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Fundamentos de la Extracción de ADN
Cd. Obregón, Sonora a 26 de mayo de 2015
M.C. Arturo Muñoz Pérez
I Taller de Técnicas Moleculares
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La Célula
Unidad fundamental de todos los organismos vivos
Animales Microorganismos Plantas
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Tipos de células
Las células se clasifican en dos grandes grupos: Eucariotas Procariotas
¿Cuáles son las diferencias?
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ÁCIDOS NUCLÉICOS
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Ácidos NucleicosSon moléculas esenciales para las funciones de la célula y constituyen el material genético de los organismos.
Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico (ADN) (ARN)
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NucleótidosMonómeros de los ácidos nucleicos, están compuestos por los siguientes tres elementos:
Base nitrogenada(5 diferentes)
Azúcar pentosa
Grupo Fosfato
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Bases nitrogenadasLa información genética esta almacenada con un código formado por cuatro bases químicas. Las bases nitrogenadas están divididas en dos grupos:
GuaninaAdenina TiminaCitosina
Purinas Pirimidinas
Uracilo
ARN
ADN
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Ensamblaje de ADN
Enlace fosfodiéster
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Apareamiento de basesLos nucleótidos se enlazan por medio de puentes de hidrógeno para formar ácidos nucleicos o polinucleótidos. Un átomo de hidrógeno de una molécula es atraído a un átomo electronegativo especialmente nitrógeno, oxígeno, y otra molécula
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Estructura de ADN
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EXTRACCIÓN DE ADN
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Extracción de ADNProtocolo de Raeder & Broda, 1985.
La extracción y purificación del ADN es el paso inicial y básico para realizar trabajos en biología molecular.
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Consideraciones para una buena extracción
• Cantidad de ADN• Remoción de inhibidores• Remoción o inhibición de nucleasas• Maximizar la calidad de ADN
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Proceso
1. Obtención de muestra2. Extracción y purificación3. Cuantificación4. Calidad5. Conservación
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I. OBTENCIÓN DE MUESTRA
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Obtención de muestra
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II. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN
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Fenol-Cloroformo
Es un método de extracción líquido-líquido. Se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructurar subcelulares mediante el empleo de detergentes con lo posterior eliminación de las proteínas y lípidos con solventes orgánicos.
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Solución de extracción
La solución de extracción esta formado por 200 mM Tris HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 250 mM EDTA, 0.5 % SDS
Nos ayuda a:• Disolver membranas celulares• Inactivar ADNasas y RNAsas• Remoción de contaminantes
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EDTA
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NaClProporciona iones Na+ que bloquean la carga negativa del fosfato del ADN. Esta negatividad en el ADN provoca que las moléculas se repelen unas a otras. Los iones Na+ forman un puente iónico con los grupos fosfatos, neutralizando las cargas y permitiendo una mayor afinidad entre las moléculas de ADN
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SDSDetergente aniónico que desnaturaliza las proteínas y solubiliza la membrana celular
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Precipitación de ADN
• El ADN es altamente insoluble en isopropanol, este se disuelve en agua para inducir a que el ADN tenga un cambio estructural en la solución, se junte y precipite.
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III. CUANTIFICACIÓN
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Cuantificación de ADNLa cuantificación de ADN se realiza mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 260 nm. La pureza es evaluada por la tasa de absorbancia de 260 nm y 280 nm.
Un ADN de buena calidad es aquel que su relación es de 1.7 a 2.0
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IV. CALIDAD
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Prueba de calidad
Electroforesis
Es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por la aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga:masa
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Elementos de la electroforesis
Gel de agarosa (1 – 2 %)Cámara de electroforesis Buffer
Marcador peso molecularBuffer de carga Transiluminador
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Prueba de calidad
Las biomoléculas poseen una carga eléctrica (ADN negativa), estas se ven sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula.
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Prueba de calidad
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V. ALMACENAMIENTO DE ADN
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Conservación de ADN
• El ADN se mantiene en congelación (-80 °C) hasta su empleo. A menor temperatura la preservación se prolonga y múltiples descongelaciones ocasionan una degradación progresiva, por lo que es recomendable hacer alícuotas.
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PRÁCTICA DE LABORATORIO
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Colocar 100 mg de micelio fresco en un tubo
eppendorff de 1.5 mL
Práctica de Laboratorio
Agregar 500 µL de buffer de extracción
Resuspender el pellet celular
Mezclar el vórtex durante
5 min
Añadir 350 µL de fenol (4 °C),
mezclar en vórtex 30 seg
Añadir 150 µL de cloroformo,
mezclar en vórtex 30 seg
Centrifugar durante 30
min a 13 000 rpm a 4 °C
Tomar la fase acuosa
Agregar 1 volumen de cloroformo y
mezclar en vortex 30 seg
Centrifugar a 13 000 rpm durante 10 min
Transferir la fase acuosa y agregar 0.6 volúmenes de
isopropanol
Homogenizar por inversión y centrifugar 5
min a 13,000 rpm. Descartar sobrenadante
Lavar pellet con 500 µL de etanol al 70 %
Centrifugar a 13,000 g por 2 min a 4 °C y
descartar sobrenadante
Cheng & Jian, 2006
PROTOCOLO EXTRACCIÓN DE ADN HONGOS
Secar pellet y resuspender en 40
– 70 µL de H2O MQ
Almacenar a -20 °C
2x
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Preparar la cámara de electroforesis, llenándola
con TAE 1X
Práctica de Laboratorio
Preparar gel 30 g agarosa/ 30 mL
TAE 1X
Calentar en microondas
Una vez enfriado, agregar 1.2 µL de intercalante
Gelred y mezclar
Verter sobre el portagel y colocar
peines
Cargar 5 µL de ADN y mezclar con 1 µL de buffer de carga
Correr las muestras de ADN a 80 V durante 30 min
Visualizar en UVIdoc
Interpretar resultados
GEL DE ELECTROFORESIS VISUALIZACIÓN DE ADN
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GRACIAS POR SU ATENCIÓN