alta respuesta a otrosno respondedores. Se ha hallado variabilidad en la respuesta entre especies yan dentro de ellas. En cebada y trigo loscaracteres induccin de callos y regeneracin de plantas son altamente hereda


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bles, y se ha sugerido que ambos caracteres estaran controlados por muchosgenes. Por lo tanto, el mejoramiento de lacapacidad andrognica no parece difcil,siendo la identicacin de genotipos congran capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporacin en losbloques de cruzamiento.

2. El % de albinismo: la ocurrencia de plantas albinas representa un serio problemapara la aplicacin del cultivo de anterasen programas de mejoramiento de cereales. La incidencia depende, no slode la especie, sino tambin de la variedad, citndose valores de 50, 70 y 100%para tres variedades diferentes de arroz.Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la velocidad de replicacin del

material nuclear y el de las organelas,resultando en un desarrollo retardado oincompleto de los plstidos, lo cual conducira a la produccin de fenotipos albinos. De acuerdo a este autor, el desarrollo de un sistema fotosinttico funcionales promovido por el tratamiento con ba

jas temperaturas, aunque no siempre unpretratamiento con fro reduce incidenciade albinismo.

3. Las condiciones de crecimiento de lasplantas donantes: la edad y las condiciones ambientales en que crecen lasplantas afectan considerablemente lacapacidad andrognica de las mismas.Los factores ambientales ms crticosson el fotoperodo, la intensidad de luz,la temperatura, la nutricin y la concen

tracin de CO2. Estos factores incidiranen la capacidad de producir las divisiones celulares morfognicas que conducen al desarrollo de embrioides y la regeneracin de plantas. Este ltimo pasoes crtico dentro de todo el proceso, esaltamente dependiente de la calidad delcallo, y est asociado fuertemente a todala historia previa del cultivo. En general,se ha informado que la utilizacin de anteras de las primeras oraciones favorece la respuesta andrognica, mientrasque las colectadas al nal de la estacinmuestran una menor respuesta al cultivo, generando una menor cantidad deembrioides. En Brassica napus, el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la produccin de embrioidesobtenidos a partir de anteras.

4. El estado de desarrollo de las microsporas: en la fase gametoftica de las plan

tas, que comienza luego de la meiosis,las microsporas sufren inicialmente unadivisin mittica asimtrica que da origena dos clulas de distintos tamaos: la generativa (ms pequea y con un ncleoaltamente condensado) y la vegetativa(ms grande y con un ncleo difuso).En las gramneas, el ncleo generativose divide nuevamente originando dosncleos espermticos. Uno generar elendosperma triploide al fusionarse con

Figura 4. Produccin de callos y plantas a partir delcultivo de anteras de Triticum aestivum. (A) Calloblanco y compacto sobre una antera (echa). (B)Detalle del callo sealado en (A). (C) Callo transferido a medio de cultivo para regenerar planta. (D)Plntula de trigo regenerada a partir de callo, consistema radicular en formacin. (E) Planta haploidecompleta nalizando la etapa de rusticacin, creciendo sobre sustrato inerte (Perlita).


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los dos ncleos polares del saco embrionario, mientras que el segundo fertilizara la osfera produciendo el cigoto diploide, que constituir el primer paso de lanueva fase esporoftica. Los embrioideshaploides se originan in-vitro a partir deuna de las vas que se enuncian a conti

nuacin. Cuando la primera divisin mittica de la micrspora es asimtrica, loshaploides se originan por repetidas divisiones de la clula vegetativa, de la generativa o de ambas. En cambio, cuandola primera divisin mittica es simtrica,ambas clulas resultantes contribuyen aldesarrollo del haploide. Por lo tanto, unaclula gamtica masculina puede revertirsu desarrollo gametoftico hacia el granode polen y dar origen directamente a un

nuevo individuo. En general, las microsporas que se encuentran en la primeradivisin mittica son las que mejor responden. Esto vara levemente con la especie vegetal, pero esta reversin no esposible luego de iniciada la deposicinde almidn. El estado ms apropiadopara los cereales es el de micrsporauninucleada media y tarda.

5. Los pretratamientos: distintos tipos deestrs aplicados durante el estado adecuado pueden enmascarar el programagametoftico e inducir la expresin degenes especcos del desarrollo esporftico. Si bien las bajas temperaturas sonconsideradas como el mejor pretratamiento, tambin otros pueden estimularla andrognesis, como el calor, el choque osmtico, la centrifugacin de lasanteras o hasta una incisin en la partesuperior de la inorescencia donante.

Tambin se citan la poda, la pulverizacincon etrel, la irradiacin, la reduccin enla presin atmosfrica, la anaerobiosis,el tratamiento en una atmsfera saturada de agua y la aplicacin de gametocidas. Las bajas temperaturas aplicadassobre la planta madre, sobre las yemasorales jvenes o sobre las anteras, generalmente estimulan la embriognesis.El fro estimula la divisin mittica simtrica de las microsporas. Esto se debe

ra a una alteracin en la orientacin delhuso que conducira a una primera mitosis anormal del grano de polen. Por otraparte, se ha mencionado que las bajastemperaturas retardan el envejecimientode la pared de la antera, lo cual aumentara la supervivencia y la viabilidad del

polen. En general, las temperaturas citadas varan entre 2 y 10 C y la duracindel tratamiento de 2 a 30 das. Es importante determinar la temperatura adecuada para cada especie vegetal, an paravariedades dentro de la misma especie.En algunas especies, tales como Capsi-cum annun, avena y algunos genotiposde trigo se ha logrado xito con un choque con alta temperatura. Temperaturasde 30 35 C durante los primeros 1 a 4

das del cultivo ayudaron a inducir la andrognesis en varias especies de gneroBrassica.

6. La composicin del medio de cultivo: esotro de los factores importantes para elxito en el cultivo de anteras. No existeuna recomendacin general y las variaciones dependen de la especie a cultivar.a) Medios de induccin: dos tipos deestrs, osmtico y nutricional, han sidoidenticados como causas disparadorasde la induccin de embriognesis en lasmicrosporas de mono y dicotiledneas.En tabaco, el cultivo de las anteras en unmedio carente de sacarosa durante losprimeros 6 das de la etapa de induccinpermiti una mxima respuesta andrognica. Los carbohidratos cumplen dosroles fundamentales en los medios de induccin, ya que actan como osmolito ycomo nutriente. Los agentes gelicantes

representan otro aspecto importante enla evolucin de los medios de induccin.Tradicionalmente se utiliz agar comogelicante de los medios de cultivo debido a su disponibilidad y bajo costo. Peroen 1973 se detect una mejor respuestaandrognica en tabaco cuando las anteras fueron cultivadas en un medio solidicado con agar y suplementado concarbn activado. En medios lquidos laadicin de Ficoll (polmero sinttico de


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sacarosa, inerte, no inico y de alto pesomolecular) incrementa la tensin supercial y la viscosidad del medio. De estamanera, las anteras y callos otan sobreel medio lquido y se desarrollan en condiciones aerbicas, permitiendo elevadas tasas de embriognesis y de produc

cin de plantas verdes. En cuanto a losreguladores de crecimiento, la mayorade los cereales requiere de la presenciade auxinas y de citocininas en el mediode cultivo y las respuestas parecen depender de los niveles endgenos de tales reguladores. Por ejemplo, para lograrla induccin en trigo es indispensable eluso de 2,4-D en concentraciones de 1,5a 2 mg/l. Existen otras sustancias que,adicionadas al medio de cultivo, ayudan

en la estimulacin de la andrognesis,como la glutamina y el inositol. Tambinse citan otros compuestos inespeccos como extracto de papa, de batata,de mandioca, de trigo germinado y deendospermas de arroz y de maz. Enocasiones, si el medio es suplementadocon leche de coco los granos de polendesarrollan directamente en embrioides.b) Medios de regeneracin: la variedadde medios de regeneracin citada esmenor cuando se la compara con la delos medios de induccin. Los ms utilizados son modicaciones derivadas delmedio MS, con concentraciones de carbohidratos similares a las utilizadas enlos medios de cultivo de tejidos tradicionales (30g/l de sacarosa), utilizando agar(0,6%) como gelicante, auxinas menospoderosas, y un balance hormonal a favor de las citocininas

7. Las condiciones de incubacin: las caractersticas ideales de cultivo son especcas para cada especie, y an paracada genotipo dentro de una misma especie. Estas afectan particularmente latasa de absorcin nal de nutrientes y laregeneracin de plantas verdes. La duracin e intensidad lumnica, la temperatura y la orientacin de las anteras sobre elmedio de cultivo pueden tener un efectoconsiderable en algunas especies.

II. Cultivo de Microsporas: comprende laobtencin de individuos haploides a partir demicrosporas aisladas. Las espigas son pretratadas y las microsporas liberadas son colocadas en un medio de cultivo donde desarrollarnembriones haploides que sern luego transferidos a un medio de regeneracin para originar

plntulas (gura 5). Este sistema es considerado el de mayor potencial para la produccinde doblehaploides, debido a que induce a lasmiles de microsporas que contiene una or adividirse y producir embriones. La ausencia dela pared de la antera podra mejorar la nutricin y eliminar las restricciones fsicas para laandrognesis. El cultivo de microsporas tienela ventaja de originar embriones de similar tamao y etapa siolgica debido a que puedensepararse las microsporas de tamaos seme

jantes por centrifugacin diferencial. La optimizacin de los diferentes pasos crticos parael xito de esta tcnica puede llevar a la obtencin de una alta cantidad de plantas verdescon menores costos y esfuerzos. Entre los fac

Figura 5. El diagrama muestra las diferentes etapas

del cultivo de anteras y de microsporas aisladas.Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas apartir de anteras hasta la obtencin de las plantashaploides pueden describirse como sigue: a) yemaoral previo a la antesis, 1b) anteras, 1c) anterasen cultivo, 1d) y 1e) proliferacin de las anteras, 1f)callo haploide, 1g) diferenciacin de callo, h) plantahaploide. Para el cultivo de microsporas aisladas:a) yema oral previo a la antesis, 3b) microsporasaisladas de una antera, 3c) cultivo de microsporas,3d) estado multinucleado, 3e) y 3f) embrin en desarrollo.


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tores determinantes de la eciencia del mtodopodemos citar:

1. Genotipo: se han citado cultivares de cebada con una alta respuesta al cultivo demicrosporas, en contraste con otros menos respondedores.

2. Albinismo: al igual que en el cultivo de

anteras, el nmero de plantas albinasdepende del genotipo, y tambin se veinuido por la densidad de cultivo de lasmicrosporas.

3. Condiciones de crecimiento de la planta donadora: el mantenimiento de lasplantas en condiciones controladas defotoperodo y temperatura es esencial ydebe ser ajustado en funcin de la especie. Se han citado excelentes resultadosen cebada cuando las plantas son culti

vadas en ambientes libres de patgenos,con alta humedad relativa (60-80%),fotoperodo de 16 hs de luz, y adecuadorgimen de fertilizacin y riego. Cuandolas plantas crecen estresadas, ya seapor riego excesivo, sequa, enfermedades, o la aplicacin de algn plaguicida,la respuesta al cultivo de microsporas esmenor.

4. Estadio de las microsporas: como se citara anteriormente para el cultivo de anteras, es imprescindible el chequeo delestadio correcto de las microsporas paraque conserven su capacidad andrognica.

5. Pretratamientos: los ms utilizados consisten en el uso de fro, estrs osmtico,presencia o ausencia de determinadosnutrientes, etc. Se ha demostrado que losnutrientes disponibles para las microsporas durante el pretratamiento constituyen

un factor decisivo que determina la calidad de los embriones originados.6. Densidad de cultivo de las microsporas:

la densidad de las microsporas en cultivoafecta el desarrollo de las mismas y elnmero de microsporas que entrarn endivisin. Existe una concentracin mnima para el desarrollo de las microsporas,y una densidad ptima para una mayorregeneracin. Las condiciones ms favorables deben ser ajustadas en cada caso

y para cada genotipo en particular.7. Medio de induccin: se han estudiado

diferentes concentraciones de azcares,distintas fuentes de nitrgeno orgnico,y la adicin de diferentes de auxinas almedio. En general se sugiere la sustitucin de sacarosa por maltosa como fuen

te de carbohidratos, la disminucin de laconcentracin de nitrato de amonio, elagregado de glutamina, y el empleo deAPA (cido fenil actico) como auxinapara favorecer la induccin.

8. Medio de regeneracin: la composicindel medio de regeneracin puede afectarel vigor y supervivencia de las plntulas.Kasha et al. (2001), trabajando con cebada, encontraron en este mtodo unamanera eciente de produccin de DH,

con una mejor respuesta y una menordependencia del genotipo que en el casodel cultivo de anteras. A esto se le sumala ventaja de contar con una elevadacantidad de microsporas haploides en unestado siolgico uniforme, que constituyen excelentes blancos para la mutagnesis, la seleccin y la transformacin.

III. Hibridacin Interespecfca e Intergen-rica: en este caso los haploides se originan atravs de la eliminacin del genoma del polinizador. El sistema de hibridacin de trigo xHordeum bulbosum, inicialmente descubierto yempleado con xito en cebada, ha sido considerado superior al cultivo de anteras por tresrazones:

1. La produccin de haploides es ms fcil.2. El tiempo requerido para la regeneracin

de plantas es menor.3. La eciencia en la regeneracin de plan

tas parece ser mayor. La gran limitante

de este sistema lo constituye el hecho deque la mayora de los cultivares de trigo no pueden cruzarse con H. bulbosumdebido a la presencia de los genes deincompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al desconocimiento del estado de estos genes enlos genotipos de trigo y de H. bulbosuminvolucrados en los cruzamientos, debido a que los genotipos se seleccionan enbase a criterios agronmicos y no a unsistema de compatibilidad de cruzamien


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tos con H. bulbosum. Para sortear estosinconvenientes, se ha sugerido comoalternativa realizar los cruzamientos detrigo utilizando maz como polinizador(gura 6). Luego de la fertilizacin delvulo de trigo por el polen de maz, durante las primeras mitosis del cigoto, los

cromosomas del maz son eliminados.Esto se debe a una incompatibilidad entre los cinetocoros de estos cromosomasy las bras de los husos acromticos quehace que en las primeras anafases loscromosomas de maz vayan quedando

rezagados en el citoplasma, donde nalmente son degradados. El resultadode este proceso es un embrin haploidede trigo. Seguidamente, los embrionesinmaduros deben ser rescatados en unmedio de cultivo apropiado. A travs delas cruzas con maz se han obtenido ha

ploides de trigo de cultivares tanto compatibles como incompatibles con H. bul-bosum, lo cual sugiere que el sistema deincompatibilidad no afecta al mtodo detrigo x maz, por lo que sera menos dependiente del genotipo.

Figura 6. Produccin de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maz (Zea mayz).(A) Espigas de trigo cortadas en el campo y castradas en el laboratorio. (B) Plantas de maz (donantesde polen) crecidas en invernculo. (C) Desgrane de espigas para realizar la desinfeccin de los granos yposterior rescate de embriones. (D) Grano con dos embriones haploides (poliembriona). (E) Embrionesinmaduros rescatados y creciendo in-vitro. (F) Planta rusticada. (G) y (H) Plantas con 3-5 macollos consus races sumergidas en solucin de colchicina para la duplicacin cromosmica. I. Plantas tratadas concolchicina y llevadas a macetas con tierra en cmara de crecimiento


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IV. Ginognesis in vivo en maz: el empleode lneas con elevada frecuencia de haploidescomo polinizadores motiv al desarrollo dela tecnologa para la obtencin de haploidesmaternos in-vivo. Este hallazgo abri nuevasposibilidades para el empleo de polinizadoresseleccionados en funcin de su capacidad de

incrementar las frecuencias de haploides. Lneas inductoras fueron desarrolladas a partirdel germoplasma de Stock 6 de elevada haploida. El mecanismo involucrado en la generacin de haploides estara basado en la faltade fertilizacin de la oosfera durante la doblefertilizacin. En relacin a este fenmeno se haplanteado la hiptesis en que se asume que laslneas inductoras de haploida presentan dosclulas espermticas con diferente velocidadde desarrollo (gura 7).

El mtodo de generacin de haploides maternos in-vivo involucra los siguientes pasos:

1. Generacin del cruzamiento del cual sedesean obtener lneas homocigotos (Generacin parental).

2. Fecundacin de la F1 con polen proveniente del inductor de haploida.

3. Identicacin de granos haploides.

4. Duplicacin de los individuos haploides.5. Autofecundacin de las plantas haploi

des duplicadas.La identicacin de los granos haploides se

realiza mediante el empleo de genes marcadores de color en embrin y endosperma, siendoel alelo rojo navajo Navajo crown (R-nj) el

ms frecuente. Aquellos cariopses con un embrin haploide (r-nj), resultantes de la falta defecundacin de la osfera, pueden distinguirseclaramente debido a la falta de expresin delmarcador antocinico dominante R-njen el embrin. Es decir que la expresin especca delgen R-njen el endosperma (Navajo crown) yen el embrin permite de manera rpida y precisa identicar aquellos granos con la potencialidad de producir plantas haploides (gura 8).

Duplicacin cromosmicaDespus de la duplicacin cromosmica,

ya sea espontnea o inducida, se logra la homocigosis y se restaura la fertilidad. La plantahaploide, sin duplicar, es estril por lo que nopodra producir semillas. Entre las tcnicas quehan sido utilizadas para la duplicacin de haploides cabe mencionar:

Figura 7. Generacinde haploides in-vivo a travs de fecundacin incompleta. La clula espermtica se une a los ncleos polares dando como resultado la formacin del endosperma (3n).La otra clula no logra fecundar a la osfera produciendo unembrin haploide (n)

1. La duplicacin espontnea durante la etapa de callo o de res

cate de embriones.2. La regeneracin de plantas doblehaploides a partir de callosde mdula de plantas haploides de tabaco.

3. Sustancias qumicas: aunquese conocen casos utilizandoagentes qumicos tales comoacenafteno, hidrato de cloral,sulfanilamida, etc., la mayorecacia se ha logrado con la

colchicina y el xido nitroso.La aplicacin del xido nitrosobajo presin (2-6 atmsferas)resulta de especial inters porsu fcil penetracin en los tejidos y la rpida desaparicin delos mismos cuando cesa la presin. Puede utilizarse en oresrecin polinizadas. La ventajaque presenta este tratamiento es que, al poder ser aplica


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do durante la primera divisin mitticadel vulo fecundado, se ve reducida laaparicin de quimeras. Por otro lado, losresiduos de este agente resultan menostxicos para la planta que otros que seaplican en forma lquida, aunque la frecuencia de aneuploides puede ser muyelevada. La accin de la colchicina fuedescubierta en 1937 y desde entoncesha pasado a ser prcticamente el agentediploidizante ms importante. Esta drogaacta impidiendo el autoensamblaje dela tubulina, inhibiendo as la formacinde los microtbulos del huso y, en consecuencia, la segregacin anafsica de las

cromtides. Afecta por lo tanto slo a lasclulas que se encuentran en divisin.Puede aplicarse a plntulas, plantasadultas, semillas, microsporas y anteras.El tratamiento puede realizarse utilizando una solucin acuosa donde se sumergen las races, dejando fuera la partearea. Tambin se puede hacer llegar lasolucin al interior de la planta utilizando una jeringa con la dosis deseada (microinyeccin), o por absorcin de la solu

cin a travs de los tallitos decapitados,sobre los que se vierte. Otra forma estratar los callos con colchicina antes detrasladarlos al medio de regeneracin.Este ltimo mtodo permite la obtencinde gran nmero de doblehaploides, peropresenta la desventaja de que la mayo

ra de las plantas as obtenidas son mosaicos cromosmicos. Otra alternativa,para microsporas y anteras, es la adicindel agente duplicador directamente en elmedio de induccin, antes de la primermitosis. La diploidizacin en este momento requiere menos tiempo y esfuerzoy ha sido utilizada en programas de mejoramiento de trigo, maz, Tritordeum yarroz. El problema de la suplementacindel medio de induccin con colchicina es

que reduce la embriognesis en trigo, sibien en Oryza sativa y Brassica la puedeincrementar. La duracin del tratamientoy la concentracin de la solucin varanpara cada especie.

Cualquiera sea el mtodo con que se duplique la planta, un macollo o slo una yema oral, lo importante es lograr que las semillas questas produzcan sean viables.

Consideraciones fnales

La eleccin de los progenitores y la seleccin son etapas decisivas en un programa demejoramiento que avanzar luego, generacintras generacin, hacia una homocigosis quepermita entrar en las etapas de evaluacin.Ganar tiempo en estos casos puede signicar una reduccin de costos muy importante yuna ms temprana entrada en el mercado dela nueva variedad. En el caso de una especie autgama, como el trigo, es posible ganar

generaciones haciendo dos cosechas en unao, especialmente en aquellos cultivares decorto ciclo vegetativo. Esto, sin embargo, diculta la observacin de algunas caractersticasagronmicas importantes, que no pueden serobservadas en los genotipos en esas condiciones, atentando contra una seleccin eciente.Para los trigos de tipo invernal y facultativos,con ligeros requerimientos de vernalizacin,esta ganancia de generaciones no es posibleo es compleja. La produccin de individuos

Figura 8. Marcadores de color en embrin y endosperma que permiten la seleccin de granos haploides


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doblehaploides que puedan participar anticipadamente en la etapa de evaluacin agronmica se plantea como una solucin promisoria aeste problema, reduciendo los tiempos y presupuestos.

Muchos interrogantes quedan an sin resolver, limitando la aplicacin extensiva de esta

tecnologa a algunos modernos programas demejoramiento vegetal. Algunas preguntas a lasque debemos encontrar respuestas son:

En que generacin segregante se aplica elmtodo de doblehaploides?

Cul es el nmero de individuos doblehaploides derivados de un cruzamiento, representativo de la variabilidad gamtica creadaen la cruza, que permita un aprovechamientointegral, comparable al logrado con el mtodoconvencional de seleccin a campo?

Cmo superar la escasa cantidad de semilla producida?

Es una tcnica alternativa, o complementaria del mejoramiento tradicional?

La eciencia en la produccin de doblehaploides, justica su alto costo dentro de un plande mejora?

De acuerdo a Mujeb-Kazi (1998), las generaciones segregantes adecuadas para producirdoblehaploides son la F2 y F3. Si eligiramosindividuos F3, que ya cuentan con un ao deseleccin a campo durante la F2 -generacinque ha mostrado la mayor varianza gentica entre los dos padres estaramos evitandoproducir un gran nmero de plantas doblehaploides que no sern agronmicamente promisorias. No obstante, debemos considerar queseran necesarios varios cientos de individuosDH para que el proceso tenga posibilidades dexito agronmico.

En general, la produccin de doblehaploides

resulta en un gasto excesivo en comparacin alos mtodos tradicionales de mejoramiento, porlo cual en la mayora de los programas slo genotipos lite son sometidos a este sistema. Sibien el costo de produccin de los DH dependedirectamente del mtodo elegido y la eciencialograda, la aplicacin de esta metodologa almejoramiento vegetal se vislumbra ms biencomo una herramienta complementaria al mejoramiento tradicional, y que de ningn modointentara reemplazarlo.

Lecturas Recomendadas

Atanassov, A.; Zagorska, P.; Boyadjiev, P.; Djilianov,D. 1995. In vitro production of haploid plants.World Journal of Microbiology & Biotechnology,vol. 11, 400408.

Bhojwani, S.S., Razdan, M.K. 1996. Haploid Pro

duction. En: Plant Tissue Culture: Theory andPractice, Capitulo 7. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp.167-213.

Coe E. H. Jr., Neuffer M. G., Hoisington D. A. 1988.The Genetics of Corn. En: Corn and corn Improvement 3ra Edicin. (Sprague C. F., Dudley J. W.eds) pg 81-258. A.S.A., C.S.S.A., S.S.S.A, Madison Winsconsin, pp 81-258.

Lacadena, J.R. 1988. Variaciones cromosmicasnumericas. En: Gentica, Captulo 15. Lacadena,J.R. (ed.) A.G.E.S.A., Madrid. pp. 683-719.

Snape, J., Simpson, E., Parker, B., Friedt, W., Foroughi-Wher, B. 1986. Criteria for the selectionand use of doubled haploid systems in cerealbreeding programmes. En: Genetic manipulation in plant breeding. Proc. Int. Symp. EucarpiaW. Horn, C. Jensen, W. Odenbach, O. Schieder(eds). W. De Gruyter, Berlin. pp. 217229.


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III. CAPTULO 2

Aplicaciones de los marcadoresmoleculares

Alicia Carrera; Gabriela Tranquilli;

Antonio Garayalde; Marcelo HelgueraLos marcadores moleculares, herramientas

bsicas de la biotecnologa vegetal descriptasen Parte I Captulo 5 de este libro, se utilizanen la actualidad en numerosas reas relacionadas con el mejoramiento vegetal y el anlisisde la biodiversidad. A continuacin se describen algunas de esas aplicaciones. Cada unode estos campos posee una base terica enocasiones compleja y muchos de ellos requie

ren del uso de programas de estadstica avanzada. De este modo, el presente captulo debeser considerado como una introduccin a lostemas presentados.

Identifcacin de genotipos Pureza

varietalEl control de la pureza varietal y la discrimi

nacin de variedades protegidas requieren deuna adecuada identicacin de los materiales.Esta identicacin se ha basado tradicional

mente en el uso de caracteres morfolgicos ysiolgicos. Desafortunadamente, la utilizacinde recursos genticos de origen comn en diferentes programas de mejoramiento ha reducido la eciencia de discriminacin por marcadores fenotpicos (descriptores), que si bienson importantes, presentan limitaciones (bajopolimorsmo, inuencia ambiental, dependencia del estadio de desarrollo de planta, etc.).Como alternativa para resolver este problema,los marcadores moleculares resultan de gran

utilidad por su nmero virtualmente ilimitadoy por su habilidad para explorar variabilidadgentica a nivel del ADN. ISTA (InternationalSeed Testing Association) y UPOV (Union PourLa Protection Des Obtenions Vegtales) sonentidades internacionales que han distribuidoinformacin para estandarizar los anlisis delaboratorio para la identicacin de cultivares,y para reglamentar la utilizacin de diferenciasmoleculares en la evaluacin de homogeneidad intravarietal, la discriminacin de varie

dades y el otorgamiento de nuevas patentes.En la actualidad se dispone de patrones moleculares varietales para una extensa lista deespecies. Frecuentemente, un grupo de locipolimrcos de un marcador molecular, talescomo microsatlites o AFLPs (AmpliedFrag-ment Length Polymorphism) es suciente para

generar un perl molecular de identicacin, ohuella dactilar de ADN, nica para cada cultivar. Como ejemplo, podemos mencionar altrigo pan (Triticumaestivum L.) para el que sedesarroll una Matriz de Identicacin Varietalen base a marcadores microsatlites de ADN,que permite la individualizacin de las distintasvariedades argentinas. Por otro lado, a partirde datos moleculares es posible obtener distintos ndices de similitud o distancia genticay generar dendrogramas que ponen en eviden

cia las relaciones entre los materiales. Esta informacin puede ser altamente valiosa en casode litigios por derechos de obtencin. Params detalles sobre identicacin de genotiposse recomienda la lectura de Parte III, Captulos4 y 5 de este libro.

La pureza varietal es uno de los principalesrequisitos de la semilla comercial. En la produccin de semilla hbrida la heterogenidad intralote puede originarse por falta de uniformidaden las lneas parentales, polinizacin cruzada

espontnea o mezcla de semillas durante lasiembra, cosecha o embolsado. Los individuosfuera de tipo pueden identicarse mediante elpatrn molecular. Del mismo modo, puedenestablecerse las relaciones de descendenciaentre una serie de lneas parentales y sus hbridos. Asimismo, la caracterizacin molecular delneas puras permite conocer el nivel de variabilidad gentica presente en la coleccin, conrmar homocigocis, precisar la identicacin yasistir en la planicacin de los cruzamientos

destinados a producir hbridos de caractersticas superiores.

Bancos de germoplasmaEl proceso de seleccin para mejora y las

prcticas de la agricultura moderna han generado una prdida notable de diversidad en lamayora de las especies cultivadas. El reemplazo paulatino de las variedades primitivaspor los nuevos cultivares de indudables ventajas econmicas ha producido una reduccin en

el nmero de genotipos que se cultivan. La ero


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sin gentica puede tener graves consecuencias para el cultivo, principalmente en relacincon su vulnerabilidad sanitaria. Este procesopuede ser atenuado mediante la creacin debancos de germoplasma, que constituyen uncomponente vital de los programas de mejora. Las colecciones pueden mantenerse como

bancos de semilla, a campo, in-vitro o criopreservadas. Esta actividad se vuelve particularmente relevante para el Continente Americanoy el Caribe, que constituyen los centros de origen de cultivos importantes como maz, poroto,cacao, papa, man, pimiento, tomate, zapallo,adems de numerosas medicinales, aromticas, frutales y forestales.

Los recursos genticos de una especie cultivada comprenden: i) cultivares antiguos yde reciente obtencin; ii) poblaciones locales

mantenidas por los productores, landraces;iii) poblaciones silvestres de la misma especieo formas maleza; iv) especies relacionadas.Los marcadores moleculares permiten caracterizar accesiones cultivadas y silvestres, estudiar el proceso de domesticacin, establecerrelaciones logenticas, y contribuir en la tomade decisiones para la eleccin de estrategiasde conservacin. El procedimiento consiste bsicamente en analizar los materiales mediante marcadores proteicos o de ADN, y calcularmedidas de diversidad (nivel de polimorsmo,riqueza allica, presencia de alelos nicos) yde similitud gentica. Esta informacin luegose integra a datos geogrcos (procedencia delas accesiones, distribucin), pedigr, taxonoma y variabilidad en caracteres morfolgicos,fenolgicos, siolgicos, etc.

Una gran parte de los polimorsmos moleculares se encuentra en regiones no codicantesdel genoma, carece de expresin fenotpica yes selectivamente neutra. En contraste, los genes que codican los rasgos morfolgicos y/oagronmicos poseen un fuerte efecto fenotpico y han estado sometidos a intensas presiones de seleccin en las distintas etapas delmejoramiento. Por lo tanto, estos caracteresrepresentan grupos de genes sometidos a diferentes fuerzas de cambio a lo largo del procesode domesticacin. Los marcadores moleculares combinados con datos morfolgicos, agronmicos y de origen, conforman una base de

datos integral que permite describir la variacingentica en colecciones de germoplasma.

Veamos algunos ejemplos. En casos comoel girasol (Helianthus annuus), originario deEstados Unidos, el anlisis de diversidad hademostrado que el proceso de domesticacinha reducido considerablemente la base gen

tica de los materiales cultivados en relacin alas poblaciones silvestres. Por el contrario, enporoto (Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea eu-ropea), las formas cultivadas conservan granparte de la variabilidad presente en las poblaciones de los centros de origen en Amrica yEuropa, respectivamente. La comparacin entre los materiales silvestres y cultivados de unaespecie permite adems identicar los lugaresde origen del cultivo, conocidos como centrosde domesticacin. Una vez que los recursos

genticos disponibles han sido caracterizados,es posible decidir cules seran los cruzamientos que ms contribuiran a la expansin de labase gentica.

Aunque frecuentemente el proceso de domesticacin involucra una prdida importantede diversidad que es revelada por marcadoresmoleculares dispersos en el genoma, los cambios ms signicativos en el paso de formas silvestres a cultivadas pueden ser explicados porunos pocos genes. Por ejemplo, Dubcovsky yDvorak (2007) describen un fenmeno llamadosndrome de domesticacin, que es mayoritariamente adjudicado a genes que controlan laarquitectura morfolgica de la espiga y el mecanismo de dispersin de las semillas. Uno deellos es el gen Br(brittle raquis) que determina un raquis quebradizo (ancestral) o rme dela espiga; otro es el gen Tg(tenacious glume)que determina glumas rmemente adheridas algrano (ancestral) o granos desnudos y el terce

ro es el gen Q, que gobierna el libre desgranede la semilla madura y la forma cuadrada de laespiga. El alelo q produce una espiga piramidalde raquis elongado (espeltoide) cuyas semillasno se desgranan fcilmente al madurar. La espiga del trigo moderno es la resultante de lacombinacin de los alelos br(raquis rme), tg(grano desnudo) y Q, que generan una espigacuadrada, que permite el libre desgrane de lasemilla madura desnuda, facilitndose enormemente la cosecha del grano.


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Desde el punto de vista del mejoramiento,la informacin generada por los marcadoresresulta de inmediata aplicacin en los procesos de acopio (dnde colectar, qu intercambios realizar), conservacin (identicacin deduplicados en las colecciones, monitoreo delos cambios en la composicin gentica que

puedan ocurrir durante la multiplicacin o conservacin de los materiales), caracterizacin(diversidad gentica de la coleccin) y distribucin eciente de los recursos genticos hacialos usuarios.

Mapas GenticosUn mapa gentico de una especie animal o

vegetal muestra la distribucin lineal de marcadores en cada uno de los cromosomas queconstituyen el genoma de un organismo. Este

mapa esta basado en el concepto clsico deligamiento: si dos o ms genes o marcadoresestn fsicamente cercanos sobre el mismo cromosoma, sus alelos se transmiten usualmentejuntos a travs de la meiosis. Las proporcionesen que estos genes segregan en una poblacin se apartan de las esperadas bajo la ley desegregacin independiente. La mayor parte delos gametos contendrn las mismas combinaciones allicas que los padres; slo aquellosmeiocitos que experimenten un intercambioentre cromtides no hermanas o crossovergenerarn gametos con combinaciones allicasdiferentes de las parentales (recombinantes).

El fundamento del mapeo gentico reside enla relacin entre la frecuencia de recombina-cin y la distancia fsica entre los loci. La frecuencia de recombinacin entre dos genes seconvierte en una estimacin de la distancia demapa que los separa. La unidad de medida delos mapas genticos es el "centimorgan" (cM),

que es una medida de la cantidad de eventosde recombinacin entre marcadores, ocurridosen una poblacin segregante (de mapeo). Params detalles sobre construccin de mapas genticos se recomienda la lectura del Captulo 6,Parte I de este libro.

El aporte de los marcadores moleculares enla construccin de mapas genticos es fundamental, ya que han permitido incrementarla probabilidad de identicar regiones cromosmicas que determinan rasgos agronmica

mente importantes, en comparacin con losmapas obtenidos mediante el uso de marcadores morfolgicos o isoenzimticos. Consecuentemente, cuanto mayor sea el nmero demarcadores incorporados a un mapa genticomayor ser su capacidad de resolucin y utilidad como marco de referencia para incorporar

genes asociados a caractersticas de interseconmico.Para incorporar un carcter de inters agro

nmico en un mapa gentico es necesariocumplir con las siguientes etapas:

1. Desarrollar una poblacin segregantepara el carcter agronmico en cuestin.

2. Caracterizar la poblacin segreganteutilizando marcadores moleculares polimrcos (con diferencias en la secuencia de ADN entre los parentales). Para

construir un mapa mnimo es deseabledisponer de al menos cuatro marcadoresmoleculares por cada cromosoma delgenoma en estudio.

3. Evaluar fenotpicamente el carcter agronmico sobre los individuos de la poblacin segregante. Este punto es crucial,ya que si la evaluacin del carcter enla poblacin de mapeo no es precisa, elmapeo del carcter ser errneo o irrealizable.

4. Identicar marcadores ligados al carcteragronmico en cuestin (cosegregacinentre fenotipo del carcter y fenotipo delmarcador). Para esta instancia, al igualque para la construccin del mapa gentico, se pueden utilizar herramientasinformticas especcas tales como losprogramas Mapmaker, MapmakerQTL,Genemap, etc.

Cuanto mayor sea la distancia gentica entre los parentales que darn origen a la poblacin de mapeo, mayor ser la probabilidad dedetectar marcadores polimrcos, que es unpunto crtico para identicar marcadores ligados al carcter en estudio.

En el contexto del mejoramiento vegetal losmapas genticos posibilitan:

La cobertura y anlisis de genomas completos.

La localizacin de regiones genmicas


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que controlan caracteres de importanciaagronmica o industrial.

La cuanticacin del efecto de estas regiones en la caracterstica estudiada.

La descomposicin de caracteres genticos complejos (QTLs) en componentesmendelianos.

En los ltimos aos ha comenzado a usarseuna nueva estrategia de mapeo denominadamapeo por asociacin, que utiliza el concepto de desequilibrio de ligamiento (LD), denidocomo la asociacin no al azar de alelos de diferentes loci.La hiptesis de base considera queen poblaciones grandes, con apareamientos alazar (panmixis), con los locisegregando independientemente y en ausencia de seleccin,mutacin, o migracin, los loci polimrcos

estn en equilibrio: la frecuencia de un ciertohaplotipo depende del producto de las frecuencias allicas en cada locus. En este caso el LDser cero. La existencia de ligamiento fsicoaumenta los niveles de LD, aunque procesosde seleccin y migracin generan igualmentevalores de LD distinto de cero. Una ventaja importante de este mtodo es que puede prescindir de poblaciones de mapeo clsicas, talescomo F2 o RILs (Recombinant Inbred Lines)pudiendo utilizarse la variacin en poblacionesnaturales de una especie o colecciones de cultivares, producto del mejoramiento. Este enfoque aprovecha la historia de recombinacinnatural de la especie y los procesos ocurridosde seleccin, lo cual incrementa el grado deasociacin entre los marcadores y el carcterde inters.

Si un marcador resulta estar asociado a ungen que controla un carcter de inters agronmico, la seleccin de este marcador resulta

en la seleccin indirecta del gen de inters. Lacomparacin de mapas genticos entre especies genera informacin bsica sobre la estructura y evolucin de los genomas. Por otro ladoun mapa gentico constituye el punto de partida para proyectos de clonadode genes.

Seleccin asistida por marcadoresEl desarrollo de mltiples tcnicas molecu

lares ha facilitado el anlisis gentico de caracteres de inters agronmico y la seleccin

de individuos con caractersticas ventajosas.La seleccin asistida por marcadores (MAS)es un proceso de seleccin indirecta basadoen la existencia de co-segregacin entre marcadores y un gen determinado. Su ecienciadepende de la distancia entre el marcador y elgen, y de la contribucin de ese gen al fenoti

po. En trminos amplios, el marco de aplicacin que brindan los marcadores molecularescomprende la introduccin y seguimiento degenes o QTLs (Quantitative Trait Locus) de inters, as como la agilizacin del proceso derecuperacin de homocigosis en fondos genticos particulares. En el primer caso, la estrategia se basa en focalizar el anlisis sobre elgen de inters en una poblacin segregantemediante el uso de marcadores previamentedesarrollados sobre porciones de secuencias

de dicho gen, o con marcadores localizados enlas regiones adyacentes que se encuentren ligados al carcter en cuestin.El segundo casotiene que ver con que la transferencia de genesde inters se realiza comnmente mediantecruzas amplias, que requieren luego del cruzamientoinicial, una serie de retrocruzas hacia elparental elite o recurrente. El producto nal esun material que posee el fondo gentico original con la nueva caracterstica incorporada. Eneste caso, la estrategia se basa en un anlisisms amplio de la poblacin segregante, ya queel uso de marcadores no slo se aplicar parala identicacin del gen asociado a la caracterstica de inters, sino que tambin se caracterizarn otras regiones del genomas, a n deidenticar aqullas que provengan del parentalelite. Las herramientas moleculares permitenacelerar este proceso, dado que poseen altadensidad y cubren en forma uniforme el genoma.

Con relacin al seguimiento de genes de inters, un argumento frecuentemente utilizadoen contra de la seleccin asistida por marcadores es que el mejoramiento de caracteresde herencia simple no precisa de marcadorespara seleccin si los fenotipos son fcilmenteidenticables. Si bien esto es correcto,an enestos casos,la utilizacin de marcadores moleculares en un programa de mejoramientopuede representar una ventaja importante, yes que la seleccin se independiza del fenotipo


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y el ambiente. Estas caractersticas permitenidenticar rpidamente genotipos nicos enpoblaciones segregantes e incorporar variosgenes de inters en un fondo gentico, proceso tambin denominado "piramidizacin" o"apilamiento" de genes.

Por lo descripto anteriormente, puede de

cirse que la utilidad potencial de los marcadores moleculares en el proceso de mejoramiento gentico es alta. Sin embargo, factoresde orden tcnico y/o econmico han limitadosu adopcin. Dentro de los primeros, corresponde mencionar la disponibilidad de marcadores moleculares que permitan, por un lado,mejorar la cobertura del genoma en cuestin,y por otro lado, que resulten factibles de serimplementados bajo procesos automatizados,tales como extraccin de ADN o reacciones de

amplicacin a gran escala. En este sentido,es importante destacar que cada vez es mayorla cantidad y variedad de marcadores moleculares desarrollados para cultivos de importancia econmica. Por otro lado, la implementacin de un marcador para la seleccin de uncarcter agronmico en un programa de mejoramiento requiere de una serie de estudiosprevios relacionados con: (1) material a utilizar(variedades, poblaciones F2, retrocuzas, lneasavanzadas, etc.), (2) condiciones ptimas de lareaccin de PCR Polymerase Chain Reac-tion (nmero de ciclos de PCR, temperatura yextensin de cada ciclo, concentracin de loscomponentes que conforman la reaccin dePCR, etc.), (3) deteccin del marcador (gelesde agarosa, acrilamida, secuenciado, etc.), (4)tipo de informacin a obtener (marcador dominante o codominante), (5) posibilidad de eventos de recombinacin entre marcador y carcter, etc., proceso que se denomina validacin.

Desde el punto de vista del mejoramiento,sin dudas el mejor marcador es aquel que detecta sitios polimrcos que estando dentro delgen son los determinantes de la variacin fenotpica observada. Estos marcadores, tambinllamados de diagnstico o funcionales, puedenser usados en forma conable en poblacionesen las que no se hayan mapeado previamente, sin correr el riesgo de que la informacinde inters se pierda por recombinacin. Comoejemplo podemos mencionar un marcador de

sarrollado para el gen Pinb-D1 de trigo. Estegen codica una de las protenas relacionadascon textura de grano y se ha demostrado queel cambio de un aminocido (glicina a serina)da origen a una variante allica cuyo fenotipoes un grano con textura dura. Tanquilli y col.(1999) desarrollaron un marcador que detecta

dicha mutacin en cualquier poblacin segregante que sea polimrca para el gen Pinb-D1y es de gran utilidad para el mejoramiento detrigos blandos (gura 1). Desafortunadamente,la disponibilidad de marcadores funcionales seve restringida por el limitado nmero de genescaracterizados molecularmente que controlancaracteres agronmicos. Sin duda, la disponibilidad de marcadores funcionales aumentarprogresivamente a partir del conocimiento generado de los proyectos de genmica en espe

cies modelo (Arabidopsis, arroz) as como delnmero creciente de secuencias codicantesmapeadas y caracterizadas.

Dentro de los factores de ndole econmico,la principal limitante en la adopcin generalizada de esta tecnologa ha sido la relacin entre el costo del dato molecular (data point) y elvalor comercial de la semilla mejorada. En losprogramas de mejoramiento de aquellas especies donde el material de cultivo es hbrido,en general se observa mayor uso de seleccinasistida por marcadores moleculares. Es esperable que esta limitante se vaya superando conel tiempo por el permanente avance tecnolgico. En este sentido el amplio desarrollo demarcadores basados en ampliciacin (SSRsSimple Sequence Repeats-, SNPs SingleNucleotide Polymorphisms) ha permitido simplicar las metodologas a aplicar, en comparacin con aquellos marcadores basadosen hibridacin (RFLPs Restriction Fragment

Length Polymorphism, por ejemplo), reduciendo costos y tambin aumentando la ecienciaen el proceso de seleccin.

Para mas detalles sobre seleccin asistidapor marcadores se recomienda la lectura deParte III, Captulo 3 de este libro.

Mapas comparativosEl tamao del genoma de plantas es muy

variable entre especies, y gran parte de esadiferencia est dada por secuencias de ADN


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A5'- AAACAACATTGAAAAC A TG A AG AC C T TA T TC CT C CT A GCT CTC CTT GCT CTT

G TA GC G A GC A CA AC C T TC GC G C AA T AC TC A G AA G TT GG C G GC TG G T AC A AT

G AA G TT G GC G GA GG A G GT G GT TC T C AA CA A T GT C CG CA G G AG C GG C CG A AG

C TA A GC T CT T GC AA G G AT T AC GT G A TG GA G C GA T GT TT C A CA A TG A AG G AT

T TT CC A G TC A CC TG G C CC AC A A AA T GG TG G A AG GG C GG C T GT G AG CA T G AG

AAG AGC GGC

G TT CG G G AG A AG TG C T GC AA G C AG C TG AG C C AG A TA GC A C CA CA A T GT C GC

T GT G AT TC T A TC CG G C GA G TG AT C C AA G GC A GG C TC GG T G GC T TC TT G G GC

ATT TGG CGA GGT GAG GTA TTC AAA CAA CTT CAG AGG GCC CAG AGC CTC CCC

TCA AAG TGC AAC ATG GGC GCC GAC TGC AA G T TC C CT AG T G GC T AT TA C T GG

TGA TGATATAGCCTC

TATTCGTGCCAATAAAATGTCACATATCATAGCAAGTGGCAAATAAGAGTGCTGAGTGATGATCTATGAA

TAAAATCACCCTTGTATATTGATCTGTGTTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3

B

500 bp400 bp

300 bp

200 bp

1 2 3 4 5 6 M

Gly

Ser

Figura 1. (A) Secuencia nucleotdica del gen pinb-D1, mostrando el cambio de aminocido Glicina Se

rina (Gly Ser) resultante de la mutacin de la base guanina (G) a adenina (A) que diferencia a los alelos

asociados a texturas blandas y duras, respectivamente. Con un recuadro se indican las zonas donde hibri

dan losprimers, y en negritas y subrayado las bases que forman el sitio de restriccin de BsrBI (GAGCGG/

CCGCTC) presente en el alelo asociado a textura dura en grano de trigo. (B) Fotografa de electroforesis

en gel de agarosa 2% de productos de PCR amplicados conprimers sealados en gura anterior dige

ridos con la enzima de restriccin BsrBI. En calles 1, 4 y 6 patrn del alelo depinb-D1 asociado a textura

blanda; en calles 2, 3 y 5, patrn del alelo de pinb-D1 asociado a textura dura.


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repetitivo, que diere entre especies (especie-especco). Contrastando con esta situacin,los genes tienden a ser altamente conservadosa nivel de secuencia de ADN y esta caracterstica permite utilizar los genes como sondaspara identicar secuencias de genes ortlogos(genes con funciones similares, presentes en

diferentes especies, que derivan de una secuencia ancestral).A partir de esta informacin(presencia/ausencia de genes ortlogos) seconstruyen los denominados mapas compa-rativos. En general, al comparar mapas genticos de dos especies emparentadas, se handetectado regiones cromosmicas donde losgenes mantienen el orden y las relaciones deligamiento, fenmeno conocido como colineari-dado sintenia. Esta sintenia se va perdiendo amedida que se comparan especies ms aleja

das logenticamente. Ejemplos de genomascon regiones colineares se han observado engrupos de especies pertenecientes a la familia Solanaceae (tomate, papa, pimiento), entreArabidopsis sp. y cultivos del gnero Brassica,y tambin dentro de las gramneas entre especies pertenecientes a la tribu Triticeae (trigo,cebada, centeno) as como entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonmicas, tal el caso de arroz, maz y sorgo.

La utilidad de los mapas comparativos puede apreciarse desde distintos puntos de vista.Por un lado, aportan informacin valiosa paradetectar cambios producidos en la estructuracromosmica, que ocurrieron durante el proceso evolutivo, ya que cuando se comparan laposicin y el nmero de locientre los mapas dedos especies se hace evidente la ocurrencia derearreglos como inversiones, translocacionesy duplicaciones. En otros casos se ha podidodetectar la ocurrencia de eventos de poliploi

dizacin muy antiguos. Por ejemplo, el mazpresenta un comportamiento meitico que corresponde al de una especie diploide tpica. Sinembargo, el mapa molecular muestra que numerosos loci RFLP de arroz estn presentesdos veces en el genoma de maz por lo queactualmente se considera que el maz desciende de un poliploide ancestral.

Por otro lado, los mapas comparativos posibilitan la transferencia de informacin molecular de especies modelo con genomas simples,

completamente secuenciados, tales comoAra-bidopsis y arroz (Arabidopsis Genome Initiative, 2000; International Rice Genome Sequencing Project, 2005), a especies con genomasms complejos tales como trigo, cebada, avena, etc. Este ha sido tal vez el objetivo principalpara impulsar el desarrollo de estos mapas.

Las notables similitudes observadas entre genomas fue la base sobre la que se postul eluso de especies modelo, a partir de las cuales estudiar y avanzar en el conocimiento degenomas ms complejos. Asimismo, partiendodel supuesto de que los genes que gobiernanaspectos fundamentales de la biologa vegetalmuy probablemente estn conservados entredistintas especies, y el hecho que la variacinen el tamao de los genomas de especies relacionadas se debe fundamentalmente a varia

cin en la cantidad de ADN no codicante y noa una variacin en el nmero de genes, la ideade llegar a la identicacin, clonado y caracterizacin de genes en las especies modelo se havisto fortalecida. De este modo la informacingenerada podra hacerse extensiva a una amplia gama de especies, incluyendo las cultivadas. En este sentido, la informacin molecularproveniente de los genomas de Arabidopsis yarroz ha sido clave para clonar genes de inters agronmico en especies de genomas complejos como el trigo, como por ejemplo, Vrn-1,Vrn-2, Q, Ph1, Ppd-D1, Lr10, etc.

Clonado posicionalEl clonado posicional consiste en el aisla

miento de un gen responsable de un carcter particular a partir del conocimiento de sulocalizacin en el genoma. El proceso utilizainformacin gentica (modo de herencia delcarcter y ubicacin del gen/es en una regin

especca de un mapa), molecular (secuencianucleotdica de aquellos genes presentes en laregin cromosmica asociada con el carcter),y de funcin o expresin de los genes.

El primer paso para lograr esto es seleccionar parentales que sean contrastantes parael carcter vinculado al gen en cuestin, porejemplo, una variedad de trigo susceptible yotra resistente a la roya de la hoja. Una vezseleccionados los parentales se desarrolla unapoblacin segregante, la ms sencilla es una


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F2, a partir de la cual se construye un mapagentico utilizando marcadores moleculares,y sobre este marco se identican las regionescromosmicas asociadas al control de dicharesistencia.

Una vez identicada dicha regin, paraavanzar hacia el clonado posicional, es nece

sario mejorar el grado de resolucin del mapaen esa zona. Esto se logra saturando dicharegin con nuevos marcadores moleculares eincrementando el nmero de individuos de lapoblacin, a n aumentar las posibilidades deencontrar recombinantes entre marcadores estrechamente ligados. El objetivo es reducir elintervalo del genoma analizado al fragmentomnimo posible que contenga al gen de inters.Muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo comparativo en regiones cromo

smicas ortlogas de especies emparentadascon genomas menos complejos. En el caso detrigo, seran arroz, cebada, sorgo, Triticum mo-nococcum, Triticum tauschii, etc.

Una vez reducido al mnimo el intervalo degenoma portador del gen de inters, el pasosiguiente es obtener la secuencia nucleotdicadel mismo. Una forma de hacerlo es medianteuna caminata cromosmica, para lo cual es necesario contar con un mapa fsico (secuencianucleotdica) de la regin. Para el ejemplo queestamos considerando, la caminata se iniciaseleccionando de una "biblioteca" del genomade trigo (BAC library) aquellos clones (tomos)que hibriden con los marcadores que anquean al intervalo portador del gen. Los clonesseleccionados en la hibridacin contra la biblioteca son digeridos con enzimas de restriccin para identicar en cada caso fragmentoscompartidos y no compartidos. Se estima quelos clones seleccionados con un mismo mar

cador deben tener en comn al menos un fragmento de digestin (el fragmento que posee lasecuencia del marcador). Los fragmentos nocompartidos corresponden a los extremos deestos clones parcialmente solapados entre s.Estos extremos se utilizan como nuevos marcadores para extender la caminata cromosmica hacia el gen, reiniciando la bsqueda declones en la biblioteca genmica. Este procesose hace simultneamente en ambos sentidos,hasta lograr que el mapa fsico (secuencia nu

cleotdica) que se ha iniciado desde cada marcador anqueante forme un continuo o "contig"de fragmentos de ADN genmico de trigo. Estecontigcontiene la secuencia del gen en estudio. El paso siguiente consiste en la secuenciacin del contig. A partir de esta informacin,y por anlisis de secuencia con herramientas

bioinformticas, se determinan los genes presentes y aquellos posibles candidatos del carcter en estudio. La prueba denitiva para establecer el hallazgo del gen en cuestin es laprueba de complementacin. Esto consiste entransformar una planta que carece del carcter en estudio (siguiendo con el ejemplo, unavariedad de trigo susceptible) con cada uno delos genes candidatos y determinar cual de ellosle conere el carcter (en este caso resistenciaal patgeno).

A partir de la secuenciacin completa del genoma de arroz es posible obtener una primeraestimacin de los genes presentes en nuestrocontig, con algunas salvedades, como son lapresencia de genes especcos de arroz (queno estarn en el contigde trigo) y trigo (queno estarn en el genoma de arroz), ruptura dela colinearidad de genes entre genomas porrearreglos cromosmicos, etc. Como ejemplo,en el clonado posicional del gen Vrn-1 en Triti-cum monococcum se utiliz una poblacin de3095 individuos F2, para llegar a delimitar unintervalo de 0,04 cM en el cromosoma 5Am quecontena dos genes candidatos. Posteriormente, mediante estudios de expresin de estosgenes se observ que slo uno de ellos (Ap-1) presentaba un patrn de expresin idnticoal gen Vrn-1. Para llegar a esto se trabaj conmarcadores provenientes de las bibliotecas delos genomas de cebada, sorgo, arroz y Triticummonococcum (gura 2).

Distribucin de la variabilidad genticaen poblaciones naturales y conservacinLas especies estn constituidas por unidades

o demos ms o menos aislados denominadospoblaciones. Una especie vegetal raramentese extiende en forma continua e ininterrumpida.En general adopta una distribucin en parches.El nmero de individuos en cada poblacin, elmodo reproductivo (autogamiaalogamia), lasdistancias interdemos, el tipo de polinizacin


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(gravedad-anemla-entomla), la accin delhombre en la fragmentacin del hbitat y el origen (especies nativasespecies introducidas)determinan en conjunto una distribucin de lavariacin gentica propia de cada especie.

Los programas de conservacin utilizan amenudo informacin acerca de la distribucinde la variacin gentica para establecer prioridades y estrategias de manejo. Las variacio

nes dentro y entre poblaciones colaboran enla denicin de las unidades a conservar y seconvierten en elementos importantes para latoma de decisiones relacionadas con la proteccin de la biodiversidad. Es deseable que laspoblaciones seleccionadas para formar partede las reas protegidas, contengan la mayordiversidad gentica posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo.

A partir de marcadores codominantes comolas isoenzimas y microsatlites, pueden obte

nerse parmetros de diversidad: P, nmero deloci polimrcos/nmero total de loci analizados; A, nmero promedio de alelos por locus;Ho, heterocigocidad observada; y He, heterocigocidad esperada (1- p

i2, p

i:frecuencia al

lica del alelo i). Dado que los genotipos homoy heterocigotos pueden ser reconocidos, esposible probar si la poblacin se encuentra enequilibrio de Hardy Weinberg. Con los datos de

frecuencias allicas disponibles se calculan ndices tales como Nei, Rogers, o Prevosti y seconstruyen matrices de distancia gentica (D),a partir de las cuales es posible realizar anlisis de agrupamientos que permiten visualizarlas semejanzas o diferencias genticas entrepoblaciones.

En el caso de marcadores dominantes comolos RAPD (RandomAmplicationofPolymor-phic DNA) o AFLP (AmpliedFragmentLeng-th Polymorphism) el genotipo heterocigoto no

Figura 2. A. Mapa gentico de la regin genmica del cromosoma 5A de T. monococcum que incluye elgen Vrn1. Las distancias genticas estn en cM. BD Mapas fsicos de la region colinear a Vrn1 en losgenomas de arroz, sorgo y T. monococcum. B, BACs de arroz; C BAC de sorgo, D contig de BACs de T.monococcum. En crculos de distintos tonos de gris se indican genes conservados entre genomas. AGLG1y AP1 son genes completamente ligados a Vrn-1. Figura adaptada de L. Yan et al. (2003). Positional cloning of wheat vernalization gene VRN1. PNAS 100: 6263-6268.


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A B C D E F G H I J K L M N

1 11 10 2 5 5

2

3 ind pob P2 240 P2 260 P2 330 P2 400 P2 440 P6 520 P6 550 P6 590 P6 650 P6 660 P6 800

4 1 A 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 15 2 A 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1

6 3 A 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1

7 4 A 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1

8 5 A 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1

9 6 B 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0

10 7 B 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1

11 8 B 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0

12 9 B 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1

13 10 B 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1

14

A B C D E F G H I J K L1 1 10 2 5 5 1 102 Hoja1 Binary D Pop1 Pop23 1 2 3 4 5 6 7 8 9 104 0 15 3 0 26 3 2 0 37 2 1 3 0 48 3 2 0 3 0 59 5 4 6 5 6 0 6

10 5 2 4 3 4 2 0 711 4 1 3 2 3 3 3 0 812 2 1 3 2 3 3 3 2 0 913 5 2 4 3 4 2 0 3 3 0 1014

puede ser reconocido y se asume para unaespecie diploide que cada banda correspondea un locus con dos alelos, A y a. El homocigoto dominante (AA) y el heterocigoto (Aa)corresponden a la presencia de la banda y laausencia corresponde al homocigoto recesivo(aa). Los parmetros de diversidad pueden serestimados: P de la misma manera que para

marcadores codominantes; A es dos, por denicin; slo es posible calcular He a partir delas frecuencias allicas estimadas, asumiendoequilibrio. Entonces 2qq = donde q es lafrecuencia del alelo a y q2la frecuencia de individuos con ausencia de banda; luego p = 1q siendo p la frecuencia del alelo A. Con estos datos, para calcular la He se procede de lamisma manera que para marcadores codominantes.

El estudio de variabilidad con marcadoresdominantes no permite determinar si una poblacin est o no en equilibrio de Hardy Weinberg. Las diferencias genticas entre poblaciones pueden igualmente ser estimadas conmtodos que no utilizan frecuencias allicas yque por lo tanto no asumen equilibrio. Uno deestos mtodos se basa en el clculo de distancias binarias entre pares de individuos, que

consideran la proporcin de bandas compartidas. El paso siguiente comprende un anlisisde la varianza molecular (AMOVA) que permiteparticionar esta varianza en sus componentesdentro y entre poblaciones a diferentes niveles. El programa GenAlEx disponible en http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/, permite realizar AMOVA y otros anlisis de variabilidad,

distancia gentica y correlaciones a partir dedatos moleculares. Posee un slido soporteterico, es de acceso libre y de fcil manejodado que se agrega a la barra de herramientasOfce Excel.

El siguiente es un ejemplo simplicado deuso de este programa.

Paso 1) Confeccin de la tabla de datos enformato para GenAlEx conteniendo registro demarcadores RAPD de dos poblaciones vegetales.

Nmero de loci RAPD: 11 (A1) Nmero de individuos totales: 10 (B1) Nmero de poblaciones: 2 (C1)- Nmero de individuos de la poblacin A: 5(D1)- Nmero de individuos de la poblacin B: 5(E1)

Paso 2) Clculo de las distancias binarias entre individuos.GenAlEx Distance Genetic (binary) OK


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Del anlisis se concluye que la diferenciacinmolecular entre las poblaciones representa un33 % de la varianza total, y que esa diferenciaes signicativa (p= 0,02).

La diversidad gentica cuanticada pormarcadores moleculares puede mostrar, porejemplo, que en una especie nativa de inters

forestal todas las poblaciones presentan altosniveles de variabilidad gentica y son bastantesimilares entre si. En este caso, la decisin decules poblaciones formarn parte del programa de conservacin podra basarse en consideraciones exclusivamente prcticas ya quelas poblaciones son genticamente equivalentes. Por el contrario, una especie compuestade poblaciones con niveles bajos de variabilidad en cada unidad pero con alto grado dediferenciacin entre poblaciones, requerir que

los esfuerzos de proteccin sean dirigidos hacia tantas poblaciones como sea posible, yaque cada una de ellas posee una identidadgentica diferente. Poblaciones de especiesendmicas, con niveles de diversidad genticaextremadamente bajos y un reducido nmerode individuos, son normalmente ingresadas ala categora de especies en peligro de extincin.

En este punto, es importante recordar quelos marcadores moleculares representan va

riacin gentica esencialmente neutra, es decirse encuentran sometidos a la accin de fuerzas evolutivas no selectivas tales como derivao ujo gnico. Las decisiones nales de un programa de conservacin deberan por lo tantocombinar los datos obtenidos a partir de marcadores moleculares junto con la evaluacinde ciertos rasgos morfolgicos, siolgicos oreproductivos, que son crticos en el procesode adaptacin y supervivencia de las poblaciones en su hbitat.

Las malezas de mayor impacto en la agricultura mundial son en general especies introducidas. En el nuevo territorio, libre de presionesselectivas tales como especies competidoraso patgenos caractersticos del ecosistema deorigen, la especie introducida es capaz de establecerse y colonizar todos los territorios que

renan determinadas condiciones ambientales. La caracterizacin gentica de las poblaciones de malezas puede aportar informacinde utilidad en los programas de control. Mediante marcadores moleculares puede establecerse si las poblaciones actuales provienende un solo evento de introduccin, con unospocos individuos iniciales o por el contrario,ocurrieron mltiples eventos de introduccin.Adems, determinados marcadores informativos pueden establecer con bastante precisin

cul es el lugar de origen de las poblaciones introducidas, y en este caso rastrear enemigosnaturales que pudieran ser tiles en el controlbiolgico de la especie invasora.

El tipo de reproduccin de una especie vegetal determina en gran parte la distribucinde variabilidad gentica entre poblaciones. Losmecanismos reproductivos pueden clasicarseen los tres tipos bsicos: alogamia, autofecundacin y apomixis. En realidad, existen combinaciones de estos tipos bsicos, con porcen

tajes variables de cada uno de ellos segn lasespecies y an dentro de las poblaciones, conformas obligadas o facultativas. El estudio demarcadores moleculares en diferentes plantasde una poblacin y su progenie ha contribuidoa determinar el tipo de reproduccin de numerosas especies vegetales

Estimacin del ujo gnico

El ujo gnico entre poblaciones vegetalesocurre mediante el movimiento de polen o de

Paso 3) A partir de la matriz de distancia se realiza el anlisis de varianza molecularGenAlEx AMOVA (tri or square distance matrix; 999 permutations) OK


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semillas. La morfologa de semilla y polen, losmecanismos de dispersin, el tipo de polinizacin, etc., hacen que la contribucin de estasdos vas al ujo total vare de acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares permitencuanticar cada uno de estos procesos. Si elujo gnico se produce bsicamente a travs

de polen, los marcadores de ADN de organelas, como por ejemplo cloroplastos, no serntransferidos de una poblacin a otra porqueeste tipo de informacin es slo heredada vamaterna. En contraste, si el ujo gnico se realiza principalmente a travs de semillas, tantolos marcadores de herencia materna como losde herencia biparental o nuclear, sern transmitidos entre poblaciones. Mediante el usode marcadores altamente polimrcos comolos microsatlites es posible determinar cul

ha sido la planta donadora del polen de cadasemilla de una pla

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