OBTENCIÓN DE ADN EN CÉLULAS ANIMALES

Tema: OBTENCIÓN DE ADN EN CÉLULAS ANIMALES

OBJETIVO: Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades físicas y químicas del ADN, que permiten la observación de su estructura fibrilar, que confirma que en el núcleo se encuentra replegado.

CUESTIONARIO

1. Observar el link:http://www3.gobiernodecanarias.org/aciisi/cienciasmc/web/u6/contenido1.3.2_u6.html.

Y elabora un mapa conceptual del proceso realizado.

2. Responde a las siguientes preguntas:  ¿Para qué aíslan los científicos el ADN?

1. La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ultimo hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite el alcohol.

2. Con esta técnica se puede hacer una identificación de ADN, en pruebas de paternidad, con un sencillo hisopado de cavidad bucal y de esta manera se puede extraer células epiteliales y proceder a llevar a cabo la prueba en un laboratorio, o con muestras de sangre así obtener ADN y realizar la prueba deseada.

3. Verificación de identidad por medio de la extracción genética es la huella genética, un proceso en el cual el material genético puede ser emparejado en una escena del crimen, por medio de esta técnica se ha trabajado tanto para colocar a una persona en la escena de un crimen, como para exonerar a las personas condenadas erróneamente por un delito.

4. Nos permite a más de es hacer una identificación en casos de muestras cuando, no hay na identificación de los cuerpos, mediante muestras de ADN y así facilitar en reconocimiento forense.

En qué consiste la técnica del PCR.

La técnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction= Reacción en Cadena de la Polimerasa) permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN.

Esta técnica es usada para crear un gran número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización, apareamiento con cebadores y extensión por una ADN polimerasa termoresistente.

Requiere conocer la secuencia de nucleótidos de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de ADN complementarios a una porción de cada una de las dos cadenas de la doble hélice.

1. La mezcla de reacción contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (P1 y P2) que servirán como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato –dATP, dGTP, dCTP y dTTP–

2. Proceso

La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación o alineación y una de elongación.

a) Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde.

b) Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.

c) Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y la enzima Taq ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensión de la cadena complementaria a partir del extremo 3’ de los cebadores. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.

Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposición se encuentran la detección precoz o prenatal de enfermedades genéticas, la detección de infecciones virales latentes o la producción de grandes cantidades de fragmentos de ADN humano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros métodos. Esta técnica también se aplica para estudios de identidad y filiación.

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm (1).

La molécula de ADN es una estructura constituida por dos cadenas que codifican la información genética de un organismo. Cada cadena es una secuencia de nucleótidos. La lectura de esta secuencia de nucleótidos proporciona la información genética propia del organismo. Con la técnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction= reacción en cadena de la polimerasa) es posible obtener millones de copias de un fragmento del ADN (por ejemplo, de un gen de interés). La proteína que lleva a cabo el proceso de copia de las cadenas del ADN es la ADN polimerasa. En el primer ciclo de la PCR se consigue duplicar el fragmento de interés porque cada cadena del ADN sirve de molde para la síntesis de otra cadena. Como en cada ciclo aumenta el número de cadenas que sirven de molde para la ADN polimerasa, en tan sólo 25 ciclos de copia la técnica de la PCR permite obtener millones de copias de un fragmento que se encontrara presente como copia única al comenzar el proceso. La PCR es una técnica válida para diferentes aplicaciones médicas que requieran una concentración alta de un fragmento concreto del ADN: para

identificar anomalías en la secuencia de nucleótidos que apunten a posibles patologías, para identificar a un individuo o averiguar su parentesco con otros ya que el patrón de nucleótidos del ADN es característico de cada individuo o para detectar la presencia de ADN de microorganismos útil en el diagnóstico de infecciones o para probar la eficacia de un tratamiento.

http://medmol.es/enlaces-de-interes/ (2).

Aplicaciones en medicina PCR

En medicina legal: identificación de individuos a partir de muestras biológicas.

o Diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias

o Pruebas de paternidad

o Detección temprana de patógenos.

o Detección de cepas resistentes a antibióticos.

Además, se han diseñado PCR más específicas que se pueden elegir según sea la muestra a estudio. Los diferentes tipos de PCR, además de la básica, son:

PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos minúsculos.

PCR in situ: permite la detección de ADN en el mismo lugar de la muestra, sin tener que procesarla primero con técnicas de laboratorio. Se suele utilizar para biopsias o raspados de células.

PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos de ADN a la vez y con una sola muestra.

PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utiliza el VIH entre otros virus.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se añade un componente fluorescente que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del ADN detectado.

3. INVESTIGAR:

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.

1. ¿Para qué se utiliza el jabón líquido y el NaCl en la extracción?

El jabón liquido tiene como función destruir las membranas celulares del tejido vivo, el detergente disuelve las grasas, que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células(es el mismo principio por que el gel limpia la grasa de nuestra piel). Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior.

El detergente cumple la misión de formar un complejo con las proteínas histonas y separarlas de ADN.

http://learn.genetics.utah.edu/es/extraction/detergent.cshtml (3).

http://wwww.madrimasd.org/cienciaysociedad/taller/biologia/extraccion-adn/ (4).

La sal común (NaCl).

 Cada hebra de ADN está cargada de manera negativa y como sabemos, las cargas iguales se repelen. Para minimizar esta repulsión electrostática agregaremos una pizca de sal. La sal está compuesta de átomos con carga positiva (el sodio) y negativa (el cloro). Los iones positivos serán atraídos por las cargas negativas del ADN y “apantallaran” a estas cargas, como resultado, la repulsión entre las hebras de ADN disminuye.

La acción de la sal es cubrir los terminales fosfatos negativos, permitiendo así que los extremos se unan y el ADN precipite en la solución de alcohol.

https://notaminima.wordpress.com/2013/10/24/extraccion-adn/ (5).

La sal evita la unión de proteínas al ADN La sal con esa concentración, es un medio hipertónico que provoca el

estallido de las células y los núcleos, quedando libre las fibras de cromatina.

http://wwww.ehowenespanol.com/utiliza-sodio-extraccion-adn-sobre_100099/(6).

2. ¿Qué utilidad tiene el bicarbonato?

El bicarbonato cumple la función de mantener el PH de la mezcla, neutralizando la acidez de la disolución consiguiendo un pH neutro

http://www.eurekamuseoa.es/images/stories/AreaEducativa/RecursosDidacticos/PracticaLaGenetica/PROFESORES_PRACTICA_LA_GENTICA.pdf (7).

El bicarbonato sódico (NaHCO3). Ayuda al detergente a romper las membranas.

http://olimpiadn.educabarrie.org/wp-content/uploads/2015/03/Colegio-Internacional-Extr-ADN-bases-nitrogenadas.pdf (8).

3. ¿Por qué se incorpora finalmente el alcohol muy frío al medio?

La acción del alcohol

La acción del alcohol es limpiar el ADN de otras biomoléculas a través de la precipitación. En este proceso el alcohol hace que el ADN pierda contacto con las moléculas de agua que lo rodean y lo aísla de la solución acuosa.

Porque la temperatura del alcohol baja

Porque así permite que la membrana exista, y forma complejos de lípidos y proteínas haciéndolos precipitar en la solución de alcohol, y cuanto más frío, mayor es la insolubilidad.

Permite que se precipite el alcohol, para poder visualizar las fibras del ADN.

http://extracciondeadndefrutillab56.blogspot.com/2012/06/el-adn-es-la-sustancia-quimica-donde.html (9).

El ADN es una molécula muy larga y tiende a agruparse. De ahí la facilidad para retirarla. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol ya que el ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol precipita en la interfase entre alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

https://docs.google.com/document/d/1L_FOt4Ov3sGKqF7cm1l3NLCY2S5G2cfPpmkdpOu-Is/edit?pli=1 (10).

.

Conclusiones

Mediante un método especifico casero se pudo obtener ADN y con varios materiales sencillos que utilizamos día a día, ayudan a la obtención de este, ya que cuentan con propiedades que permiten la obtención de este por ejemplo la destrucción de la membrana, disminuyen la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten, conteniendo algunas de ellas enzimas que son unas sustancias que atacan a las proteínas de las células, lo que permite romperlas y separarlas. Permitiendo el aislamiento y obtención del ADN

Bibliografía

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm (1). http://medmol.es/enlaces-de-interes/ (2). http://learn.genetics.utah.edu/es/extraction/detergent.cshtml (3). http://wwww.madrimasd.org/cienciaysociedad/taller/biologia/extraccion-adn/ (4). https://notaminima.wordpress.com/2013/10/24/extraccion-adn/ (5). http://wwww.ehowenespanol.com/utiliza-sodio-extraccion-adn-sobre_100099/

(6). http://www.eurekamuseoa.es/images/stories/AreaEducativa/

RecursosDidacticos/PracticaLaGenetica/PROFESORES_PRACTICA_LA_GENTICA.pdf (7).

http://olimpiadn.educabarrie.org/wp-content/uploads/2015/03/Colegio- Internacional-Extr-ADN-bases-nitrogenadas.pdf (8).

http://extracciondeadndefrutillab56.blogspot.com/2012/06/el-adn-es-la- sustancia-quimica-donde.html (9).

https://docs.google.com/document/d/ 1L_FOt4Ov3sGKqF7cm1l3NLCY2S5G2cfPpmkdpOu-Is/edit?pli=1 (10).

In this esperiment you need to isalate some DNA fron a human test subject

Why you may ask do you need humana ADN

Genetic testing

scientists isolate DNA for a variety of reason some of which include: genetic testing, body identification ,analysis of forensic evidence

DNA extraction is typically the first step in a longer laboratory process

DNA extraction is an important part of that process because the DNA first needs to be purified away from protein and other celular contaminants.

we need cells, because that´s where the DNA is . inside almots every cell in our bodies is a nucleus,and inside each nucleus is about two meters of DNA.

Celula nucleo croosoa histonas adn

So where do we begin? First we need to collect some cells from our test subject.

the skin on the inside of our mouths loses thousands of cells every day. These are the cells we´re after.

let´s get started

the steps you will follow to purify DNA from a cheek swab are shown below.

1. Collect cheek cells2. Burst cells open ti reléase DNA3. Separate DNA from proteins and debris4. Isolate concentrated DNA

here are the materials and equipment you will ned to purify DNA from cheek cells.

drag the swab over to the inside of the test subject´s mounth to collet a simple

next, you´ll place the swab into an eppendorf tuve.lokk closely at the swab. Note thatit is covered whinh hundreds of tiny cheek cell. Inside each cheek cell is a nucleus, and insid nucleus is DNA.

the end of the swab must be cut off so you will be able to close the tuve.Using the micropiprttor, add some lusis solution to the tuve. Lyis is a greek Word that means to separate.

place the tuve into the warm wáter bath. the lysis solution you just added contains two important ingredients: detergent and an enzyme called proteinase K.The detergent disrupts the cell membrane and nuclear envelope, causing the cells to burst open and reléase their DNA.The DNA is still wrapped very tightly around proteins called histones , and the proteinase K cuts apart the histones to free the DNA.the cells have stayed in the warm wáter bath long enough for the DNA to be freed from the cells, and we have removed the swab from the tuve. Add some concentrated salt solution to your tube.

the salt causes proteins and other celular debris to clump together.place the tube into the centrifugein order to balance the centrifuge, a tube containing wáter is placed opposite your tube. Click the lid to closet h centrifuge and turn it on.inside the centifuge, the tube spin around at high speed. The heavy clumps of protein and celular debris to snik to the bottom of the tube,while the strands of DNA remain distributed throungh the liquid.use the micropiprttor to carefully remove the top liquid (which contains DNA) and palce i tinto a clean tube. The proteins and other cllular debris stay behind. add some isopropyl alcohol to the tube.inverting the tube several times mixes the isopropyl alcohol into your DNA solutio. Because DNA is not soluble ( does not stay disolved) in siopropyl alcohol, it comes out of solution. You can now see the clumped DNA with your naked eye.place the tube into the centrifuge and clik on the lid to close it and turn it on. This time, after the simple spins inthe centrifuge, the DNA sinks to the bottom of the tube. once the liquid is removed and the DNA is allowed to dry, yo can re- dissolve it in the solution of your choice. You can store it in the freezer for many years, or you can move on to your next experiment. You have just extracted DNA.Try your hand at DNA extraction using common houshold ítems you can find in your kitchen.