GENETICA MOLECULAR AREA: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR ASIGNATURA: UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES...

GENETICA MOLECULAR

AREA: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULARASIGNATURA:

UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES Gen Mol

PROFESOR TITULAR: DR. VICTOR ROMANOWSKI

PROFESOR ADJUNTO: DRA. PATRICIA AGOSTINO

LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA

TURNO NOCHE:

BLOG: http://genmol.blog.unq.edu.ar/Gen Mol

TEMAS DE LAS CLASES TEORICAS

•Estructura del material genético.•Replicación del DNA.

•Mutaciones y reparación del daño en el DNA.

•Recombinación.

•Mecanismos de transposición.•Transcripción.

•Regulación de la expresión génica.•Traducción.

•Direccionamiento de proteínas.

•Organismos transgénicos y terapia génica.

•DNA recombinante y estudios cromosómicos.

•Técnicas corrientes en genética molecular.

1º PARCIAL

2º PARCIAL

A LO LARGO DEL

CUATRIMESTRE

Gen Mol

Bibliografía recomendada

•Biología Molecular de la célula. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002). 4º edición, Garland Publishing, Inc. Catálogo biblioteca UNQ: 571.6 BIO (ediciones 1996, 2002 y 2004).

•Gene VIII. Lewin, B. (2004). Ed. Prentice Hall. (y ediciones anteriores). Catálogo biblioteca UNQ: 572.8 LEW (edición 1995, Gene V).

•Biología Celular y Molecular. Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Darnel, J. (2002). 4º edición, editorial Médica Panamericana SA, España (5º edición en inglés). Catálogo biblioteca UNQ: 571.6 BIO (ediciones 2001 y 2005).

•Lehninger. Principles of Biochemistry, Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. (2008), 5º edición (en castellano: 3º edición, 2001, editorial Omega, España). Catálogo biblioteca UNQ: 572.3 LEH.•Molecular Biology. Weaver, R. (2004). 4º edición, Editorial McGraw-Hill.

Gen Mol

www. pubmed.com

Información actualizada y sitios de interés

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books

Gen Mol

Cronograma (primeras clases) Gen Mol

Extracción de ADN de tejidos humanos

Alumnos + algunos familiares por vía materna

ADN nuclear

ADN mitocondrial

Gen Amelogenina

Identificación sexual

Deleciones en el cromosoma

Y

Herencia Materna

Amplificación por PCR y análisis de polimorfismos

Total: 5 trabajos prácticos

Gen Mol GENETICA MOLECULAR,

LABORATORIOS

Se realizará una extracción de ADN humano para su posterior amplificación utilizando la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los alumnos extraen su propio ADN a partir de muestras de mucosa bucal. Se suman también muestras de familiares por vía materna.

TP 1: Extracción de ADN a partir de muestras de mucosa bucal

Extracción con cloroformo-isoamílico.Semi-cuantificación

mediante electroforesis en gel

de agarosa.

2 clases

Gen Mol

El gen de amelogenina (AMG) codifica para una proteína del esmalte dental, y se encuentra en ambos cromosomas sexuales. La secuencia de este gen en el cromosoma Y se diferencia de la del X por una deleción de aproximadamente 200 pb, por lo que la visualización del producto de PCR permitirá distinguir las muestras provenientes de mujeres de aquéllas provenientes de varones.

TP 2: Caracterización del sexo mediante la amplificación por PCR del gen de

amelogenina. Gen Mol

Amplificación de AMG por PCR.

Resolución en gel de agarosa 2%

2 clases

A diferencia del DNA nuclear, la herencia del DNA mitocondrial es exclusivamente materna. Esta unidad incluye la amplificación por PCR de una región del DNA mitocondrial de 312 pb (conocida como secuencia de Anderson) y su posterior digestión enzimática para poder visualizar el patrón de RFLPs característico de cada muestra. La visualización de RFLPs se realiza mediante la técnica de electroforesis en geles de arcrilamida.

TPs 3 y 4: Detección de RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) mediante la amplificación por PCR de un fragmento de ADN

mitocondrial.

Amplificación por PCR fragmento ADNmit

Digestión con enzima MnlI

Visualización patrones RFLP 3 clases

Gen Mol

Existen grandes regiones en el cromosoma Y asociadas con la producción de células espermáticas, conocidas como AZF (azoospermia factor). Deleciones en algunas de estas regiones se asocian a infertilidad masculina.

Se utilizarán los conceptos aprendidos (como PCR multiplex) para el estudio de microdeleciones correspondientes a la región de los genes AZF y su correlación con infertilidad y cáncer testicular.

TP 5: Detección de deleciones en el cromosoma Y asociadas con infertilidad

masculina.

2 clases

Gen Mol

FORMA DE EVALUACION

Teoría:

•Dos exámenes parciales y un integrador.

•Se promociona con 7 (siete) o más puntos en los parciales.

Trabajos prácticos:

•80% de asistencia

•Informe de TPs

•Exposición de trabajos

•Examen de TPs

REGIMEN DE ESTUDIOS DE LA UNQ

http://www.unq.edu.ar/advf/documentos/5006e6bcefbf8.pdf

ARTICULO 11°: Se considerará ausente a aquel alumno que no se haya presentado a las instancias de evaluación pautadas en el Programa de la asignatura.

Gen Mol

http://www.unq.edu.ar/advf/documentos/5006e6bcefbf8.pdf

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO

Introducción sobre los siguientes temas:

Estructura química y estabilidad. DNA A, B y Z.

Hidrólisis y densidad de los ácidos nucleicos.

RESUMEN DE LA CLASE

Clase de hoy:

Efecto hipercrómico.

Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos)

Bases, nucleósidos y nucleótidos.

Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos.

Estructura del RNA.

Avances científicos en base a la desnaturalización y renaturalización.

Gen Mol

DNA

RNA

transcripción inversa

transcripción y replicación de RNA

replicación de DNA virus a DNA

retrovirus y retroelementos

virus a RNA

transcripción

traducción

proteínaplegamiento (folding),

procesamiento, direccionamiento

(targeting)

procesamiento de RNA

splicing, edición, modificación de nucleótidos y de extremos 5´y 3´

reparación recombinació

n

El dogma central de la biología El dogma central de la biología molecularmolecular

Expandiendo aun más el dogma: non-coding RNAs (microRNA, etc.)

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO I

Rugosas (R): inofensivas

Lisas (S): virulentas

1928: Frederick GriffithInfección con dos cepas

de Streptococcus pneumoniae

(S)

(R)

(S) inactivada

(R) + (S) inactivada

Las primeras evidencias

Griffith showed that adding heat-killed virulent bacteria (harmless to mice) to a live nonvirulent strain permanently transformed the latter into lethal, virulent, encapsulated bacteria.

Un poco de historia…

El experimento de Avery O., McLeod C. y McCarty M. (1944) fue la primer evidencia

directa de que el DNA es la base de la información genética

Extract from heated smooth (S) bacteria

treatment with protease (digests proteins)

mix with rough (R) bacteria and injected into mice

mice died

Extract from heated smooth (S) bacteria

treatment with DNAase (digests DNA)

mix with rough (R) bacteria and injected into mice

mice lived

DNA carries genetic information

¿Como se demostró que el DNA es el responsable de la herencia?


Determinaron que el DNA es el material

genético en el bacteriófago T2

Alfred Hershey y Martha Chase (1952)

32P experiment 35S experimentESTRUCTURA DEL MATERIAL

GENETICO I

Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos

nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes

principales:

•Azúcar: una pentosa.

•Ácido fosfórico

•Bases nitrogenadas:

purinas y pirimidinas

La naturaleza química de los ácidos nucleicos

A, G, T, C están presentes en el ADNA, G, U, C están presentes en el ARN


Nomenclatura


Bases inusuales

Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son: •Hipoxantina, •Xantina, •2-metiladenina,•7-metilguanina•6-metil-aminopurina.

Ejemplos de bases pirimidínicas:•5-metilcitosina (propia del DNA)•5-hidroximetil citosina (HMC): sustituye a la citosina en los fagos T-pares.

En los RNA de transferencia (tRNA) se encuentran •Ribotimidina, •Dihidrouridina, •Seudouridina•Inosina (I).

Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de RNAs.


•La composición de bases varía de una especie a otra.

•La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma especie.

•La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). %A = %T.

•La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). %G= %C.

•La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C).

•La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada.

REGLAS DE CHARGAFF (fines de la década del ‘40)

Para el DNA doble cadena (dsDNA)

La estructura del DNA


% de bases en distintos organismos


HMC = hidroximetil-citocina

La estructura del DNA

•Patrón helicoidal del DNA.

•Dos periodicidades a los largo del eje, una primaria de 3,4 A y una secundaria de 34 A.

PATRON DE DIFRACCION DE RAYOS X

"The instant I saw the picture my mouth fell open and my pulse began to race." -- James D. Watson (1968), The Double Helix, page 167. New York: Atheneum, Library of Congress card number 68-16217.

Principios de la década del ‘50


Estructura del DNA: la doble hélice(1953)

• El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa alternantes está expuesto al agua del ambiente

• Las bases están apiladas en el interior de la doble hélice, con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice

• El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la superficie de la doble hélice

G C A T

• El anillo de furanosa está en la conformación C-2´endo

James Watson & Francis Crick, 1953, Nature, vol 171,

737-738


La estructura del DNA• Cadenas antiparalelas


Fuerzas que estabilizan la doble hélice

• Enlaces de hidrógeno (pequeña contribuión)

• Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica

• Interacciones iónicas:

- Repulsión entre las cargas negativas de los fosfatos

- Los cationes actúan como contraiones estabilizando el DNA

(divalentes más eficientes que monovalentes; el Mg+2 estabiliza la

estructura del RNA)


La forma B es la más estable en condiciones fisiológicas

Comparación de las formas A, B y Z del DNA


DNA A: 75% agua(esporos), Na+

DNA B: 92% aguaWatson & Crick

DNA Z: poli-pur-pyr, -GCGC… alta [Na+]


Estructuras inusuales

Palíndromos (palindromes)

Repeticiones en espejo (mirror repeats)

Horquillas (hairpins)

Cruciformes (cruciforms)


Estructuras inusuales: triplex DNAs

Apareamiento tipo Hoogsteen

Estables a pH bajos (citocina protonada, C+)

H-DNA: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos.

Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar puentes de hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de DNA de triple hélice.

H-DNA


Estructuras inusuales: cuadruplex DNADNA cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de guanina (DNA cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el DNA cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática.

Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH


Estructura del RNA

El RNA es químicamente más reactivo que el DNA


Typical right-handed stacking pattern of single stranded RNA. The bases are shown in gray, the phosphate atoms in yellow, and the riboses and phosphate oxygens in green.

La estructura del RNA


Secondary structure of RNAs. (a) Bulge, internal loop, and hairpin loop. (b) The paired regions generally have an A-form right-handed helix, as shown for a hairpin.


Las moléculas de ssRNA pueden exhibir conformaciones variadas

Estructuras secundarias en RNA

tRNA


Las células producen

varios tipos de RNA

Tipos principales de RNA que fabrican las células

Tipo de RNA Función

mRNARNA mensajeros, codifican proteínas

rRNA

RNA ribosómicos, forman la estructura básica de los ribosomas y catalizan la síntesis de proteínas

tRNA

RNA de transferencia, cruciales en la síntesis de proteínas como adaptadores entre el mRNA y los aminoácidos

snRNA

RNA pequeños nucleares, participan en varios procesos nucleares, incluyendo la maduración del pre-mRNA

snoRNARNA pequeños nucleolares participan en el procesamiento y modificación química de los rRNA

Otros RNA

Participan en diversos tipos celulares, como la síntesis de los telómeros, la inactivación del cromosoma X y el transporte de proteínas


1-5 % 80 %

10-15 %

Perkins et al., 2015. Expanding the ‘central dogma’: the regulatory role of nonprotein coding genes and implications for the genetic liability to schizophrenia. Molecular Psychiatry (2005) 10, 69–78

Los RNAs no-codificantesESTRUCTURA DEL MATERIAL

GENETICO I

Propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos

• Medio ácido y alcalino• Densidad de flotación

(ultracentrifugación en gradientes de densidad)

• Espectro UV• Temperatura de desnaturalización

(estabilidad de la doble hélice a medida que se incrementa la temperatura)


Hidrólisis química en medio ácido

Ácidos fuertes: escinden tanto los enlaces

fosfodiéster como los enlaces N-glicosídicos.

Ácidos débiles: escinden los enlaces N-

glicosídicos. Los enlaces de las purinas son más

lábiles que los de las pirimidinas. Se obtiene

ácido nucleico sin bases púricas


Hidrólisis química en medio alcalino

RNAClivaje del

enlace fosfodiester


Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C, mayor

densidad.

Densidad de los ácidos nucleicos

Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en %:

= 1,660 + 0,00098(G+C)

DNA Densidad (g/ cm3) % (G+C)

Polímero A-T 1.675 0

Diplococcus pneumoniae 1.700 42

Escherichia coli 1.710 51

Serratia marcescens 1.716 55

Mycobacterium phlei 1.732 73


Desnaturalización del

DNA


Doble cadena (ds)

Simple cadena (ss)

Desnaturalización del DNA

Condiciones que favorecen la desnaturalización

•Alta temperatura

•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)

•Alto pH (desprotonación de bases)

Monitoreo de la desnaturalización

•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm

Nucleótidos libres> ssADN> dsADN

•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud

•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm (temperatura de melting)

DESNATURALIZACION POR CALOR

Cálculo de Tm

•Oligonucleótidos cortos: Tm (oC) = (A+T)x2 + (C+G)x4

•Oligonucleótidos largos:Tm = 81.5 +16.6Log [Na+] + 0.41 (%CG) – (625/N) (N=longitud del oligo)


Parámetros que intervienenen en la desnaturalización del DNA

Parámetro Efecto sobre Tm Efecto sobre la velocidad de renaturalización

Composición de bases

Incremento de Tm con el aumento del %G-C

No ejerce efecto

Longitud<150 bp; incremento de Tm con el incremento de longitud; >500 bp no hay efecto

Incrementa la velocidad con la longitud

Fuerza iónica Incremento de Tm con el aumento de [Na+]

Optimo a 1.5 M Na+

% bp mismatch

Disminuye Tm con el aumento de %mismatch

Disminuye la velocidad con el aumento de %mismatch

Concentración No ejerce efecto Aumenta la velocidad con el aumento de [DNA]

Agentes denaturalizant

es

disminuye Tm con el aumento de [formamide], [urea]

Optimo a 50% formamide

Temperatura - Optima a 20°C por debajo de Tm


Efecto hipercrómicoThe purine and pyrimidine bases in DNA absorb UV light maximally at a wavelength of approximately 260 nm. In double-stranded DNA, however, the absorption is decreased due to base-stacking interactions. When DNA is denatured, these interactions are disrupted and an increase in absorbance is seen. This change is called the hyperchromic effect. The extent of the effect can be monitored as a function of temperature


Renaturalización• La desnaturalización es un proceso reversible• Reanealling: reasociación de las cadenas de DNA

Algunos usos experimentales de la hibridación de ácidos nucleicos:

•PCR•Southern blot •Northern blot •in situ hybridization •D-loop or R-loop mapping •Cot curves


Avances científicos

• Disociación y reasociación de las hebras complementarias del DNA (hibridación de sondas)

• Replicación del DNA in vitro (síntesis de genes usando cada una de las hebras de la doble hélice como molde para la copia)

• PCR (amplificación de un segmento de DNA en un tubo de ensayo)

• Síntesis de DNA a partir de RNA (transcriptasa reversa de retrovirus)


Avances científicos

• Enzimas de restricción (tijeras mágicas para cortar DNA en forma precisa)

• Ligasa (pegamento especial para unir trozos de DNA: permite la construcción de moléculas recombinantes)

• Enzimas de restricción + ligasa = DNA recombinante (ingeniería genética)


Hibridación Reasociación de secuencias

complementarias

secuencia blanco + sonda


• DNA: Southern blot

• RNA: Northern blot

• Marcación radioactiva, fluorescente, quimioluminiscente, etc.

Southern blot


PCR (Polymerase chain reaction)


En resumen…

Estructura química y estabilidad del DNA.

Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos)

Efecto hipercrómico.

Hidrólisis y densidad de los ácidos nucleicos.

Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos.

Bases, nucleósidos y nucleótidos.

Naturaleza química de los ácidos nucleicos.

Tipos de estructura de DNA (A, B, Z).Estructura y tipos de RNA.


Gen Mol

Avances científicos en base a la desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos.

¿Preguntas?

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