FUNCIONES INDEPENDIENTES DE PROTENA VIRAL NUCLEICO

CIDO EN EL CRECIMIENTO DE BACTERIFAGO *

By A.D. Hershey y Martha Chase

(Desde el Departamento de Gentica de la Institucin Carnegie de Washington, Cold Sprig

Harbor, Long Island)

(Recibido para su publicacin el 9 de abril de 1952)

El trabajo de Doermaml (1948), Doermann y Dissosway (1949), y Anderson y Doermann (1952) ha

demostrado que los bacterifagos T2, T3, y Multiplican T4 en la clula bacteriana en una forma no

infecciosa. Lo mismo es cierto de los del fago transportado por ciertas bacterias lisognicas (Lwoff

y Gutmann, 1950). Poco ms se sabe acerca de la fase vegetativa de estos virus. Los experimentos

reportados en este trabajo muestran que uno de los primeros pasos en el crecimiento de T2 es la

liberacin de su capa de protena del cido nucleico de la partcula de virus, despus de lo cual la

mayor parte de la protena que contiene azufre no tiene an ms la funcin.

Materiales y Mtodos - fagos. T2 significa en este trabajo la variedad llamada T2H (Hershey,

1945); T2h significa uno de los mutantes de espectro de hospedadores de T2; medios UV-fago

irradia con luz ultravioleta de una lmpara germicida (General Electric Co.) a una supervivencia

fraccional de 10-5

.

Bacterias sensibles significa una cepa (H) de Escherichia colisensible a T2 y su h mutante; bacterias

resistentes a B / 2 significa una cepa resistente a T2, pero sensible a su h mutante; bacterias

resistentes B/2h significa una cepa resistente a ambos. Estas bacterias no adsorber los fagos en los

que son resistentes.

"Caldo de sal de los pobres 'contiene por litro 10 gr. Bacto-peptona, 1 gr. Glucosa y 1 gr. NaC1.

"Caldo" contiene, adems, 3 gr. extracto bacto-beef y 4 gr. NaCl.

Medio Glicerol-lactato contiene por litro 70 mm lactato de sodio, 4 gr .glicerol, 5 gr. NaC1, 2 gr.

KCI, 1 gr. NH4Cl, 1 mm MgC12, 0,1 mm CaC12, 0,01 gr. gelatina, 10 mgr. P (como ortofosfato), y

10 mg. S (como MgSO4), a pH 7,0.

Medio de adsorcin contiene por litro 4 gr. NaC1, 5 gr. KSO4, 1.5 gr. KH2PO4, 3.0 gm.Na2HPO4,

1 mM MgSO4, 0,1 mm CaCl2 y 0,01 gr. gelatina, a pH 7,0.

Tampn veronal contiene 1 gr por litro. Diethylbarbiturate sodio, 3 mm MgS04, 1 de gr. gelatina, a

pH 8,0.

El HCN se refiere el presente trabajo consiste en una solucin de cianuro de sodio molar

neutralizado cuando sea necesario con cido fosfrico.

* Esta investigacin fue financiada en parte por una beca de investigacin de la National Instituto

Microbiolgico de los Institutos Nacionales de Salud, Servicio de Salud Pblica.

Los istopos radiactivos han sido facilitadas por el Laboratorio Nacional de Oak Ridge en la

asignacin de la Divisin de Istopos, Estados Unidos Comisin de Energa Atmica.

La adsorcin de istopos a las bacterias se mide generalmente mediante la mezcla de la muestra en

medio de adsorcin con bacterias de 18 cultivos de caldo horas previamente calentadas a 70 C.

durante 10 minutos y se lavaron con medio de adsorcin. Las mezclas fueron se calent durante 5

minutos a 37 C, se diluy con agua, y se centrifug. Los ensayos se de hecho, tanto los sedimentos

y fracciones de sobrenadante.

La precipitacin de istopo con antisuero se midi mediante la mezcla de la muestra en 0,5 por

ciento de solucin salina con aproximadamente 1011 por ml.de fago no radiactivo y ligeramente

ms de la menor cantidad de suero antiphage (dilucin final 1:160) que causar precipitacin visible.

La mezcla se centrifug despus de 2 horas a 37 C. Las pruebas con DNasa (desoxirribonucleasa)

fueron realizados por muestras del calentamiento diluido en tampn veronal durante 15 minutos a

37 C.con 0,1 trapo. por ml. del cristalino enzima (Worthington Laboratorio de Bioqumica).

Istopo soluble en cido se midi despus de la muestra refrigerada haba sido precipitada con

cido tricloroactico al 5 por ciento en presencia de 1 mg. / ml, albmina de suero, y se centrifug.

En todos los fraccionamientos que implican la centrifugacin, los sedimentos no se lavaron, y

contena aproximadamente 5 por ciento del sobrenadante. Ambas fracciones se ensayaron. La

radiactividad se midi por medio de un extremo-ventana contador Geiger, utilizando muestras secas

lo suficientemente pequeas para evitar prdidas por el ensimismamiento. Por me-absolutos

mensiones, soluciones de referencia de P obtenidos de la Oficina Nacional de Normalizacin, as

como un estndar simulada permanente, se utilizaron. Para las mediciones absolutas de Ss5

nos

basamos en los ensayos (4-20 por ciento) proporcionados por el proveedor del istopo (Laboratorio

Nacional de Oak Ridge).

Medio Glicerol-lactato se eligi para permitir el crecimiento de las bacterias sin un-cambios de pH

deseables a bajas concentraciones de fsforo y de azufre, y probadas til tambin para ciertos

experimentos descritos en este documento.Cultivos de 18 horas de sensibilidad bacterias que crecen

en este medio contienen aproximadamente 2 109 clulas por ml., que crecen exponencialmente y

sin retraso o cambio en la dispersin de la luz por celular cuando se subcultivan en el mismo medio

de grandes o pequeos cabezas de serie. El tiempo de generacin es de 1,5 horas a 37 C. Las

clulas son ms pequeos que las cultivadas en caldo.T2 muestra un perodo de latencia de 22 a 25

minutos en este medio. El rendimiento fago obtenido por lisis con cianuro y UV-fago (descrito en el

contexto) es uno por bacteria a los 15 minutos y 16 por bacteria en 25 minutos. El tamao de la

rfaga final en culturas diluidas es de 30 a 40 por bacteria, lleg a los 50 minutos. En 2 108

clulas por ml., la cultura lisa lentamente, y produce 140 fagos por bacteria. El crecimiento tanto de

bacterias y fagos en este medio es tan reproducibles como que en caldo.

Para la preparacin de fago radiactivo, P32

de actividad especfica de 0,5 mc. / Mg, o S35

de la

actividad especfica 8,0 mc. / Mg, se incorpor en el medio de glicerol-lactato, en el que se permite

la proliferacin bacteriana al menos 4 horas antes de la siembra con el fago. Despus de la infeccin

con el fago, el cultivo se aire durante la noche, y el radiactivo fago se aisl mediante tres ciclos de

alternativa lento (2,000 G) y rpido (12.000 G) centrifugacin en medio de adsorcin. Las

suspensiones se almacenan a una concentracin no superior a 4 i.tc. / ml.

Preparaciones de este tipo contienen 1,0 a 3,0 10-12

ug. S y 2,5 a 3,5 10-11

ug. P por partcula de

fago viable. Preparaciones ocasionales que contienen cantidades excesivas de azufre se puede

mejorar la absorcin de bacterias muertas por calor, que no se adsorben el fago. La pureza

radioqumica de las preparaciones es algo incierto, poseer la posible presencia de partculas de fago

inactivos y membranas fagos vacas.

La presencia en nuestras preparaciones de azufre (alrededor de 20 por ciento) que se precipita por

antiphage suero (Tabla I) y, o bien adsorbido por las bacterias resistentes a los fagos, o no adsorbido

por bacterias sensibles a los fagos (Tabla VII), indica contaminacin por el material de la

membrana.Los contaminantes de origen bacteriano son probablemente insignificante para

propsitos actuales, a juzgar por los datos que figuran en la Tabla I. Para la prueba de que nuestro

principales hallazgos reflejan propiedades genuinas de partculas de fagos viables, contamos con

algunos experimentos con fagos inactivados citados al final de este documento.

La Morfologa Qumica de Partides fagos reposo -. Anderson (1949) encontr que el bacterifago

T2 podra ser inactivado mediante la suspensin de las partculas en altas concentraciones de

cloruro de sodio, y rpidamente diluyendo la suspensin con agua. Los fagos inactivados era visible

en micrografas electrnicas en forma de renacuajo "fantasmas". Dado que ninguna inactivacin se

produjo cuando la dilucin fu lenta, atribuy la inactivacin de choque osmtico, y dedujo que las

partculas posea una membrana osmtica.Herriott (1951) encontr que el choque osmtico liberado

en la solucin de ADN (cido nucleico desoxypentose) del fago partculas, y que los fantasmas

pueden adsorber a las bacterias y lisar ellos. Seal que se trataba de un comienzo hacia la

identificacin de las funciones virales con sustancias virales.

Hemos plasmolyzed T2 marcado isotpicamente mediante la suspensin del fago (1011

por ml.) En

cloruro de sodio 3 M durante 5 minutos a temperatura ambiente, y rpidamente vertiendo en la

suspensin de 40 volmenes de agua destilada.Los plas- fago molyzed, que no contenga ms de un

2 por ciento de los sobrevivientes, era entonces un- alyzed para el fsforo y el azufre en las varias

maneras que se muestran en la Tabla I. La resultados confirman y extienden los resultados

anteriores de la siguiente manera:

1. Plasmlisis separa fago T2 en fantasmas que contienen casi toda la azufre y una solucin que

contiene casi todo el ADN de las partculas intactas.

2. Los fantasmas contienen los principales antgenos de la partcula del fago detectar- capaz por

nuestro antisuero.El ADN se libera en forma de cido libre, o posiblemente vinculado que, al

parecer, las sustancias no antignicos sin azufre.

3. Los fantasmas se adsorben especficamente a las bacterias susceptibles fago-; la ADN no lo es.

4. Los fantasmas representan capas de protenas que rodean el ADN de la intacta partculas,

reaccionan con antisuero, proteger el ADN de DNasa (desoxyribo- nucleasa), y llevar el rgano

de unin a las bacterias.

5. Los efectos observados se deben a choque osmtico, porque fago suspendido en sal y diluida

lentamente no se inactiva, y su ADN no est expuesta a DNasa.

Sensibilizacin del ADN del fago a la ADNasa por adsorcin de bacterias

P32 S35 P32 S35

soluble en acido - - 1 -

soluble en acido despues del tratamiento con Dnasa 1 1 80 1

adsorbido a las bacterias sensibles 85 90 2 90

precipitada por antifago 90 99 5 97

porcentaje de isotoposTotal del fago marcado con Plasmolysed fago marcado con

TABLA I

Composicin de los fantasmas y la solucin de Plasmolysed Fago

Fago adsorbido a las bacterias durante 5 minutos a 37 C. en medio de adsorcin, seguido de lavar.

Las bacterias calentaron durante 10 minutos a 800C.en medio de adsorcin (antes de la infeccin) o

en tampn veronal (despus de la infeccin). Fago no adsorbido calienta en tampn veronal, se trat

con DNasa, y se precipit con cido tricloroactico. Todas las muestras fraccionadas mediante la

centrifugacin de 10 minutos a 1.300 G. Sensibilizacin del ADN del fago a la ADNasa por

adsorcin de bacterias. La estructura de la partcula del fago reposo descrito anteriormente sugiere a

la vez la posibilidad que la multiplicacin del virus es precedida por la alteracin o eliminacin de

la capas protectoras de las partculas. Se podra esperar que este cambio manifestarse como una

sensibilizacin del fago ADN de DNasa.Los experimentos descritos

En la Tabla II muestran que esto ocurre.Los resultados se pueden resumir de la siguiente manera:

1. El DNA del fago se convierte en gran medida sensible a ADNasa despus de la adsorcin a

bacterias muertas por calor.

2. Lo mismo es cierto del ADN de fago adsorbido a bacterias y, a continuacin, calentado a 80 C.

durante 10 minutos, a cuya temperatura es des absorbida fago no sensibilizado a DNasa.

3. El ADN de fago adsorbido a las bacterias sin calefaccin es resistente a la DNasa,

presumiblemente debido a que est protegido por las estructuras celulares impermeables a la

linea de enzima.

Graham y colaboradores (comunicacin personal) fueron los primeros en descubrir la

sensibilizacin de ADN del fago a DNasa por adsorcin a-muertos por calor bacterias.

Despues de Dnase No Dnase

Las bacterias vivas S35 2 1

Las bacterias vivas P32 8 7

Las bacterias calentadas antes de la infeccion S35 15 11

Las bacterias calentadas antes de la infeccion P32 76 13

Las bacterias calentadas despues de la infeccion S35 12 14

Las bacterias calentadas despues de la infeccion P32 66 23

P32 5

P32 13

P32 81

P32 88

TABLA II

Sensibilizacin de los fagos de ADN para DNasa por adsorcin de bacterias

el fago absorbido a Fago etiquetado

con

Isitopo no cedimentable (porcentaje)

Climatizada fago absorbida

El ADN en las clulas infectadas tambin se pone a disposicin de DNasa alternativo congelacin y

descongelacin (seguido de la fijacin de formaldehdo para inactivar Cellular enzimas), y en cierta

medida por la fijacin de formaldehdo solo, como ilustrado por el siguiente experimento.

Las bacterias se cultivaron en caldo a 5 10 clulas por ml., Se centrifugaron, se resuspendieron en

medio de adsorcin, y se infectaron con aproximadamente dos P = fago marcado por bacteria.

Despus de 5 minutos para la adsorcin, la suspensin se diluy con agua que contiene por 1,0

litros MXS MgSO4, 0,1 m CaCl y 10 de trapo.gelatina, y centrifugar. Las clulas se resuspendieron

en el fluido mencionada en ltimo lugar a una concentracin de 5 x 108 por ml.

Esta suspensin se congel a -15 C.y descongelado con un mnimo de calentamiento, tres veces

seguidas. Inmediatamente despus de la tercera descongelacin, las clulas se fijaron por la adicin

de 0,5 por ciento(V / v) de formalina (35 por ciento HCHO).Despus de 30 minutos a temperatura

ambiente, la suspensin se dializ libre de formaldehdo y centrifugado a 2200 g durante 15

minutos.Las muestras de P-etiquetados fago, fija congelada thawedl, y se dializa, y de las clulas

infectadas fijado slo y se dializ, se llevaron a lo largo de como controles.

El anlisis de estos materiales, dada en la Tabla III, que muestra el efecto de congelacin y

descongelacin es hacer que el ADN intracelular lbil a DNasa, sin, sin embargo, que causa gran

parte de ella a lixiviarse de las ceils.Congelacin y descongelacin y la fijacin de formaldehdo

tienen un efecto insignificante en adsorbido fago, y el formaldehdo fijacin, tiene slo un efecto

leve sobre las clulas infectadas.

Tanto la sensibilizacin de la intracelular p3-a DNasa, y su falta de lixiviacin fuera de las clulas,

son caractersticas constantes de los experimentos de este tipo, con independencia de lisis visible.

En el experimento se acaba de describir, la suspensin congelada se aclar durante el perodo de

dilisis. Microscopa de contraste de fases mostr que las celulas consisti en gran parte de las

membranas vacas, muchos aparentemente roto. En otro experimento, las muestras de bacterias

infectadas de un cultivo en caldo de sal de los pobres fueron congelados y descongelados en varias

ocasiones varias veces durante el perodo de latencia de crecimiento de fago, se fijaron con

formaldehdo, y luego se lav en la centrfuga.

Compensacin y lisis microscpico ocurrieron solamente en suspensiones congeladas durante el

segunda mitad del perodo de latencia, y ocurri durante el primer o segundo deshielo. En este caso

las clulas lisadas consistan enteramente de las membranas celulares intactas, aparece vaco,

excepto por algunos pequeos cuerpos refringentes, ms caractersticos aparentemente unido a las

paredes de las clulas.El comportamiento de p32 intracelular hacia DNasa, en cualquiera de las

clulas lisadas o no lisadas, no fue significativamente diferente de que se muestra en la Tabla III, y

el contenido de PA fue slo ligeramente inferior despus de lisis. El fago liberado durante la

congelacin y descongelacin tambin fue filtrado este experimento. La lisis se produjo sin la

liberacin apreciable de fago en las suspensiones congeladas hasta e incluyendo los 16 minutos, y el

20 min- muestra ute produjo slo el cinco por bacteria.Otra muestra de la cultura formalinizados a

los 30 minutos, y se centrifug sin congelacin, contenida66 por ciento de la PA en forma no

sedimentable.El rendimiento de fago extracelular a los 30 minutos fue 108 por bacteria, y el

material sedimentado consista gran parte de los desechos sin forma, pero tambin muchos

contenida celular aparentemente intacta membranas.

TABLA III

Sensibilizacin de los fagos Intracdlular de DNasa por congelacin, descongelacin, y Fijacin con

formaldehdo

Las cifras expresan por ciento de P32

en el fago original, o su fraccin adsorbida.

Llamamos a las siguientes conclusiones a partir de los experimentos en los que las clulas

infectados con PS! fago marcado se someten a congelacin y descongelacin.

1.El DNA del fago se vuelve sensible a ADNasa despus de la adsorcin de bacterias en tampn

bajo condiciones en las que se produce al proceso de crecimiento conocida (Benzer, 1952;

Dulbecco, 1952).

fago no absorbido

congelado

descongelado, fijo

clulas infectadas

congelados,

descongelados, se

fijaron

celulas solo

infectadas

- 71 86

- 0 0.5

- 59 28

- 29 14

1 0.8 0.4

11 21 5.5

TABLA IIISensibilizacin de Intracdlular Fago a DNasa por congelacin, descongelacin, y Fijacin con

formaldehido

total P 32

soluble en acido

acido soluble despues Dnase

total P 32

soluble en acido

acido soluble despues Dnase

fraccion de sedimentos de baja velocidad

fraccion sobrenadante de baja velocidad

2.La membrana celular se puede hacer permeable al DNasa en condiciones que no permitir el

escape de cualquiera de los P = intracelular o la mayor parte de la contenido de la celda.

3.Incluso si las clulas se lisan como resultado de la congelacin y descongelacin, lo que permite

escapar de otros constituyentes celulares, la mayor parte de la p3 derivado de fago permanece en el

interior las membranas de las clulas, al igual que la progenie del fago maduro.

4.El p3 intracelular derivado de fago se libera en gran parte durante espon- lisis espontnea

acompaada de la liberacin del fago Interpretamos estos hechos en el sentido de que el ADN

intracelular derivado del fago no es ms que el ADN en solucin, sino que es parte de una

estructura organizada en todo momento durante el perodo de latencia.

Liberacin de ADN a partir de partculas de fago por adsorcin bacteriana Fragmenttos. La

sensibilizacin de ADN del fago a despolimerasa especfica por adsorcin a las bacterias podra

significar que la adsorcin es seguido por la expulsin de el ADN del fago a partir de su capa

protectora. El siguiente experimento muestra que este es, de hecho, lo que sucede cuando el fago se

une a bacterias fragmentada las clulas.

TABLA IV

Liberacin de ADN de fagos adsorbidos en los restos de bacterias

S 35 - y la etiqueta P-T2 se mezclaron con muestras idnticas de los restos de bacterias en la

adsorcin medio y se calent durante 30 minutos a 37 C. Despus las mezclas se centrifugaron

S35 P32

16 22

87 55

0 2

2 29

5 5

13 45

0.8 0.5

0.8 39

TABLA IV

Liberacion de ADN de fago absorbido a los residuosbacterianos

fago etiquetado con

isotopo soluble en acido

fraccion de sedimentos

sobrevivir fago

Isotopo total

soluble en acido despues de Dnase

soluble en acido despues de Dnase

fraccion sobrenadante

sobrevivir fago

Isotopo total

isotopo soluble en acido

durante 15 minutos a 2200 g, y las fracciones de sedimento y sobrenadante se analizaron por

separado. Los resultados AX expresaron como tanto por ciento de fago de entrada o de istopos.

Los restos de bacterias se prepar por las clulas que infectan en el medio de adsorcin con cuatro

partculas de T2 por bacteria, y la transferencia de las clulas a la sal de los pobres caldo a 37 C.

El cultivo se aire durante 60 minutos, se aadi r/50 HCN, y la incubacin continu durante 30

minutos ms.En este momento el rendimiento de ex-fago intracelular fue de 400 partculas por

bacteria, que se mantuvo sin adsorber debido a la baja concentracin de electrolitos. Los escombros

de la lisada las clulas se lavaron por centrifugacin a 1700 g, y se resuspendieron en adsorcin

medio a una concentracin equivalente a 3 X 10 clulas lisadas por ml. Consista en gran parte de

las membranas celulares colapsadas y fragmentada. La adsorcin de la radio-fago activa a este

material se describe en la Tabla IV. Los siguientes hechos debe tenerse en cuenta.

1. La fraccin no adsorbida contena slo el 5 por ciento del fago original, partculas en forma

infecciosa, y slo el 13 por ciento del total de azufre.(Mucho de este azufre debe ser el material

que no es adsorbible a bacterias enteras).

2. Alrededor del 80 por ciento del fago fue inactivada. La mayor parte del azufre de los este fago,

as como la mayora de los fagos sobrevivir, se encontr en el sedimento fraccin.

3. La fraccin sobrenadante contena 40 por ciento del total de fagos DQA (En una forma lbil

para ADNasa), adems del ADN de los sobrevivientes no adsorbido fagos. El ADN lbil

ascendi a aproximadamente la mitad de, el ADN de la inactivado partculas de fago, cuya

azufre sedimentado con la restos de bacterias.

4. La mayor parte del ADN sedimentable podra explicarse ya sea como superviviente fago, o

como ADN lbiles a la DNasa, este ltimo que asciende a aproximadamente la mitad del ADN

de las partculas inactivadas.

Experimentos de este tipo no son satisfactorios en un aspecto: no se puede decir si el ADN liberado

representa todo el ADN de algunos de las inactivadas partculas, o slo parte de ella.

Se obtuvieron resultados similares cuando las bacterias (cepa B) se zadas por grandes cantidades de

muertos por UV fago T2 o T4 y despus se prueba con la etiqueta P-T2 y T4.El principal punto de

inters en este experimento es que los restos de bacterias saturado con T2 muertos por UV adsorbe

T4 mejor que T2, y los residuos saturado con adsorbe T4 T2 mejor que T4.Al igual que en el

experimento anterior, algunos del fago adsorbido no se inactiv y algunos de los ADN de la inac-

fago vada no fue liberado de los escombros.

Estos experimentos muestran que algunos de los receptores de las clulas para T2 son diferentes de

algunos de los receptores de las clulas para T4, y que fago inherentes a las especficos receptores

especficos se inactiva por el mismo mecanismo que la fijacin de fago a receptores no

seleccionados. Este mecanismo es, evidentemente, uno activo, y no simplemente el bloqueo de los

sitios de unin a las bacterias.

La eliminacin de las capas de fagos de Bavteria Infected -. Anderson (1951), fue obtenido

micrografa electrnica s lo que indica que el fago T2 se une a las bacterias por la cola. Si se

conserva este accesorio precaria durante el progreso de la infeccin, y si las conclusiones anteriores

son correctas, debera ser una simple cuestin de romper las membranas de fagos vacos de los

infectados bacterias, dejando el ADN del fago dentro de las clulas.

Los siguientes experimentos muestran que este se lleva a cabo fcilmente por una fuerte las fuerzas

de cizallamiento aplicadas a las suspensiones de clulas infectadas, y, adems, que en- las clulas

infectadas de la que ha sido 80 por ciento del azufre del virus parental eliminado permanezca capaz

de producir progenie de fagos.

Bacterias Hermanos cultivadas fueron infectadas con S-3s o P3 * fago marcado en adsorcin medio,

el material no adsorbido se elimin por centrifugacin, y las clulas se resuspendieron en agua que

contiene por litro 1 m sobre sulfato de magnesio,, 0.1 rn de CaCl, y 0,1 gr. gelatina. Esta suspensin

se centrifug en un mezclador warning (tamao semimicro) a 10.000 R.P.M. La suspensin se

enfri brevemente en agua con hielo al final de cada perodo de 60 segundos en funcionamiento.

Las muestras se retiraron a intervalos, tituladas (a travs de suero antiphage) para medir el nmero

de bacterias capaces de fago rendimiento, y se centrifugaron para medir la proporcin de istopo

liberado de las clulas.

Los resultados de un experimento con cada istopo se muestran en la figura.1. La datos para S

como y la supervivencia de las bacterias infectadas proceden de la misma experimento, en el que la

relacin de fago aadido a las bacterias era 0,28, y las concentraciones de las bacterias eran 2,5 X

108 por mh infectados, y 9,7 x 10

8 por ml. total, en valoracin directa. El experimento con el fago

P32

-marcado era muy similar.

En relacin con estos resultados, se debe recordar que Anderson (1949) encontr que la adsorcin

del fago a la bacteria podra evitarse por la rpida agitacin de la suspensin.

Figura 1. La eliminacin de $ A5 y 1 a partir de bacterias infectadas con el fago radiactivo, y la

supervivencia de las bacterias infectadas, durante la agitacin en un mezclador Waring.

Con relaciones ms altas de infeccin, cantidades considerables de azufre eluyen fagos a partir de

las clulas de forma espontnea en las condiciones de estos experimentos, aunque la elucin de P y

la supervivencia de las clulas infectadas no se ven afectados por mltiples complicidad de la

infeccin (Tabla V). Esto demuestra que hay una accin cooperativa entre las partculas de fago en

la produccin de las alteraciones de la membrana bacteriana que debilitan la unin del fago.Los

cambios celulares detectados en de esta manera se puede relacionar con los responsables de la

liberacin de bacterias componentes de las bacterias infectadas (Prater, 1951; Price, 1952).

Una variante de los experimentos anteriores fue diseado para probar las bacterias en un una etapa

posterior en el crecimiento del fago. Para este propsito las clulas infectadas se airearon en caldo

para 5 o 15 minutos, fijados por la adicin de 0,5 por ciento(v / v) comercial formalina, se

centrifugaron, se resuspendieron en formalina al 0,1 por ciento en agua, y posteriormente se

manipula como se ha descrito anteriormente. Los resultados fueron muy similares a las ya

presentadas, excepto que la liberacin de PS de las clulas era ligeramente menos, y titulaciones de

las clulas infectadas no podan hacerse.

El material S86

-etiquetado separado de las clulas infectadas en la forma de- descrito posee las

siguientes propiedades. Se sediment a 12.000 G, aunque menos completamente de partculas de

fago intactas.Se precipit completamente por antiphage suero en presencia de fago portador

conjunto.40 a 50 por ciento de los

que readsorbs a las bacterias sensibles, casi independientemente de la concentracin bacteriana-

tracin entre 2)

3. Estos hechos demuestran que la mayor parte del azufre fago se mantiene en la clula superficie

durante la infeccin, y no participa en la multiplicacin de intracelular fago. El 0f el ADN del

fago a granel, por otro lado, entra en la clula pronto despus de la adsorcin del fago a las

bacterias.

Transferencia de azufre y fsforo de los padres a la progenie de fagos. Nosotros han llegado a la

conclusin de que por encima de la mayor parte de la protena que contiene azufre de la partcula de

fago en reposo no toma parte en la multiplicacin de fagos, y en hecho de no entrar en la clula. De

ello se desprende que poco o nada de azufre debe ser trans- preferente de los padres a la progenie de

fagos. Los experimentos descritos a continuacin muestran que esta expectativa es correcta, y que la

transferencia mxima es del orden 1 por ciento

Las bacterias se cultivaron en un medio de glicerol-lactato durante la noche y se subcultivaron en el

mismo medio durante 2 horas a 37C. con aireacin, el tamao de la siembra est ajustado

nefelometra para producir 2108 clulas por ml. en el sub- cultura. Estas bacterias se sedimentaron,

se resuspendieron en medio de adsorcin a una concentracin de 109 clulas por ml., e infectadas

con el fago S35

-1abeled T2.Despus de 5 minutos a 37 C, la suspensin se diluy con 2 volmenes

de agua y resedimentado para eliminar los fagos no adsorbido (5 a 10 por ciento en ttulo) y S A5

(15 por ciento).Las clulas se suspendieron en glicerol al lado medio de lactato a una concentracin

de 2 X 1 @ por ml.y se aire a 37 C.

Crecimiento del fago se termin en el momento deseado mediante la adicin de un rpido xito-

cesin 0.02 mt HCN y 2 X 1011 fago UV-kflled por ml. de la cultura. La cianuro se detiene la

maduracin del fago intracelular (Doermann, 1948), y y el fago UV - matado minimiza las prdidas

de la progenie del fago mediante la adsorcin a los residuos bacterianos , y promueve la lisis de

bacterias ( Maal ~ e y Watson , 1951 ) . Como se mencion en otra conexin , y tambin se seala

en estos experimentos , la lisis de fago debe estar estrechamente relacionada con la multiplicacin

de fagos de someterse a ( por ejemplo , T2H , su h mutante , o T2L , pero no de T4 o T6 , en este

caso ) con el fin de prevenir la inactivacin de la progenie por adsorcin a los residuos bacterianos.

Para obtener lo que llamaremos el mximo rendimiento de los fagos , se aadi el fago lisado de

25 minutos despus de la colocacin de los ceils infectados en el medio de cultivo, y el cianuro se

aadi al final de la segunda hora . En estas condiciones , la lisis de las ceils infectados se produce

con bastante lentitud .

La aireacin se interrumpe cuando se aadi el cianuro, y los cultivos se dej durante la noche a

37 C. Los lisados se fraccionaron mediante centrifugacin en un sedimento de baja velocidad

inicial ( 2.500 g durante 20 minutos ) , un sobrenadante de alta velocidad ( 12.000 g durante 30

minutos ) , una segunda sedimentos de baja velocidad obtenido por medio de adsorcin

recentrffuging en el sedimento de alta velocidad se resuspendieron , y el sedimento de alta

velocidad aclarado .

La distribucin de S ~ 8 y el fago entre fracciones obtenidas a partir de tres cultivos de este tipo se

muestra en la Tabla VI. Los resultados son tpicos (a excepcin de las excesivamente buenas

recuperaciones de fago y S A6) de lisados en caldo as como lisados en medio de glicerol-lactato.

El resultado sorprendente de este experimento es que la distribucin de S 35 entre las fracciones

es la misma para los primeros lisados que no contienen la progenie de fagos, y los posteriores que

lo hacen. Esto sugiere que poco o nada de S 36 est contenido en la progenie del fago maduro. El

fraccionamiento adicional por adsorcin a las bacterias confirma esta sugerencia.

Mezclas de adsorcin preparadas al efecto contenan aproximadamente 5 X 10 ~ bacterias

muertas por calor (70 C durante 10 minutos) a partir de cultivos de caldo de 18 horas, y

La infeccin con T2 marcado con S3S , 0,8 partculas por bacteria . Lisis del fago UV - matado K

mutante de T2 . Los rendimientos de fagos por bacteria infectada : < 0,1 despus de la lisis en t - ~

0 ; 0.12 en t = 10 ; . mximo rendimiento 29 Recuperacin de los medios S s5 por ciento de la

entrada adsorbido se recuper en las cuatro fracciones ; recuperacin del fago significa por ciento

del rendimiento total de fagos ( por nmero de placa antes del fraccionamiento ) se recuper

mediante una valoracin de las fracciones.

aproximadamente 1011 fagos (UV- muertos lisis de fagos ms fago prueba) , por ml . de medio de

adsorcin . Despus de calentar a 37 C. durante 5 minutos , las mezclas se diluyeron con 2

volmenes de agua , y se centrifugaron . Los ensayos se hicieron a partir de sobrenadantes y de

lavar se resuspendieron los sedimentos.

Los resultados de las pruebas de adsorcin de S 35 y los fagos a bacterias (H) adsorber tanto la

progenie T2 y K - fago mutante de lisis , a las bacterias ( B / 2 ) adsorber lisis de fagos slo , y para

bacterias ( B/2h ) adsorber ni , se muestran en la Tabla VII , junto con pruebas paralelas de

autntica fago marcado con SAS.

S35 fago

1ro sedimentos de baja velocidad 79 81 82 19

2do sedimentos de baja velocidad 2.4 2.1 2.8 14

Sedimentos de alta velocidad 8.6 6.9 7.1 61

Sobrenadante de alta velocidad 10 10 7.5 7.0

Recuperacion 100 100 96 100

TABLA VI

Distribucin porcentual de los fagos y S35 entre fracciones separado por centrifugacin de

Lysales despus de la infeccin con el T2 S35 Etiquetada

FraccionMaximo rendimientoLisis en t = 0

S35Lisis en t = 10

S35

Los ensayos de adsorcin muestran que el S 85 presente en el fago de semillas se adsorbe con la

especificidad de los fagos , pero que S 85 presente en lisados de bacterias infectadas con este fago

muestra un comportamiento ms complicado . Se absorbe fuertemente a las bacterias

adsorbentes tanto progenie y de lisis de fagos . Es dbilmente se adsorbe a las bacterias

adsorbentes tampoco. Se adsorbe moderadamente bien a bacterias de adsorcin del fago de lisis

pero no la progenie de fagos. Esta ltima prueba muestra que el a5 S no est contenida en la

progenie de fagos, y se explica el hecho de que el S aB en los primeros lisados no contiene

progenie se comporta de la misma manera.

La especificidad de la adsorcin de material marcado con SSS contaminacin de la progenie del

fago es evidentemente debido a la lisis de fagos, que tambin se adsorbe mucho ms fuertemente

a la cepa H de a B / 2, como se muestra tanto por la reduccin visible en Tyndall de dispersin

(debido al fago de lisis) en los sobrenadantes de las mezclas de ensayo, y por mediciones

independientes. Esta conclusin es confirmado adems por los siguientes hechos.

El fago marcado de manera uniforme y los productos de su crecimiento son, respectivamente, el

fago de semillas y las fracciones de sedimento de alta velocidad desde el experimento mostrado

en la Tabla VI .

El fago marcado de manera uniforme se analiza a una baja relacin de fago a las bacterias : + UV -

k significa con aadido de UV - matado h mutante en igual concentracin a la presente en los otros

materiales de ensayo .

La adsorcin de los fagos se mide por recuento de placa de los sobrenadantes , y tambin

sedimentos en el caso de las bacterias resistentes , en la forma habitual .

1 . Si las bacterias estn infectadas con S 35 del fago , y a continuacin se lisaron cerca del punto

medio del perodo de latencia con cianuro solo ( en brothi pobre en sal para evitar la readsorcin

de S 35 a los residuos bacterianos ) , la fraccin de sedimento de alta velocidad contiene S 35 que

se adsorbe dbilmente y de forma no especfica a las bacterias .

+ UV -k No UV -k

S35 S35 S35 S35 Fago

sensible (H) 84 86 79 78 96

Resistente (B/2) 15 11 46 49 10

Resistente (B/2h) 13 12 29 28 8

TABLA VII

Etiquetados de manera

unifirme S35 fago

Productos

de lisis en

t=10

Descendencia de fagos

(maximo rendimiento)bacterias absorbentes

Las pruebas de adsorcin con uniforme S35 del fago etiquetados y con productos de su

crecimiento en un medio no radiactivo

porcentaje absorbido

2 . Si el fago de lisis y el fago infectar 1abeled - S35 son los mismos ( T2 ) , o si se permite que el

cultivo en caldo pobre en sal para lisar de forma espontnea (de modo que el rendimiento de la

progenie es grande ) , el S 85 en el fraccin de sedimento de alta velocidad se adsorbe con la

especificidad de la progenie del fago ( excepto por un dbil adsorcin no especfica ) . Esto se

ilustra en la Tabla VII por la adsorcin de H y B/2h .

Cabe sealar que una progenie de fagos crecido de fago 1abeled - S35 y que contiene una cantidad

mayor o menor de radiactividad contaminantes no poda distinguirse por cualquier mtodo

conocido de autntica fago 1abeled - S85 , la excepcin de que una pequea cantidad del

contaminante puede ser eliminado por adsorcin a las bacterias resistentes a los fagos . Adems

de las propiedades ya mencionadas , los 8s S contaminantes se precipitan por completo con el

fago por antisuero , y no se pueden separar de forma apreciable a partir del fago por ms de

sedimentacin fraccionada , en cualquiera de las concentraciones altas o bajas de electrolito .

Por otro lado , la contaminacin qumica de esta fuente sera muy pequeo en circunstancias

favorables , porque la progenie de una sola partcula de fago son numerosos y el contaminante se

deriva evidentemente de los padres .

Las propiedades del contaminante marcado con SSS muestran que consiste en los restos de las

capas de las partculas de fago parental , presumiblemente idnticos con el material que se puede

quitar a partir de clulas no lisadas en la Blendor Waring . El hecho de que se somete a poco

cambio qumico no es sorprendente ya que probablemente nunca entra en la clula infectada .

Las propiedades descritas explican un informe preliminar errnea ( Hershey et al. , 1951 ) de la

transferencia de S 35 de los padres a la progenie de fagos.

Hay que aadir que los experimentos idnticos a los mostrados en las Tablas VI y VII , pero a partir

de fago marcado con P3 ~ , muestran que el fsforo se transfiere de los padres a la progenie del

fago en la medida de 30 por ciento en rendimientos de aproximadamente 30 por fagos infectados

bacteria , y que la P3 ~ en cultivos prematuramente lisadas es casi en su totalidad no sedimentable

, convirtindose , de hecho , soluble en cido en el envejecimiento .

Medidas similares de la transferencia de P ~ han sido publicados por Putnam y Kozloff ( 1950 ) y

otros. Watson y Maal ~ e ( 1952 ) resumen este trabajo, e informar igual de transferencia ( casi el

50 por ciento) de fsforo y adenina.

A la progenie de S85 marcado con Pkage prcticamente libre de tke Parental Labd - . El siguiente

experimento demuestra un alto precio que la transferencia obligatoria de azufre de los padres

para los hijos de fagos es inferior al 1 por ciento , y probablemente mucho menos . En este

experimento , el rendimiento del fago a partir de bacterias infectadas a partir del cual las capas de

fagos marcados con S3S haban sido despojados en el Blendor Waring era ensayada directamente

para S s ~ .

Bacterias sensibles cultivadas en caldo se infectaron con cinco partculas de marcado con SaS

fagos por bacteria, la alta proporcin de la infeccin que sea necesaria a los efectos de ensayo. Las

bacterias infectadas fueron liberados de fago no adsorbido y se suspendieron en agua que

contiene por litro 1 na MgSO4, 0,1 mr CaC12 y 0,1 gr. gelatina. Una muestra del esta suspensin

se agit durante 2,5 minutos en el Blendor Waring, y se centrifug para eliminar el extraceUular

S% Una segunda muestra se ejecuta en el Blendor fue centrifugado al mismo tiempo. Las clulas

de ambas muestras se resuspendieron en caliente sal-pobres caldo a una concentracin de

bacterias l0 s por ml., y se aire durante 80 minutos. Los cultivos despus se lisaron por la adicin

de 0,02 mM de HCN, 2 10 U UV T2 muerto, y 6 de trapo. NaCl por ml. de la cultura. La adicin de

sal en este punto provoca S como que de otro modo seran eludible (Hershey et al., 1951) para

permanecer unido a la residuos bacterianos, los lisados se fraccionaron y se ensayaron como

se describe anteriormente, con los resultados mostrados en la Tabla VIII.

Los datos muestran que el despojo reduce ms o menos proporcionalmente el S AS

contenido de todas las fracciones. En particular, el SSS-contenido de la fraccin contiene

mayor parte de la progenie del fago se redujo de casi el 10 por ciento a menos del 1 por

ciento del istopo inicialmente adsorbida. Este experimento muestra que la mayor parte de

la S 36 que aparece en todas las fracciones de lisado se deriva de los restos de las capas de

las partculas de fago parental.

Propiedades de Fago inactivada por formaldehdo -. Fago T2 calentado para 1 hora a 37

C. en un medio de adsorcin que contiene 0,1 por ciento (v / v) comercial formalina (35 por

ciento HCHO), y luego se dializa libre de formaldehido

Todas las bacterias de entrada se recuperaron en ensayos de clulas infectadas realizadas

durante el latente perodo de dos culturas. Los rendimientos de fago fueron 270 (clulas

despojadas) y 200 por bacteria, ensayada antes del fraccionamiento. Las cifras entre

parntesis se obtuvieron de las tasas de conteo cerca del fondo.

Hyde, muestra una reduccin en el ttulo de la placa por un factor de 1,000 o ms.

Inactivada fago de esta especie posee las siguientes propiedades:

1. Se adsorbe a las bacterias sensibles (tal como se mide por cualquiera de S 36 o PS etiquetas), a la extensin de aproximadamente 70 por ciento.

2. El fago adsorbido mata a las bacterias con una eficiencia de alrededor del 35 por ciento en comparacin con el fago poblacin original.

S35 Fago S35 Fago

Eluido en el mezclador de fluido 86 - 39 -

1 ro sedimentacion de baja velocidad 3.8 9.3 31 13

2 do sedimentacion de baja velocidad 0.2 11 2.7 11

Alta velocidad de sedimentacion 0.7 58 9.4 89

Alta velocidad de supernatant 2.0 1.1 1.7 1.6

Recuperacion 93 79 84 115

TABLA VIII

Lysales de bacterias infectadas con S35 etiquetada T2 y despojado en el mezclador Waring

Porcentaje de absorcion S35 o el

rendimiento del fago

Celulas no despojadasCelulas despojadas

3. El ADN de las partculas inactivas es resistente a la DNasa, pero se hace sensible por choque osmtico.

4. El ADN de las partculas inactivas no est sensibilizado a DNasa por adsorcin a las bacterias con calor mat, ni es liberado en solucin por adsorcin a residuos

bacterianos.

5. 70 por ciento del ADN del fago adsorbido se puede extraer de infectados clulas hiladas en la Blendor Waring. El ADN separado se vuelve a casi en su totalidad

resistentes a DNasa

Estas propiedades muestran que T2 inactivado por formaldehdo es en gran parte en-

capaz de inyectar su ADN en las clulas a las que se atribuye. Su comportamiento en

los experimentos descritos da un fuerte apoyo a nuestra interpretacin de la cor-

responder experimentos con el fago activo.

DISCUSIN " Hemos demostrado que cuando una partcula de bacterifago T2 se conecta

a una clula bacteriana , la mayor parte del ADN del fago entra en la clula , y un residuo

que contiene al menos 80 por ciento de la protena que contiene azufre del fago se mantiene

en la superficie celular . Este residuo consiste en la formacin de la membrana de

proteccin de la partcula de fago de descanso de material , y no juega ningn papel

adicional en la infeccin despus de la unin del fago a la bacteria . Estos hechos dejan en

cuestin de la posible funcin de la 20 por ciento de protena que contienen azufre que

pueden o no pueden entrar en la clula . Nos encontramos con que poco o nada de esto se

incorpora en la progenie de la partcula infectante, y que por lo menos parte de ella consiste

en el material adicional que se asemeja el residuo que se puede mostrar a permanecer

extracelular. El fsforo y adenina ( Watson y Maal ~ e , 1952 ) derivado a partir del ADN

de la partcula de infectar , por otro lado , se transfieren a la progenie de fagos en una

medida considerable e igual . Inferimos que la protena que contiene azufre, no tiene

ninguna funcin en la multiplicacin de fagos , y que el ADN tiene alguna funcin . Hay

que recordar que las siguientes preguntas siguen sin respuesta . ( 1 ) Hay algn material de

fago libre de azufre que no sea el ADN entre en la clula ? ( 2 ) En caso afirmativo , es

transferida a la progenie del fago ? ( 3 ) es la transferencia de fsforo ( o hipottico otra

sustancia ) a la progenie directa - es decir, no se mantenga en todo momento de una forma

especficamente identificables como sustancia fago o indirecta ?

Nuestros experimentos muestran claramente que una separacin fsica del fago T2 en partes

genticos y no genticos es posible . Una separacin funcional correspondiente se ve en la

independencia parcial del fenotipo y el genotipo en el mismo fago ( Novick y Szilard , 1951

; Hershey et a / , 1951 . ) . El producto qumico

identificacin de la parte gentica tiene que esperar , sin embargo , hasta que alguna de las

preguntas han sido respondidas . Dos hechos de importancia para el mtodo inmunolgico

de ataque a los problemas

de crecimiento viral debe destacarse aqu . En primer lugar, el antgeno principal de las

partculas infecciosas del fago T2 persiste sin cambios en las clulas infectadas . En

segundo lugar, permanece unido a los restos bacteriana resultante de la lisis de las clulas .

Estas posibilidades parecen haber sido pasado por alto en un estudio de Rountree (1951 ) de

los antgenos virales durante el crecimiento del fago T5 .

RESUMEN

1 . Choque osmtico interrumpe partculas de fago T2 en el material que contiene casi todo

el azufre del fago en una forma precipitable por antiphage suero , y capaz de adsorcin

especfica a las bacterias . Se libera en la solucin casi todos el ADN del fago en una forma

no precipitable por antisuero y no adsorbible a las bacterias . La protena que contiene

azufre de la partcula de fago evidentemente constituye una membrana que protege el ADN

del fago a partir de DNasa , comprende el material antignico nico o principal , y es

responsable de la unin del virus a las bacterias .

2 . Adsorcin de T2 a las bacterias , y de calefaccin o de congelacin y descongelacin

alternativa de las clulas infectadas calentar - matado , sensibilizar al ADN del fago

adsorbido a DNasa . Estos tratamientos tienen poco o ningn efecto sensibilizador en fago

no adsorbido . Ni calefaccin ni de congelacin y descongelacin libera el ADN de fago a

partir de clulas infectadas , aunque otros constituyentes celulares pueden ser extrados por

estos mtodos. Estos hechos sugieren que el ADN de fago forma parte de una estructura

intracelular organizan durante todo el perodo de crecimiento del fago .

3 . Adsorcin del fago T2 a los residuos bacterianos hace que parte del ADN del fago a

aparecer en solucin , dejando el azufre fago unido a los escombros . Otra parte del ADN

del fago , que corresponde aproximadamente a la mitad restante de la ADN del fago

inactivado , permanece unido a los restos pero puede ser separado de ella por DNasa . El

fago T4 comporta de manera similar , aunque los dos fagos pueden ser mostrados para

unirse a diferentes sitios de combinacin . La inactivacin del fago por los residuos

bacterianos evidentemente est acompaada por la ruptura de la membrana viral .

4 . Las suspensiones de clulas infectadas agit en un mezclador Waring liberar 75 por

ciento del azufre del fago y slo el 15 por ciento del fsforo a la solucin de fago como

resultado de la fuerza de cizallamiento aplicada . Las clulas siguen siendo capaces de

producir progenie de fagos .

5 . Los hechos expuestos muestran que la mayora del azufre del fago se mantiene en la

superficie celular y la mayor parte del ADN del fago entra en la clula sobre la infeccin .

Si el material libre de azufre que no sea ADN entra en la clula no se ha determinado . Las

propiedades del residuo que contiene azufre - identifican como membranas esencialmente

sin cambios de las partculas de fago . Todos los tipos de pruebas muestran que el paso del

ADN del fago en la clula se produce en medio no nutriente bajo condiciones en las que

otros pasos conocidos en el crecimiento viral no se producen .

6 . La progenie del fago producido por las bacterias infectadas con el fago etiquetados con

azufre radiactivo contiene menos de 1 por ciento de la radiactividad de los padres. La

progenie de partculas de fago marcado con fsforo radiactivo contiene 30 por ciento o ms

del fsforo de los padres.

7 . Fago diluido inactivado por formaldehdo es capaz de adsorber a las bacterias , pero no

libera su ADN a la clula . Esto demuestra que la interaccin entre el fago y bacteria resulta

en la liberacin del ADN del fago a partir de su membrana protectora depende de los

componentes lbiles de la partcula del fago . Por el contrario , los componentes de la

bacteria esencial para esta interaccin son notablemente estable . La naturaleza de la

interaccin es por lo dems desconocido .

8 . La protena que contiene azufre de partculas de fago de reposo se limita a una capa

protectora que es responsable de la adsorcin a las bacterias, y funciona como un

instrumento para la inyeccin del ADN del fago en la clula. Esta protena probablemente

no tiene ninguna funcin en el crecimiento de intracelIular fago. El ADN tiene alguna

funcin. Otras inferencias qumicos no deben ser extrados de los experimentos

presentados.