Práctica de enzimas: Biofuel Fundamento Enzimas As enzimas son xeralmente proteínas (coñécense algúns ácedos nucleicos con función enzimática) que actúan como catalizadores, acelerando as reacciónss químicas que terían lugar extremadamente a modo de xeito espontáneo. As enzimas aceleran a meirande parte das reaccións químicas que ocorren nas células. As reacción que rompen as moléculas (coma as que participan na dixestión e na respiración celular) ou as involucradas na biosíntese de moléculas (coma as da fotosíntese ou da replicación do ADN) requiren enzimas. Cada tipo de enzima ten unha forma específica relacionada coa estructura do seu sustrato (Figura 5). O sustrato és a molécula ou moléculas que a enzima convirte en producto(s). O sustrato encaixa nun lugar da proteína globular chamado o centro activo. As propiedades da forma e a química (distribución de cargas por exemplo) deste sitio son críticos para a función da enzima.

Fig. 5. Un diagrama esquemático de celobiosa e celobiasa en disolución. A. A celobiosa en disolución componse de duas moléculas de glucosa unidas covalentemente por unha ligazón beta(1-4). B. A celobiasa ten un espazo que se axusta á molécula de celobiosa. C. A celobiasa estabiliza á celobiosa para que a ligazón entre as glucosas poda romperse. D. Unha vez rota a ligazón glucosídica da celobiosa, as duas moléculas de glucosa céibanse, e a enzima é quen de se unires a outra molécula de celobiosa para comezar de novo o ciclo.

Moitas das reaccións químicas catalizadas por enzimas poden ter lugar de

xeito espontáneo, pero moito máis a modo. As enzimas aceleran as reaccións reducindo a súa enerxía de activación. Esta és a cantidade de enerxía precisa para que a reacción teña lugar. As enzimas tamén estabilizan o estado de transición da reacción. O estado de transición é a estructura con maior enerxía na reacción. Ó reducires esta enerxía, a reacción pode ter lugar dun xeito máis doado. As enzimas son "selectivas" en relación ás condicións nas que funcionan mellor. A temperatura e o pH teñen que ser as idóneas para a enzima. Para calquera reacción química, elevando a temperatura aumentará o movemento das moléculas, o que terá como consecuencia que se produzan máis colisións. Aumenta a enerxía cinética media das moléculas de modo que un número maior delas será quen de reaccionar. Con todo, nunha reacción enzimática, demasiado calor non é unha cousa boa. As interaccións non-covalentes dentro da proteína, tales coma as pontes de hidróxeno e ligazóns iónicas pódense romper a altas temperaturas. Esto produce un cambio conformacional (na forma) na enzima. Se os cambios na forma da enzima afectan ó sitio activo, o sustrato non encaixa axeitadamente e a enzima non é funcional. A enzima: celobiasa Nesta práctica imos estudar a celobiasa, unha enzima involucrada na descomposición da celulosa. A celolosa é un homopolisacárido composto de paquetes de cadeas de beta-D-glucopiranosa que se atopa nas paredes celulares vexatais. É un proceso natural utilizado por moitos fungos e bacterias (algúns presentes nos intestinos dos termes, outros nos estómagos dos ruminantes e tamén nas pilas de compostaxe) para producir la glucosa como fonte de alimento. Romper a celulosa das plantas en azúcar é tamén un paso importante na creación de etanol como combustible. O sustrato: celobiosa O sustrato natural da enzima celobiasa é a celobiosa (Figura 6). Trátase dun disacarido composto por dúas moléculas de beta-D-glucopiranosa. Con todo, cando se estuda a función desta enzima, é mellor procurar un modo de detectar que cantidade de sustrato é utilizado ou que cantidade de producto se forma. As disolucións de celobiosa (o sustrato) e de glucosa (o producto) son incoloras, e non hai moitos métodos sinxelos, de baixo custo, para detectar

cuantitativamente estas moléculas.

Fig. 6. Ruptura de celobiosa por acción da celobiasa. O sustrato natural da celobiasa é o disacárido celobiosa. Cando a celobiosa se xunta á celobiasa, esta rompe a ligazón glucosídica beta(1-4) ceibándose dúas moléculas de beta-D-glucopiranosa.

Para estudar esta reacción é máis doado usar un sustrato artificial, o p-nitrofenil-glucopiranósido. Este sustrato artificial é quen de se xuntar á mesma enzima de xeito semellante a como o fai a celobiosa. Cando p-nitrofenil-glucopiranósido se rompe por acción da celobiasa, prodúcese glucosa e p-nitrofenol (Figura 7). Cando o p-nitrofenol se mestura cunha solución de pH básico (por exemplo, a solución de parada que se usa nesta práctica), as disolucións viran ó amarelo. Ademáis, a cantidade de cor amarillo é proporcional á cantidade de p-nitrofenol presente. Por cada molécula de p-nitrofenol, fórmase outra de glucopiranósido. Para as reaccións enzimáticas con celobiasa, outra das vantaxes de utilizar unha disolución pH alcalino para revelar a cor do p-nitrofenol, é que ese pH provoca a desnaturalización da enzima e, con ela, a parada da reacción.

Fig. 7. Desdobre do p-nitrofenil-glucopiranósido en glucosa e p-nitrofenol por acción da celobiasa. Cando a celobiasa rompe o p-nitrofenil-glucopiranósido, céibanse unha molécula de glucosa e unha de p-nitrofenol. Se se pon o p-nitrofenol nunha disolución básica, prodúcese unha cor amarela, que pódese cuantificar por un sinxelo método colorimétrico.

Medida da cantidade de producto producido Dado que o producto (p-nitrofenol) da reacción vira ó amarelo ó engadir unha disolución básica, pódese coñecer a cantidade de producto que se está a producir. Canto máis intensa sexa a cor, maior é a cantidade de producto producido. Un método sinxelo de estimación da cantidade de producto é comparar o amarelo das mostras de reacción enzimática con un conxunto de patróns de cor coñecidos, que conteñan unha cantidade tamén coñecida de producto. Comparando a mostra cos patrón e escollendo aquel ó que máis se achegue na cor, temos unha estima da cantidade de producto na mostra. Alternativamente, pódese utilizar un espectrofotómetro (ou un colorímetro), que mide a cantidade de cor amarela facendo que un raio de luz atravese a mostra (lonxitude de onda de 410 nm). O espectrofotómetro mide a cantidade de luz absorbida pola mostra. Canto máis escura sexa a cor amarela da mostra, máis luz absorbe. Compre medir previamente un conxunto de patróns de p-nitrofenol de concentracións coñecidas para establecer unha curva estándar. Logo, coa curva estándar, pódese transformar un valor de absorvancia nun valor de concentración. Medida da tasa de actividade da celobiasa Co gallo de determinar que factores inflúen na capacidade dunha enzima para descompoñer o seu sustrato, determínase a velocidade de reacción, ou cantidade de producto formado nun periodo de tempo dado. Para estudiar a actividade da celobiasa, imos medir a velocidade de reacción mediante a adición de enzima ó sustrato. A enzima e o sustrato disólvense nun tampón que está nun valor de pH ideal (pH 5.0) para que a reacción se produza. A determinados tempos, se elimina unha mostra da reacción enzimática e engádese a unha solución de pH básico que provoca a detención da reacción. Calculando como se produce o p-nitrofenol en función do tempo, pódese calcular a velocidade de reacción. Observando en pequenos incrementos de tempo, pódese determinar se o ritmo da enzima é constante ou se disminúe a medida que baixa a cantidade de sustrato dispoñible. Tamén se pode detectar calquera efecto do pH, da temperatura, a concentración de sustrato ou a concentración da enzima teñen sobre a velocidade inicial de reacción.

-oOo-