GENETICA MOLECULARGENETICA MOLECULAR

Dra. Dania Guerra Dra. Dania Guerra

Uno de los objetivos fundamentales de la genética medica y humana es comprender a nivel molecular la base de las mutaciones que generan enfermedades genéticas y utilizar dicha información para mejorar los métodos diagnósticos y de tratamiento de estos trastornos

¿COMO OBTENER GRANDES CANTIDADES DE ADN EN FORMA PURA PARA ANÁLISIS MOLECULAR?

Mediante el proceso de clonación molecularclonación molecular que consiste en aislar la secuencia de ADN que nos interesa y obtener múltiples copias de ésta introduciéndolo en un organismo, que es usualmente una bacteria (en vivo) o por procedimientos como la PCR (en vitro)

CLONACIÓN MOLECULARCLONACIÓN MOLECULAR

Para poder clonar un fragmento de ADN es necesario:

-Aislar el fragmento que queremos clonar

-El vector, que es el organismo donde vamos a recombinar el ADN foráneo, y este se va a multiplicar dentro de otro organismo

-El hospedero que generalmente es una bacteria, capaz de garantizar la multiplicación del vector en su interior

-Enzimas necesarias para el proceso: las endonucleasas de restricción y la ligasas

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Las endonucleasas de restricción bacterianas son enzimas que reconocen secuencias de doble cadena especificas, generalmente cortas en el ADN y lo cortan en el sitio especifico de reconocimiento o cerca de este y dejan un segmento pegajoso monocatenario capaz de unirse a su segmento complementario facilmenteEjemplo la enzima de restricción EcoR1 reconoce la secuencia especifica de 6 pares de bases

Enzima de restricción EcoR1

ELECTROFORESIS

Una vez fragmentados los segmentos de ADN pueden visualizarse ya que estos migran en un gradiente eléctrico que tiene como soporte un gel, con una velocidad inversamente proporcional a su tamaño, por lo que los mas pequeños “corren” con mas rapidez. Al finalizar la corrida el gel se lava y se tiñe con un colorante que se introduce entre las dos hélices del ADN (bromuro de etidio) y que tiene la capacidad de absorber la luz ultravioleta emitiendo una luz anaranjada, que permite identificar los diferentes fragmentos de ADN

Un VECTOR es una molécula de ADN que se replica de una manera autónoma en un hospedero, tales como bacterias o levaduras, de la cual puede ser aislada en forma pura para su análisis Vectores mas frecuentes:

Plásmidos Moléculas de ADN circular de tamaño pequeño o moderado que se encuentran presentes normalmente en algunos microorganismos , a los cuales favorecen en alguna función

BacteriófagosSon de mayor tamaño por lo que trasportan mayor cantidad de ADN foráneo e ingresan a la célula bacteriana de manera mas eficiente

INCLUSIÓN DEL ADN EXTRAÑO EN EL VECTOR

EL FRAGMENTO DE ADN EN CUYO EXTREMO ESTANLAS 4 BASES SE HIBRIDIZA CON EL EXTREMO DE 4BASES DEL ADN DEL PLASMIDO POR ACCION DE LADNA LIGASA

El hospedero es generalmente la bacteria E. Coli

GENOTECA GENOMICA

Si el ADN de un organismo es sometido a la acción de una enzima de restricción, se forman numerosos fragmentos, estos fragmentos pueden ser ligados a un vector que se trato con la misma enzima, de forma que se produce una colección de moléculas del vector que llevan todos los tipos de fragmentos, esta colección se denomina GENOTECA GENOMICA

Materialmente es un conjunto de placas de Petri (20 o mas) con cultivos en los que cada colonia tiene un fragmento de ADNComo solo el 10% del genoma es ADN de copia unica (exones de los genes) es mas util construir una genoteca a partir de ARNm o genotecas de ADN complementario

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASAREACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

Esta técnica fue descrita por Kary Mullis en 1980 y consiste en la amplificación exponencial de un fragmento especifico de ADN

Se requiere: -Dos oligonucleotidos pequeños (primers o cebadores) que son complementarios a cada uno de los extremos del ADN matriz o templado que se quiere amplificar-La enzima polimerasa termoresistente, la Tac polimerasa-los 4 dexoinucleotidos que se incorporan al nuevo ADN-Un buffer a PH 8.5 + Cloruro de Magnesio

Esta mezcla se coloca en un termociclador, equipoque calienta y enfría rápidamente los tubos en los ciclos programados

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASAREACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

APLICACIONES DE LA PCR

METODOS DE ANALISIS DEL DNAMETODOS DE ANALISIS DEL DNA

Los métodos para identificar una determinada secuencia de ADN o ARN se basan en su propiedad de HIBRIDAR, es decir la propiedad de la cadenas simples de nucleótidos de unirse con a una cadena estrictamente complementaria de bases

Es necesario disponer de una secuencia conocida (cadena simple) que esta rotulada con un marcador , radiactivo o no, esta recibe el nombre de SONDA y puede proceder de múltiples fuentes:Secuencias de ADN genómico aleatoriasSecuencias de ADNc complementario Genes específicosSecuencias de oligonucleotidos obtenidas mediante síntesis basada en la secuencia de la proteina

Métodos: Southern Blot, Northern Blot y Western

TECNICA DE SOUTHERN BLOTTECNICA DE SOUTHERN BLOT

1. Se somete el ADN a digestión con una enzima de restricción

2. Se realiza una electroforesis en gel de agarosa separando los fragmentos de restricción por tamaños

3. Se desnaturalizan los fragmentos del gel mediante tratamiento con álcalis, convirtiéndolos en fragmentos de hebra simple

4. Se coloca una membrana de nitrocelulosa o nylon sobre el gel y se comprime, de manera que una alicuota de los fragmentos se pegan a la membrana ( como una impronta, huella= blot en ingles

5. Esta membrana se trasfiere a una solución con la sonda y si existe una secuencia complementaria la hibridación se visualiza colocando la membrana lavada y seca se adhiere a una placa fotográfica que es revelada

IMPRONTA O HUELLA DE SOUTHERN ( SOUTHERN BLOT)IMPRONTA O HUELLA DE SOUTHERN ( SOUTHERN BLOT)

SECUENCIACION

El conocimiento de la secuencia del ADN aporta información sobre la naturaleza de las mutaciones especificas, la función del gen y la similitud con otros genes conocidos.

El método de secuenciación enzimático inventado por Frederick Sanger se basa en el uso de dideoxinucleotidos de terminación de cadena, estos son similares a los deoxinucleotidos normales solo que han perdido un grupo hidroxilo y esto impide la formación de nuevos enlaces fosfodiester con las bases del DNA libre

Los dideoxinucleotidos se incorporan a la hélice en formacion , pero una vez incluidos no pueden incorporarse nucleótidos adicionales y se detiene la sintesis

SECUENCIACION

El cebador híbrida en la posición complementaria adecuada y la DNA polimerasa añade las bases libres a la molécula de DNA en formación, pero una vez que se incorpora un dideoxinucleótido, la cadena termina. Así se producen fragmentos de longitud variable que terminan en el mismo dideoxinucleótido

Para realizar la secuenciación se requiere los cuatro dideoxi correspondientes a los nucleótido normales A, T, C, G, el ADN de cadena simple cuya secuencia queremos determinar, la enzima DNA polimerasa, los cebadores marcados radiactivamente, los nucleótidos normales

SECUENCIACION

Se corren cuatro reacciones de secuenciación diferentes, una para cada base. Se realiza una electroforesis con los fragmentos obtenidos de cada reacción , que se colocan de forma adyacente en el mismo gel para que se pueda comparar la posición de cada fragmento, dado que cada banda corresponde a una cadena de ADN con una única base en su extremo, la secuencia del ADN puede ser leída observando el orden de las bandas en el gel tras de realizar una autoradiografía

SECUENCIACION AUTOMATIZADA

-Cada uno de los cuatro nucleótidos se marca con un fluorocromo que emite luz en un espectro distinto

-Los productos de la reacción se someten a electroforesis y a medida que se desplazan por una ventana, son excitados por un haz de luz láser

-La luz que emiten es captada por una cámara digital, que la traduce a una señal electrónica, generándose una imagen compuesta del gel

-Obteniéndose un grafico , en el que cada uno de los cuatro nucleótidos esta representado por un pico de distinto color

SECUENCIACION

TECNOLOGIA PARA EL DIAGNOSTICO MULTIGENICO O GENOMICOTECNOLOGIA PARA EL DIAGNOSTICO MULTIGENICO O GENOMICOMICROARREGLOS DE ADNMICROARREGLOS DE ADN