Ganoderma lucidum reduce la obesidad en ratones …..., 1323-1332 (2011). o CAS o Artículo o PubMed...
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Ganoderma lucidum reduce la obesidad en ratones al modular la composición de la microbiota intestinal • Chih-Jung Chang , • Chuan-Sheng Lin , • Chia-Chen Lu , • Ene Martel , • Yun-Fei Ko , • David M. Ojcius , • Shun-Fu Tseng , • Tsung-Ru Wu , • Yi-Yuan Margaret Chen , • John D. Young y • Hsin-Chih Lai Comunicaciones de la naturaleza volumen 6 , Número de artículo: 7489 ( 2015 ) Citar este artículo • 9416 Accesos • 332 citas • 225 Altmetric • Métricadetalles • El 11 de julio de 2017 se publicó una corrección de errores de este artículo. • Este artículo ha sido actualizado Resumen La obesidad se asocia con inflamación crónica de bajo grado y disbiosis intestinal. Ganoderma lucidum es un hongo medicinal utilizado en la medicina tradicional china con supuestos efectos antidiabéticos. Aquí, mostramos que un extracto acuoso de Ganoderma lucidumEl micelio (WEGL) reduce el peso corporal, la inflamación y la resistencia a la insulina en ratones alimentados con una dieta alta en grasas (HFD). Nuestros datos indican que WEGL no solo revierte la disbiosis intestinal inducida por HFD, como lo indican las proporciones disminuidas de Firmicutes a Bacteroidetes y los niveles de Proteobacterias portadoras de endotoxinas, sino que también mantiene la integridad de la barrera intestinal y reduce la endotoxemia
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Ganoderma lucidum reduce la obesidad
en ratones al modular la composición de
la microbiota intestinal
• Chih-Jung Chang ,
• Chuan-Sheng Lin ,
• Chia-Chen Lu ,
• Ene Martel ,
• Yun-Fei Ko ,
• David M. Ojcius ,
• Shun-Fu Tseng ,
• Tsung-Ru Wu ,
• Yi-Yuan Margaret Chen ,
• John D. Young y
• Hsin-Chih Lai
Comunicaciones de la naturaleza volumen 6 , Número de
artículo: 7489 ( 2015 ) Citar este artículo
• 9416 Accesos
• 332 citas
• 225 Altmetric
• Métricadetalles
• El 11 de julio de 2017 se publicó una corrección de errores de
este artículo.
• Este artículo ha sido actualizado
Resumen
La obesidad se asocia con inflamación crónica de bajo grado y disbiosis
intestinal. Ganoderma lucidum es un hongo medicinal utilizado en la
medicina tradicional china con supuestos efectos antidiabéticos. Aquí,
mostramos que un extracto acuoso de Ganoderma lucidumEl micelio (WEGL)
reduce el peso corporal, la inflamación y la resistencia a la insulina en ratones
alimentados con una dieta alta en grasas (HFD). Nuestros datos indican que
WEGL no solo revierte la disbiosis intestinal inducida por HFD, como lo
indican las proporciones disminuidas de Firmicutes a Bacteroidetes y los
niveles de Proteobacterias portadoras de endotoxinas, sino que también
mantiene la integridad de la barrera intestinal y reduce la endotoxemia
metabólica. Los efectos anti-obesidad y moduladores de la microbiota son
transmisibles a través de la transferencia horizontal de heces de ratones
tratados con WEGL a ratones alimentados con HFD. Además, mostramos que
los polisacáridos de alto peso molecular (> 300 kDa) aislados del extracto de
WEGL producen efectos similares contra la obesidad y la modulación de la
microbiota. Nuestros resultados indican que G. lucidum y sus polisacáridos de
alto peso molecular pueden usarse como agentes prebióticos para prevenir la
disbiosis intestinal y los trastornos metabólicos relacionados con la obesidad
en individuos obesos.
Introducción
La medicina tradicional china tiene una larga historia en países asiáticos que
se remonta a varios miles de años 1 , 2 . Una clase de remedios tradicionales de
uso común consiste en hongos medicinales como Ophiocordyceps
sinensis , Antrodia cinnamomea y Agaricus blazei Murrill, que contienen una
amplia gama de compuestos inmunomoduladores y bioactivos 3 , 4 . Uno de los
hongos medicinales más intrigantes es el hongo basidiomiceto Ganoderma
lucidum , que se ha utilizado durante siglos para promover la salud y la
longevidad 5. Estudios anteriores han demostrado que los triterpenos y los
polisacáridos aislados de G. lucidum inhiben la diferenciación de
adipocitos 6 y producen efectos de hipoglucemia en ratones
diabéticos 7 . Además, los proteoglicanos aislados de los cuerpos
fructíferos de G. lucidum inducen actividades antidiabéticas,
antihiperlipidémicas y antioxidantes 8 . Sin embargo, se desconoce si G.
lucidum produce algún efecto sobre el peso corporal y los trastornos
relacionados con la obesidad.
La obesidad se define como una enfermedad asociada con numerosos
problemas de salud y una esperanza de vida reducida 9 . La evidencia
creciente indica que la obesidad está estrechamente relacionada con la
inflamación crónica de bajo grado, que puede conducir a resistencia a la
insulina, diabetes tipo 2, enfermedad del hígado graso, enfermedad
cardiovascular, apnea obstructiva del sueño y cáncer 10 , 11 . La alta prevalencia
de obesidad es actualmente una gran amenaza para la salud pública,
con ∼ 500 millones de personas obesas y 1.4 billones de personas con
sobrepeso en todo el mundo 12 . La prevención de la obesidad representa, por
lo tanto, un gran desafío para las sociedades modernas.
Un estudio reciente indica que los cambios en la composición de la microbiota
intestinal están asociados con el desarrollo de la obesidad y sus trastornos
metabólicos asociados 13 . La microbiota intestinal comprende billones de
bacterias que contribuyen a la adquisición de nutrientes y la regulación
energética 14 , 15 . Un aumento en la proporción de los principales Firmicutes /
Bacteroidetes phyla y los cambios en varias especies bacterianas pueden
promover el desarrollo de la obesidad en modelos dietéticos y genéticos de
obesidad en ratones 16 , 17 . Otros estudios en animales obesos sugieren que la
disbiosis intestinal inducida por la obesidad causada por factores ambientales
o genéticos deteriora la integridad intestinal 18 , 19.. Este proceso conduce a la
liberación del lipopolisacárido de endotoxina (LPS) de bacterias
gramnegativas intestinales en el torrente sanguíneo 20 , lo que a su vez
conduce a inflamación metabólica y resistencia a la insulina en ratones
obesos 21 debido a la estimulación del receptor 4 tipo Toll (TLR4)
inflamación mediada 22 . Además, la inyección crónica de LPS en ratones
conduce a una obesidad leve y resistencia a la insulina 21 , destacando un
posible papel para el LPS derivado de microbiota en la inflamación inducida
por la obesidad.
Se está evaluando una serie de tratamientos, incluidos antibióticos y
prebióticos 18 , 19 , para el tratamiento de la obesidad y sus trastornos
metabólicos relacionados 23 . Por ejemplo, el tratamiento con antibióticos
altera la microbiota intestinal, reduce la endotoxemia sanguínea y mejora la
tolerancia a la glucosa en ratones que carecen del gen de la leptina
( ratones ob / ob ) o en ratones alimentados con un HFD 19 . Además, los
prebióticos son carbohidratos y fibras fermentables no digeribles, que reducen
el peso corporal y ejercen efectos antiinflamatorios principalmente al mejorar
el crecimiento de bacterias beneficiosas específicas que se encuentran en el
intestino 24 , 25.. Los prebióticos no solo alteran la microbiota intestinal sino
que también mejoran la integridad de la unión apretada intestinal y
disminuyen la endotoxemia sanguínea causada por LPS 18 . Los prebióticos
pueden, por lo tanto, proteger a los animales contra la inflamación inducida
por la obesidad.
En el presente estudio, examinamos si un extracto acuoso de G.
lucidum micelio (WEGL) puede disminuir la obesidad en ratones alimentados
con HFD. Nuestros resultados indican que WEGL reduce la obesidad y la
inflamación en los ratones tratados. Estos efectos son transmisibles a los
ratones alimentados con HFD a través del trasplante de heces horizontales, lo
que indica que los efectos de WEGL involucran la microbiota intestinal. La
caracterización de WEGL mostró que los polisacáridos de peso molecular>
300 kDa ejercen efectos de mejora similares a los de WEGL. Estos resultados
implicaron que los polisacáridos de alto peso molecular pueden ser los
componentes activos de WEGL. Nuestros datos demuestran que WEGL
representa un posible agente prebiótico que puede usarse para el tratamiento
de la obesidad y sus complicaciones.
Resultados
WEGL previene la obesidad inducida por HFD en ratones
Utilizando un modelo de obesidad en ratones, observamos que la alimentación
con HFD durante 8 semanas condujo a aumentos significativos en el peso
corporal y hepático, la acumulación de grasa epididimaria y subcutánea, y la
deposición de lípidos en adipocitos y hepatocitos en comparación con la
alimentación de los alimentos de control ( Fig. 1a – g ) . Mientras que 8% de
WEGL no produjo ningún efecto aparente en ratones alimentados con comida,
la suplementación con WEGL disminuyó el aumento de peso y la
acumulación de grasa de una manera dependiente de la dosis en ratones
alimentados con HFD ( Fig. 1a – g ). La ingesta media de energía, la grasa de
las heces y la energía de las heces no variaron significativamente entre los
grupos alimentados con HFD ( Figura 1 complementaria), lo que sugiere que
los efectos de WEGL sobre el peso corporal y los parámetros de obesidad no
se debieron a la reducción del consumo de alimentos o la extracción de
energía. Estos resultados implican que WEGL reduce el aumento de peso y la
acumulación de grasa en ratones alimentados con HFD.
Figura 1: WEGL reduce el peso corporal y la acumulación de grasa en
ratones alimentados con HFD.
Los ratones alimentados con Chow y HFD se trataron diariamente con 100 μl
de agua o WEGL al 2, 4 u 8% (p / v) mediante sonda intragástrica durante dos
meses ( n = 7 para cada grupo). Se muestran los efectos del tratamiento con
WEGL sobre el peso corporal ( a ) aumento de peso corporal ( b ) grasa
epididimaria ( c ) grasa subcutánea ( d ) y tamaño del adipocito epididimario
( e ). En e , el tamaño del adipocito se estimó utilizando el software Image J
(panel inferior). Barra de escala, 50 μm. El peso del hígado se midió en HFD
y control, ratones alimentados con pienso ( f ). El contenido de lípidos en el
hígado se evaluó usando tinción con aceite rojo O ( g ). Barra de escala, 30
μm. Los datos se expresan como media ± sem de diferencias de peso corporal
ena se analizaron usando la prueba t de Student de dos colas no
apareada (** P <0.01, *** P <0.001). Las barras gráficas en b, c,
d y f marcadas con letras diferentes en la parte superior representan resultados
estadísticamente significativos ( P <0.05) basados en el análisis ANOVA
unidireccional post hoc de Newman – Keuls , mientras que las barras
etiquetadas con la misma letra corresponden a resultados que muestran sin
diferencias estadísticamente significativas En el caso de que haya dos letras en
la parte superior de la barra en b , cada letra debe compararse por separado
con las letras de otras barras para determinar si los resultados muestran
diferencias estadísticamente significativas.
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WEGL reduce la inflamación en ratones alimentados con HFD
Estudios anteriores han demostrado que los ratones obesos alimentados con
HFD producen niveles más altos de citocinas proinflamatorias en los tejidos
hepáticos y adiposos, incluido el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α),
interleucina-1-beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) y el inhibidor del activador
del plasminógeno-1 (PAI-1; ref. 26 ). Por el contrario, la producción de la
citocina antiinflamatoria IL-10 se reduce en animales obesos 27 . Medimos la
expresión de ARN mensajero (ARNm) de estas citocinas después de 8
semanas de alimentación con HFD con o sin suplementación con WEGL. Los
niveles de expresión de TNF-α, IL-1β, IL-6 y PAI-1 fueron mayores en los
tejidos hepáticos y adiposos de ratones alimentados con HFD en comparación
con los tejidos de los ratones alimentados con pienso de control, mientras que
la expresión de IL-10 se redujo ( Fig. 2a -mi) En particular, el patrón de
expresión de estas citocinas se alteró de una manera dependiente de la dosis
mediante el tratamiento con WEGL, lo que resultó en niveles de expresión
más cercanos a los de los ratones alimentados con pienso que los ratones
alimentados con HFD con una dosis creciente de WEGL ( Fig. 2a-
e ). Además, WEGL redujo los niveles de proteínas TNF-α, IL-1β e IL-6
secretadas de una manera dependiente de la dosis en el suero de ratones HFD
( Figura complementaria 2 ).
Figura 2: WEGL disminuye la expresión de citocinas proinflamatorias en
el hígado y los tejidos adiposos de ratones alimentados con HFD.
Los animales fueron tratados como en la figura 1 . La expresión relativa de
TNF-α ( a ), IL-1β ( b ), IL-6 ( c ), IL-10 ( d ) y PAI-1 ( e ) en tejidos
hepáticos y adiposos se evaluó mediante qRT-PCR y en comparación con el
grupo Chow. Los datos se muestran como media ± sem Las barras de gráfico
con letras diferentes en la parte superior representan resultados
estadísticamente significativos ( P <0.05) basados en el análisis ANOVA
unidireccional post hoc de Newman – Keuls , mientras que las barras con la
misma letra corresponden a resultados que no muestran estadísticamente
significativo diferencias En el caso donde dos letras están presentes en la parte
superior de las barras en d , e, cada letra debe compararse por separado con
las letras de otras barras para determinar si los resultados muestran diferencias
estadísticamente significativas.
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La obesidad se caracteriza por la infiltración y activación de células inmunes
en tejidos hepáticos y adiposos 28 . Los macrófagos M1, que son reclutados
por la proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1), están asociados con
inflamación crónica de bajo grado en los tejidos adiposos de animales
obesos 26 . Como la expresión de ARNm de MCP-1 disminuyó en el hígado y
los tejidos adiposos de ratones alimentados con HFD después del tratamiento
con WEGL ( Figura complementaria 3a), examinamos el número de
macrófagos reclutados en tejidos hepáticos y adiposos mediante análisis de
citometría de flujo. Para estos experimentos se usó una doble tinción de
macrófagos con anticuerpo anti-F4 / 80 combinado con anticuerpo anti-
CD11b (para macrófagos hepáticos, también llamados células de Kupffer) o
anticuerpo anti-CD11c (para macrófagos en tejidos adiposos). Se detectaron
niveles más altos de macrófagos en tejidos hepáticos y adiposos de ratones
HFD en comparación con ratones alimentados con comida ( Fig. 3b, c
suplementaria ). Si bien los niveles de macrófagos aumentaron después del
tratamiento con 8% de WEGL en ratones alimentados con comida, WEGL
redujo estas células de una manera dependiente de la dosis en tejidos
hepáticos y adiposos de ratones alimentados con HFD ( Figura
complementaria 3b, c ).
Estudios anteriores indicaron que la alimentación con HFD también produce
una pérdida gradual de las células T reguladoras (Treg) en comparación con
los ratones alimentados con pienso 26 . Si bien HFD también redujo los
niveles de Treg en nuestro modelo de ratón, la suplementación con WEGL
condujo a aumentos dependientes de la dosis de células Treg en el hígado y
los tejidos adiposos de ratones HFD ( Figura complementaria 3d, e ). Además,
los ratones alimentados con comida tratados con WEGL al 8% mostraron
niveles aumentados de Treg en comparación con los ratones alimentados con
comida no tratada ( Figura complementaria 3d, e ). Estos resultados indican
que WEGL reduce la inflamación en ratones alimentados con HFD al reducir
la infiltración de macrófagos y mejorar la acumulación de Treg en tejidos
hepáticos y adiposos.
WEGL reduce la endotoxemia y la resistencia a la insulina en ratones HFD
La endotoxemia y la señalización TLR4 controlan la producción de citocinas
proinflamatorias en los tejidos objetivo y conducen a inflamación crónica y
resistencia a la insulina en ratones alimentados con HFD 19 . Examinamos los
efectos de WEGL sobre los niveles séricos de LPS (es decir, endotoxemia) y
la expresión de la proteína TLR4 en tejidos hepáticos y adiposos. WEGL
redujo la endotoxemia y la expresión de la proteína TLR4 en ratones
alimentados con HFD en comparación con HFD solo ( Fig. 3a-c ). Dado que
las vías de señalización TLR4 inducen la producción de citocinas
proinflamatorias al modular la actividad de JNK y NF-κB 29 , 30 , examinamos
si estas vías están afectadas por la suplementación de WEGL. Como se
muestra en la Fig. 3d, e, WEGL inhibió la fosforilación de JNK en tejidos
hepáticos y adiposos de ratones alimentados con HFD. Además, la producción
de IκB-α, cuya interacción con NF-κB previene la translocación y activación
de NF-κB, fue mejorada por el tratamiento con WEGL ( Fig. 3f, g ).
Figura 3: WEGL reduce las vías de señalización relacionadas con LPS y
TLR4 en suero en ratones HFD.
Los efectos del tratamiento con WEGL en la endotoxina sérica ( a ) La
producción de proteínas TLR4 ( b , c ) La fosforilación de JNK ( d , e ) y la
producción de IκB-α ( f , g ) se examinaron en el hígado y los tejidos adiposos
epididimales de chow- y HFD- ratones alimentados como se describe en
la figura 1 . La endotoxina sérica (EU ml −1 ) se determinó como media ± sem
utilizando el kit de ensayo de lisado de amebocitos de
limulus. Inmunotransferencias representativas para proteínas diana en bgson
exhibidos. Los marcadores de peso molecular se indicaron como kilodaltons
(kDa). Los niveles de proteína se normalizaron a los controles internos (β-
actina o JNK total, T-JNK) y la relación relativa al grupo Chow se marcó en la
parte superior de las inmunotransferencias. Las barras gráficas en una con
letras diferentes en la parte superior representan resultados estadísticamente
significativos ( P <0.05) basados en el análisis ANOVA unidireccional post
hoc de Newman – Keuls , mientras que las barras etiquetadas con la misma
letra corresponden a resultados que no muestran diferencias estadísticamente
significativas. Cuando hay dos letras en la parte superior de la barra, cada letra
debe compararse por separado con las letras de otras barras para determinar si
los resultados muestran diferencias estadísticamente significativas.
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Dado que la activación mejorada de las rutas JNK y NF-κB puede inducir
resistencia a la insulina mediante la fosforilación del sustrato receptor de
insulina-1 (IRS-1) en la serina 307 y la desfosforilación de Akt 31 ,
examinamos los efectos de WEGL sobre la actividad de la insulina. Como se
muestra en la figura complementaria 4a – e , el tratamiento con WEGL redujo
los niveles de insulina y glucosa en ayunas y disminuyó la resistencia a la
glucosa y la insulina en ratones alimentados con HFD. En consecuencia, la
fosforilación de la serina 307 en IRS-1 fue inhibida por WEGL en los tejidos
hepáticos y adiposos, mientras que la fosforilación de Akt fue mejorada por el
extracto de micelio ( Suplemento Fig. 4f-i ). WEGL por lo tanto reduce la
endotoxemia y previene la resistencia a la insulina en ratones alimentados con
HFD.
WEGL regula la expresión de genes lipogénicos
Estudios anteriores han demostrado que la expresión de genes implicados en
la biosíntesis de lípidos, como la acetil-CoA carboxilasa-1, la sintasa de ácido
graso, la proteína de unión a elementos reguladores de esteroles-1 y los
receptores γ activados por el proliferador de peroxisomas, aumenta en tejidos
hepáticos y adiposos de Ratones alimentados con HFD 32 , 33 . Nuestros
resultados indicaron que 8% de WEGL no afectó significativamente la
expresión de estos genes en ratones alimentados con comida ( Fig. 5a-d
suplementaria ). Por el contrario, WEGL redujo la expresión del gen
lipogénico de una manera dependiente de la dosis en ratones alimentados con
HFD ( Figuras suplementarias 5a-d ).
Se cree que los niveles aumentados de ácidos grasos libres (FFA) en la sangre
de animales obesos surgen de una mayor masa de tejido adiposo y una mayor
inflamación en ratones alimentados con HFD 34 . Estos ácidos grasos
circulantes también inducen la señalización de TLR4 en los tejidos objetivo y
causan resistencia a la insulina 22 . Observamos que WEGL redujo los niveles
séricos de FFA en ratones HFD ( Figura complementaria 5e ). De este modo,
WEGL puede reducir la acumulación de grasa al inhibir la expresión génica
adipogénica y disminuir la FFA en suero en ratones alimentados con HFD.
WEGL revierte la disbiosis intestinal inducida por HFD
La microbiota intestinal de humanos obesos y ratones alimentados con HFD
se caracteriza por una mayor relación Firmicutes-Bacteroidetes,
Proteobacterias productoras de endotoxinas elevadas y especies bacterianas
inmuno-homeostáticas reducidas 35 , 36 . Examinamos los efectos de WEGL en
la composición de la microbiota intestinal mediante un análisis basado en
pirosecuenciación de ARNr bacteriano 16S (región V3-V5) en heces
cecales. Después de eliminar secuencias no calificadas (ver Métodos), se
obtuvieron un total de 691,370 lecturas sin procesar y un promedio de 16,461
± 5,411 lecturas por muestra. Después de seleccionar las lecturas efectivas, se
generó un total de 292,952 lecturas efectivas y cada muestra fecal ( n= 7 para
cada grupo) produjo un promedio de 6,975 ± 2,192 lecturas efectivas. No se
observaron muestras con un bajo número de lecturas efectivas (<3,000). Los
análisis del índice de rarefacción y de Shannon indicaron que la profundidad
de secuenciación cubría filotipos nuevos raros y la mayor parte de la
diversidad ( Figura complementaria 6 ).
El análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en UniFrac reveló una
agrupación distinta de la composición de microbiota para cada grupo de
tratamiento ( Fig. 4a ). El análisis multivariado de la varianza de las
puntuaciones de la matriz PCoA indicó una separación estadísticamente
significativa entre la microbiota de Chow y Chow + 8% de grupos WEGL
( Fig. 4b ). También se observaron separaciones significativas para los grupos
HFD, HFD + 4% WEGL y HFD + 8% WEGL ( Fig. 4b ). Por otro lado, la
microbiota intestinal de los ratones HFD + 2% WEGL no difirió
significativamente de la de los ratones HFD ( Fig. 4b ), lo que es consistente
con los efectos leves producidos por 2% WEGL ( Figs. 1 , 2 , 3).) En
particular, el perfil taxonómico demostró que el tratamiento con 4% y 8% de
WEGL redujo la proporción de Firmicutes a Bacteroidetes y el filo de
Proteobacteria en ratones alimentados con HFD a niveles similares a los de los
ratones alimentados con chow ( Fig. 4c ). Aquí tampoco se observaron los
cambios producidos por el tratamiento con 2% de WEGL ( Fig. 4c ).
Figura 4: WEGL altera la composición de microbiota en ratones
alimentados con HFD.
La composición de la microbiota en heces de ratones alimentados con pienso
tratados con o sin WEGL al 8% y ratones HFD tratados con 2, 4 u 8% de
WEGL se analizaron usando secuenciación de próxima generación ( n = 7
para cada grupo). ( a ) Los gráficos mostrados se generaron utilizando la
versión ponderada de la PCoA basada en UniFrac. ( b ) Análisis de varianza
multivariante de las puntuaciones de la matriz de PCoA. ( c ) Perfiles
taxonómicos bacterianos en el nivel de filo de bacterias intestinales de
diferentes grupos de ratones. ( d ) Mapa de calor que muestra la abundancia
de 91 OTU alteradas significativamente por WEGL en ratones alimentados
con HFD basados en RDA. ( e ) Representación de información sobre taxones
bacterianos (especies, género, familia y filo) de 91 OTU de dson
exhibidos. Los círculos blancos y los diamantes negros indican las OTU que
aumentaron o disminuyeron en los grupos alimentados con Chow y HFD +
WEGL en relación con el grupo alimentado con HFD. Las estrellas negras
representan OTU cuya abundancia en ratones alimentados con comida fue
alterada por HFD y luego revertida por WEGL. La taxonomía OTU se
muestra a la derecha.
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Utilizamos el análisis de redundancia (RDA) para identificar los filotipos
bacterianos específicos que fueron alterados por la alimentación HFD y el
tratamiento WEGL. En comparación con los ratones alimentados con pienso,
la alimentación de HFD alteró significativamente 209 unidades taxonómicas
operativas (OTU), produciendo 44 OTU aumentadas y 165 disminuidas
( Datos suplementarios 1 y Figura complementaria 7a ). En ratones
alimentados con HFD, la suplementación con 2, 4 y 8% de WEGL,
respectivamente, alteró 44 (24 aumentaron y 20 disminuyeron), 42 (24
aumentaron y 18 disminuyeron) y 56 OTU (24 aumentaron y 32
disminuyeron; Datos complementarios 2 y Suplementario Fig. 7b – d ), lo que
resulta en cambios significativos en un total de 91 OTU distintas ( Fig.
4d) Entre las 91 OTU que se alteraron en comparación con los ratones
alimentados con HFD, los tratamientos con WEGL al 2, 4 y 8% alteraron las
OTU en la misma dirección en los ratones Chow para 18, 17 y 30 OTU,
respectivamente ( Fig. 4e , resaltada con estrellas negras) . Estos resultados
sugieren que el 8% de WEGL es el tratamiento más efectivo para modular la
microbiota intestinal en nuestro modelo.
El análisis detallado de las 30 OTU invertidas por WEGL al 8% indicó
que Mucispirilum shaedleri 37 , Escherichia
fergusonii (Proteobacteria 20 ), Enterococcus spp. 38 , Lactococcus
lactis 39 , Clostridium lactatifermentans (Clostridium XIVb) y Oscillibacter
valericigenes 25 , 40 (que se descubrió que estaban mejorados por HFD y que se
correlacionan positivamente con la obesidad en los estudios anteriores citados
anteriormente) fueron revertidos en un 8% de WEGL ( Fig. 4d, e) En
particular, en comparación con los ratones HFD, el tratamiento con WEGL al
8% mejoró una variedad de especies bacterianas que se correlacionan
negativamente con la obesidad, incluyendo Parabacteroides
goldsteinii , Bacteroides spp., Anaerotruncus colihominis , Roseburia
hominis , Clostridium methylpentosum (Clostridium IV), Clostridium XIVa y
XVIII y Eubacterium coprostanoligenes ( Fig. 4d, e y Datos suplementarios
2 ; tenga en cuenta que estas especies se redujeron inicialmente por HFD en
comparación con la alimentación con comida). Especies bacterianas que
incluyen E. coprostanoligenes , C. methylpentosum , P.
goldsteinii ,Bacteroides spp., A . colihominis , R . hominis y Clostridium XIVa
y XVIII también se enriquecieron en el tratamiento Chow + 8% WEGL en
comparación con la dieta Chow ( Datos complementarios 3 y Figura
complementaria 7e ). Además, muchas especies bacterianas aumentaron en el
grupo WEGL al 8% pero no fueron alteradas por HFD, lo que indica que
WEGL puede enriquecer especies bacterianas específicas ( Fig. 4e y Datos
Complementarios 2 ). En conjunto, estos resultados muestran que WEGL
modula la microbiota intestinal de los ratones alimentados con HFD, lo que
resulta en una composición de microbiota similar a la de los ratones
alimentados con pienso.
WEGL mantiene la integridad intestinal en ratones HFD
Dado que la disbiosis intestinal en animales alimentados con HFD puede
afectar la permeabilidad intestinal y, posteriormente, conducir a la liberación
de LPS bacteriano en la circulación 19 , examinamos si WEGL modula la
integridad intestinal. Mientras que la alimentación con HFD redujo la
expresión de los componentes de unión apretada, zonula occludens-1 (ZO-1) y
occludina, estos efectos fueron revertidos por la suplementación con WEGL
( Figura complementaria 8 ). Estos hallazgos sugieren que WEGL puede
mejorar la integridad de la barrera intestinal en ratones alimentados con HFD.
Los trasplantes fecales WEGL reducen la obesidad
Estudios recientes han demostrado que la capacidad de la microbiota intestinal
para modular la obesidad puede transferirse a otros animales 13 . Para
determinar si la microbiota intestinal de los animales tratados con WEGL
puede mejorar la condición de los ratones alimentados con HFD, transferimos
la microbiota de los ratones tratados con WEGL a los ratones alimentados con
HFD, seguido de un examen de los rasgos relacionados con la obesidad. El
análisis de la cohorte de ratones donantes indicó que el tratamiento con
WEGL redujo el peso corporal y la relación Firmicutes a Bacteroidetes en la
microbiota intestinal de ratones alimentados con HFD ( Figuras
suplementarias 9a, b ), similar a los resultados mostrados anteriormente
( Figuras 1a y 4c) Nuestros resultados mostraron además que la transferencia
fecal horizontal de ratones alimentados con chow (Chow → HFD), Chow +
8% WEGL (8% WEGL (Chow) → HFD) o HFD + 8% WEGL (8% WEGL
(HFD) → HFD ) redujo el peso corporal, la acumulación de grasa
epididimaria y subcutánea y el peso del hígado en comparación con la
transferencia fecal de ratones alimentados con HFD (HFD → HFD; Fig. 5a –
d ). La transferencia fecal del grupo Chow + 8% WEGL produjo los efectos
más sólidos sobre el aumento de peso y la acumulación de grasa ( Fig. 5a –
c ).
Figura 5: La obesidad y la acumulación de grasa se revierten mediante el
trasplante fecal de ratones tratados con WEGL a ratones alimentados
con HFD.
Se colonizaron ratones alimentados con HFD de ocho semanas de edad con
heces de diferentes grupos de ratones durante 8 semanas, seguido de la
medición del peso corporal ( a ) grasa epididimaria ( b ) grasa subcutánea ( c )
y peso hepático ( d ). Cada grupo constaba de cinco ratones. Las diferencias
de peso corporal en a se analizaron utilizando la prueba t de Student de dos
colas no apareada (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001). Las barras gráficas
en b – d con diferentes letras en la parte superior representan resultados
estadísticamente significativos ( P <0.05) basados en Newman – Keuls post
hoc análisis ANOVA unidireccional, mientras que los datos etiquetados con la
misma letra corresponden a resultados que no muestran diferencias
estadísticamente significativas.
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La expresión de citocinas proinflamatorias y genes lipogénicos también se
redujo en los tejidos hepáticos y adiposos de ratones HFD después de la
transferencia de heces derivadas de animales tratados con WEGL ( Fig. 6a-
d y Fig. Suplementaria 10 ). Además, los niveles de expresión de ARNm y
proteínas de las proteínas de unión apretada en el segmento íleon también
aumentaron después de la transferencia de heces de ratones tratados con
WEGL ( Fig. 6e – g ). La transferencia de heces de ratones alimentados con
WEGL al 8% a ratones HFD también produjo cambios estadísticamente
significativos en la expresión de TNF-α ( Fig. 6a ), genes lipogénicos ( Fig. 10
complementaria ) y uniones estrechas de íleon ( Fig. 6e – g), en comparación
con la transferencia fecal de ratones alimentados con comida. Estos resultados
sugieren que los efectos reductores de peso de WEGL en ratones alimentados
con HFD pueden deberse a la modulación de la microbiota intestinal.
Figura 6: Análisis de citocinas proinflamatorias y uniones estrechas
intestinales después del trasplante fecal de ratones tratados con WEGL.
Se colonizaron ratones HFD de ocho semanas de edad con heces de los grupos
de ratones indicados durante 8 semanas. En comparación con el grupo HFD
→ HFD, los niveles relativos de expresión de ARNm de TNF-α ( a ) IL-1β
( b ) IL-6 ( c ) y MCP-1 ( d ) en tejidos hepáticos y adiposos, así como
occludina ( e ) y ZO-1 ( f ) en íleon, se evaluaron mediante qRT-
PCR. Inmunoblots de íleon representativos para occludina, ZO-1 y β-actina en
cada grupo. ( g ) Los marcadores de peso molecular se indicaron como
kDa. Cada grupo constaba de cinco ratones. Las barras gráficas en a – f con
diferentes letras en la parte superior representan resultados estadísticamente
significativos ( P <0.05) basados en Newman – Keulsanálisis ANOVA
unidireccional post hoc , mientras que las barras etiquetadas con la misma
letra corresponden a resultados sin diferencias estadísticamente significativas.
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Los trasplantes fecales WEGL modulan la composición de la microbiota
intestinal
Para confirmar que WEGL modula la microbiota intestinal, examinamos la
composición de las bacterias intestinales después de la transferencia fecal de
ratones tratados con WEGL al 8%. En un análisis de secuenciación separado,
se obtuvieron un total de 1,056,611 lecturas sin procesar y un promedio de
52,831 ± 6,766 lecturas por muestra. Posteriormente, se generó un total de
458,093 lecturas efectivas y cada muestra fecal ( n = 5 para cada grupo)
produjo 22,905 ± 3,039 lecturas efectivas. Bajo esta profundidad de
secuenciación, también se cubrieron los filotipos raros y la mayor diversidad
( figura complementaria 11 ). En comparación con los ratones que recibieron
heces de ratones alimentados con HFD, los ratones alimentados con HFD
receptores ( n = 5 para cada grupo) mostraron una microbiota distinta después
del trasplante fecal de Chow-, Chow + 8% WEGL- o HFD + 8% WEGL-fed
ratones (Fig. 7a, b ). La transferencia fecal de ratones con HFD produjo
relaciones Firmicutes a Bacteroidetes y niveles de Proteobacterias y
Deferribacteres phyla que no diferían de los de los ratones alimentados con
HFD ( Fig. 7c , en comparación con la Fig. 4c ). Por el contrario, la
transferencia de heces de ratones Chow-, Chow + 8% WEGL y HFD + 8%
alimentados con WEGL produjo valores similares a los de los ratones
alimentados con chow o tratados con WEGL ( Fig. 7c , en comparación con
la Fig. 4c ).
Figura 7: Análisis de la microbiota intestinal después del trasplante fecal.
El trasplante fecal de Chow-, HFD- y Chow / HFD + 8% de ratones
alimentados con WEGL se realizó y se realizó un análisis de microbiota
relevante como se describe en los Métodos. ( a ) Los gráficos mostrados se
generaron utilizando la versión ponderada de PCoA basada en UniFrac. ( b )
Análisis de varianza multivariante de las puntuaciones de la matriz de
PCoA. ( c ) Análisis taxonómico bacteriano de la bacteria intestinal de cada
grupo de ratones. ( d ) Mapa de calor que muestra la abundancia de 155 OTU
alteradas significativamente por ratones trasplantados Chow, Chow + 8%
WEGL y HFD + 8% WEGL según el análisis RDA. ( e ) Representación de
información sobre taxones bacterianos (especies, géneros, familias y filos) de
155 OTU de dson exhibidos. Los círculos blancos y los diamantes negros
indican las OTU que aumentaron o disminuyeron en comparación con los
ratones receptores de HFD.
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El análisis RDA identificó un total de 155 OTU que fueron significativamente
alterados por el trasplante fecal de Chow- (126 OTU), Chow + 8% WEGL-
(71 OTU) y HFD + 8% de grupos alimentados con WEGL (75 OTU) en
comparación con HFD → Ratones HFD ( Datos suplementarios
4 y Suplemento Fig. 12 ). Entre
estos, M . shaedleri , E . fergusonii , L . lactis , C . scindens y O . los
valericigenes , que se potenciaron con la alimentación con HFD ( Fig. 4d ), se
revirtieron todos por transferencia fecal de ratones alimentados con Chow-,
Chow + 8% WEGL- y HFD + 8% WEGL ( Fig. 7d, e) Además, Clostridium
cocleatum , Bacteroides caccae, Eubacterium dolichum y Coprobacillus
cateniformis se alteraron después del trasplante fecal de los mismos tres
grupos de ratones ( Fig. 7d, e , estas bacterias no se identificaron en los
experimentos de tratamiento WEGL que se muestran en la Fig. 4 ). Es de
destacar que, mientras que la reducción inducida por HFD de P . Se observó
goldsteinii ( Fig. 4d, e ) en ratones HFD → HFD, esta especie fue inducida
por trasplante fecal de los otros tres grupos de ratones ( Fig. 7d,
e ). Curiosamente, Akkermansia muciniphila, una especie bacteriana
potencialmente beneficiosa, solo se identificó en ratones alimentados con
HFD que recibieron heces de Chow + 8% de ratones tratados con WEGL
( Fig. 7d, e ). Estos resultados indican que WEGL restaura la microbiota
intestinal de ratones HFD a una composición similar a la de los ratones
alimentados con comida.
Los polisacáridos de alto peso molecular WEGL reducen la obesidad
Para identificar los ingredientes activos de WEGL responsables de los efectos
contra la obesidad, fraccionamos el extracto de micelio en cuatro fracciones
(G1, G2, G3 y G4) en función de sus pesos moleculares ( Tabla 1 ). Como se
muestra en la Fig. 8a – e , la fracción G1, que consistía en polisacáridos con
peso molecular> 300 kDa ( Tabla 1 ) y una composición de monosacáridos
que comprende 47.5% de manosa, 26.3% de glucosa y 16.9% de galactosa
( Tabla 2 ), produjo un significativo anti -efectos de obesidad sobre el peso
corporal, el peso del hígado y la grasa epididimaria y subcutánea en ratones
alimentados con HFD. Notablemente, la extensión de los efectos contra la
obesidad observados fue similar a la producida por todo el extracto de micelio
WEGL ( Fig. 8a – e) En contraste, la fracción G2 mostró modestos efectos
contra la obesidad, mientras que no se observó ningún efecto significativo
para las fracciones G3 y G4 ( Fig. 8a-e ). No se observaron cambios
significativos en la ingesta media de energía, la grasa de las heces o la
extracción de energía después del tratamiento con las fracciones de
polisacárido ( Figura 13 suplementaria ). Estos resultados sugieren que los
efectos antiobesidad del micelio WEGL pueden deberse principalmente a su
fracción de polisacárido de alto peso molecular.
Tabla 1 Análisis de peso molecular de subfracciones de polisacárido
aisladas de WEGL micelio.
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Figura 8: Efecto de las fracciones de polisacárido WEGL sobre el peso
corporal y la acumulación de grasa en ratones alimentados con HFD.
Los ratones alimentados con chow o HFD se trataron diariamente con 100 μl
de subfracciones de polisacárido (G1, G2, G3, G4), WEGL al 8% o agua
mediante sonda intragástrica durante 2 meses ( n = 5 para cada grupo). Efectos
de las subfracciones de polisacárido sobre el peso corporal ( a ) aumento de
peso corporal ( b ) grasa epididimaria ( c ) grasa subcutánea ( d ) y peso
hepático ( e ). Las diferencias de peso corporal en a se analizaron utilizando
la prueba t de Student de dos colas no apareada (** P <0.01,
*** P <0.001). Las barras gráficas en b - e etiquetadas con letras diferentes en
la parte superior representan resultados estadísticamente significativos
(P <0.05) basado en el análisis ANOVA unidireccional post hoc de Newman-
Keuls , mientras que las barras con la misma letra corresponden a resultados
que no muestran diferencias estadísticamente significativas. En el caso de que
haya dos letras en la parte superior de las barras en e , cada letra debe
compararse por separado con las letras de las otras barras para determinar si
los resultados muestran diferencias estadísticamente significativas.
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Tabla 2 Composición de monosacáridos de la subfracción WEGL-G1 (>
300 kDa).
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Discusión
Aunque estudios previos han demostrado que G . lucidum reduce la glucosa
sérica y produce efectos beneficiosos sobre la diabetes mellitus tipo 2 en los
modelos murinos 6 , 41 , 42 , no se han investigado los efectos de este hongo en
la microbiota intestinal, la inflamación y la obesidad. Nuestro estudio muestra
que G . El micelio lucidum previene la obesidad inducida por la dieta y alivia
la inflamación al modular la composición de la microbiota intestinal y
mantener la integridad de la barrera intestinal. Por lo tanto, nuestros resultados
revelan que WEGL modula la microbiota intestinal que previamente se
informa que se correlaciona con la obesidad 43, pero también identifica los
polisacáridos de alto peso molecular (> 300 kDa) como los principales
ingredientes bioactivos responsables de estos efectos.
Nuestras observaciones de que WEGL produce cambios significativos en la
microbiota intestinal y los efectos antiobesidad de WEGL son transferibles a
través del trasplante fecal respaldan el concepto de que la obesidad está
asociada con una microbiota intestinal alterada. Estos hallazgos son
consistentes con los resultados de un estudio reciente de Ridaura et
al. 13Utilizando gemelos discordantes para la obesidad como modelo, estos
autores observaron que la transferencia de la microbiota intestinal de
individuos obesos a ratones alimentados con HFD transmitía un mayor
aumento de peso y mayores niveles de trastornos metabólicos asociados a la
obesidad que la transferencia fecal del gemelo magro del individuo. Nuestros
resultados sugieren que la microbiota intestinal puede ser modulada por
intervención dietética o transferencia fecal, y que el extracto de micelio
WEGL puede usarse como prebióticos para producir una microbiota intestinal
específica asociada con un aumento de peso reducido, inflamación y
resistencia a la insulina en individuos obesos.
El modelo actual de inflamación crónica inducida por HFD y trastornos
relacionados con la obesidad se explica en gran medida por la disbiosis de la
microbiota intestinal y el aumento de los niveles de LPS en la sangre, una
afección llamada endotoxemia metabólica 19 . La luz intestinal es un
reservorio de LPS de bacterias gramnegativas que
incluyen Escherichia spp. 20 En un estado de disbiosis intestinal como se
observa en animales alimentados con HFD, el tubo intestinal puede tener
fugas gradualmente, permitiendo que el LPS de las bacterias Gram negativas
ingrese a la circulación enterohepática. Las bajas concentraciones de LPS en
la sangre pueden causar inflamación sistémica y dirigida en ratones
alimentados con HFD y humanos obesos a través de la activación de la
señalización TLR4 en varias células 22. Nuestros resultados indican que la
suplementación con WEGL mejora la integridad de la barrera intestinal,
reduce la endotoxemia, disminuye la señalización de TLR4 y disminuye la
inflamación en ratones obesos alimentados con HFD. Por lo tanto, los efectos
beneficiosos inducidos por el tratamiento con WEGL pueden atribuirse a
alteraciones específicas en la microbiota intestinal (por ejemplo, reducción
de Escherichia spp. Como E. fergusonii ) y al mantenimiento de la integridad
de la barrera intestinal.
Los macrófagos encontrados dentro de los tejidos adiposos exhiben dos
perfiles de activación diferentes que consisten en los tipos M1 y M2 44 . Los
macrófagos M1 inducidos por LPS se acumulan alrededor de los adipocitos y
hepatocitos moribundos y secretan citocinas proinflamatorias, proporcionando
un mecanismo para explicar cómo la obesidad puede propagar la
inflamación 45 . Observamos que el tratamiento con WEGL reduce el número
de macrófagos y disminuye la expresión de MCP-1 en tejidos hepáticos y
adiposos de ratones alimentados con HFD ( Figuras suplementarias 3a-
c ). Además, un aumento de la expresión de IL-10 ( Fig. 2d ) y las células
Treg en el hígado y los tejidos adiposos ( Suplemento Fig. 3d, e) también se
observó en ratones tratados con WEGL. Además de los macrófagos y las
células Treg, otras células inmunes como las células NKT y
B 46 , 47 , 48 también pueden contribuir a los efectos antiobesidad observados
aquí.
La microbiota intestinal de humanos y animales obesos se asocia con niveles
disminuidos de Bacteroidetes intestinales y niveles elevados de Firmicutes, lo
que indica que estos filos principales pueden desempeñar un papel en la
inflamación relacionada con la obesidad 16 , 49 . En consecuencia, los
prebióticos que se alimentan con el compuesto de hemicelulosa vegetal
arabinoxilano invierte la relación Bacteroides a Firmicutes y reduce la
obesidad 50 . Observamos que la suplementación con WEGL al 8% en ratones
alimentados con HFD restableció la relación Firmicutes a Bacteroidetes a la
observada en ratones alimentados con pienso ( Fig. 4c ). Curiosamente, los
probióticos Bifidobacterium spp., Que previamente se informó que reducen la
obesidad 51 , 52, no se detectaron en el presente estudio. Esta observación
sugiere que WEGL puede producir efectos contra la obesidad al alterar la
relación Firmicutes a Bacteroidetes, así como al modificar los niveles de otras
especies bacterianas específicas ( Datos complementarios 2 y 3 ).
Un estudio anterior mostró que las fibras de quitina-glucano modulan
el clúster de Clostridium XIVa ( Roseburia spp.) En la microbiota intestinal
de ratones alimentados con HFD 53 . Anteriormente se descubrió que
las bacterias pertenecientes a los grupos de Clostridium XIVa, XVIII y IV,
que carecen de toxinas prominentes y factores de virulencia, modulan el
metabolismo de los ácidos grasos del huésped, inducen la actividad de las
células Treg y atenúan la colitis 54 . Además, Eubacterium spp. inducidos por
oligosacáridos prebióticos producen efectos beneficiosos en los animales
anfitriones 55 , destacando el posible efecto probiótico de estas
especies. Nuestros resultados demuestran que la suplementación con WEGL
mejora los niveles bacterianos de Clostridiumlos grupos IV, XVIII y XIVa
( Roseburia spp.) y Eubacterium spp. en ratones obesos alimentados con HFD
( Fig. 4d, e y Datos Complementarios 2 ). Estos resultados indican que los
efectos de WEGL pueden deberse al menos parcialmente a un aumento en las
poblaciones de estas especies beneficiosas. La alimentación con WEGL
también disminuyó varias especies bacterianas asociadas con la inflamación y
la obesidad. Por ejemplo, E. fergusonii , que está asociada con la inflamación
inducida por HFD 20 , se redujo después del tratamiento con WEGL ( Fig. 4d,
e y Datos complementarios 2 ). Oscillibacterspp. También se informó que
aumentaron en los ratones alimentados con HFD en comparación con los
ratones alimentados con comida, y estas bacterias mostraron una relación
negativa con la expresión de las proteínas de la unión apretada
intestinal 40 . De acuerdo con estas observaciones, el tratamiento con 8% de
WEGL revirtió el porcentaje de Oscillibacter spp. en la microbiota intestinal
de ratones alimentados con HFD a un porcentaje similar al observado en
ratones alimentados con pienso ( Fig. 4d, e y Datos complementarios 1 y
2 ). Además, Mucispirillum spp. perteneciente a Deferribacteres, que se sabe
que colonizan la capa mucosa, aumentó en ratones alimentados con HFD en
comparación con los ratones alimentados con pienso 56 . En
contraste, Mucispirillum.spp. fueron reducidos por WEGL en ratones HFD en
el presente estudio ( Fig. 4d, e y Datos Complementarios 2 ). Por lo tanto,
WEGL puede prevenir la obesidad inducida por HFD al modular la
composición de la microbiota intestinal de múltiples maneras 57 . No obstante,
no se puede descartar la hipótesis de que WEGL también puede afectar
directamente las vías de señalización proinflamatorias como TLR2, que
también controla la adiposidad y la resistencia a la insulina 58 .
Además de la modulación de la composición de microbiota,
nuestros experimentos in vivo demuestran que la administración de WEGL
también reduce la expresión de genes implicados en la síntesis de ácidos
grasos y reduce la resistencia a la insulina en ratones alimentados con
HFD. Estos resultados sugieren que los efectos de WEGL pueden deberse a la
modulación de la expresión de genes lipogénicos. Además, un estudio previo
demostró que la sobreproducción de citocinas proinflamatorias como TNF-α,
IL-1β, IL-6 y MCP-1 en animales obesos puede ser responsable del desarrollo
de inflamación crónica y resistencia a la insulina, debido a al menos en parte a
la fosforilación del IRS-1 (en serina 307; ref. 31) En el presente estudio, el
tratamiento con WEGL indujo la desfosforilación de IRS-1 y la fosforilación
mejorada de Akt, lo que condujo a una mejor sensibilidad a la insulina. Por lo
tanto, WEGL puede no solo regular la expresión de genes lipogénicos, sino
también afectar las vías de señalización involucradas en la resistencia a la
insulina.
Estudios anteriores han puesto de relieve la importancia de los ácidos grasos
de cadena corta (AGCC) como el acetato, el propionato y el butirato en la
mejora de las enfermedades inflamatorias crónicas y la promoción de la salud
de los colonocitos 59 . Se informó que los SCFA suprimen la producción de
citocinas proinflamatorias, aumentan la expresión de IL-10 y activan las
células Treg, lo que conduce a la mejora de la colitis 60 . Los SCFA se
producen a partir de la fermentación de polisacáridos y algunos otros
prebióticos por bacterias intestinales como Bacteroides spp. 50 Como el
porcentaje de Bacteroidesse mejoró con el tratamiento de ratones HFD con
8% de WEGL, es posible que la cantidad de SCFA también aumente en este
caso. Queda por determinar si los SCFA se ven afectados o no por WEGL y si
estas moléculas contribuyen al efecto antiinflamatorio de WEGL.
En particular, nuestros resultados muestran que los polisacáridos de alto peso
molecular (> 300 kDa) aislados de WEGL producen efectos significativos
contra la obesidad en ratones alimentados con HFD. Con respecto al posible
mecanismo de acción de los polisacáridos de WEGL, estudios previos
sugieren que las bacterias intestinales poseen preferencias distintas de
polisacáridos y que estas moléculas pueden favorecer el crecimiento de
especies bacterianas específicas en la microbiota intestinal 61 . En conjunto,
nuestros resultados sugieren que tanto WEGL como sus polisacáridos de alto
peso molecular pueden usarse como prebióticos para reducir el aumento de
peso corporal, la inflamación crónica y la resistencia a la insulina en
individuos obesos.
Métodos
Cepas murinas y fúngicas
Los experimentos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con
las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la
Universidad Chang Gung (IACUC; Aprobación No. CGU11-117). Los
ratones del linaje genético C57BL / 6NCrlBltw se compraron en Biolasco
(Taiwán) y se mantuvieron en condiciones de luz controlada (ciclo de luz-
oscuridad de 12 h), con libre acceso a alimentos y agua. Los ratones machos
de ocho semanas de edad se distribuyeron aleatoriamente en seis grupos que
contenían de cinco a siete animales cada uno (véase la leyenda de las Figs.
1,4-6,8). Los ratones fueron alojados en grupos de tres o cuatro animales por
jaula, y fueron alimentados con una dieta estándar de comida (13.5% de
energía de grasa; LabDiet 5001; LabDiet, EE. UU.) O una dieta alta en grasa
(60% de energía de grasa ; TestDiet 58Y1; TestDiet, EE. UU.). El G.
lucidumcepa inicialmente aislada y caracterizada en Chang Gung
Biotechnology y el extracto acuoso de micelio cultivado se procesaron como
se describió anteriormente 62 . Brevemente, el extracto de agua se preparó
mezclando 400 g de G seco . micelio lucidum en 10 l de agua antes de agitar a
150 rpm durante 30 min a 121 ° C. La solución se enfrió a temperatura
ambiente (22 ° C), seguido de centrifugación a 5.894 gdurante 30 minutos a 4
° C utilizando una centrífuga Sorvall RC 3C Plus (Thermo Fisher Scientific,
EE. UU.). El sobrenadante se concentró usando un concentrador de vacío
Rotavapor Buchi R220 (Buchi, Suiza) a 65 ° C para obtener un volumen final
de 2 l. El extracto se esterilizó a 121 ° C durante 20 min, seguido de
almacenamiento a 4 ° C en botellas de vidrio oscuro. El micelio consistía en
<5% de fibra cruda; > 10% de polisacáridos; proteínas crudas a 38,78 g por
100 g; grasa bruta a 2,41 g por 100 g; carbohidratos a 41.99 g por 100
g; aminoácidos a 5,2 g por 100 g; y sodio a 76,39 mg por 100 g. Las calorías
se midieron a 345 kcal por 100 g. Cada grupo de ratones se alimentó durante 2
meses con dieta de alimentación o HFD, más la administración diaria de 100
μl de agua o WEGL al 2, 4 u 8% (p / v) mediante sonda intragástrica.
Preparación de subfracciones de polisacárido WEGL
Las fracciones de polisacárido WEGL fueron proporcionadas por Chang Gung
Biotechnology. Brevemente, se mezclaron 100 ml de extracto WEGL con 600
ml de etanol al 95% (v / v) antes de la incubación durante 16 ha 4 ° C. La
solución se centrifugó a 4.500 g.durante 20 minutos a 4 ° C (centrífuga
Sorvall RC 3C Plus; Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). El primer
sobrenadante se decantó y se añadieron 100 ml de etanol frío al 70% para
producir un gránulo. La solución se centrifugó como anteriormente y el
segundo sobrenadante se decantó. Esta operación se repitió tres veces. El
primer y segundo sobrenadantes se agruparon para obtener un volumen de
1.050 ml (fracción G4). El precipitado precipitado que contenía polisacáridos
en bruto se mezcló con 1.000 ml de agua destilada y el material se disolvió
por completo. La solución de polisacáridos en bruto se concentró hasta un
volumen final de 700 ml usando un concentrador de vacío R220 (Büchi,
Suiza) a 65 ° C para eliminar el alcohol residual. Se añadió agua destilada a la
solución cruda de polisacárido para obtener un volumen final de 2.400
ml.2PES; Spectrum Laboratories, EE. UU.). La presión transmembrana se
ajustó a 15 psi. Se añadió un total de 1.800 ml de agua destilada durante la
filtración de la solución de polisacárido en bruto. El filtrado retentivo (650 ml)
se conservó (G1-1). Las soluciones se filtraron usando una membrana de
cassette de 300 kDa (Minimate TFF Capsule; Pall, EE. UU.). Se añadió un
total de 600 ml de agua destilada durante la filtración. El filtrado retentivo
(950 ml) se recogió (G1-2). Los filtrados G1-1 y G1-2 se combinaron para
obtener un volumen de 1.600 ml (G1). El filtrado filtrado se filtró con una
membrana de cassette de 10 kDa. Se añadió un total de 600 ml de agua
destilada durante la filtración. Se obtuvieron el filtrado retentivo (970 ml)
(G2) y 3.600 ml del filtrado permeado (G3). El G1, G2,
Trasplante fecal
El trasplante fecal se realizó en base a un protocolo
establecido 63 . Brevemente, los ratones donadores machos de 8 semanas de
edad ( n = 5 por grupo de dieta) fueron alimentados con Chow, Chow + 8% de
WEGL, HFD o HFD + 8% de WEGL durante 3 meses. Después de 4 semanas
de alimentación, las heces se recolectaron diariamente durante los siguientes 2
meses bajo una campana de flujo laminar en condiciones estériles. Las heces
de los ratones donantes de cada grupo de dieta se agruparon y se
resuspendieron 100 mg en 1 ml de solución salina estéril. La solución se
mezcló vigorosamente durante 10 s usando un vórtice de mesa (Vortex-Genie
2, Scientific Industries, EE. UU.; Velocidad 9), antes de centrifugar a
800 gpor 3 min. El sobrenadante se recogió y se usó como material de
trasplante como se describe a continuación. Se preparó material de trasplante
nuevo el mismo día del trasplante dentro de los 10 minutos antes de la sonda
oral para evitar cambios en la composición bacteriana. Los ratones machos
receptores de ocho semanas de edad ( n = 5 para cada grupo de trasplante) se
alimentaron con HFD y se inocularon diariamente con material de trasplante
fresco (100 μl para cada ratón) mediante sonda oral durante 2 meses, antes de
matarlos para su posterior análisis. El análisis del peso corporal y la
microbiota intestinal de los ratones donantes ( Figuras suplementarias 9a, b )
indicó que los tratamientos de dieta de 4 semanas de duración utilizados para
esta cohorte de ratones produjeron cambios similares a los de los tratamientos
de 2 meses ( Figuras 1a y 4c ).
Anticuerpos
Anticuerpos contra IκB-α (factor nuclear del potenciador del gen del
polipéptido ligero kappa en inhibidor de células B alfa; 1: 1,000; 9242L), JNK
(c-Jun N-terminal; 1: 1,000; 9252L), JNK fosforilado (1: 1,000; 4668S), IRS-
1 fosforilado (sustrato receptor de insulina-1; fosforilación en serina 307; 1:
1,000; 2381S), IRS-1 (1: 1,000; 2382L), Akt (1: 1,000; 4691L), Akt
fosforilado (fosforilación en serina 473; 1: 1,000; 4060L) y TLR4 (1: 1,000;
2219) fueron adquiridos de Cell Signaling Technology (USA). Los
anticuerpos contra zonula occludens-1 (ZO-1; 1: 250; 61–7,300) y occludina
(1: 250; 71–1,500) se obtuvieron de Invitrogen (EE. UU.). Los anticuerpos
secundarios (IgG anti-conejo, H + L; 1: 10,000 y 1: 2,000 para anticuerpos
primarios de Cell Signaling Technology e Invitrogen, respectivamente; 111-
035-003) se adquirieron de Jackson ImmunoResearch (EE. UU.). El
anticuerpo contra β-actina (1: 20,000; NB600-501) y el anticuerpo secundario
anti-IgG de ratón (1: 20,000; sc-2005) se adquirieron de Novus Biologicals
(EE. UU.) Y Santa Cruz Biotechnology (EE. UU.), Respectivamente. Anti-F4
/ 80 conjugado con FITC (1: 100; 11-4801; eBioscience, EE. UU.), Anti-
CD11b conjugado con PE (1: 100; 557397; BD Pharmingen, EE. UU.), Anti-
CD11c (1: 100; 557401 ; BD Pharmingen), anti-CD4 conjugado con PE (1:
100; 557308; BD Pharmingen), anti-CD25 conjugado con PerCp-Cy5.5 (1:
100; 551071; BD Pharmingen) y anti-conjugado con Alexa Flour 488
También se usaron anticuerpos Foxp3 (1: 100; 560403; BD
Pharmingen). 557397; BD Pharmingen, EE. UU.), Anti-CD11c (1: 100;
557401; BD Pharmingen), anti-CD4 conjugado con PE (1: 100; 557308; BD
Pharmingen), anti-CD25 conjugado con PerCp-Cy5.5 (1: 100; 551071; BD
Pharmingen) y los anticuerpos anti-Foxp3 conjugados con Alexa Flour 488 (1:
100; 560403; BD Pharmingen) también se usaron. 557397; BD Pharmingen,
EE. UU.), Anti-CD11c (1: 100; 557401; BD Pharmingen), anti-CD4
conjugado con PE (1: 100; 557308; BD Pharmingen), anti-CD25 conjugado
con PerCp-Cy5.5 (1: 100; 551071; BD Pharmingen) y los anticuerpos anti-
Foxp3 conjugados con Alexa Flour 488 (1: 100; 560403; BD Pharmingen)
también se usaron.
Determinación de energía y grasa en las heces.
Las mediciones se realizaron en base a un protocolo reportado
previamente 64 . La densidad de energía se determinó utilizando un
calorímetro de bomba adiabática (Gallenkamp, Reino Unido). Los lípidos
fecales totales se extrajeron como se describió anteriormente 65 . Brevemente,
las muestras fecales secas se homogeneizaron una vez con heptano / dietiléter
/ etanol (1: 1: 1, vol / vol) y dos veces con heptano / dietiléter / etanol / agua
(1: 1: 1: 1, vol / vol). Los sobrenadantes se recogieron en viales de vidrio que
se habían pesado previamente. La cantidad total de lípidos en cada
sobrenadante se midió gravimétricamente después de la evaporación del
disolvente y se expresó como un porcentaje del peso de la muestra fecal de
partida.
Aceite rojo O tinción
Las secciones de hígado congelado (6 μm de espesor) se tiñeron con Oil Red
O (Sigma, EE. UU.) Durante 20 min, y luego se tiñeron con hematoxilina
durante 1 min. Las secciones se examinaron bajo microscopía óptica. Se
analizaron un total de 20 secciones de tejido para cada animal.
Test oral de tolerancia a la glucosa
A los ratones en ayunas durante la noche se les administró glucosa por sonda
oral (3 g kg −1 , solución al 66%), y la medición de la evaluación del modelo
homeostático de resistencia a la insulina se realizó como se describió antes
del 20 . La glucosa en sangre se determinó con un medidor de glucosa (Roche
Diagnostics, Suiza) usando sangre recolectada de la punta de la vena de la
cola.
Análisis bioquímicos
La cuantificación de LPS en suero se realizó usando un kit comercial basado
en el uso de un extracto de amaebocitos Limulus (kit Lal; Cambrex Bio
Science, EE. UU.). Las muestras se diluyeron 1:20 y se calentaron durante 10
minutos a 70 ° C. Las concentraciones séricas de insulina se determinaron en
5 μl de suero usando un kit comercial ELISA (Mercodia, Suecia) basado en
las instrucciones del fabricante. Los FFA en suero se determinaron usando un
kit de detección comercial (Biovision, EE. UU.).
PCR cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa
El ARN total se aisló usando un kit de aislamiento de ARN de tejido total
(Geneaid, Taiwán). Se usaron cantidades iguales de ARN total para sintetizar
ADNc con el kit Quant II fast RT (Tools, Taiwán). La PCR cuantitativa en
tiempo real de transcripción inversa (qRT – PCR) se realizó por triplicado
utilizando SYBR Green, placas de 384 pocillos y el sistema de PCR en tiempo
real LightCycler 480 (Roche Diagnostics). Cada pozo se cargó con un total de
10 μl que contenía 1,5 μl de ADNc, 1 μl de cebadores objetivo, 1,5 μl de agua
y 5 μl de Kapa SYBR Fast Master Mix. La PCR de inicio en caliente se
realizó durante 50 ciclos, y cada ciclo consistió en desnaturalización durante
15 segundos a 94 ° C, recocido durante 30 segundos a 60 ° C y alargamiento
durante 30 segundos a 72 ° C. Se utilizó el software Roche LightCycler
(versión 1.5.0, Roche Diagnostics) para el análisis de datos. La cuantificación
relativa se realizó utilizando el 2 −ΔΔCTmétodo 66 . La expresión se normalizó
contra el gen de limpieza gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Los niveles
medios de expresión de los ratones alimentados con comida se establecieron
como 100%. Los cebadores utilizados se muestran en la Tabla
complementaria 1 .
Western blotting
Cien mg de tejido adiposo, hepático o intestinal se homogeneizaron en una
solución comercial de extracción de proteínas Pro-Prep (Intron
Biotechnology, Corea del Sur). Los lisados de proteínas totales se
fraccionaron en un gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio al 10% y se
transfirieron por electroformación sobre membranas de difluoruro de
polivinilideno (Immobilon TM-P; Millipore, EE. UU.). Las membranas se
bloquearon con leche descremada al 5% durante 1 hora a temperatura
ambiente en tampón TBST (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6, Tween 20 al
0,1%) y se probaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Las
membranas se incubaron luego con anticuerpo secundario conjugado con
peroxidasa de rábano picante. Las diluciones de anticuerpos primarios y
secundarios se describieron en la sección Anticuerpo anterior. Las bandas de
proteínas se desarrollaron utilizando quimioluminiscencia mejorada
(Millipore). Las inmunotransferencias originales se proporcionaron
enSuplementario Fig.14 .
Análisis de morfometría de tejidos adiposos epididimarios.
Los tejidos adiposos epididimarios recién aislados de ratones de tipo salvaje o
tratados con WEGL se fijaron durante la noche en formalina al 10%, seguido
de deshidratación, inclusión en parafina y seccionamiento. Las secciones de 8
μm se tiñeron con hematoxilina y eosina, y el tamaño de las células se analizó
utilizando el software Image J (National Institutes of Health, EE. UU.).
Análisis de citometría de flujo.
Se enjuagaron tejidos adiposos y hepáticos epididimales en solución salina, se
picaron en trozos finos y se digirieron con colagenasa (Sigma, EE. UU.) En
tampón Krebs – Henseleit – HEPES (Sigma, EE. UU.; PH 7,4)
complementado con 20 mg ml −1 de BSA y 2 mM glucosa. La incubación se
realizó a 37 ° C en un agitador durante 45 min. Las muestras se pasaron a
través de una malla y se fraccionaron por centrifugación breve (1,000 g) Los
gránulos o las células flotantes se recolectaron para obtener la fracción
estromal-vascular o los adipocitos en los tejidos adiposos,
respectivamente. Las células en la fracción estromal-vascular y las fracciones
hepáticas se lisaron en tampón Pharm Lyse durante 30 minutos a 4 ° C y se
resuspendieron en tampón de tinción Pharmingen (Becton Dickinson, EE.
UU.). Las células se incubaron con el anticuerpo comercial 2.4G2, que
reacciona contra los receptores murinos FcgII y FcgIII (Becton Dickinson,
EE. UU.) Durante 10 minutos y luego con anticuerpos primarios o los isotipos
de control correspondientes durante 30 minutos a 4 ° C. Las células se
enjuagaron dos veces y se resuspendieron en tampón de tinción
Pharmingen. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando un
FACSCalibur (Becton Dickinson, EE. UU.). El análisis de datos se realizó
utilizando el software de análisis de citometría de flujo Kaluza (Beckman
Coulter, EE. UU.). Los macrófagos se identificaron como células F4 / 80 y
CD11c doble positivas en tejidos adiposos o como F4 / 80 y CD11b doble
positivas en el hígado. CD4, CD25 y el factor de transcripción Foxp3 se
analizaron para las células Treg.
Mediciones de citoquinas
Los niveles de proteína IL-1β, IL-6 y TNF-α se midieron usando kits
comerciales de ELISA (R&D Systems, EE. UU.).
Análisis de microbiota intestinal
Las muestras de heces se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido antes
de almacenarlas a -80 ° C. El ADN se extrajo usando un kit de aislamiento de
ADN fecal (MoBio Laboratories, EE. UU.). Para cada muestra de heces
cecales, el gen 16S rRNA que comprende regiones V3-V5 se amplificó
usando un cebador directo compuesto y un cebador inverso que contiene un
código de barras único de 10 bases para etiquetar cada producto de PCR. Para
cada muestra, se preparó una mezcla de PCR de 50 μl que contenía una
plantilla de ADN de 25 ng, tampón KAPA HiFi 5 ×, mezcla KAPA dNTP 10
mM, 1 U μl −1 ADN polimerasa KAPA HiFi (KAPA Biosystems, EE. UU.) Y
0,3 μM de cebador compuesto pares. Las condiciones de reacción de PCR
consistieron en 95 ° C durante 3 minutos, seguidas de 15-25 ciclos de 98 ° C
durante 20 s, 45 ° C durante 15 sy 72 ° C durante 15 s, y una extensión final
de 72 ° C durante 1 minuto. Los pares de cebadores compuestos consistieron
en el cebador directo (5′-
GCCTTGCCAGCCCGCTC ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3 ') - un
compuesto de 454 B cebador (subrayado) y el cebador bacteriana universal de
338F (cursiva) -y el cebador inverso
(5'- GCCTCCCTCGCGCCATCAG NNNNNNNNNN CCGTCAATTCMTTT
GAGTTT -3') - un compuesto de 454 Un cebador (subrayado ), un código de
barras único de 10 bases (NNNNNNNNNN) y el cebador bacteriano de
amplio rango 907R (cursiva). Las PCR replicadas se agruparon y los
amplicones se purificaron usando el kit de purificación de PCR QiaQuick
(Qiagen, EE. UU.). Los productos de PCR se secuenciaron en una plataforma
454 FLX pyrosequencer de acuerdo con los procedimientos recomendados por
454 Roche. Se seleccionaron lecturas de alta calidad para el análisis
bioinformático y todas las lecturas efectivas de todas las muestras se
agruparon en OTU en función del 97% de similitud de secuencia de acuerdo
con 454 SOP67 . Brevemente, los criterios de control de calidad para
seleccionar lecturas sin procesar de alta calidad incluyeron la eliminación de
secuencias que carecían de cebadores V3 – V5 o secuencia de código de
barras (la secuencia de código de barras no coincidía o no se identificó), así
como secuencias que contenían una región variable corta (<90 pb) o bases
indeterminadas (> 2 bases) en la región variable V3 – V5. Los criterios de
eliminación de ruido incluyeron (1) el uso de una ventana deslizante de 50 pb
para reducir el error de secuencia y (2) un puntaje de calidad promedio de 35
dentro de esa ventana para el recorte de secuencia. Todas las secuencias de
alta calidad se alinearon usando el alineador múltiple de terminación de
espacio de alineación más cercano en la alineación de base de datos
compatible con SILVA. Se eliminaron las lecturas que no se alinearon con la
región anticipada de la alineación de referencia. Secuencias de quimera
identificadas usando el algoritmo UCHIME 68fueron eliminados. Todas las
lecturas se clasificaron utilizando un clasificador bayesiano con base de datos
RDP casera. Se eliminaron las lecturas que no podían clasificarse a nivel del
reino. El análisis de diversidad alfa, incluido el análisis de rarefacción y el
índice de Shannon, se calcularon utilizando QIIME 69 . Fast UniFrac PCoA se
realizó con el árbol filogenético construido insertando el representante de cada
OTU también generado usando QIIME 69 . Según los métodos estadísticos
publicados 70, la significación estadística de la separación entre grupos de
animales en las gráficas de puntajes de PCoA se evaluó mediante un análisis
multivariado de prueba de varianza con diferencias en los valores fisiológicos
y bioquímicos para la significación estadística. Los datos distribuidos
normalmente se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA)
utilizando la prueba post hoc de Tukey (SPSS, EE. UU.). La abundancia
relativa de cada OTU (log 10 transformado) se utilizó para construir modelos
RDA y las OTU que eran diferentes entre los grupos de animales se evaluaron
con Canoco para Windows 4.5 (Microcomputer Power, EE. UU.) De acuerdo
con las instrucciones del fabricante. La significación estadística se evaluó
mediante el procedimiento de permutación de Monte Carlo con 499
permutaciones aleatorias.
Determinación de bacterias por PCR cuantitativa en tiempo real
Utilizando cebadores específicos para bacterias descritos en la Tabla 1
suplementaria , se determinó la abundancia de Firmicutes, Bacteroidetes y
bacterias totales en las heces fecales de cada grupo de dieta en un punto de
tiempo indicativo mediante PCR cuantitativa en tiempo real basada en el
método 2 ΔΔCT 66 . La abundancia relativa de Firmicutes y Bacteroidetes se
normalizó a las bacterias totales para el cálculo de la relación Firmicutes-
Bacteroidetes.
análisis estadístico
Los datos obtenidos de tres experimentos repetidos se muestran como medias
± sem. Las diferencias en el peso corporal se evaluaron utilizando la prueba t
de Student de dos colas no apareada . Los conjuntos de datos que involucraron
a más de dos grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía, seguido de
las pruebas post hoc de Newman-Keuls (ver la leyenda de las figuras 1-
3,5,6,8). El análisis de secuenciación de próxima generación se evaluó
utilizando las pruebas post hoc de diferencia significativa honesta de
Tukey . Un valor de P de 0.05 se consideró estadísticamente significativo. En
las figuras, los datos con diferentes letras superíndice son significativamente
diferentes según el análisis estadístico ANOVA post hoc . Se utilizó SPSS
versión 17.0.
Información Adicional
Códigos de acceso: los datos de secuenciación de Microbiota se depositaron
en la base de datos Sequence Read Archive de NCBI con el código de
acceso SRP057860 .
Cómo citar este artículo: Chang, C.-J. et al. Ganoderma lucidum reduce la
obesidad en ratones al modular la composición de la microbiota
intestinal. Nat. Commun. 6: 7489 doi: 10.1038 / ncomms8489 (2015).
Códigos de acceso
Adhesiones
Archivo de lectura de secuencia
• SRP057860
Cambia la historia
• 11 de julio de 2017
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