Bioquímica-Fosforilación Oxidativa FOSFORILACIÓN OXIDATIVA

La energía de oxidación de combustibles carbonados en las mitocondrias se utiliza para

sintetizar ATP de un modo muy eficaz.

Un hombre sedentario de 70kg requiere unas 2000 kcal para sus necesidades diarias,

necesita 80kg de ATP/día. Cada molécula de ATP se recicla diariamente alrededor de 300

veces, esto es posible gracias al proceso de la fosforilación oxidativa.

La fosforilación oxidativa es el proceso por el cual se forma ATP como resultado de la

transferencia de electrones desde el NADH o FADH2. Ocurre en la mitocondria de los seres

aeróbicos por lo que depende del O2 atmosférico como aceptor último de electrones y

protones que acaba dando H2O.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

Membrana externa rica en porina mitocondrial, proteína de 30-35 kd, que permite el paso de

moléculas pequeñas como fosfato, cloruro, aniones orgánicos, nucleótidos de adenina, etc.

Solapamiento de dotaciones génicas en mitocondrias. Reclinomonas contiene todos

genes que codifican proteínas de los organismos mencionados.

Las mitocondrias son orgánulos semiautónomos que mantienen una relación

endosimbiótica con la célula hospedadora, tienen DNA y RNAs propios. El contenido de

información del DNA en este orgánulo varía según las especies. Parte de las proteínas

mitocondriales están codificadas por el núcleo celular. El genoma bacteriano mas parecido

parecido al de la mitocondria es el de la Rickettsia prowazekii (causante del tifus, transmitido

por piojos). El proceso endosimbiótico con un antecesor primitivo de Rickettsia prowazekii

parece ser el origen mitocondrial.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

Para medir el potencial de

transferencia electrónica E0´ de un electrón se

mide como potencial redox, como es el caso

del potencial de transferencia de electrones del

NADH+H+ o del FADH2.

Una semipila conectada con la semipila

estandar de referencia permite conocer el

potencial de reducción de un par redox.

4 Complejos: tres bombas de protones y una conexión

con Krebs: Succinato-Q reductasa que no bombea protones.

Los complejos I, II, III, y IV están asociados en un

complejo macromolecular llamado respirosoma. Facilitan la

transferencia rápida de electrones y previenen la liberación de

intermediarios (radicales) en las reacciones. La ubiquinona o

CoQ difunde con gran rapidez en el interior de la membrana

interna, es un excelente transportador de electrones.

El citocromo c (proteína pequeña soluble 16kd) hace de

conexión entre CIII y IV y esta situada en la membrana interna

hacia el lado citosólico.

Los electrones del FADH2 son transferidos al CoQ y

posteriormente al complejo Q-citocromo oxidorreductasa (C. III).

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa Estados de oxidación de las quinonas:

Las reacciones de transferencia de electrones están acopladas a la unión y liberación

de protones.

Desde el NADH los electrones son cedidos al FMN del Complejo I, dentro de este

complejo pasan a proteínas Fe-S.

Dentro del CI los e- pasan desde el FMN a una proteína hierro-azufre, llevan hierro no

hemínico. Las NADH-Q oxidorreductasas según las diferentes especies, llevan complejos 2Fe-

2S como 4Fe-4S, además de ir unidos a 4 residuos S- de Cys de las proteína del CI. Después

pasaran a complejos CoQ y CoQ móviles. No aceptan ni liberan H+.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

Las reacciones redox tienen lugar en la parte externa de la MM hacia la matriz

mitocondrial. El flujo de los electrones desde el NADH al CoQ a través de este complejo

bombea 4 protones y la captura de 2 protones adicionales al CoQ que se reduce a QH2.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa Esquema de la situación y funcionamiento de los complejos integrantes de la cadena

respiratoria:

La succinato

deshidrogenasa del ciclo

de Krebs que cataliza la

oxidación de succinato a

fumarato y se genera un

FADH2, forma parte del

Complejo II, complejo

succinato-Q reductasa es

un complejo integral de

membrana interna

mitocondrial, desde el

FADH2 los electrones se

transfieren a complejos Fe-S y de aquí a Q (para dar QH2, Ubiquinol). Este complejo no

transporta protones a diferencia del CI, por lo que un NADH en términos energéticos equivale

a más ATP que un FADH2. Otros enzimas como la lanzadera: glicerol fosfato deshidrogenasa

implicada en la reoxidación del NADH citosólico y la acil-CoA deshidrogenasa implicada en la

degradación de ácidos grasos, transfieren sus electrones de forma similar a la anterior desde el

FADH2 a Q para formar Ubiquinol (QH2), todas forman parte del complejo II y no bombean

protones.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

El Complejo III: Q citocromo c

reductasa transfiere los electrones

desde el QH2 al citocromo c (cit c),

bombea protones al espacio externo de

la matriz mitocondrial.

Un par de electrones bombea

un neto de 2 H+ , la mitad de la HADH-Q

reductasa al tener menor fuerza de

empuje termodinámico.

Contiene dos tipos de

citocromos b y c1, los citocromos son

proteínas con hierro hemínico y

transportan electrones, el hierropara de

Fe +2 ferroso a Fe +3 férrico. El

citocromo b lleva dos hemos el bL y el bH

que presentan diferente afinidad por los

electrones al estar en entornos

polipeptídicos diferentes. Los tres

citocromos llevan el grupo hemo es decir la ferro-protoporfirina IX, al igual que la

hemoglobina y la mioglobina.

Lleva también complejo 2F-2S, (centro de Rieske) en los que el Fe va unido a His en

lugar de Cys.

EL CICLO Q: se oxidan 2 de QH2 a Q y otra Q pasa a QH2.

Dos moléculas de QH2 se unen de forma consecutiva al complejo III, cediendo cada una

dos electrones y dos protones. Los protones se liberan al lado externo de la membrana

mitocondrial, los 2 electrones viajan a través del complejo. Uno de los electrones fluye al

complejo 2Fe-2S del centro de Rieske y después al cit c1 y de ahí es transferido a una molécula

del cit c oxidado, fuera ya del complejo, pasándolo a cit c reducido. El cit c reducido difunde a

través de la membrana hasta ser reoxidado de nuevo por el IV complejo. El segundo electrón

es transferido a una Quinona oxidada en otro centro de unión y pasa a un anión radical

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa semiquinona Q•- La unión de la segunda QH2 cede un electrón a otro cit c y otro electrón al

radical semiquinona que captura 2H+ de la matriz y pasa a QH2. Se ceden 4 protones al lado

externo y se capturan 2 mas de la matriz. De este modo se van pasando los electrones al cit c

de uno en uno ya que 1 cit c solo acepta 1 electrón y el QH2 los transporta de dos en dos.

El complejo IV llamado citocromo c oxidasa también bombea

protones al exterior de la matriz mitocondrial. Cataliza la

transferencia de electrones desde el cit c reducido al oxígeno

molecular, que es el aceptor final de los electrones.

Esta reacción depende de la presencia de oxígeno y condiciona a los seres aeróbios a

vivir en presencia de este aceptor de electrones.

La reacción es termodinámicamente espontánea con ΔG0´ = -55,4 kcal/mol. La

citocromo c oxidasa bovina consta de 13 subunidades de las cuales 3 son codificadas por la

propia mitocondria. Lleva dos grupos hemo y

3 iones Cu que ocupan 2 centros de cobre el

cobre A y B. El centro A lleva 2 cobres CuA/

CuA enlazados por dos residuos de histidina.

Este centro acepta en primera instancia los

electrones desde el cit c reducido. El otro CuB

esta coordinado con tres residuos de histidina

uno de ellos modificado con un enlace

covalente con una tirosina. (Fig. 1). Los

centros van pasando de cuproso a cúprico

según van aceptando y cediendo electrones.

Los grupos hemo a y a3 se diferencian respecto a los del complejo III en que llevan diferentes

radicales, cadenas carbonadas y uniones covalentes a la proteína.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

Mecanismo de transferencia de electrones en la citocromo c oxidasa. El hemo a3 y el

CuB forman el centro activo donde el O2 se reduce a H2O.

Estructura del puente de peróxido:

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa Se incorporan 4 H+ de la matriz mitocondrial para formar

2moléculas de agua. Adicionalmente el complejo bombea otros 4 H+

al exterior durante el paso de los electrones. Por lo que se genera

también gradiente de protones y contribución a la diferencia de

carga en la matriz mitocondrial respecto al compartimento externo

de la membrana mitocondrial.

Resumen del respirosoma:

El NADH +H+ y el FADH2 que proceden del ciclo de Krebs y de la degradación de los

ácidos grasos ceden sus electrones y protones a la cadena de transporte electrónico. Estas

reacciones espontaneas generan además a la generación de una fuerza protón-motriz que va

asociada al bombeo de protones a medida que los electrones fluyen de potenciales mas

electronegativos a mas electropositivos. Esta fuerza se utilizará para la síntesis de ATP y

producción de calor.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa El gradiente de protones impulsa la síntesis de ATP:

Hipótesis quimiosmótica de Mitchell 1961 propuso que el transporte de electrones y

la síntesis de ATP eran dos procesos acoplados a través de un gradiente de protones en de la

membrana interna mitocondrial. La fuerza protón motriz tiene dos componentes: uno eléctrico

y otro químico (el gradiente de pH). El flujo de protones genera la fuerza suficiente para llevar

a cabo la síntesis de ATP. Un proceso exergónico como el flujo de electrones desde -0,32 a

+0,82 V está acoplado a un proceso endergónico:

El complejo enzimático se denomina ATP sintasa o complejo V.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa El flujo de protones en las subunidades del anillo c (de F0), propulsa la síntesis de ATP a

través del movimiento rotatorio de la subunidad γ. El mecanismo implica a las subunidades a y

c: a esta en contacto directo con las 10 subunidades c del anillo que atraviesa la membrana

interna, cuando giran. La subunidad a contiene dos semiconductos hidrófilos que no atraviesan

la membrana, los protones pueden entrar en los conductos pero no pueden salir del

hemiconducto. La interacción de a con c facilitará la salida de los protones hacia la matriz

mitocondrial.

La estructura de c se ha determinado por cristalografía de RX y NMR. La subunidad

está formada por 2 hélices α que atraviesan la membrana, en la mitad de una de las hélices un

Asp 61 está en contacto con el entorno del conducto hidrofílico y su grupo carboxilo está como

–COO-.

El entorno del espacio externo rico en protones tenderá a pasar a la matriz

mitocondrial pobre en protones a través de los semiconductos. Un protón se unirá en el

semiconducto externo y se unirá al residuo de aspartato 61, se provoca una rotación sucesiva

del anillo de tal forma que las subunidades c se van protonando en los aspárticos 61, así

interaccionan al final de la rotación con el otro semiconducto abierto a la matriz y el protón es

liberado. El movimiento de protones promueve la rotación coordinada de las subunidades del

anillo desde la concentración alta de protones (exterior, espacio intermembrana) a la

concentración baja de protones (interior, matriz mitocondrial). El anillo está firmemente unido

a la subunidad γ y ε, formando el rotor, mientras que el estator del motor, lo forman las

subunidades α3 β3 junto con a, b2 y δ de la ATP sintasa, estas dos últimas evitan el giro de la

cabeza hexamérica. Cada giro de 360º hace que las 3 subunidades β sintetizen un ATP. Un

anillo con 10 subunidades c (levadura) corresponderá a 10 protones desplazados del exterior al

interior y 3 moléculas de ATP sintetizadas: 10/3 = 3,33

protones por molécula de ATP. Según las especies puede

haber diferencia en el nº de subunidades c del anillo.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

Si tenemos 10 subunidades c en el anillo, en 360º sintetiza 3 ATPs 10/3 =3,33 protones

por ATP sintetizado. Asumiendo 3 protones por ATP hay que tener en cuenta que parte de

estos protones se disipan cuando el ATP sale de la mitocondria al citosol. Se consideran 2,5

ATPs por NADH y 1,5 ATPs por FADH2.

Para justificar los 85 kg de ATP diarios para un hombre de 70 kg: 85000/507=167,65

moles de ATP; 167,65 x 6,022 1023 = 1,0x1026 moléculas de ATP. Deberían fluir a través de la

ATP sintasa 3,3 x 1026 protones cada día. Lo que serìa : 3,8x1021 prot/s.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa Integración de los complejos I, II, III, IV y V:

LANZADERAS. Regeneración del NADH citosólico:

El FADH2 y el NADH+H+ en estado reducido del citosol no pueden atravesar la MI de la

mitocondria por lo que para re-oxidarse y ceder sus electrones y protones al respirosoma

deben de usar una de las lanzaderas: 1-del glicerol 3-fosfato o 2-la del malato-aspartato. En

cada tipo celular se expresa solo uno de los tipos de lanzadera. De esta forma los coenzimas

como el NADH+H+ que proceden de la glucolisis (citosol) se re-oxida, para intervenir en la

glucolisis, de nuevo.

La glicerol 3-fosfato deshidrogenasa citosólica y su isoenzima glicerol 3-fosfato

deshidrogenasa mitocondrial son las responsables de la oxidación del NADH+H+ citosólico a

FADH2 mitocondrial. Se pierde un ATP en el intercambio.

Se expresa un músculo y otros tejidos.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa Teniendo en cuenta que: 1 NADH+H+ equivale a 2,5 ATPs y 1 FADH2 equivale a 1,5

ATPs, se pierde un ATP en la re-oxidación.

La lanzadera del malato-aspartato se expresa en corazón e hígado y la re-oxidación del

coenzima se lleva a cabo sin perdida de ATP ya que es el NADH+H+ el producto final formado y

equivale a 2,5 ATPs.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa Mecanismo de la ATP-ADP translocasa mitocondrial:

El ATP formado por el complejo V, queda en la matriz mitocondrial por lo que debe

salir al citosol donde se consume a ADP y Pi. La translocasa importa ADP acoplado a la salida

de ATP y viceversa. Este enzima representa el 15 % de la proteína total de MI mitocondrial y

tiene 30kd, en este intercambio se pierde ¼ del rendimiento energético asociado a la

transferencia de electrones. La inhibición de este enzima bloquea la respiración celular.

Estructura propuesta para la ATP-ADP translocasa

y otros varios transportadores mitocondriales o carriers.

Es una estructura tripartita en la que las hélices

transmembrana se disponen en forma de tienda india con

el centro de unión al nucleótido en el centro geométrico.

El Pi también es transportado al interior mitocondrial a

través del transportador del fosfato que se intercambia

por un grupo OH-. El genoma humano codifica para mas

de 40 de este tipo de transportadores. Estos

transportadores aportan a la ATP sintasa de sus sustratos,

formando un gran complejo: ATP sintatosoma.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

La velocidad de fosforilación está determinada por la necesidad de ATP. (Carga

energética). A su vez la disponibilidad de los coenzimas NAD+ y FAD controlan la velocidad del

ciclo de Krebs. Se trata de procesos acoplados, por lo que la C.E controla la velocidad de

transferencia de los electrones hasta el O2.

Desacoplamiento entre la fosforilación oxidativa y el transporte electrónico para producir

calor:

Una forma de mantener la Tª corporal en animales que hibernan, seres recién nacidos

y mamíferos adaptados al frío. UCP-1 o termogenina es una proteína desacoplante de 33kd

parecida a la ATP translocasa. El paso de electrones a través de esta proteína produce calor.

Las hormonas en ambientes frios produce liberación de ácidos grasos de los TG del tejido

adiposo que activan a la termogenina, y se produce calor.

Bioquímica-Fosforilación Oxidativa

Algunos inhibidores del transporte electrónico que

han ayudado en el estudio del proceso oxidativo y su

acoplamiento a la fosforilación oxidativa. La oligomicina y

la diciclohexilcarbodiimida son inhibidores de la ATP

sintasa. El atractilósido y el ácido bongcréquico son

inhibidores de la ATP trasnlocasa.

Un desacoplante de ambos procesos. Los

desacoplantes consumen oxígeno porque cortocircuitan el

transporte de electrones a través de la membrana interna

mitocondrial, pero no se sintetiza ATP en su presencia.