Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia...

43
Fonaments de la imatge digital Marta Valeri Sala, MSc, Biòloga Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR

Transcript of Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia...

Page 1: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Fonaments de la imatge digital

Marta Valeri Sala, MSc, Biòloga

Responsable de la Unitat de Microscòpia

UAT - VHIR

Page 2: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

La imatge digital és una matriu numèrica de punts d’una determinada

mida anomenats píxels.

Es tracta d’una funció discontínua on cada punt tindrà un valor numèric

que dependrà de la intensitat de llum captada en aquell punt.

Ángel Martínez Nistal

Servicio de Proceso de Imágenes

Universidad de Oviedo

Page 3: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

128 x 128 256 x 256

512 x 512 1024 x 1024

Imatge Digital Resolució espacial

A més píxels les imatges:

Són més contínues, amb més informació.

El temps d’exposició de la mostra serà més gran.

L’arxiu ocuparà més espai.

La resolució temporal disminuirà.

Page 4: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

128 x 128

256 x 256

512 x 512

1024 x 1024

Resolució espacial

Page 5: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Criteri de Nyquist

Per poder diferenciar bé entre dues estructures, la

mida del píxel/vòxel ha de ser almenys la meitat

(1/2.3) de la distància entre aquestes.

No podem diferenciar entre les dues estructures.

Adquisició Microscòpia

Page 6: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Microscòpia

Per obtenir la mida del píxel desitjada podem:

Canviar a un objectiu d’un altre augment.

Fer un zoom òptic de la imatge: el zoom òptim és aquell que compleix el criteri de Nyquist

Variar el format d’adquisició ( 256 x 256, 1024 x 1024...).

Fer binning (càmeres CCD).

Oversampling o zoom buit

undersampling

mida correcta

Imatges amb els límits de les estructures

menys definits.

Sobreexposició de la mostra a la llum.

Arxius amb molt més pes.

Disminució de la resolució espacial

Menys degradació del fluorocrom

Aparició d’artefactes, pèrdua

d’estructures.

Resolució espacial

Page 7: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Càmeres CCD i PMT

Binning 2 x 2 Binning 3 x 3

Pèrdua de resolució.

Millora de la relació senyal/soroll de fons.

Millora de la velocitat d’adquisició.

Disminució de la fotodestrucció.

Page 8: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

Rang Dinàmic: nivells de gris

Resolució cromàtica

Profunditat

A cada nivell de gris se li assignarà un valor numèric.

El valor numèric de cada píxel és una mesura indirecta de la quantitat de biomolècula

marcada existent.

És molt important treballar amb la imatge de base o una còpia d’aquesta sense modificar.

Cal ser molt rigorós en la preparació, el manteniment dels paràmetres d’adquisició i la

modificació de les imatges a avaluar.

Ángel Martínez Nistal

Servicio de Proceso de Imágenes

Universidad de Oviedo

Page 9: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

Color blanc/gris

Color RGB

Resolució cromàtica

Page 10: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Color CMYK

Imatge Digital

Color indexat

Les impresores fan servir aquest mode.

Admet imatges de 8 bits (fins a 256 colors).

L’ avantatge és que obtenim imatges de color que ocupen

molt menys espai.

Resolució cromàtica

Page 11: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Paletes de colors

Page 12: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Resolució cromàtica

Artefactes i pèrdua d’informació en l’adquisició de la imatge:

Imatge amb les

estructures que tenen

forma de xinxeta

sobresaturades

Imatge sense saturació; es pot

quantificar de forma relativa

la quantitat de biomolècula

existent.

Page 13: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge digitalitzada

Microscòpia

Es tracta d’un objecte matemàtic, d’una matriu de números on el valor numèric m(x,y)

es tradueix en el valor d’intensitat de gris de la imatge al punt (x,y).

60 70 115

65 80 123

69 110 125

39

82

83

103

88

59

112

96

67

35

73

72

60

120

40

218

229

169

228

236

194

229

237

197

231

241

200

Imatge Digital

Page 14: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

Canals Bits/Píxel Valors

3 24 (8 x3) (0...255) RGB (16 millons)

3 36 (0...4095) RGB (19 millons)

3 42 (0...16383) RGB (4 billons)

Imatge en nivells de gris

Imatge en color RGB

Canals Bits/Píxel Valors

1 1 0...1

1 8 0...255

1 12 0...4095

1 14 0...16383

1 16 0...65535

Resolució cromàtica, espacial i pes

Page 15: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

Mida 8 bits 24 bits

512 x 512 256 Kb 768 K

1024 x 1024 1M 3 M

1 Bit = 0,1

1Byte = 8 bits = (2)8 = 256

1KB = 1024 bits

1 MB = 1024 KB

Resolució cromàtica, espacial i pes

Formats amb compressió :

. tiff : algoritme LZW (loss-less file compression )

Suporta un ample rang de profunditats de bits.

. jpeg: aplica 1/30 de taxa de compressió.

Provoca canvis tant de resolució espacial com

d’intensitat dels nivells de gris.

Obrir i salvar una imatge jpeg repetides vegades

implica també l’aplicació acumulativa del mateix

algoritme , la qual cosa provoca una degradació

de la imatge.

Format sense compressió: . Raw

. Específic de cada equip ( FV1000 és .oib )

tiff

jpeg

Page 16: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Transformacions de la imatge

adquirida

Page 17: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Esquema

Imatge Real

Imatge digitalitzada

Captura de la imatge (digitalització)

Processament de la imatge

Imatge Binària

Soroll de fons

Errors d’il·luminació

Redistribució de l’histograma

Aplicació de filtres matricials

Segmentació

Imatge avaluable

Conclusions i decisions

Identificació d’estructures

Mesures de diferents

paràmetres: àrea,

perímetre...

3D

Dilatació

Erosió...

Calibració

(metadata)

Page 18: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Anàlisi de la imatge

Calibració

IntDen Mean StdDev Median Min Max

1 89505 255 0 255 255 255

2 125460 255 0 255 255 255

3 85170 255 0 255 255 255

4 64770 255 0 255 255 255

5 193035 255 0 255 255 255

Page 19: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

Calibració de la imatge (mida real del píxel o vòxel)

Resolució espacial

. Problemes en la identificació d’objectes.

. Obtenció de mesures errònies com ara l’àrea, el perímetre, la longitud, les distàncies,

la mobilitat cel·lular…

. Disminuir o engrandir la mida d’una imatge condueix a pèrdues de resolució espacial i

del valor numèric dels píxels. Si es fa aquest procés repetides vegades, es van

acumulant les errades en la imatge final.

. En reconstruccions 3D, s’obtindran proporcions de la imatge distorsionades (aplanamet,

estirament…).

Page 20: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

Operacions punt a punt

+ operació =

Tots els píxels de la imatge es modifiquen proporcionalment

Operacions aritmètiques

Histograma: normalització, escalat,

linearització

Operacions de processament per grups de píxels veïns

(Filtres matricials)

Quantificar una imatge modificada mitjançant l’aplicació

d’un filtre matricial no és recomanable.

El valor final de cada píxel

de la imatge dependrà dels

píxels que l’envolten.

Page 21: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Operacions punt a punt

Histograma:

Normalització: reescalat entre els nivells de grisos. Reasignació d’aquests repartint-se per

igual.

Escalat: Variar el rang de detecció.

Linearització: Reforça els grisos mitjos.

Inversió o positivat (gels).

Operacions aritmètiques:

Suma

Divisió

Resta

Multiplicació

Imatge Digital Processament de la imatge

Modificacions en la brillantor, el contrast, la redistribució de l’histograma, la correcció

gamma etc… per millorar la imatge són acceptables, sempre i quan s’apliquin de la

mateixa manera en totes les imatges a comparar.

Page 22: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

Histograma: Informa de la representació de cada nivell de gris en la imatge.

Dr. José Pertusa

Departament de Biologia Funcional

Universitat de València

Page 23: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

Operacions aritmètiques

Resultat de la resta entre dues imatges:

Les imatges A, B i C s’han restat de dos en dos obtenint les

imatges AB, BC i AC

Dr. José Pertusa

Departament de Biologia Funcional

Universitat de València

Page 24: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

Operacions aritmètiques

+ 50

- 50

x 2

/ 2

Dr. José Pertusa

Departament de Biologia Funcional

Universitat de València

Page 25: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Categories de filtres:

Imatge Digital Processament de la imatge

De suavitzat o de pas baix:

D’emfatització:

Detecció de marges:

Mitja

Mitjana

Gaussians

Efecte: Difuminar

Desenfocar

Reduir el soroll

Efecte: Augment del contrast per

ressaltar estructures

Els valors intermitjos es consideren positius mentre que a la resta se’ls dóna un

valor negatiu o zero

Laplacians

Sobel

Roberts

Sharpen 1

Sharpen 2

Operacions de processament per grups de píxels veïns (Filtres matricials)

Page 26: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

1 2 1

2 4 2

1 2 1

Gauss

25 50 25

50 100 50

25 50 25

6 25 6

25 100 25

6 25 6

6 18 25 18 6

18 50 71 50 18

25 71 100 71 25

18 50 71 50 18

6 18 25 18 6 Gauss 1 Gauss 2 Gauss 3

Gauss 4 L’efecte del degradat o desenfocament serà diferent

Segons la matriu aplicada, el pes de cada píxel i la mida.

Té més pes el píxel central i el pes dels altres és proporcional

a la distància amb el centre.

Page 27: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

Mitjana Original

De pas baix

Elena Abad

Cardiologia experimental

IUHVH

Page 28: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

0 -1 0

-1 5 -1

0 -1 0

-1 -1 -1

-1 9 -1

-1 -1 -1

Sharpen

Sharpen 1 sharpen 2

Sharpen Original

Page 29: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

Sobel Original

De detecció de marges

Page 30: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Average

Sharpen Sobel

Projecció Màx.

Imatge Digital Processament de la imatge

0 -1 0

-1 5 -1

0 -1 0

0 -1 0

-1 5 -1

0 -1 0

Page 31: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

Segmentació

Eritròcits de pollastre en extensió de sang tenyida

Histograma de nivells de gris

Dr. José Pertusa

Departament de Biologia Funcional

Universitat de València

Page 32: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Processament de la imatge

Segmentació

Selecció de llindars i aplicació de la màscara sobre els nivells de grisos.

Representacions de màscares binàries: blanc = 1 i negre = 0 o a la inversa.

Dr. José Pertusa

Departament de

Biologia Funcional

Universitat de València

Page 33: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Anàlisi de la imatge

IntDen Mean StdDev Median Min Max

1 89505 255 0 255 255 255

2 125460 255 0 255 255 255

3 85170 255 0 255 255 255

4 64770 255 0 255 255 255

5 193035 255 0 255 255 255

Assaig de migració

Autofluoresc.

del filtre

Merge

Substracció

Binarització

watershed

Cèl. GFP +

Cel. Object Counter (Fiji , ImageJ)

Page 34: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Anàlisi de la imatge

IntDen Mean StdDev Median Min Max

1 89505 255 0 255 255 255

2 125460 255 0 255 255 255

3 85170 255 0 255 255 255

4 64770 255 0 255 255 255

5 193035 255 0 255 255 255

Mesures d’intensitat de fluorescència

Nuclis

Redirecció

Substracció

Prot. X

Cel. Object Counter (Fiji , ImageJ)

Page 35: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Anàlisi de la imatge

Calibració

Segmentació

IntDen Mean StdDev Median Min Max

1 89505 255 0 255 255 255

2 125460 255 0 255 255 255

3 85170 255 0 255 255 255

4 64770 255 0 255 255 255

5 193035 255 0 255 255 255

Page 36: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

Màscara Binària

Anàlisi de la imatge

Page 37: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

Anàlisi de partícules

Anàlisi de la imatge

Page 38: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

MIA

B6_S3_1

B6_S3_2 B6_S3_4

B6_S3_3

MLC

20X

1024 x 1024

Anàlisi de la imatge

Page 39: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital

MIA

Anàlisi de la imatge

Page 40: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Imatge Digital Cal recordar

Millora de la imatge

Espacial:

Identificació d’objectes i obtenció de mesures com ara àrea, perímetre,

amplada, longitud...

Espectral:

El valor numèric de cada píxel és una mesura indirecta de la quantitat de

biomolècula marcada existent. Per tant, en aquest cas és molt important

treballar amb la imatge de base o millor una còpia d’aquesta sense cap

modificació. Cal ser molt rigorós tant en la preparació com en el

manteniment dels paràmetres d’adquisicó en totes les imatges a avaluar.

Page 41: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Cal recordar Imatge Digital

S’han de conèixer les limitacions i aberracions de l’equip que es fa

servir en l’adquisició de la imatge.

La manipulació s’hauria de fer sobre una còpia de la imatge original.

S’accepten modificacions lineals com petites modificacions de la

brillantor i del contrast.

Tallar la imatge (crop) també s’accepta si és per millorar la composició

de la figura i no per amagar detalls que estan en desacord amb la

nostra hipòtesi.

Les imatges que s’han de comparar, s’han d’adquirir i processar en les

mateixes condicions.

Es poden qüestionar manipulacions en àrees concretes de la imatge.

Page 42: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Cal recordar Imatge Digital

S’haurien d’indicar al peu de la figura les modificacions que s’hagin fet

amb l’aplicació de filtres, ja que canvien el valor numèric dels píxels.

És més que qüestionable copiar i clonar objectes.

S’accepten modificacions lineals com petites modificacions de la

brillantor i del contrast.

Les mesures d’intensitat s’haurien de fer en imatges no modificades o

modificades uniformement i el menys possible.

Evitar la compressió que porti pèrdues d’informació.

Posar sempre la barra d’escala.

Page 43: Fonaments de la imatge digital - VHIR · 2013. 7. 23. · Responsable de la Unitat de Microscòpia UAT - VHIR . ... Operacions de processament per grups de píxels veïns ... Té

Moltes Gràcies