FRACIONAMIENTO CELULAREl fraccionamiento celular es usado para investigar la bioqumica y fisiologa deorganelosfuera del ambiente complejo de la clula intacta. El objetivo principalde este experimento es aislar los cloroplastos, ncleo y mitocondria del tejido de plantas porel mtodo de fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscpicamente y estimar elcoeficiente de sedimentacin de los cloroplastos.HOMOGENIZACINPara preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medioapropiado (una solucin amortiguadora, salina azcar isotnica). Para mantenerla integridad de losorganelosy enzimas durante el procedimiento de lafraccionacin,todas las soluciones y cristalera deben mantenerse fras. Despus de rebanar las hojas, el tejido est preparado para la homogenizacin, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin daar el medio en suspensin. La suspensin de clulas constituyentes se llamahomogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenizacin se debe realizar con unmortero (fig.1), al cual se le aade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislarn de la espinaca; ncleos y mitocondria se aislarn de la coliflor. CENTRIFUGACINDebido a las diferencias en tamao y densidad, cada componente celular est sujeto a una fuerza centrfuga. La fuerza generada por la centrfuga se expresa como fuerza centrfuga relativa (RCF) en unidades de g.La RCF es una funcin de velocidad de centrifugacin en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partculas desde el eje de rotacin. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de laecuacin: RCF = 1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (encm) desde el eje de rotacin hasta el margen de afuera del tubo de centrfuga.CENTRIFUGACIN DIFERENCIALEn la centrifugacin diferencial, elhomogenadoes centrifugado repetidas vecesa altasvelocidades, sedimentndoloprogresivamente en pequeas partculas. El mtodo est ilustrado en lafig.2. La primera centrifugacin es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fraccin nuclear. Este pellet contiene el ncleo, clulas intactas y tejido.La prxima separacin es elsobrenadantepostnuclearo partculas suspendidas en lquido sobre el pellet nuclear, el cual estransferidoa otro tubo de centrfuga y se centrfuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrfuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fraccinmitocondrial;ste contiene mitocondria y micro cuerpos.EJEMPLO:

PROCEDIMIENTO1. Perfusin y lavado del hgado, para el lavado utilizaremos KCL.

EN EL HGADO

1. Homogenizacin de la muestra, en un mortero trituramos el hgado.

3. Contrapeso y se lleva la muestra ala centrifugadora a 5 minutos.

4. La primera centrifugacin que en su sedimento encontramos: ncleos y fragmentos de la membrana plasmtica luego llevamos el sobrenadante a una segunda centrifugacin por 10 minutos.

LA SANGREN LA SANGRE

5. Se obtuvo el segundo centrifugado en el cual encontramos en su sedimento: mitocondrias y lisosomas.

a. Se extrae sangre de un compaero de clase. Y se le agrega a un tubo de ensayo eliminando cualquier coagulo que se forme. b. Se contrapeso

c. Se lleva a centrifugacin por 10 minutos obteniendo el suero sanguneo

RESULTADOS:

N CENTRIFUGACINTIPOOBSERVACIN

PRIMERA CENTRIFUGACINFRACCIONAMIENTO NUCLEARNcleos, membrana

SEGUNDA CENTRIFUGACINFRACCIONAMIENTO MITOCONDRIALmitocondria y lisosomas

DISCUSIN:Fraccionamiento sub celular consiste en una tcnica bioqumica utilizada para separar ls distintos organelos y componentes celulares para su estudio, en la prctica primero se procedi a decolorar el hgado de pollo el cual se realiz por la tcnica de perfusin la cual consiste en inocular unan solucin de nuestra muestra de hgado con el fin de eliminar el tejido con una solucin buffer (eliminar el color rojo, la sangre) para ello utilizamos KCl 0,154M helado.2Cuando se perfunde se suele realizar en un rgano aislado lo cual permite el bombeo de una disolucin isotnica, esta se encarga de aportar todos los nutrientes necesarios y a su vez eliminar desechos.Luego se procede al fraccionamiento y homogenizacin, luego la muestra se coloc en un tubo de ensayo con sacarosa, ya que le da un medio adecuado a la muestra seguida de centrifugacin a distintas velocidades y tiempos, pues en la primera centrifugacin que se realiz en 5 minutos encontramos en el sedimento ncleos, membrana plasmtica, en la segunda centrifugacin observamos en el sedimento mitocondrias y lisosomas. Finalmente en el sobrenadante se encuentran partculas menos densas esta se debera llevar a una tercera centrifugacin pero por la premura del tiempo no se lleg a realizar. Dando fin con la segunda centrifugacin a la prctica. (1)(2)(3) Resumen Primero se procedi a la extraccin del rgano en este caso del hgado, el cual va a ser colocado en una placa Petri, para luego ser perfundido con KCl helado, siendo inoculado con una jeringa en el tejido, luego se procede al fraccionamiento y homogenizacin, se llev la muestra a 2 tubos con sacarosa, contrapesamos y finalmente sometemos a centrifugacin la primera a 5 minutos y la segunda a 10 minutos en las cuales observamos fraccin nuclear y fraccin mitocondrial respectivamente.CONCLUSIONES:1. Se identific tericamente las fracciones de sedimento y sobrenadante en los 2 procesos de centrifugacin a las cuales se someti al hgado; al igual que la sangre pero esta se someti a una sola centrifugacin de 10 minutos obteniendo el suero sanguneo.2. Se identific la fraccin celular nuclear y mitocondrial por centrifugacin diferencial. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:1. KOOCMAN, J. Bioqumica: Textos y atlas. (3, ed.). Argentina: Panamericana. p: 1982. CAMPBELL, N. (2008). Biologa. (7! ed.).Argentina: Panamericana. pp: 97 1003. LODICH, Berk. (2008). Biologa Celular y Molecular. (5, ed.) Argentina: Panamericana p: 167

PUNTO ISO ELECTRICOEl Punto Isoelctrico (IEP) est definido como el pH en el cual las cargas positivas igualan a las cargas negativas y no existe movimiento en un campo elctrico.En su calidad de protena, la gelatina exhibe una conducta anfotrica debido a la presencia de grupos funcionales de aminocidos y grupos amino y carboxil terminales. En medios acdicos, es decir en presencia de altas concentraciones de iones H+, la gelatina tiene carga positiva. En medios alcalinos, es decir en presencia de iones OH-, la gelatina tiene carga negativa. En el punto isoelctrico (IEP) las cargas positivas de los radicales NH3+ igualan a las cargas negativas de los radicales COO-.El IEP es una propiedad intrnseca de la gelatina, determinada por los tratamientos de las materias primas y el tipo de proceso: Las gelatinas Tipo A (cidas) presentan un IEP que oscila entre 6 - 9.5. Sin embargo, el tratamiento previo de ciertas materias primas (como por ejemplo el proceso de depilado del cuero o piel) pueden bajar el IEP a menos de 6. Las gelatinas Tipo B (alcalinas) tienen un IEP que oscila entre 4.5 5.6.La gelatina con un IEP bajo se debe al fenmeno de amidacin de aminocidos. Las gelatinas de Tipo A y B provenientes de materias primas tratadas o pre tratadas con sustancias alcalinas que eliminan los grupos de amidas, presentan un IEP bajo.

CARACTERSTICASLas funcionalidades de las protenas se ven afectadas cuando se aproximan al IEP, debido a la atraccin electroesttica de los grupos con carga opuesta. De esta manera, en el IEP las propiedades de la gelatina coinciden con los valores mximos o mnimos. Mnimos : hidratacin, viscosidad y gelificacin ; mximos: turbidez, fuerza de gel, poder de espumado y sinresis- El IEP es til para explicar las posibles interacciones de la gelatina con otros ingredientes, en particular los polmeros aninicos. Por ejemplo, una gelatina Tipo B interacta mejor con un polmero aninico (ej. carrageninas en el mousse de chocolate) para evitar la precipitacin por incompatibilidad, que depende de las condiciones de Ph.PROCEDIMIENTO

Agregamos a 1 ml de casena en acetato de sodio 0,1 N a cada tubo. Obteniendo un efecto inmediato.Agregamos a 9 tubos de ensayo cido actico ms agua destilada.

1 tubo: 3,2 Ac. Actico + 6,8 H2O destilada.2 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 1 + 5 Ml de H2O destilada.3 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 2 + 5 Ml de H2O destilada.4 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 3 + 5 Ml de H2O destilada.5 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 4 + 5 Ml de H2O destilada.6 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 5 + 5 Ml de H2O destilada.7 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 6 + 5 Ml de H2O destilada.8 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 7 + 5 Ml de H2O destilada.9 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 8 + 5 Ml de H2O destilada. (de este tubo se saca 5 ml y se elimina)

Despus de 30 minutos calentar ligeramente cada uno de los tubos y apreciar el efecto sobre la solubilidad. Anotar.

Finalmente agregamos una gota de fenolftalena. Mezcla.

Sucesivamente se le agrego NaOH hasta la aparicin de color rosado.

RESULTADOS:N DE TUBO123456789

9pH de cada tubo3,53,84,14,44,75,05,35,65,9

Enturbiamiento al mezclar O++++++OO

Enturbiamiento a ppdo a 30O++XXX+OO

Solubilidad despus de calentarO

+XXXX+OO

Solubilidad despus de agregar NaOH 10%OOOOOOOOO

O= no cambio + = Opalescencia X= ppdoAPLICACIN DE LA ECUACION DE HENDERSON HASSELBACH

pK Ac. Actico = 4,7La Concentracin de sal es de 0,1 N en cada caso.La concentracin de cido es 1,6 ml de cido 1 N en el tubo 1 (1,6 ml. 1N = 16ml. 0,1 N)

=5,9

PI = 4,4

DISCUSIN:El punto isoelctrico en una protena tiene que ver con las cargas positivas y con las cargas negativas, siendo importante saber que esta propiedad es especfica de cada protena, utilizando una muestra practica de casena.El PI no es ms que una caracterstica de las protenas donde estn neutras y por tal motivo precipitan, esta caracterstica es la que se resalta en la prctica al comparar los tubos ya que nos permite diferenciar donde se produce el punto isoelctrico, se ve cuando hay mayor precipitado. En los diferentes tubos se observaron enturbecimiento y opalescencia.Un factor importante es la intervencin de color y tiempo. Luego cuando agregamos el indicador en pH acido (fenolftalena) podemos ver que mientras lo alejes del pH el indicador desaparece.RESUMEN:En esta prctica se enumeran 9 tubos, en el primer tubo se mide 3,2 ml de cido actico 1N y 6,8 ml de agua destilada, luego se mide 5 ml de agua para los tubos restante. Despus sacamos 5ml del primer tubo y luego pasarlo al segundo tubo este procedimiento se repite hasta llegar al noveno tubo donde se elimina esos 5ml. Luego se agrega 1ml de casena en acetato de sodio a cada tubo y observamos los cambios, as dejamos pasar 30 minutos y observamos los cambios; calentamos los tubos ligeramente, luego se le agreg fenolftalena, sucesivamente se le agrego NaOH hasta la aparicin de color rosado.CONCLUSIN: Se determin el PI de una protena que fue de 4,4 relacionando la solubilidad mnima con el pH de la solucin en que ella se produce.

VITAMINA CLavitamina Ces unavitaminahidrosoluble sensible al calor. Qumicamente hablando, se trata de cido L-ascrbico y sus sales, los ascorbatos(los ms comunes, que son ascorbatos de sodio y de calcio).

ACCINLa vitamina C es uncofactor enzimticoimplicado en diversas reacciones fisiolgicas (hidroxilacin). Es necesaria para la sntesis del colgeno y de los glbulos rojos, y contribuye al buen funcionamiento del sistema inmunitario. Tambin juega un papel en el metabolismo del hierro, en la transformacin de dopamina ennoradrenalinay en la biosntesis de carnitina. Bajo su forma oxidada, atraviesa la barrera hemato-enceflica para acceder al cerebro y a varios rganos. Muy frgil en solucin, se destruye al contacto con el aire, por la luz o el calor. Se trata de un antioxidante, molcula capaz de contrarrestar la accin nociva de oxidantes como los radicales libres. Con este fin, tambin se emplea la forma R- del cido ascrbico, la cual, al contrario que la forma L-, no presenta actividad vitamnica.

SOS TERAPUTICOSU Segn varios terapeutas e investigadores que hacen uso de dosis farmacolgicas de ascorbatos, si esta molcula es administrada bajo una forma adecuada, por medio de tcnicas apropiadas, en dosis suficientemente frecuentes, en conjuncin con ciertos agentes y durante un perodo suficiente, puede prevenir y, a menudo, curar, un gran nmero de enfermedades, corrientes o raras, mortales o no, particularmente la gripe y las enfermedades coronarias. Sin embargo, se ha demostrado que es errnea la creencia popular de que la vitamina C evita el resfriado, aunque s puede acortar ligeramente su duracin.

Se utiliza tambin como desintoxicante de algunos medicamentos y drogas, y tiene la capacidad de evitar la formacin de nitritos y aminas cancerosos por su poder antioxidante. Recientemente se emplea en la prevencin y tratamiento de la enfermedad del viajero (cinetosis).

Apoyo al sistema inmunitarioEl cido ascrbico apoya el sistema inmune (los glbulos sanguneos blancos). La vitamina C fortalece no slo las clulas inmunes (linfocitos y macrfagos) sino tambin la concentracin de inmunoglobulinas en el suero sanguneo.

Regulacin del colesterol

Un estudio que data de 1986 indica que la vitamina C podra tener un papel importante en la regulacin de la sntesis delcolesterol.

Vitamina C y plomo

En 1939, 34 trabajadores que haban absorbido plomo fueron tratados con vitamina C. Recientemente, un estudio sobre animales mostr que la vitamina C tena un efecto protector contra la intoxicacin por plomo sobre la funcin nerviosa y muscular. Entre fumadores, la administracin de 1000 mg de vitamina C permiti una reduccin media del 81% de las concentraciones sanguneas de plomo, mientras que 200 mg quedaron sin efecto. Los autores concluyeron que un suplemento de vitamina C podra representar un modo econmico y prctico de hacer bajar las concentraciones de plomo en la sangre.

Autismo

Un suplemento de vitamina C reduce la gravedad de los sntomas en nios que sufren autismo.

Traumatologa

La aparicin del sndrome de desfallecimiento multivisceral, que para los traumatlogos es uno de los principales signos anunciantes de defuncin, aparece menos a menudo entre los pacientes que reciben vitamina C. Esta vitamina reduce tambin la duracin de la estancia en cuidados intensivos.

Fertilidad

Entre hombres infecundos, se demostr que un suplemento de vitamina C mejoraba la cualidad del esperma (morfologa y movilidad de los espermatozoides) y aumentaba el nmero de espermatozoides.

PROCEDIMIENTO

Extraer el jugo de limn.

Se prepara una dilucin 0,1/2 en una solucin actica metafosfrica.

Se titula la muestra con una solucin de 2,6 diclorofenolindofenol.

Con la titulacin tomara un color ligeramente rosado.

RESULTADOS:DETERMINACIN CUANTITATIVA:

DISCUSIN:En esta prctica se pudo observar la manera en como la vitamina c reacciona con la solucin 2,6 diclorofenolindofenol a raz que se forma un complejo coloreado entre la solucin y la vitamina C, debido que esta es un tipo de reaccin acido-base.Que se encontr que la vitamina c es el zumo de limn en el cual la muestra fue diluida con una solucin actica metafosfrica y titulada con la solucin 2,6 diclorofenolindofenol y observamos el cambio de color, que pasa de azul oscuro a rosa dbil. El cido ascrbico (vitamina C) se determin qumicamente en el laboratorio basndose en su fuerte capacidad reductora; que es capaz de reducir al 2,6 diclorofenolindofenol (azul en medio bsico y rojo en medio acido) a un compuesto incoloro. El 2,6 diclorofenolindofenol en este caso acta como un solvente indicador y la soluciona Actico metafosfrica como una solucin extractora, la cual se hace bsica para poder cuantificar.As comparando los resultados de los distintos alimentos analizados podemos observar que la cantidad de vitamina c en ellos es muy variable.Tambin cabe mencionar que la vitamina c se degrada a temperaturas por lo que se recomienda no cocer por demasiado tiempo, ya que esto conlleva a la desnaturalizacin e inactivacin de las vitaminas cuando lo ingerimos. RESUMEN:En el desarrollo de la presente prctica, se determin cuantitativamente el porcentaje de vitamina C en el limn.Primero se extrajo el zumo de limn, 0,1 ml y se diluyo en una solucin actica metafosfrica, 0,19 ml logrando una dilucin 1/20.Luego se prepar el blanco utilizando 2 ml de solucin actica metafosfrica titulando con el indicador. Se procedi a calcular del promedio del sol. Blanco. Con la dilucin de la muestra ya realizada se empez a titular con 2,6 diclorofenolindofenol y hasta la variacin del color ha rosado dbil.CONCLUSIN: Se determin cuantitativamente que el jugo de limn presenta una cantidad de Ac. Ascrbico de 1,8 mg.