8/19/2019 Genetica de la conservación

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Universidad de Antioquia

Instituto de Biología

Genética de la Conservación

Parcial 2

2015-1

Por:Alejandra María Moreno Sierra - 1.020.393.841

Punto 1.

La policía decomisó un cargamento ilegal de huesos presuntamente de tigres en unaeropuerto. Un análisis de microsatélites reveló los siguientes genotipos (tres loci)para uno de los huesos confiscados. Locus A (110/120); locus B (131/131); locus C(200/200).

Las frecuencias alélicas en las dos poblaciones de referencia son las siguientes:

Locus A Locus B Locus C

 Alelo 110 120 131 133 200 208

India 0.4 0.6 0.9 0.1 0.7 0.3China 0.6 0.4 0.4 0.6 0.5 0.5

Al computar las frecuencias esperadas del genotipo multilocus del cargamento dehuesos en las poblaciones candidatas de India y China, se obtuvieron los siguientesresultados:

Para India: : 2 = 2(0.4 × 0.6) = 0.48 

: = (0.9) = 0.81 

: = (0.7) = 0.49 

Para China: : 2 = 2(0.6 × 0.4) = 0.48 

: = (0.4) = 0.16  :

= (0.5) = 0.25 

Ahora la probabilidad de hallar otro individuo con el mismo fenotipo para cada una delas poblaciones, se halla de la siguiente manera:Para India: 0.48 × 0.81 × 0.49 = 0.19 Para China: 0.48 × 0.16 × 0.25 = 0.019 

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Esto quiere decir que en India hay un 19% de probabilidad de encontrar un individuodiferente con el mismo genotipo que el del individuo de referencia; y, en China sólohabría una probabilidad de 1.9%, esto puede verse reflejado en el hecho de que hayuna mayor homocigotos para los locus B y C en India que en China. De acuerdo con

estas probabilidades encontradas, podría decirse que los huesos de los tigresencontrados tienen una mayor probabilidad de provenir de India que de China, dadala concordancia en los genotipos.

Punto 2.

El efecto fundador puede llevar a cuellos de botella en los cuales se verá afectada ladiversidad genética, dado que la población fundadora es de menor tamaño que lapoblación de la cual proviene. Esta baja diversidad puede llevar a depresión porendogamia y la disminución en la habilidad de que la población fundadora evolucioneen su nuevo ambiente.

El hecho de que especies invasoras que se enfrentan a este tipo de efectos provocadospor los cuellos de botella lleguen a ser exitosas se debe a que en algunas ocasioneséstas especies pueden tener una diversidad más amplia que la encontrada en especiesnativas del ambiente colonizado puesto que estas pueden provenir de una mezcla dediferentes poblaciones de origen. Es decir, que la asociación entre un mayor númerode individuos introducidos y el número de eventos de liberación y la probabilidad deconvertirse en una especie invasiva sugiere que éstas no son tan genéticamentepaupérrimas como se espera. Adicionalmente, algunas plantas pueden contrarrestarestos efectos debido a su reproducción, la cual pude ser asexual por apomixis oreproducción vegetativa, y en ambos casos la depresión por endogamia son evitados

porque la progenie es idéntica genéticamente a las plantas parentales. Además,muchas plantas son polipoloides y pueden autofecundarse y la variación genética esmantenida a través de la fijación de la heterocigosis. [1].

Cuando una especie es introducida a un nuevo ambiente, ésta debe enfrentarse con laadaptación local. En algunos casos las especies invasoras logran desplazar yreemplazar a las especies nativas. Existen varias explicaciones acerca de cómo lasespecies invasoras logran establecerse, desplazar y reemplazar a las nativas, una deellas es que estas especies pueden ser intrínsecamente mejores competidores, puestoque evolucionaron en ambientes más competitivos. También puede presentarse queen éste nuevo ambiente no hallan depredadores de estas especies como ocurre por

ejemplo con el pez León en las costas colombianas, permitiendo la reproducción y conello el desplazamiento de las especies nativas. Adicionalmente, las adaptaciones de lasespecies nativas generalmente son ocasionadas por eventos que ejercen una granfuerza de selección sobre ellas, sin embargo, estos pueden ser a largo plazo mientrasque las especies invasoras pueden ser capaces de superar a las especies nativasdependiendo de su capacidad de adaptación la cual puede estar dada en pocasgeneraciones. [1].

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Punto 3.

Algunos estudios indican que los clones pueden ser fisiológicamente normales yaparentemente saludables, hay otras observaciones y reportes en la literatura de

fenotipos anormales asociados que vienen a aparecer durante las fases juveniles yadultas de la vida. La incidencia de estas anormalidades puede variar dependiendo dela especie particular, el genotipo o tipo de célula, o de acuerdo a aspectos específicosde la transferencia nuclear y los protocolos de cultivo utilizados. [2].

El síndrome de la descendencia clonada es un continuo, en que los fenotipos letales yanormales pueden ocurrir en cualquier fase del desarrollo, dependiendo al grado dedesregulación de genes clave, debido presuntamente a errores fundamentales en lareprogramación epigenética. Incluso clones aparentemente normales pueden tenerregulación anormal de muchos genes que son también sutiles del resultado de unfenotipo obvio. [2].

El acortamiento en los telómeros evidenciados en la clonación de la oveja Dolly,debido al envejecimiento de las células somáticas que se van a acortando a medidaque éstas se reproducen, pueden llevar a un envejecimiento prematuro y muerte delclon, sin embargo, otros estudios han sido contradictorios con respecto a la longitudde los telómeros en los clones, con informes de la restauración a la normalidad en elganado y ratón. En la clonación de ratones se ha encontrado su vida recortada un 50%debido a neumonía y fallas hepáticas. [2].

La evidencia de un sistema inmune comprometido es un fenotipo observado en el clonde algunas especies. Indicadores directos de una respuesta inmune reducida son la

aplasia tímica que se ha documentado en el ganado bovino clonado y niveles másbajos de producción de anticuerpos en ratones clonados y de citoquinas en cerdosclonados Esto puede aumentar su susceptibilidad a la infección y la enfermedad. Laincidencia de enteritis, infecciones umbilicales y respiratorias se ven aumentadas enganado clonado. [2].

Otras anomalías observadas incluyen defectos en los sistemas cardiovascular,musculo esquelético y neurológico, así como la susceptibilidad a las infeccionespulmonares y trastornos digestivos. La hidronefrosis es particularmente común en elganado ovino, con los niveles de urea en suero elevadas correspondientes a algunosclones sobrevivientes. [2].

Punto 4.

Protocolo.

o  Colección de muestras.

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El oso de anteojos está clasificado como carnívoro, sin embargo presenta una dietaomnívora, predominando hierbas y frutos. Dentro de su dieta se encuentranbromelias, frutos de ericáceas, pseudobulbos de orquídeas, maíz, frutos de achupayas,sauce, tuna, entre otras. [3].

Sus heces fecales pueden ser evaluadas por medio de observación intensiva yrealizando comparaciones hechas con fotografías recopiladas en Figuero y Stucchi1 [4], además de las fotografías reportadas por Caselli [3], en las cuales se puedenidentificar heces líquidas, semilíquidas, pastoza y en bloques. Esto con el fin deasegurar que las muestras de heces fecales tomadas son de osos de anteojos y no deotros mamíferos mayores que se puedan encontrar en el área geográfica de estudio,adicionalmente con el fin de garantizar una mayor fidelidad en las recolecciones sedebe tener en cuenta las especies que pueden ser encontradas en el lugar y qué tanparecida podrían ser las muestras fecales de éstas con respecto al del oso de anteojos.

Durante la colección de heces se deben tener en cuenta que las heces deben ser lo másfrescas posibles y que sólo se busca la parte exterior de éstas puesto que fue la últimaque estuvo en contacto con la pared intestinal.

o  Conservación y transporte de las muestras fecales.

Existen varias formas para inactivar enzimas, pero éstas son usualmente costosas orequieren de reactivos que generalmente no están disponibles para muchos biólogos yveterinarios de campo. Sin embargo, prevenir la actividad de las ADNasas es muchomás fácil y se consigue generalmente al deshidratar la muestra. Dos formas de hacerloson:

1. Deshidratación de la muestra con silica gel u otro desecante.2. Deshidratación de la muestra con etanol (70 – 100%). A menor concentración másfácil su transporte, porque es menos inflamable. Sin embargo, a menor concentración,mayor será la degradación del ADN. Por eso no se recomiendan concentracionesinferiores al 70%. [4].

Es importante evitar la contaminación de las muestras, por lo tanto lo mejor es notomar las muestras con las manos desnudas. En este caso puede valerse de espátulasestériles y guantes, en caso tal de no tener estos instrumentos a la mano puede optarpor ayudarse con una pequeña rama con el fin de ayudar a impulsar las heces dentro

de los tubos para su posterior transporte.

1 Éste libro es mencionado en el artículo: Márquez, Gisella & Pacheco, Victor. (2010). Nuevas evidenciasde la presencia del Oso Andino (Tremarctos ornatus) en las Yungas de Puno, el registro más austral dePerú. Revista Peruana de Biología. 17:3. Lima-Perú. Disponible en:http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=S1727-99332010000300014&script=sci_arttext. Sinembargo, no es posible su visualización directa pues exige la compra de éste.

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Para estos casos puede hacer uso de tubos Falcon de 50 a 100mL, este material debeestar esterilizado previamente. Una vez haya introducido las heces en el contenedorcorrespondiente procede a cubrir la muestra con el etanol o con la sílica;adicionalmente, es importante mantener una cadena de frío de 4ºC hasta que se llegue

al laboratorio para el estudio de la muestra en donde deberá almacenarse a -20ºC. [3].

Es importante que las muestras se encuentren etiquetadas con un número dereferencia, la fecha de colección, la localidad y la especie. También pueden tomarsedatos adicionales como la ubicación exacta por medio del GPS y el nombre delrecolector, así como otras notas que considere de importancia.

o  Extracción de ADN. 

  Tomar de 1 a 1.5 g de heces y depositarlas en un tubo de centrífuga de 15 mL.  LLevarlas a vórtex y lavarlas utilizando 5 mL de etanol, centrifugar a 4000xg

por 2 minutos. Descartar el sobrenadante.  Se repite el lavado utilizando 5 mL de TE (10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8).  Adicionar al tubo de centrífuga 3 mL de TNE (10 mmol/L Tris-Cl, 0.5% SDS, 1

mmol/L CaCl2) y 50 µL de proteinasa K (20mg/mL) para la digestiónenzimática y fue llevar a incubación a 55ºC por 1-2 h.

  Centrifugar nuevamente a 4000xg por 1 minuto.  Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga con 3g de almidón de

papa, llevar a vortex por 1 minuto e incubar por un minuto a temperaturaambiente. Centrifugar nuevamente a 8000xg por 3 minutos con el fin deprecipitar el almidón.

  Pipetear 600µL de sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 2mL,adicionar 150 µL de solución de NaCl (3.5 mol/L) y 250 µL de solución de CTAB(0.7 M NaCl, 10% cetil trimetil- bromuro de amonio CTAB) seguido deincubación a 70ºC por 10 min.

 

Extraer la mezcla utilizando dos veces un volumen igual defenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1).

 

Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y adicionar un volumen igual debuffer (4M hidroclorato de guanidina, 1M de acetato de potasio, pH 5.5),mezclar y aplicar a una columna de centrifugación y centrifugar a 6000xg por30 segundos.

 

Lavar el filtrado por centrifugación (8000 xg, 1 min) dos veces, usando 750µL

de etanol al 75%. El DNA se eluye con 200 µL TE y 50 µL/mL de RNasa.2

 [5].

2  Este protocolo de extracción de ADN fue tomado de la consulta realizada previamente para lapurificación de heces, se decidió utilizar este mismo protocolo puesto que éste fue probado en variosmamíferos consiguiendo una mejor calidad del material genético de las heces estudiadas

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o   Amplifiación del ADN por PCR. 

De acuerdo con el protocolo utilizado por Caselli (2012), se pueden amplificar dosgenes: el gen amelogenina y el gen SRY, utilizando los primers SE47 y SE48 para los

segmentos del gen amelogenina presente en los cromosomas sexuales X e Y. Para elgen SRY se pueden emplear los primers SRYB3 y SRYB5 presente en los cromosomasY. Para realizar la amplificación se pueden utilizar diferentes kits como el KitMultiplex (Qiagen).[3].

o  Electroforesis. 

Los productos de la PCR se diluyen con buffer loading a razón de 5:1 y se depositan enun volumen final de 20μl en un gel de agarosa al 3% a 100 voltios hasta el final delcorrido. Se puede utilizar un marcador de 100bp para corroborar los tamaños de losalelos.

Utilizar un sistema de electroforesis horizontal para la verificación de la amplificaciónde los productos de la PCR.

o  Sexaje. 

La electroforesis deberá mostrar las bandas correspondientes al genotipo encontradopara cada una de las muestras estudiadas. Los resultados para el gen amelogeninadeberá mostrar dos bandas de 245 pb para el genotipo hembra correspondientes a loscromosomas XX, mientras que en los machos se encontrarán dos bandas una de 245pb y otra de 191 pb correspondientes a los cromosomas X e Y respectivamente.

Con respecto al gen SRY sólo mostrará una banda de aproximadamente 163 pbcorrespondiente al cromosoma Y que sólo se posee por el macho, sin embargo, estemarcador es poco informativo pudiendo dar falsos positivos.[3].

o  Identificación de especies. 

Una vez realizada la identificación entre machos y hembras, estos datos pueden serutilizados para identificar la distribución geográfica de estos en el lugar de estudio,teniendo en cuenta los datos colectados inicialmente del sitio de colección demuestras y de esta manera conocer más acerca de ciertos hábitos relacionados con la

ecología del animal como hábitos reproductivos, entre otros.

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Bibliografía

[1]. Allendorf FW y Luikart GH. Conservation and the Genetics of Populations.

Blackwell Publishing. 2007.

[2]. Wells, D.N. (2005). Aminal cloning: problems and prospects. Scientific andTechnical Review of the Office International des Epizooties. 24:1. Paris. Pág. 251-264.Consultado el 08 de agosto de 2015. [Internet]. Disponible en:http://vet.hcmuaf.edu.vn/data/file/application%20of%20biotechnology%20of%20animal%20health%20and%20production%20/Animal%20cloning%20problems%20and%20prospects.pdf

[3]. Caselli, Cristina Sofía. (2012). Sexaje molecular a partir de heces en osos deanteojos (Tremarctos ornatus). Tesis para optar el Título profesional de Médico

Veterinario. Univesidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima-Perú. Consultado el 08de agosto de 2015. [Internet]. Disponible en:http://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/3754/1/Caselli_sc.pdf

[4]. Figueroa J. & M. Stucchi. (2009). El oso andino: alcances sobre su historianatural. Asociación para la Investigación y Conservación de la Biodiversidad-AICB.Primera edición. Lima-Perú. Pág. 13-18.

[5] 

ZHANG. Bao-Wei, LI. Ming, MA. Li-Chao, WEI. Fu-Wen. (2006). A Widely ApplicableProtocol for DNA Isolation from Fecal Samples. Biochemical Genetics, Vol. 44, 11-12.[Internet]. Consultado el 11 de julio de 2015. Disponible en:

http://download.bioon.com/view/upload/month_0808/20080803_b522fd29733287cdd0d12UxVmnKRNZ9k.attach.pdf