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2 evaluaciones, 2 fechas de cada uno:-Son equivalentes!, no hay distinción entre las fechas-Se puede utilizar ambas fechas para mejorar la nota

1 evaluación parcial de TPs

Régimen de promoción tal como lo establece la Universidad !

al menos 6 en cada evaluación yel promedio de ambas debe dar al menos 7

Bases moleculares de la HerenciaLas primeras preguntas de la herencia

Aristóteles (384-322 AC) Ambos padrescontribuyen a la creación de los hijos através de la mezcla de sangres ohumores.

Herencia mezcladora:

•mezcla de caracteres de los padres en cada generación

•explica que los miembros de una especie se parezcan

Kirk y Michael Douglas

Analiza la herencia de características simples en arvejas

La herencia se debe a elementos discretos que no se mezclan y aparecen en proporciones estables y repetibles

1865 Gregor Mendel

Las reglas de la herencia

Diferencias entre ARN y ADN

Estructura de los nucleótidos

Enlaces entre nucleótidos

Estudia células blancas presentes en pus de vendas

de heridas abiertas.

• Obtiene un precipitado de núcleos, del que aisla

una sustancia rica en fósforo que llamó nucleína

• Esta sustancia se aisla de distintos tipos de células

• Está compuesta por H N C y OFriedrich Miescher

1869

Phoebus Levene

1905-1939

• La nucleína contiene proteínas y porciones noproteicas (ácidos nucleicos).• Los ácidos nucleicos se pueden descomponer enazúcares y compuestos ricos en nitrógeno (purinasy pirimidinas).Albrecht Kossel

1881

¿ Qué evidencias experimentales indican que los

ácidos nucleicos están asociados a la información

genética?

Las Primeras evidencias

rugosas

Lisas virulentas

1928: Frederick Griffith Infección con pneumococos

El ADN como principio transformante

Avery, MacLeod & McCarty (1944)

Determinaron que el ADN es el material genético en el bacteriófago T2

Alfred Hershey y Martha Chase (1952)

La naturaleza química de los ácidos nucleicosLa naturaleza química de los ácidos nucleicos

Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos

nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes

principales:

•Azúcar, en concreto una pentosa.

•Ácido fosfórico

•Bases nitrogenadas: púricas y

pirimidínicas

Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son: •Hipoxantina, •Xantina, •2-metiladenina,•6-metil-aminopurina.

Entre las bases pirimidínicas podríamos citar la 5-metilcitosina (propia del ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares.

En los ARN de transferencia (ARN-t) se encuentran la Ribotimidina, Dihidrouridina, Seudouridina e Inosina (I).

Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs.

Base Nitrogenada

Nucleósido Nucleótido

Adenina Adenosina Ácido Adenílico

Guanina Guanidina Ácido Guanílico

Citosina Citidina Ácido Citidílico

Timina Timidina Ácido Timidílico

Uracilo Uridina Ácido Uridílico

Algunas bases pueden ionizarse a bajo o alto pH

Adenosina pKa = 3.8

Citidina pKa = 4.5

Guanosina pKa = 2.4 Guanosina pKa = 9.4

Las bases están sujetas a tautomerización

La estructura del ADNLa estructura del ADN

•La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = T . La relación entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T = 1). •La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La relación entre Guanina y Citosina es igual a la unidad ( G/C=1). •La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C). La relación entre (A+G) y (T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1. •Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) era característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos no eran la repetición monótona de un tetranucleótido. Existía variabilidad en la composición de bases nitrogenadas

REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HÉLICE

Procedencia del ADN A G C T 5-Me-C

Timo de Bovino 28,2 21,5 21,2 27,8 1,3

Esperma de bovino 28,7 22,2 20,7 27,3 1,3

Germen de trigo 27,3 22,7 16,8 27,1 6,0

Saccharomyces 31,3 18,7 17,1 32,9 -

Escherichia coli 26,0 24,9 25,2 23,9 -

Mycobacterium tuberculosis 15,1 34,9 35,4 14,6 -

ØX174 24,3 24,5 18,2 32,3 -

T3 23,7 26,2 27,7 23,5 -

T5 30,3 19,5 19,5 30,8 -

T7 32,4 18,3   32,4 17,0 HMC

Virus ARN A G C U

Mosaico del tabaco (TMV) 29,8 25,4 18,5 26,3

Mosaico amarillo nabo 22,6 17,2 38,0 22,2

Poliomielitis 28,6 24,0 22,0 25,4

Encéfalo miocarditis del ratón 27,3 23,5 23,2 25,9

Reovirus Tipo 3 28,0 22,3 22,0 27,9

Tumor de las heridas 31,1 18,6 19,1 31,3

2 Cadenas enrolladas sobre el mismo eje formando una doble hélice a la derecha

• El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa alternantes está expuesto al agua del ambiente

• El anillo de furanosa está en la conformación C-2´endo

• Las bases están apiladas en el interior de la doble helice, con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice

• El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la superficie de la doble hèlice

G C A T

Fuerzas que estabilizan la doble hélice

• Enlaces de hidrógeno (pequeña contribuión)

• Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica

• Interacciones iónicas:

Repulsión entre las cargas negativas de los fosfatos

Los cationes actúan como contraiones estabilizando el ADN

(divalentes mas eficientes que monovalentes; el Mg+2 estabiliza la

estructura del RNA

ADN-B: ADN en disolución, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones con baja fuerza iónica se corresponde con el modelo de la Doble Hélice.  ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11 pares de bases por giro completo y 26 A de diámetro. Es interesante por presentar una estructura parecida a la de los híbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento ARN-ARN. ADN-Z: doble hélice sinistrosa (enrollamiento a izquierda), 12 pares de bases por giro completo, 18 de diámetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de bases púricas y pirimidínicas (GCGCGC), debido a la conformación alternante de los residuos azúcar-fosfato sigue un curso en zig-zag. Requiere una concentración de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las proteínas que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos básicos sería posible que algunas convirtieran segmentos de ADN-B en ADN-Z.

La estructura del híbrido DNA-RNA es la de una doble hélice con las características generales de un A-RNA, o del A’-RNA. Típicamente se detectan 11-12 pares de bases por vuelta de hélice.

Agentes intercalantes

• Moléculas aromáticas que interaccionan con el ADN insertándose entre bases apiladas

• Fluorescentes

Detección de DNA y RNA• Agentes mutagénicos

Acridine orange

Ethydium bromide

Apareamiento tipo Hoogsteen

Estables a pH bajos (C+,pKa= 7.5)

ADN triple hélice o ADN-H: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. Este oligonucleótido se une a pares de bases A-T y G-C mediante enlaces de hidrógeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del oligonucleótido y los pares A-T y G-C de la doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos.

ADN cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucarióticos (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem  una secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática. Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P  TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG  3'OH

DENSIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOSDensidad: existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del

ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN.

                                      

                           

                                         

                          Cuanto mayor es el contenido en (G+C)

mayor es la densidadBasándose en múltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Está fórmula es la siguiente: ρ = 1,660 + 0,00098(G+C).  

Desnaturalización del ADNDesnaturalización del ADN

¿Qué es?

¿Qué agentes desnaturalizantes existen?

¿cómo actúan?

¿Cómo la ponemos de manifiesto?

•Fuerza iónica•Agentes caotrópicos•Agentes formadores de puentes de hidrógeno

Para DNA:DNA duplex:Para DNA:DNA duplex:

Tm = 81.5Tm = 81.5oo + 16.6 log M + 41 (fraccion + 16.6 log M + 41 (fraccion

molar G+C) - 500/L -0.62 (%formamida) molar G+C) - 500/L -0.62 (%formamida) Para oligonucleotidosPara oligonucleotidos (menores a 20 (menores a 20

nt en 0.9M NaCl) nt en 0.9M NaCl)

TdTd((ooC) = 4 (G + C) + 2 (A + T) C) = 4 (G + C) + 2 (A + T)

For probes >150 ,Tm decreases 1o for every 1% mismatch.For oligonucleotides Td decreases 5o for every mismatch.

La hibridación de ANs posee múltiples La hibridación de ANs posee múltiples usosusos

Southern blot /Northern blotSouthern blot /Northern blot Colony blotingColony bloting PCRPCR PurificaciónPurificación MicroarraysMicroarrays FISHFISH

Condiciones que favorecen la desnaturalización

•Alta temperatura

•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)

•Alto pH (desprotonación de bases)

Monitoreo de la desnaturalización

•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm

Nucleótidos libres> ssADN> dsADN

•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm

•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitudLa Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud

•La condición standard es 0.12 M buffer fosfato de sodio (0.18 M en ion sodio

DESNATURALIZACION POR CALORDESNATURALIZACION POR CALOR

•Oligonucleótidos cortos

Tm = (A+T)x2oC + (C+G)x4oC

•Oligonucleótidos largosTm = 81.5 +16.6Log [Na+]+ +0.41 (%CG) – 625/N

N –length of oligo

Hidrólisis de ácidos nucleicosHidrólisis de ácidos nucleicos

Ruptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídicoRuptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídico Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y

desoxiribosa (producto: ac. apurínicodesoxiribosa (producto: ac. apurínico Hidrólisis alcalina (Hidrólisis alcalina (RNA)RNA)– clivaje del enlace fosfodiester– clivaje del enlace fosfodiester

RenaturalizaciónRenaturalización La desnaturalización es un proceso reversibleLa desnaturalización es un proceso reversible Reanealing – reasociación de las cadenas de ADNReanealing – reasociación de las cadenas de ADN

La reasociación de ADN no repetido se produce en un La reasociación de ADN no repetido se produce en un rango de 2-logrango de 2-log

Cinética de renaturalizaciónCinética de renaturalización

Definición de CotDefinición de Cot1/21/2: función inversa de la : función inversa de la

constante de velocidad (constante de velocidad (kk))

tkCc

c

00 1

1

CC00t t ½ ½ :: valor de Cvalor de Coot cuando se t cuando se

reasoció un 50%reasoció un 50%

1)1(2

10 tkC

tkC01

1

2

1

2)1( 0 tkC

1120 tkC

ktC

12/10

¿Complejidad del Genoma ?

¿Qué es?

AAAAAAAAAAAAAAAA

ATATATATATATATATA

ATCATCATCATCATCA

C= 1; L=16

C= 2; L=16

C= 3; L=16

ATCGCTAGAACGTCTG C= 16; L=16

Curvas de reasociación de ADN no repetitivoCurvas de reasociación de ADN no repetitivo (fragmentos de 500 nt)(fragmentos de 500 nt)

If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp)If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp)N (genome size) is determined directly from CN (genome size) is determined directly from C00tt1/21/2

C = NC = N

(N)(N)

106

repeats

3 genes

200 genes ≈ 4,000

genes

≈ 10,000 genes

CC00tt1/21/2

Reasociación para EucariotesReasociación para Eucariotes

> 2 logs: diferentes poblaciones> 2 logs: diferentes poblaciones

≈ 25-30% Moderadamente Repetitivo 350 copias

≈ 45-55% Copia única

≈ 20-25% altamente repetitivo: 2x106 copias

Leer del Lodish!!!!Leer del Lodish!!!!

¿Qué representan las secuencias únicas, ¿Qué representan las secuencias únicas, moderadamente repetidas y altamente moderadamente repetidas y altamente repetidas???repetidas???

Empaquetamiento del ADN Eucariota

En el genoma humano tenemos 3 x 109 bp distribuidos en 23 cromosomas

La forma B-DNA ocupa 3.4 A/bp

Debemos empaquetarlo en un núcleo con un diámetro de 5 m (10.000 veces)

El DNA durante la interfase se encuentra condensdo formando un complejo nucleoproteico denominado cromatina

La longitud total del ADN celular humano es de 2 metros!!!

Chromatin Proteins

Chromatin proteins 1. Histone Proteins (small, positively charged—rich in lysine and arginine residues) Core histones: H2A, H2B, H3, H4 Linker histone: H1 2. Nonhistone chromosomal proteins

El ADN se enrolla alrededor del núcleo histónico: Nucleosomas2 H2A2 H2B2 H32 H4

Nucleosomes-Contain a histone core octomer + 146 bp core DNA-Spaced ~200 bp apart(146 bp core DNA + 20-60 bp linker DNA)

“Beads on a String”

-Core DNA is protected DNases

La Histona H1 une 2 hélices de ADN

30-nm Fiber

2 Modelos para la fibra de cromatina de 30-nm

Un modelo de la estructura del cromosoma

DNA exists in chromatin form during interphase

DNA in most compact form (chromosomes) during metaphase of mitosis

¿Qué es el superenrollamiento?

Qué es el superenrollamiento?

El superenrollamiento se produce en casi todos

los cromosomas (circular o lineal)

Relajado vs Superenrollado

El ADN relajado no está superenrollado

En el superenrrolamiento negativo el ADN está subenrollado (favorece el desapareamiento de la doble hélice (el ADN circular aislado de células siempre se encuentra superenrollado negativamente

Linking Number (L or Lk) = número de veces que dos cadenas están entrelazadas

Twists (T or Tw) = número de vueltas de hélice

Writhes (W or Wr) = número de veces que el dúplex se entrecruza consigo mismo

L = T + WL = T + W

L = T + W

T = +3 T = +2 T = +1T = +0W = +0 W = +1 W = +2 W = +3

T = –3 T = –2 T = –1T = –0W = +0 W = –1 W = –2 W = –3relaxed

relaxed

Qué hacen las topoisomerasas?

1. Cambian el linking number de la molécula de ADN mediante:A) Cortando una o ambas cadenas y luego,B) Enrollarlas mas o menos y uniendo nuevamente los extremos.

2. Usualmente relajan el ADN superenrollado

Type I Topoisomerases

Topo I from E. coli 1) acts to relax only negative supercoils2) increases linking number by +1 increments

Topo I from eukaryotes 1) acts to relax positive or negative supercoils2) changes linking number by –1 or +1 increments

Maximumsupercoiled

3 min.Topo I

25 min. Topo I

Relaxation of SV40 DNA by Topo I

Type II Topoisomerases

All Type II Topoisomerases Can Catenate and Decatenate cccDNA molecules

Circular DNA molecules that use type II topoisomerases:

E. coli Eukaryotes-plasmids -mitochondrial DNA-E. coli chromosome -circular dsDNA viruses (SV40)

An E. coli Type II Topoisomerase: DNA Gyrase

Topo II (DNA Gyrase) from E. coli 1) Acts on both neg. and pos. supercoiled DNA2) Increases the # of neg. supercoils by increments of 23) Requires ATP

Sample Linking Number Questions

1) You have a relaxed 5,500 bp plasmid DNA molecule,which you treat with DNA gyrase to add 50 negative supercoils

A. How many helical turns are there in the relaxed molecule? B. What is the linking number of the molecule after treatment with DNA gyrase?

A. 5500 bp X 10 bp/turn = 550 turns

B. L = T + W = 550 – 50 = 500

•Virus cuyo material hereditario es ADN. •Virus cuyo material hereditario es ARN. •Virus cuyo material hereditario es ARN-ADN. •Virus cuyo material hereditario es ADN-ARN.

LOS CROMOSOMAS DE VIRUS: CLASIFICACIÓNLOS CROMOSOMAS DE VIRUS: CLASIFICACIÓN

Los virus pueden clasificarse en:

•Bacteriofagos o fagos: virus que parasitan a bacterias

•Virus Animales.

•Virus vegetales

Considerando el tipo de organismo que parasitan

Desde el punto de vista genético

VIRUS CUYO MATERIAL HEREDITARIO ES ADN

VIRUS ADN

Tipo de Molécula Tipo de HéliceTipo de virus según

huésped.Familia de virus

Circular

SencillaFago

ØX174 M13

Animal Parvovirus

Doble Animal

Papovavirus (SV40, polioma)

Adenovirus Herpetovirus (Herpes)

Poxvirus (viruela) Iridovirus (peste

porcina)

Lineal Doble FagoExtremos cohesivos:

Fago Ø80, 434, P2, 186) Redundancia terminal: serie T-par,

T3 y T7  

                                                                                                                              

Fago filamentoso

M13

                                                                                                                                                                                                         

Esquema del bacteriofago

M13

                                                                                                                              

Fago filamentoso

M13

                                                                                                                                                                                                         

Esquema del bacteriofago

M13

                                                                                                                              

Fago filamentoso

M13

                                                                                                                                                                                                         

Esquema del bacteriofago

M13

Ha sido empleado ampliamente en estudios sobre la replicación del ADN

•tienen una cápside poliédrica •molécula de ADN circular de hélice sencilla (hebra +) con 5.400 nt

•forma replicativa duplex

de la hebra - se sintetiza el ARN mensajero que se traducirá para producir las proteínas de la cápside

ØX174

El bacteriofago M13 tiene una cápside de tipo filamentoso dentro de la cual se encuentra una molécula circular de ADN de hélice sencilla de 6.400 nucleotidos. Al igual que ØX174, también pasa por una forma replicativa dúplex.

Fago filamentoso M13Fago filamentoso M13

SV40 (Papovavirus)

tiene una cápside icosaédricaADN circular doble hélice de 5.243 pares de nucleotidos.

Su ADN se asocia con las histonas de la célula huésped

El fago posee una cápside icosaédrica con una cola. Dentro de la cápside existe una molécula de ADN doble hélice lineal con 48.000 pares de bases.

fago

fagos de la serie T

cápside icosaédrica con cola que encierra en su interior ADN doble hélice lineal (aproximadamente 166.000 pb).

Presentan redundancia terminal: repetición de una secuencia de 2.000 a 6.000 bp en los dos extremos

LOS CROMOSOMA DE LAS BACTERIAS: ORGANIZACIÓN EN DOMINIOS

la primera evidencia citológica se obtuvo más tarde (Cairns, 1963) marcando radiactivamente el ADN, realizando una autorradiografía y analizando los resultados al microscopio óptico.  

La circularidad del cromosoma de E. colise demostró mediante estudios genéticos de construcción de mapas de tiempo mediante la técnica de la conjugación interrumpida (Jacob y Wollman, 1958).

F. JacobF. Jacob E. L. WollmanE. L. Wollman

En bacterias se han encontrado proteínas con características muy semejantes a las

histonas de los organismos eucariontes.

•la HU que es un dímero de subunidades diferentes y semejante a la histona H2B

•la proteína H dímero de subunidades idénticas y semejante a la histona H2A

•la proteína P semejante a las protaminas,

•la subunidad H1,

•el dímero HLP1 y

•el monómero HLP1.

PROTEÍNAS BACTERIANAS SEMEJANTES A LAS HISTONAS

PROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIASPROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIAS

ProteínaProteína ComposiciónComposición Contenido por Contenido por célulascélulas

Semejanza con Semejanza con eucarionteseucariontes

HUHU

Dímero Dímero subunidades subunidades

y y de de 9.000 d.9.000 d.

40.000 dímeros40.000 dímeros Histona H2AHistona H2A

HH

Dímero Dímero subunidades subunidades idénticas de idénticas de

28.000 d.28.000 d.

30.000 dímero30.000 dímero Histona H2BHistona H2B

IHFIHF

Subunidad Subunidad de de 10.500 d. 10.500 d.

Subunidad Subunidad de 9.500 d.de 9.500 d.

DesconocidoDesconocido DesconocidaDesconocida

H1H1 Subunidad de Subunidad de 15.000 d.15.000 d. 10.000 copias10.000 copias DesconocidaDesconocida

HLP1HLP1 Monómero de Monómero de 15.000 d.15.000 d. 20.000 copias20.000 copias DesconocidaDesconocida

PPSububnidad de Sububnidad de

3.000 d.3.000 d. DesconocidoDesconocido ProtaminasProtaminas

LOS PLASMIDIOS

.

Los plasmidios se pueden se clasifican según las funciones o el tipo de

información que llevan en: •Factores de Fertilidad o factores F. •Factores de resistencia de transferencia a drogas, factores RTF o factores

R. •Factores colicinógenos, factores Col o factores Cf. Las colicilinas son

sustancias que matan a las bacterias. Naturalmente las bacterias

productoras de colicilinas son inmunes a ellas.

Moléculas de ADN doble hélice circular que se replican de forma autónoma e independiente a la del cromosoma principal y que pueden, en algunas situaciones, integrarse en el cromosoma principal bacteriano y a partir de ese momento replicarse al mismo tiempo.

elementos genéticos extracromosómicos

El tamaño y número de los plasmidios es muy variable (2.000 a 100.000 pares de bases/1-100 copias por célula)

Algunas preguntas-ejercicios….Algunas preguntas-ejercicios….