Giza haziko peptidasak eta gizonezkoen ugalkortasunaren ...

Giza haziko peptidasak eta gizonezkoen ugalkortasunaren asaldurak

Jakintza-arloa: Medikuntza

Egilea: ASIER VALDIVIA PALACIN

Urtea: 2005

Zuzendaria: JON IRAZUSTA ASTIAZARAN

Unibertsitatea: UPV/EHU

ISBN: 978-84-8438-622-3

Hitzaurrea

Lehenengo eta behin, UEUri eskertu nahi nioke, ikerkuntza lan honen argitaratzea

aurrera eraman nahi izanagatik. Alde batetik, lan hau euskarazko publikoarentzat

interesgarria suertatu daitekeela pentsatzeagatik eta liburu modura ematen dioten

hedapenagatik. Gainera, aspaldian irakurtzen ez nuen nire tesi oroitidazkiarekin

berriz harremanean jartzera bultzatu naute, eta garai gazte haietako oroitzapenek

berriz ekartzeko beta eman didate.

Ikerkuntza lan hau euskaraz egitera eraman gaituzten arrazoiak anitzak dira. Alde

batetik, nire motibazio pertsonalak, euskaraz haur-eskolatik ikasi izateak, horretara

bultzatu ninduen. Gurasoek, erdaldunak, euskaraz ikastea ziurtasun gutxiko apustua

zenean, eta euskarazko hezkuntza arautua oraindik jaiotzen zegoenean egin zuten

aukerari balioa eman nahi izan nion. Unibertsitate malako ikasketak ere euskaraz

egin nituela, eta euskararen aldeko jarrera proaktiboa zuen laborategi batean

(EHUko Fisiologia Saileko Jon Irazusta eta Javier Gil irakasleen zuzendaritzapean,

Fisiologia Zelularreko laborategia) sartu nintzela ere oso baldintza aproposak izan

ziren, doktore-tesia ere euskaraz egiteko.

EHUko ikertzaileen formaziorako diru-laguntza bati esker, lan honi hasiera eman

zitzaion Jon Irazusta (besteak beste, Euskara eta Eleaniztasun Errektoreorde

izandakoa) eta Javier Gilen proposamenez. Tesia euskaraz idaztea ia hasieratik,

modu naturalean, hartutako erabakia izan zen beraz. Gure laborategiko ikerketa

lerroa neuropeptidoen metabolismoaren ingurukoa zen nagusiki garai hartan.

Neuropeptidoak, izenean doakien bezala, neuronen arteko komunikazioan

inplikatutako seinale molekula peptidikoak dira, baina tesi lan honen izenburutik

ulertu daitekeenez, lan honetako ikerketa giza ugalkortasunaren inguruan dihardu.

Ikergai hain ezberdinen arteko saltoa, neuropeptidoak nerbio sistemako seinaleak

izateaz gain, beste ehun eta sistema ezberdinetan, oso funtzio heterogeneoen

modulazioan harremanak topatu zirela kontutan izanik, modu errazagoan ulertu

daiteke. Gainera, peptido hauek puskatzen dituzten entzimak, peptidasak, nahiko

hedapen zabala dute giza ehunen artean, hauek benetan, peptidoak baino gehiago,

ikerlan honen helburua direla. Beraz, entzima hauen ikerketa hasi genuen, horietako

bat giza hazian deskribatua izan zela, ernalkuntzaren erregulazioarekin harremana

zegoela bibliografian behartu genuenean.

Horrela gauzak, eta esperimentazio epea bukatuta, tesiaren oroitidazkiaren idazketa

prozesua hasi zen. Terminologia teknikoa eta zientifikoa euskaratzeak sarritan, nahi

baino gehiagotan, hitz berriak asmatzera behartzen gintuen (hitz eratorriak, hitz

elkartuak, hitz konposatuak… uff). Askotan ere maileguen erabilera inposatzen zen;

hitz berriak sortzea euskararen aberastasunaren aldetik interesgarria bazen,

ikuspuntu tekniko batetik oso artifiziala edota testuinguru kanpokoa gerta liteke, tesi

oroitidazki batek izaten ohi dituen arau zorrotzekin, eta ikerkuntza medikoak dituen

kutsu kontserbadoreak kontutan izanik. Beste kontu bat, ikertutako entzimen izenen

grafia izan zen. Nik, izen berezi bezala hartu eta hitz larriz idatzi beharko genituela

lehendabiziko hizkian; zuzendariek, minuskulaz idazteko, irakurketa ez

korapilatzeko….

Idazteko prozesua aurrera zihoala EHUko ikerlarien prestakuntzarako beka bukatu

zitzaidan. Garai horretan, zuela gutxi, EHUk Euskaraz Tesia Idazteko diru-laguntzen

deialdiak sortu zituen, Euskara Errektoreordetzaren eskutik. Ni baino lehen, Gorka

Larrinaga doktoreak gure laborategian eskatu zuen laguntza hau bere lehendabiziko

deialdian, eta bere atzetik nik. Zerbitzu horretako pertsonala benetan lagungarria eta

adiskidetsua iruditu zitzaidan.

Azkenean, alea bukatuta zegoela, Doktore tesiaren defentsarako epaimahaia

bilatzeko prozesua hasi zen. Doktore euskaldunak, ikerketaren gaian adituak edo

behintzat lotura zutenak, EHUkoak zein kanpokoak, emakumeak zein gizonak… Ez

zen erreza izan. Hemendik ere, euren burua epaimahaian parte-hartzeko eskaini

zutenei, bihotzez mila esker.

Ez nuke hitzaurre hau bukatu nahi, nire aldamenekoei eskerronak berriztu barik.

Garai horietatik honetara, ikerketarako motibazioa eta nire lorpenetan oinarri izan

diren lankide, adiskide, senitarteko eta bereziki Beronika, nire bikoteari, nire

alferkeriarako joera naturalaren aurkako botikarik onena delako.

Asier Valdivia, 2017ko urria.

Eman ta zabal zazu

Universidad Euskal Hernko del País vasco Unibertsitatea

MEDIKUNTZA ETA ODONTOLOGIA FAKULTATEA FISIOLOGIA SAILA

GIZA HAZIKO PEPTIDASAKETA

GIZONEZKOEN UGALKORTASUNARENASALDURAK

Asier Valdivia Palacín (2005)

UNIVERSIDAD EUSKAL HERRIKODEL PAIS VASCO UNIBERTSITATEA

Eman ta zabal zazu

GIZA HAZIKO PEPTIDASAK

ETA

GIZONEZKOEN UGALKORTASUNAREN

ASALDURAK

DOKTORE-TESIA:

Asier Valdivia Paladn

Fisiología SailaMedikuntza eta Odontología Fakultatea

Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín

David Artola Blancori

Oraindif^eta Setira^o

gure 6iíiotzean ,

Doktoie-Tesia Asier Valdivia Palacín

,(Ez, ez zaitez satatu. (Egin aCa ez egin,

6aina ez zaitez saiatu"

(V

Ondorio 6eza(a, oso gutjçi dafyguth, eta ñata ere, Harrigarria da zenBat ezagutzen cfugun.

fita harrigarnagoa, fiain ezagutza tyj^ia^fiorrenôeste Botere ematea('Bertrand usseH)

Doktoie-Tesia Asier Valdivia Palacín

(Pertsom Baten Bizitza ez da prozesu (errozuzena, Bizipen ugariren gainjarpena eta

■proiefytu anitzen garapena Baizi^ Jfoizean Behin, atzera Begiratzefcg Beta azaCtzen zaigu, asfcgtan

proieptu fiorictakp 6at Bupaize^p Bidean dagoenean. 'Momentu haietan, niri Behintzat, Beti

etortzen zaizhit arin Burura Bizitzaren ataChorretan (agundu nautenpertsom^

jlsf{otan gaCdetu izan diot neure Buruari, Beste tofciren datera fan egitera, ikertzera erori

izan Banintz, nere Bizitza orain noCakoa izango ote zen, ÇaCdera ñau ez da 6a tere zientifiÑoa ezta

arrazionafa ere. Stephen J. Çouûf eBoCuzionista ameriharrah defendatzen duen Ñpntingentziaren

kimtzeptmf^ ziurasÇtnire Bizitza guztia atdaraziho 6aiCu$e: 5Vz ez nintefce ni, edo horreCakp

zerBait. J&CaBaina, gaCdera horren jatorria, Beste ÇezÇa xehego, sentipenezho Bat da: nire inguruan

izan denjendeguztiaren ordez Beste pertsona Batzuh^Badra, egin dudanaren antzekp zeozer Burutu

ahaCizango nuhe? erantzun BezaCa, arrazoia ,"SaCiteke” eta BihotzaPJ'ezelz" esaten didate.

Luzatzen fasiii naiz eta horrenBeste pertsonari esêrrafêmateô eta gogorapenaêgiteô

tofci txifci, txiÇiegi, hau agortu^p dut. <Beraz, fiasi gaitezen CehcnBaikfieiv

LehenBizi, EJTV-Çp Jdedikuntza eta OdontoCogia ‘FaÑiiftate^p ‘FisioCogia SaiCari, Bertan

egin didan harrera eta ifcertzeÇo eman didan auÑeragatif esherrai eman nahi izan nizftiofcg. Tesi

honen garapem eta ehoizpena iraundu duen Bitartean izandahp firu zitzendariei, Juan ManueC

Çandarias y (Bajón, Temando JQinz eta (Begoña Ochoa Irafccisk (Do torei. JfawÇin Batera, saiCei{o

ira asCe, Beâdun eta JlZ<Pf(p guztiei (Berezifci, Luis Casis-% taCde honen sortzaiCea izateagatiiêta

<David eta Monica, orain Vtah-n Bizi direna^ Çazteizô ‘Enrique eta Bere taCdeari eta Juan

íMúgica-ri, i%erfceta~iCdo ñau zaBaftzeho aukera eman ziguiafco.

Ej ferra Bihotzez (haie^ jaftin Behar o Cuhete zein madaraino...), nire tesi honen

zuzendariaf^diren, Jon Irazusta eta Javier Çif Irafcask (Dohtorei

EsÑer anitz (Donostiaô (Erizaintza ‘Eshptari, Bere irakaste eta JLZ<P oei eta Berezipi

Çorosti taCdefco partaideei, egin didaten harreragatiki eta Behar izan dudan edozerrerahp eman

dizhjdaten errazLasunengati^

Esfer mita, (BifBoftp Euscalduna %finif¡ari eta zefiazpi ñango seminoCogia iaBorategia eta

Lagundurihp Vgalfteta unitateari eman didaten CaguntzagatiEsher Bereziaf Carmen Ochoari,

ESKER ONAK


<Vertsona Gaten Bizitza ez da prozesu úrrozuzena, 6izipen ugariren gainjarpena eta

praicÇtu anitzen garapena ñaizií íNoizean Behin, atzera Begiratzeô Beta azaCtzen zaigu, askotan

proiefctu ñorietaf{p Bat Bufiatzefto Bidean dagoenean. Momentu ñaietan, niri éeñintzat, Beti

etortzen zaizkil arin burura Bizitzaren ataChorretan fagundu nauten pertsonaf^

jisfiotan gaCdetu izan diot neure Buruari, Beste toftiren Satera Can egitera, ikertzera erori

izan Banintz, nere Bizitza orain noCaíipa izango ote zen. ÇaùCera ñau ez da Bátete zientififcpa ezta

arraziom(a ere. Stephen J. ÇouCd eBoCuzionista amerifcarra defendatzen duen ftontingentziaren

£pntzeptua$¿ ziurasfci, ñire Bizitza guztia afdarazi/îo BaiCuÇe: ffî ez ninteê ni, eda horrefkkg

zerSait. JltaBaina, gaCdera horren jatorria, Beste f{ezf{a xehego, sentipenezfco Bat da: ñire inguruan

izan denjende guztiaren ordez Beste pertsona 6atzuf{ 6aRra, egin dudanaren antzekg zeozerBurutu

aíiaCizango nu eP erantzun BezaCa, arrazoia^‘'6aCite e" eta Bihotza^ “ezetz" esaten didate.

Luzatzen fiasia naiz eta íorrenBeste pertsonari esÇerra ematefco eta gogorapenaf egitefco

tof{i txtkl, txikjegi, hau agortuko dut. (Beraz, fiasi gaitezen íehenBaiCeñeiv

LehenBizij TJíV-ko íMediûntza eta OdontoCogia ‘FaÇuCtatefco TisioCogia SaiCari, Bertan

egin didan fiarrera eta iÇertzeÇp eman didan aukeragatif es fierra^ eman nafii izan nizkiof e. tfesi

ñoiien garapem eta eÇoizpena iraundu duen Bitartean izandafio fiiru zuzendariei, Juan ManueC

Çandarias y (Bajón, Femando Jlinz eta (Begoña Ochoa IrakasCe (DoÇtorei Haueftin Batera, saiCe o

irafcasCe, Beâdun eta JïZ<Pfcp guztiei (BereziÇi, Luis Casis-i, tatde honen sortzaiCea izateagatifêta

(David eta Mónita, orain Zltafi-n Bizi d ir e n a ÇazteizÇo Enrique eta Bere taCdeari eta Juan

Múgica-ri, iÇerÇeta-iCdo hau za6aítze(¡o aufcera eman ziguCafco.

c£sêrrakj, Bifiotzez (haief jakin Beharfco Cuñete zein maiCaraino...), ñire tesi honen

zuzendariaí^diren, Jon Irazusta eta Javier Ç'iCIra asCe <Dof{torei

%sker anitz (Donostiaô ‘Erizaintza ‘EsÇolhri, Bere impaste eta JlZ<P%pei eta Berezifti

Çorosti taCdef{0 partaideei, egin didaten harreragati£ eta Behar izan dudan edozerrerafco eman

dizfÿdaten erraztasunengatif^

‘Esêr miCa, <BiCBofcg ‘EusÇaCduna %Cini%ari eta zehazfti hango seminoCogia CaBorategia eta

Lagundurikp VgaCÇeta unitateari eman didaten [aguntzagatü(Esêr Berezia£ Carmen Ochoari,

ESKER ONAK

Asier Valdivia Doktore-Tesia

Bere adeitasunagati^ eta Bere motiBazioagali^ lEsí¡erra j ere (Euscara Errektoreordetzaô

perlsonaCan, 6ere laguntza eta arduragati

Orain 6ai, ez ditut afiazluko ñire eguneroka (anfcideaf (Berriz ere, Jon, taídeô Bi piéote

antofatzai(eetaf{p 6at, egiten ari nintzenaren konfidantza gaCtzear nengoeCa gora egiteagatif^ eia

datua£ i$ustef¡p eta ideia£ gauzaizebp duen aBi(eziagati^¡, Javi, Beste piBotea, taídekp Burn

pragmatista, BeragaBe oraindi£ Cunaren hasieran egongo nintzateke. ¡Defentsa Canetan, Çorüa

(txjstufariafi ñamaéitan) eta JldoCfo (may the force Be with you), zentraCe moduan, antagoniô-

osagartiafc Bata musitan armeniozalka, Bestea %ariBe Migaren aûdeÇp porroÇatua, Bie^ dute

soCasera o eta azaCpenetarafip aBiiezia. !HegaCetan, ‘Fatima (giro t%arra ivçatu egiten dueCakg) eta

fíaiara (ñire Confidente gogo faena) ipiniftp nituzÇe. (Ri fiauen dizipCina eta seriotasun efiunekp

BatareÇin poztufcp nintzateÇe. <Defentsaren aCBoetan, JLmaia, edozeingaiari Buruzô eztaBaidarako

Beti prest, eta Itziar, (nperíangiíe eta âfectarako Beste fitiqije on Bat. yï tezain moduan, Jaime, tofc

guztitan egotefip eta gauza guztitaz arduratzefio duen gaitasunagati4. Jlurrefari moduan Eíiaitz

Bfotting-aren “sheriff'-a, izotz-ûtxa esítuetan duela, Broma gutoq; Leire eta Nerea, haief^Bait dita

etorfazuna. <Ez ditut añaztu nafii. ziBer-lítcna eta Susana, Beti [aguntzefco eta entzutekg prest...

(Buâtzera noaCa, adisfcideei ñire tesiari Buruz Baziíadaêgin arren, Benetan arduratu izan

direCako. <Esf(erraf¡¿ Eran, (paBCo, Igor, íMifieC eta Nerea, Zigor, If¡er, (Ramón, Juíen, Josu, Jlrâtu,

Imaz, Eder, Santi, Jo%e, Itiçaz, Sergio, 'Jfaritz, Enefip, (pifcutaraftp nes%a$¿ “Çaizfiiaren ardatza"...,

IñaÑi, Mvaro, Jain(af(¡, Eneô,... JímaLur, ÇoitiBera eta EECñkpei... ez nufte inoiz Buâtukp.

Nirefiin uniBertsitatean iBiCitafto lagutiei Jíemen ere, aipamen Berezi Bat gazteegijoan zaizfÿgun

(David Jírtoía, (agun minarentzat, tesi hau Berea Bait da, maiCa dandi Batean, eta Beragati£

taBorategian sartu nintzeüÇo (egin dut!)etaXaBi Cotorentzat, dueCa egun guú(i utzi Baitgaitu.

Jlzkenil^ etxefipei. Jlma, JLita, Çorfia, eta Conchi ere, ema(te)n didazuen guztiagati

Bada izue. (Beronifcari, ni aguantatzeagatii^ eta den-denagatifa, eta Bere famiíiari !Nire famiCiafio

Beste guztiei, rtosf(i, eta gogoramen Bereziaz amona IsaBeCeta Laurirentzat.

Çuztiet\

M i í a e s k e r

ESKER ONAK

Doktore-Tesia Asict Valdivia Palacín

AURKIBIDEA

AURKIBIDEA

Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín

AURKIBIDEA

1. S A R R E R A 1

1.1. GIZA UGALKORTASUNAREN GAIA

GAUREGUNGO GIZARTEAN 3

1.1.1. Giza haziaren analisia: Normaltasuna eta Patología 6

1.2. GIZONEZKOEN UGAL APARATUA 10

1.2.1. Garapen enbrionarioa 10

1.2.2. Ugal aparatu arraren egiturak 11

1.2.2.1.Barrabilak 11

1.2.2.2.Epididimoa 12

1.2.2.3.Hodi Deferenteak 12

1.2.2.4.Guruin osagarriak 13

1.2.3. Esperraatogenesia 16

1.3. ESPERMATOZOIDEAREN EGITURA ETA

PROZESU FISIOLOGIKOAK 19

1.3.1. Espermatozoidearen egitura 19

1.3.2. Espermatozoidearen heltzea 23

1.3.3. Espermatozoidearen motilitatea 26

1.3.4. Kapazitazioa 28

1.3.5. Erreakzio Akrosomikoa 30

1.4. HAZIAREN BESTELAKO OSAGAIAK 31

1.4.1. Likido Seminala 31

1.4.2. Prostasomak 32

AURKIBIDEA


1.5. PEPTIDO ERjREGULATZAILEEN GARRANTZI

FISIOLOGIKOA 34

1.5.1. Peptido erregulatzaileak 34

1.5.2. Peptido erregulatzaileen sintesia, metaketa eta

Jariapena 37

1.5.2.1. Biosintesia 37

1.5.2.2. Metatzea 37

1.5.2.3. Askapena 38

1.5.2.4. Hartzaileak 38

1.5.2.5. Inaktibazioa 39

1.5.3. Barne Peptido Opioideak (BPO) eta euren

eragin fisiologikoak 40

1.5.3.1. Orokortasunak eta deskribapen historikoa 40

1.5.3.2. BPOen sailkapena, ezaugarri molekularrak eta

Kokapena 41

1.5.4. TRH hormona eta bere analogoak 44

1.5.4.1. Orokortasunak eta deskribapen historikoa 44

1.5.4.2. TRHaren peptido analogoak 45

1.5.4.3. TRHaren banaketa gorputzean 4 6

1.5.4.4. TRHaren ezaugarri molekularrak,

Doktote-T esia Asier Valdivia Palacin

1.6.2. Entzefalinen entzima anderatzaileak. Aminopeptidasak

eta Endopeptidasa Neatroa 58

1.6.2.1. Endopeptidasaneutroa (EC 3.4.24.11) 59

1.6.2.2.Puromizinarekiko sentikora den

Alanina aminopeptidasa (PSA edo EC 3.4. í 1.14) 60

1.6.2.3. Alanina aminopeptidasa N edo M

(puromizinarekiko ez -sentikorra)

(APNedo EC 3.4.11.2) 62

1.6.3. TRH eta honen peptido analogoak anderatzen

dituzten peptidasak 63

1.6.3.1. Prolil Endopeptidasa (EC 3.4.21.26) 64

1.6.3.2. Piroglutamil peptidasa I (EC 3.4.19.3) 66

1.6.4. Peptidasen garrantzia ugalkortasunean 70

2. HELBURUAK 74

3. MATERIALA ETA METODOAK 81

3.1. ERABILITAKO EHUN BIOLOGIKOEN LORPENA 83

3.2. MATERIALA 84

3.2.1. Produktu kimikoak 84

3.2.2. Tresneria eta ekipamendua 86

3.3. SOLUZIOAK ETA BUFFERRAK 87

3.3.1. Soluzio indargetzaileak 87

3.3.2. Bestelako soluzioak 89

3.3.3. Saio Entzimatikoetarako sustrato-soluzioak 91

3.3.4. Zatiki azpizelularren purutasun-saioetarako

Soluzioak 92

3.4. METODOAK 93

3.4.1. Ehunen isolamendua eta giza haziaren

iaginen lorpeua 93

AURKIBIDEA


3.4.2. HazMaginen espermio-kopuruaren,

mugikortasunaren, morfologiaren eta

bideragarritasunaren azterketa 94

3.4.3. Lagin entzimatikoen lorpenerako prozedurak 97

3.4.4. Aktibitate entzimatikoa neurtzeko teknika 103

3.4.4.1. Aminopeptidasen eta Prolil

Endopeptidasaren aktibitatearen behaketa 104

3.4.4.2. Entzefalinasaren aktibitatearen behaketa 105

3.4.5. Proteinen kontzentrazioaren kuantifikazioa 107

3.4.6. Sustrato-kontzentrazio egokiaren doipena 108

3.4.7. Inhibitzaileen eta substantzia gehigarrien bidezko

aktibitate entzimatikoen bereizketa 110

3.4.7.1. Aktibatzaile tipikoak: EDTA eta DTT 110

3.4.7.2. Inhibitzaile espezidikoen erabilpena 113

3.4.8. Ehunen arteko aktibitate peptidasikoen konparaketa 115

3.4.9. Método estatistikoak 116

4. EMAITZAK 117

4.1. TEKNIKAREN DOIKETA 119

4.1.1. Sustrato kontzentrazio optimoa 119

4.1.2. Aktibitate entzimatikoen bereizketa 129

4.1.2.1. Inhibitzaile espezifikoen erabilpena 129

4.1.2.2. Substantzia gehigarriak EDTA eta DTT 140

4.2. AKTIBITATE ENTZIMATIKOAK:

EHUNEN ARTEKO KONPARAKETA K 150

4.3. AKTIBITATE PEPTIDASIKOAK ETA

HAZIPATOLOGIAK 161


HAZIAREN PARAMETRO EZBERDINAK 179

4.5. ZATIK3ENISOLAMENDUAREN DOITASUNA.

LAKTATO DESHIDROGENASA 187

AURKIBIDEA


4.6. IKERTUTAKO PEPTIDASEN BANAKETA

HAZI-ZATIKIEZBERDINETAN 191

5. EZTABAIDA 193

5.1. GIZA HAZIKO PEPTIDASAK 195

5.1.1. Entzefalinen peptidasa anderatzaileen bereizketa 196

5.1.2. TRH hormona eta analogoak anderatzen

dituzten peptidasen bereizketa 199

5.1.3. Peptidasak. ehunen arteko konparaketa 201

5.2. GIZA HAZIAREN PATOLOGIAK ETA

PEPTIDASEN AKTIBITATEAK 203

5.2.1. Entzefalinen entzima anderatzaileak eta

hazi patologiak 203

5.2.2. TRH hormona eta analogoen entzima

anderatzaileak eta hazi patologiak 206

5.2.3. Giza haziko peptidasak eta peptidoak.

Lanerako hipotesiak 208

6 . ONDORIOAK 213

7. BIBLIOGRAFIA ETA ERREFERENTZIAK 217

AURK3BIDEA

Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacio: 1

SARRERA

SARRERA 1

2 Asier Valdivia Doktore-Tesia

SARRERA

Doktoïe-Tesia Asier Valdivia Palacín 3

1. SARRERA

1.1. GIZA UGALKORTASUNAREN GAIA

GAUREGUNGO GIZARTEAN

Aintzinetik datorkio gizarteari bere ugalkuntzaren osasuna mantentzearen

ardura. Gaur egun ere, handia da giza ugalkortasunak duen interesa, gai honen

inguruan dauden ikerketen ugaritasunak isladatzen duen bezala. Adibidez, Estatu

Batuetan, adin ugalkorrean dauden bikoteen %15ak jaso izan du inoiz

ugalezintasunarekin erlazionatutako laguntza (Templeton, 1995). Proportzio hau

%13tik, %24ra aldatu daiteke ikerketa epidemiologikoak egin diren herrialdeetan, eta

Espainar Estatúan, prebalentzia %19’2a déla estimatu da (NOGF/FIGO, 1995). Honen

barruan, gizonezkoen ugalkortasuna etengabeko eztabaida zientifikoen iturria izaten

da. Badirudi, ugalezintasun kasu guztien %25a gizonezkoei lotutako faktoreei zor

zaiela (Templeton, 1995). Hau dela eta, gizonezkoen ugalkortasunari eta

ugalezintasunari buruz, ikuspegi ezberdinez, aritzen diren lan zientifikoak ugari dira.

Giza haziaren kalitateraren jeitsierari buruz ohartarazten diguten ikerketak

(Carlsen eta lank., 1992) honen adibide dira. Giza haziaren kalitatearen jeitsiera hau

ukatzen duten ikerketak ere badaude (Andolz eta lank., 1999; Acacio eta lank., 2000).

Giza haziaren kalitateari buruzko lan hauek arazo metodologiko ugari azaltzen dituzte.

Hala nola, gehienetan, aztertutako populazioak ugalkortasun arazoak dituzten

gizonezkoekin egiteak, lagin-bilketa prozedura ezberdinak erabiltzen dituzten lan

askoren metaanalisiak izateak, haziaren azterketan erabilitako teknikak ezberdinak

izateak edota meta-analisirako erabilitako eredu estatistiko ezberdinek ondorio

SARRERA 3


kontraesankorrak emateak, lan hauen baliogarritasuna erlatiboa egiten dute. Honen

inguruan egin diren ikerkuntza gehienak atzeranzkoak izan dira gainera, eta honelako

gaiak ebasteko interesgarriagoak omen dira aurrerazko ikerketak (Multigner eta Oliva,

2002). Dena den, gai honen inguruan argi dagoen zerbait, kalitatearen balizko jeitsiera

hori onartuta ere, jeitsiera hori ez delà unibertsala ez eta homogeneoa ere, ikuspegi

geografiko batetik begiratuz (Multigner eta Oliva, 2002; OME, 1999).

Hala ere, gizonezkoei lotutako ugalezintasunaren zergatiak anitzak dira (Wong

eta lank., 2000). Aide batetik, faktore genetikoak, endokrinoak eta jaiotzetikoak daude.

Hauen adibide dira Klinefelter sindromea pairatzen duten banakoen ugalezintasuna,

edota sexu-hormonen ekoizpena murriztua duten pertsonak. Bestalde, gaisotasunen

batek sortutako ugalezintasuna dago. Honen barruan, barrabiletako minbizia izan duten

gizonezkoak, barikozelea (barrabiletako odol-zirkulazioari lotutako kaltea) dutenak,

edota gemu eta ugal aparatuetan izandako infekzioek sortarazitako ugalezintasunak.

Hirugarren talde batean, haziaren garraio egokia galerazten duten faktoreak leudeke;

hala nola, autoinmunitateak sortutako ugalezintasuna (esperaiatozoideen aurkako

antigorputzak), edota sexu-disfuntzioei lotutakoa. Beste talde batean, elikadurari

lotutako gizonezkoen ugalezintasun faktoreak ditugu. Hauen artean, ekintza

antioxidatzailea duten elementu eta konposatuen gabeziak (E bitamina, C bitamina,

selenioa, karotenoideak,...) egongo lirateke, izan ere estrés oxidatiboa giza haziaren

zenbait parametro garrantzitsuetan eragina duela ikusi da (Agarwal eta lank., 2003;

Scott eta lank., 1998), eta hauekin batera, bestelako zereginak betetzen dituzten

sustantzien (zink eta folatoa) gabeziek sortutako ugalkuntzarako kalteak. Esate

baterako, zinka, barrabilen garapenarekin, espermatogenesiarekin eta

espermatozoideen mugikortasunarekin harremana duela behatu da (Favier, 1992; Wong

eta lank., 2002) (aipatuko dugu ere, geroago, Zinkaren garrantzia zenbait entzimen

aktibitatean). Azkeneko talde batean, inguruneko faktoreak aipatuko genituzke,

gizonezkoei lotutako ugalurritasunean. Hauen artean, adina eta eragile kimikoak

dauzkagu, bereziki. Badirudi, zenbait giza haziaren parametro garrantzitsu, hala nola,

haziaren bolumena eta espermatozoideen mugikortasuna, adinarekin batera behera

egiten dutela (Kidd eta lank., 2001). Oso interesgarria da, gizonezkoei lotutako

ugalezintasunari buruz Sullivan-ek ematen duen ugalezintasunaren zergatien sailkapen

4 SARRERA

Doktote-Tesia As iet Valdivia Palacín 5

orokorra, zeinean gizonezkoei lotutako ugalezintasun hiru talde nagusi ezberdintzen

dituen: Jatorri pretestikularreko ugalezintasuna (homionala, genetikoa, koitoarekin

lotutako arazoak); jatorri testikularrekoa ( Sertoli-Cell-Only sindromea,

espermatogenesiaren gelditzea, kriptorkidismoa,...) eta jatorri postestikularreko

ugalezintasuna (obstrukziozkoa, inmunologikoa, infekzioak direla eta,..) (Sullivan,

2004)

Bestalde, eta sustantzia kimikoen eraginen adibide bezala, gero eta argiago

egoten da ugalkortasunaren murrizpenaren eta gaur egungo gizarteak dakartzan zenbait

ohituraren arteko harremana. Ikerketa askok giza haziaren zenbait parametro, ohitura

kaltegarrien ondorioz, eta eragingarri ezberdinak direla eta, nola aldatzen diren behatu

dute. Honen inguruan aipagarriak dira tabako eta marihuanaren erretzea eta alkohol

kontsumoa. Wong eta lankideek, gizonezko ugalurrituekin eta ugalkorrekin egindako

ikerketa batean, ugalurrituen artean zigarro-erretze maiztasun altuagoa behatu egin

zuten (Wong eta lank., 2000). Erretzeak giza hazian estres oxidatzailearen adierazleak

(oxigenoaren espezie erreaktiboak, ahalmen antioxidatzaile totalaren jeitsiera eta

leukozitosia) gora egiten dutela ikusi dute, bestelako hazi-parametroetan aldaketa

nabamienik topatu ez duten arren (Saleh eta lank., 2002). Badira, dena den, erretzearen

eta espermatozoideen mugikortasuna, dentsitatea eta bestelako parametro en

beherakadaren erlazioa deskribatzen dutenak (Kiinzle eta lank., 2003). Alkoholaren

kasuan ere, antzerako parametroen maila baxuak topatu dira alkoholarekiko

menpekotasun sindromea izan dutenenengan (Kucheria eta lank., 1985) eta gauza bera,

marihuanaren erretzaile kronikoengan (Pardo eta lank., 1985).

Gizonezkoei lotutako ugalezintasuna edota ugalurritasunaren inguruan

egindako ikerketak ugariak badira ere, handia da oraindik gai honen inguruan dagoen

ezjakintasuna, batez ere maila metabolikoan ari diren elementu eta prozesuen inguruan.

SARRERA 5

6 Asier Valdivia Doktore-T esia

1.1.1. GIZA HAZIAREN ANALISIA: NORMALTASUNA

ETA PATOLOGIA

Aurrera jarraitu baino lehen, hizkeraren inguruko zenbait zehazpen egin behar

dira, erabiliko ditugun kontzeptu batzuk argituz. Ingurune klinikoan eta zientifikoan,

antzutasuna eta ugalezintasuna ez dira gauza bera, bietan azkeneko emaitza berdina

den arren: seme-alabak lortzeko ezintasuna. Antzutasuna, haurdunaldirik lortzen ez

duen bikoteen kasuan gertatuko litzateke, eta ugalezintasuna, zehazki, haurdunaldia

lortuta, erditzera iristen ez den emakume edo bikoteen kasuan izango litzateke.

Hertsiki, kasu bietan, medikuen laguntzarik gabe haurdunaldi edo ematzerik lortu ezin

duten bikoteei aplikatu dakieke. Lan honetan, bereizigabe erabiliko dira, antzutasuna

nahiz ugalezintasuna. Hala ere, badago beste hirugarren hitz bat defmitzeko:

ugalurritasuna edo ugal eskasia. Ugalurritasuna, ematzea lortzeko probabilitatea

ohizkoa baino txikiagoa den kasutan erabiliko dugu. Hauxe da, gainera, gehienetan

gertatzen den kasua. Bestalde, esan behar dugu ere, frogatutako ugalkortasun bezala,

inoiz seme-alabarik sortzeko gai izan den pertsonen kasuetan onartzen déla

(ugalkortasuna, behinbetirako egoera ez den heinean, kontzeptu honek balio erlatiboa

dauka).

Giza haziaren urtez-urteko kalitatearen eboluzioa aztertu dituzten metaanalisiei

buruz hitzegiten genuenean, lan horien fidagarritasuna zalantzan jar lezaken

arrazoietako bat kontuan hartzen ziren erizpideak azterketa guztietan antzekoak ez

izatea zen. Honela, beharrezkoa egiten da, bai ikerkuntzan bai praktika klinikoan,

zeintzu erizpide erabiltzen ditugu aztertzen diren giza laginak sailkatzeko, eta ikerlari

eta klinikoen arteko informazio elkartrukea egoki eman dadin. Hau da, hazian aztertzen

diren parametroak erreferentzia aniankomunen bidez erabili behar dira.

Aipatzen ari garen haziaren parametro hauek, haziaren azterketa klinikoetan

erabiltzen direnak dira. Hauen artean, espermatozoideen mugikortasuna, denstitsatea,

6 SARRERA

Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacín 7

kopuru osoa, espermatozoide bizien portzentaia, morfología, haziaren bolumen

osoa,...daude. Parametro bakoitzaren nonnaltasuna fmkatzen duten balioak, erizpide

ezberdinetan oinarritzen dira (Tygerberg, OME/WHO,...), baina erabilienak

Osasunerako Munduko Erakundeak proposatzen dituenak dira (OME/WHO, 1999).

SARRERA 7


ALDAGAIA ERREFERENTZIA BALIOA

Haziaren bohimena >2.0 ml

pH >7.2

Espermatozoide-kontzentrazioa >20 x 106 espermatozoide/ml

Espermatozoide-kopurua >40 x 10b espermat./eiakula.

Mugikortasuna

>%50 mugikor (A + B motak)

edota

>%25 mugikortasun progresiboz (A mota)

(isuriaren hurrengo 60 min.etan zehar)

Morfología >%15 forma normalak

Bizitasuna >%50 espermatozoide bizi

Odol-zehila zuriak <1 x 106 zelula/ml

Immunobikorren testa<%50 (esperm. mugikor) atxekitutako

bikorrekin

MAR testa<%50 (esperm. mugikor) partikula

atxekikorrekin

1.1. Taula. Giza haziaren normaltasunerako erreferentzia balioak (OME/WHO, 1999)

Honela, baldintza hauek betetzen ez dituzten giza haziak, patologiko bezala har

daitezke, Hala ere, honelako baldintzak ez betetzeak ez du, halabeharrez,

ugalezintasuna adierazten; gizonezko batek, aipatutako normaltasun balioak baino

murritzagoak izan ditzake bere hazian, eta, hala eta guztiz ere emalketa edota egokiro

bukatzen den haurdunaldia lor dezake. OME-ren normaltasun erizpideak betetzen ez

8 SARRERA


duten hazi-laginak, haziaren patologien terminologiaren bidez sailkatzen dira. Izen

erabilienak:

• Normozoospermia: eiakulatu nórmala, aipatutako erizpidetan oinarrituta.

• Oligozoopermia: Espermatozoideen kontzentrazioa erreferentzia-balioa baino

txikiagoa denean.

• Astenozoospermia: Espermatozoideen mugikortasuna erreferentzia-balioak

baino txikiagoak direnean. Aurrerago azalduko da, zehaztasunez,

espermatozoideen mugikortasunaren sailkapena.

• Teratozoospermia: Espermatozoide normalen (morfologikoki) kopurua,

erreferentzia-balioa baino urriagoa denean.

• Nekrozoospermia: Espematozoide bizien kopurua erreferentzia-balioa baino

baxuagoa denean.

• Azoospermia: Espermatozoiderik ez eiakulatuan.

• Aspermia: Eiakulaturik ez.

(OME/WHO, 1999)

Kasu ezberdinen arteko konbinaketak ere eman daitezke. Honela, hazi

OligoAstenoNekrozoospermiko batek, espermatozoide gutxi, motel eta %50 baino

gehiago hilak izango ditu. Gehienetan, ez dago patología bakar bat soilik azaltzen duen

hazi-laginik. Aipatutakoak ohizkoak badira ere, bestelako kasu edo talde batzuk ere

aipatu genitzake. Esate baterako, kriptozoospermia (oligozoospermiaren muturreko

kasua), hipospermia (2 mi baino gutxiagoko eiakulatuen kasuan),... Esan beharra dago,

gizonezko batek, bi eiakulatu ezberdinetan, balio ezberdinak azal ditzakela.

Horrexegatik, azterketa seminologiko bat baino gehiago egin behar da, diagnostiko

argia lortzeko.

SARRERA 9


1.2. GIZONEZKOEN UGAL APARATUA

1.2.1. GARAPEN ENBRIONARIOA

Enbrioiaren garapenaren lehenengo 6 astetan zehar, bai ar bai emeen kasuan, ugal

egituren garapena ia berdina izaten da. Aldi honetan, zenbait prozesu ematen dira:

- Hirugarren astetik aurrera, Jatorrizko zelula germinalek, saku bitelinotik

migratzen dute, atzekaldeko gorputz-paretaren mesenkimara 6. astean heltzen

direlarik. Bertan, toraxaren 10. segmentuaren mailan gandor genitalen sorrera

eragiten dute. Bertan ere, jatorri mesonefritikoa eta zelomikoa duten Sertoli

zelulen aitzindariak bateratuko dira.

Wolff-en hodiak laugarren astean garatzen dira. Gizonezkoengan geroago

epididimoa eta hodi deferenteak sortaraziko dituzte. Emakumeengan

endakatuko dira. Emakumeengan Müller-en hodiak garatu egingo dira, 6.

astean zehar.

Seigarren astea bukatzean, gizonezkoengan Testikuluen Faktore Mugatzailea

izeneko proteina espresatuko da. Honen ondorio bezala, testikuluen eta ugal hodien

formazioa eta ezberdintzapena gertatuko da oinarrizko ezaugarri sexual primarioekin

batera. Kanpo-genitalak, egitura aitzindari berdinetatik hasten dira sexu bietan.

Zazpigarren astean antzeko itxura azaltzen dute sexu bietan, haurdunaldiaren 12.

astearen bukaera arte. Pubertaroa iritsi arte ez da aldaketa garrantzitsurik gertatuko

ugal-aparatuan. Pubertaroan, jariapen eta ekintza hormonal sakonarekin batera, eta

gorputzeko beste zenbait ezaugarrirekin batera, ugal aparatuaren garapenaren fase berri

batean sartuko gara. Garai honetan, bigarren mailako ezaugarri sexualekin batera (ugal

egituren tamainaren handipena, biloaren agerpena, ahotsaren loditzea,...)

espermatogenesiari hasiera emango zaio.

10 SARRERA

Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacín 11

1.2.2. UGAL-APARATU ARRAREN EGITURAK

1.2.2.1. Testikuluak

Testikuluak androgenoen jariapenerako eta espermatozoideen sorrera eta

metaketarako organo espezializatuak dira. Itxura obalatua duten organo pareak dira.

Jaiotzaren aurrean abdomenaren barrunbetik eskrotorantz jeitsi egiten dira. Eskrotoan

kokatzearen zergatia barrabilen tenperatura, gorputzaren ohizkoa baino baxuagoa (2-

3°C) mantentzeko da. Izan ere, barrabilen tenperatura altuagoa denean

espermatogenesia kaltetua gertatzen omen da (Munkelwitz and Gilbert, 1998;

Zorgniotti, 1980). Barrabilak zenbait atalez osatuta daude,

Tubulu seminiferoak

Barrabilaren bamean dauden ehundaka hodiska bihurri eta era oso trinkoan

paketatuak dauden egiturak dira. Tubuluak lobulu ezberdinetan banatzen dira eta

guztiak Testis Sarean bukatzen dute. Tubuluetan espermatogenesia gertatzen da.

Tubulu hauen aide basalean Sertoli-ren zelulak kokatzen dira. Sertoli zelulak oso zelula

handiak dira. Euren fimtzioa espermatogenesia erregulatzea da. Zelula hauek osatzen

dute odola eta tubuluaren arteko barrera edo muga euren artean eta eurak sortutako

inbaginazioetan espermatogenesian gertatzen diren kordoi germinalak bab esten dira.

Zirrituarteko gunea

Zirrituarteko gunea (intesticium), tubuluen aide basalaren inguruan dago.

Bertan, besteak beste, Leydig zeulak kokatzen dira. Zelula hauek testosterona jariatzen

dute.

Bestelako egiturak

Barrabilaren inguruan, tubuluak biltzen, Tunika Albuginea izeneko geruza lodi

eta fibrotsua dago. Hauen luzapenak diren Pareta Testikularrrak, barrabilaren lobuluak

(non tubulu seminiferoak dauden) banatzen dituzte. Guztia inguratzen eskroto izeneko

SARRERA 11

12 Asier Valdivia Doktote-T esia

zaku-egitura dago. Egitura hau larruazalez eta zenbait rauskuluz (cremaster, dartos)

osatuta dago eta bere funtzioen artean, oso garrantzitsua izaten da testikuhietako

tenperatura konstante mantentzearena. Tubuluak, Rete Testis (testis sarea) izeneko

gune biltzailera igortzen dute euren edukina. Hemendik, hodi eferentetatik, testikulutik

kanpo, epididimora, eramaten dute esperma.

1.2.2.2. Epididimoa

Testikulutik kanpo, Rete Testis-etik, hodi eferenteen bidez epididimo izeneko

duktua dago. Epididimo bi dauzkate gizonek; bana, testikulu bakoitzarentzako.

Geroxeago ikusiko dugun bezala, organo hau oso garrantzitsua da espermatozoideen

heltze-prozesuan eta motilitatean (Cosentino eta Cockett, 1986). Hemen, espermari

haziaren zenbait osagai gehitzen zaizkio. Honela, gametoek ugalketa-prozesurako

ezinbestekoak diren zenbait propietate bereganatzen dituzte. Epididimoa, omodun

guztietan dagoen duktua da, arrain kartilaginotsuetan izan ezik, eta batez ere bame-

emakultzaz ugaltzen diren animalietan dago garatuta (Jones, 1998). Epididimoa,

klasikoki, hiru zatitan banatu izan da: hasierako zatia edo proximala, tarteko

epididimoa eta epididimo kaudala edo bukaerakoa. Epididimoaren luzera espezieen

arabera aldatzen da (Robaire eta Hinton, 2002) baina gizakian 4-5 metrokoa da,

Espermatozoideek bide hori egiteko 3 egunetik gora ematen dute, espezieraren arabera

(Wen eta Yang, 2000). Espermatozoideen heltzean ez ezik, epididimoak espermaren

biltegi bezala egiten du. Bertan, espermatozoideak egun askorako bideragarri mantendu

daitezke.

1.2.2.3. Hodi Deferenteak

Hodi deferentea edo vas deferens, epididimoaren edukina jaso eta uretrara

eramaten duen hodia da. Bere funtzio nagusia espermatozoideak uretrara kanporatzeaz

(prozesu honi emisioa esaten zaio) gain, biltegiarena da. Hauxe da basektomietan

mozten den hodia.

12 SARRERA

Doktore-Tesia Asiei Valdivia Palacín 13

1.2.2.4. Guruin Osagarriak

Badaude, ugal-funtzioaren parte diren zenbait guruin. Hauek uretrarekin

konektatuta daude eta berauen jariakinak oso garrantzitsuak dira ugalkortasunerako.

Hazi-besikulak

Hazi-likidoaren %60a izaten da guruin hauen jariakina. Jariatzen dituzten gaien

artean fruktosa (espermatozoideen elikagai energetiko nagusia), azido askorbikoa eta

prostagladinak daude, besteak beste.

Hazi-besikulan edota bere jariakinean ere aktibitate peptidasiko ezberdinak

topatu izan dira, hala ñola, Dipeptidil Peptidasa II eta IV, A Aminopeptidasa (Vanha-

Perttula eta lank., 1990), Dipeptidil Peptidasa III eta Alanil Aminopetidasa (Agrawal

and Vanha-Perttula, 1987). Beraien funtzioa ezezaguna da oraindik.

Prostata

Gemu-maskuriaren azpikaldean, uretrarekin konektatuta, kokatzen den guruina

da. Osagai asko jariatzen ditu hazi-likidora Hauen artean, poliamidak, azido zitrikoa,

fibrinolisna, fosfatasa azidoa eta kalikreina edo PSA (Prostate-Specific Antigen). Ehun

tubulualbeoarrez eta estroma fibromuskular bâtez osatuta dago. Prostata, adinarekin

handitzen den organo edo guruina da eta kasu askotan gemuaren oztopaketa eragin

dezake. Bestalde, bertan minbiziak sortzeko gune garrantzitsua daukagu

gizonezkoengan; badirudi, minbizi hauen garapenean androgenoak zerikusi handia

dutela, prostatan dagoen AR (androgenoen hartzailea) aktibatzen dituen zenbait bide

zelularren eraginez (Mobbs eta lank, 1980; Kim eta Coetzee, 2004; Porkka eta

Visaporki, 2004; Heinlein eta Chang, 2004).

Bestalde, prostataren jariakina pH azidoa duela esango dugu ere. Gainera,

jariakinen artean prostasoma izeneko besikula mintzakarak daude (aurrerago egingo

dugu hauei buruz), ugalkortasunaren zenbait prozesu garrantzitsu erregulatzen omen

dituztenak.

SARRERA 13


Prostatarekin ere zenbait peptidasa erlazionatu izan dira. PSA edo kalikreinaz

gain, dipeptidil peptidasa IV (DPP IV / CD26) (Vanhoof eta lank., 1992) , APN

entzima (tumoreekin erlazionatuta), APA (Bogenrieder eta lank., 1997), NEP edo

endopeptidasa neutroa (hau ere minbiziekin erlazionatu izan da) (Usmani eta lank.,

2000; Pan eta lank,, 2003; Shen eta lank. 2003) eta P aminopeptidasa (E.C. 3.4.11.9)

(Vanhoof eta lank., 1992) topatu dira (1.1. irudia).

14 SARRERA

Doktore-Tesia Asiet Valdivia Paíacín IS

mûîiulo dorios

tornea vaginal

túnicoCfixxjineo

ve$fcukiSHTHOO!

ompoflo

corxJixio deferente

«vyfvclülos dere ies de lo cobeza rfeJ opicfidimo

epidk>irra>

condiKio fjf epkJkJímaíio

reie lesiis

«fiducie deferente o lo solido de (acoJcicfeJ «ptdídiino

1.1. Irudia. Gizakiaren ugal aparatu arra (Debuse, 1998)

SARRERA 15


1.2.3. ESPERMATOGENESIA

Espermatogenesia, ugal ama-zeluletatik espermatozoideetara doan

ezberdintzapen-prozesuari deitzen diogu. Gameto arren sorrera, edo gameto genesi

maskulinoa ere deitzen zaio. Prozesu hau testikuluetan gertatzen da, tubulu

seminiferoetan, zehazki. Gametogenesiaren prozesua, bi sexuengan, gameto bakoitzak

ugalkuntzan izango duen betebeharrari oso lotua dago. Adibidez, gameto arrak txikiak

eta mugikorrak dira. Euren helburua gameto emea topatzea, berarekin kontaktua egitea

eta fusionatzea izaten da. Gameto emea, aldiz, normalean, espermatozoidea baino

mugikortasun gutxiagokoa eta handiagoa izaten ohi da eta bere betebeharra, emaídua

izateko “gai izatea” da.

Gametogenesia, garapen enbrionariotik hasten den prozesua da. Izan ere, ia

lehenengo zatiketa enbrionarioetatik ezberdintzen da zelula germinalen Ierro zelularra.

Espermatogenesia, berez, pubertaroan gertatzen bada ere, zelula germinalak ez daude

lo umekiaren garapen fasean; haurdunaldiaren 24-25. egunetan jatorrizko zelula

germinalak bizkarraldeko zaku bitelinoan identifikatu daitezke, garapenean dauden

testikuluetara migratzen dute eta euren muinean txertatzen dira (Starz-Gaiano eta

Lehman, 2001; Sutton, 2000; Raz, 2004). Haurdunaldiaren zehar, oinarrizko zelula

germinal hauek, zenbait apoptosi eta ugalketa prozesu bortitz pairatzen dituzte (Tres

eta lank., 2004). Behin oinarrizko zelula germinal hauek testikuluetan txertatu eta

ugaldu, ugal ama-zelula betzala ezagutuko ditugu eta euren artean eta testikuluetako

zelula somatikoekin (Sertoli,...) harreman estuak sortuko dira.

Testikuluetako tubulu seminiferoetan gametoen sorrera atsedenenean

mantentzen da hautzaroaren zehar, pubertaroan, gonadotropinen (FSH eta LH)

mailaren igoerarekin batera, testikuluetako Leydig zelulek testosterona hormona

jariatuko dute eta honekin batera espermatogenesia hasten da. Prozesu hau bizitza

osoan zehar mantendu egingo da, zaharízaroan gutxipen txiki bat nabaria den arren.

16 SARRERA

Doktore-Tesia Asief Valdivia Palacín 17

Testikuluetako tubuluetan txertatutako ama-zelula germinal hauei,

espermatogonia izena emango diegu. Hauen funtzioa mitosiren bidez zatitzea da,

honela, hasiera emango diote espermatozoideak sotzeko zatiketa eta ezberdintzapen

prozesuari. Espermatogoniaren zatiketa mitotikoaren ondorioz, espermatozito

primario ak izango ditugu, eta hauengan gertatuko da lehenengo zatiketa meiotikoa,

honetatik bi espermatozito sekundario agertuz. Hauengan ematen da bigarren zatiketa

meiotikoa, eta horren ondorioz, lau espermatida (haploideak) izango ditugu. Beraz,

laburbilduz, espermatogonia batetik, espermatozito primario bat izango dugu; bertatik

bi espermatozito sekundario sortuko dira eta azkenik, lau espermatida. Espermatida

hauek ez dute zatiketa gehiagorik pairatuko, ezberdintzapenez espermatozoidetan

bilakatuko direlarik. Espertogonietatik espermatozoideetarako prozesua dugu, hain

zuzen ere, espermatogenesia.

Ondoz ondoko zatiketa hauek nahiko konplexuak dira, besteak beste, bestelako

prozesu molekular eta morfologiko askorekin batera gertatzen direlako. Gainera,

zatiketa bakoitzaren ondoko produktuak ez dira guztiz banatzen (ez dira zelula

índependienteak bilakatzen) espermatozoide bihurtu arte. Honela, zatiketa ez-oso

hauek, elkarkonektatutako zelula-klon luzeak sortarazten dituzte. Badirudi,

komunikazio interzelular hau oso baliogarria izaten omen déla zelula hauen garapena

sinkronizatzeko. Porzesu guztia, Sertoli zelulen bidez ere, eraenduta dago.

Espermatogenesiaren barruan, espermiogenesi izeneko prozesua dugu. Hemen,

espermatida bakoitzetik espermatozoide bideragarri bat lortzeko ezberdintzapen

prozesuari esaten zaio. Prozesu honek zelularen aldaketa morfologiko eta molekular

sakonak sortaraziko di tu. Aldaketa aipagarrienak nukleoaren birkokapen exzentrikoa

eta kromatinaren paketamendu trinkoa, akrosomaren garapena, axonema eta

flageloaren garapena eta espermatozoidearen mintz plasmatikoan gertatzen diren

zenbait aldaketa, izango dira.

Gizakiarengan, ziklo espermatogeniko bakoitza 65-70 egun irauten du. Hala

ere, ziklo bakoitza bukatu baino lehen beste ziklo berri batzuk hasten dira, 2-3 asteko

erregulartasunez. Honela, tubulu bakoitzean garapen egoera ezberdinetan dauden

SARRERA 17

18 As i er Valdivia Doktore-Tesia

zelulak izango ditugu, “uhin espermatogeniko” bat osatzen (Bustos-Obregon eta lank.,

1975; Schulze, 1982). Egun bakoitzeko, 200 milioi espermatozoide sortarazten ditu

gizon osasuntsu batek (Aniann eta Howards, 1980).

Badirudi, metabolismo biopeptidikoan parte hartzen duten peptidasek,

espermatogenesiari lotutako funtzioa badituztela. Hala nola, Puromizinarekiko

sentikorra den Aminopeptidasaren (PSA) eza duten arratoiengan antzutasuna,

kopularako iharduera falta eta espermatogenesi desparekatua behatu izan da, ziuraski

Sertoli zeluletan PSA-k duen espresio maila altuarekin erlazionatuta (Osada eta lank.

2001). Bestalde, Sertoli zeluletan entzefalinen, P substantziaren eta bradikininaren

apurketa gertatzen dela ikusi ondoren, apurketa honen arduradunak

metaloendopeptidasa neutroak, angiotensinaren entzima bihurtzailea eta

aminopeptidasak zirela behatu zen. Izan ere, entzima hauek apurten dituzten hormona

peptidikoak, testikuluetako zelulen erregulazio endokrino, autokrino eta parakrinoan

garrantzia dutela topatu izan da (Monsees eta lank., 1998). B aminopeptidasa ere

deskribatua izan da testikuluetan, espermatogenesiaren fase berantiarretan (Foiulon eta

lank. 1997; Cadel eta lank., 1995).


1.3. ESPERMATOZOIDEAREN EGITURA

ETA PROZESU FISIOLOGIKOAK

XVÏÏ. mendean Antoni van Leeuwenhoek-ek, asraatu berna zuen bere

mikroskopioaz, espermatozoideak behatu zituenetik, asko ikertu egin da hauen

inguruan. Artile-merkatari honek ahariaren hazian behatutako “animalkulu” horiek,

emalkuntzarekin harremandu zituen, hasiera batean ausartu ez bazen ere, orduko

komunitate zientifikoak bere aurkikuntza onartuko ez zuelakoan.

Gaur egun, haziaren azterketa oso faktore garrantzitsua izaten da

ugalkortasunaren biologiaren ikasketarako eta ugaleztintasunaren zergatien

“screening”-a egiteko.

1.3.1. ESPERMATOZOIDEAREN EGITURA

Espermatozoideak oso zelula espezializatuak dira. Beren funtzioa ugal zelula

emearaino iristea eta hau emaltzea izaten da eta helburu hauetarako oso morfología

zehatzekoak dira. Hala ere, espermatozoideen itxura, espeziez espezie aldatzen déla

esan beharra dago, bakoitza espeziearen ugal-baldintzei egokitua. Honela ere,

espermatozoideen morfología erizpide taxonomiko bezala erabili izan da, hurbil

dauden espezieen arteko bereizketa egiteko (Phillips, 1983).

Badaude zenbait ezaugarri amankomuneko, espermatozoide gehienetan.

Nukleoa, akrosoma eta flageloa hauen adibide dira. Nukleoaren baitan oso

kondentsazio maila handiko kromatina bat izaten da. Akrosomaren kasuan, arraultza

edo gameto emearen inguruan dauden geruzak zeharkatzen laguntzen du. Flageloa,

zelularen higidurarako organulua dugu, baina ez da ezaugarri unibertsala. Beraz, ezin

da kontsideratu morfología “tipiko” bat dagoenik.

SARRERA 19


Ugaztunen espermatozoidea bi zati nagusitan ezberdindu dezakegu: burua eta

isatsa. Buruaren barruan nukleoa eta akrosoma izango dira egitura aipagarrienak.

Akrosoma, buruaren aide apikalean kokatzen da eta, nukleoaren zati handi bat

inguratzen kokatzen da. Akrosomaren atzetik geratzen den buruaren zatia, eskualde

post-akrosomala deitzen da. Isatsa, morfologikoki, lau zatitan banatu daiteke: lepoa,

tarteko zatikia, zatiki nagusia eta bukaerako zatikia. Lepoa, burua eta isatsaren arteko

giltzadura izaten da. Tarteko zatikiaren ezaugarri nagusia, isatsaren egitura

funtzionalen inguruan dagoen, mitokondriez osatutako, geruza da.

Espermatozoidearen burua ez du mikroskopioz ezberdintzeko azpiegitura

nabaririk. Barnekaldea nukleoaz beteta dago, bere kromatina konpaktatuak xehetasun

bereizgarri handirik ematen ez duelarik. Nukleoaren inguruan eta mintz plasmatikoaren

aide apikalaz inguratua, akrosoma izeneko egitura besikularra dago. Egitura honen

barruan emalkuntzarako beharrezkoak izango diren entzimak daude. Hauen artean

akrosina, proakrosina, hialuronidasa, beta-glukuronidasa, beta-glukosidasa, fosfatasa

azidoa, N-azetil-glukosaminidasa, beta-galaktosidasa,... (Mack eta lank., 1983).

Akrosomaren atzekaldean kokatzen da akrosomaren zatiki ekuatoriala. Honen

garrantzia, hemendik gertatzen déla espermatozoidea eta arraultzaren arteko hasierako

kontaktua emalkuntzaren prozesuan.

Espermatozoidearen isatsa, gametoaren mugimendua ahalbidetzeko egitura

konplexua eta espezializatua osatzen du. Mugimendua sortzen duen egitura

ultraestrukturala axonema deitzen da. Axonema, 2 mikortubulu zentralez eta hauek

inguratzen kokatzen diren 9 mikortubulu-bikotez osatutako egitura da. Mikrotubulu-

bikote bakoitzeko mikrotubuluak ezberdinak dira (bata osoa, bestea C itxurakoa). Bai

erdialdeko bi mikrotubulu osoak, bai inguruko bikote bakoitzeko mikrotubulu osoek 13

protofiruz osatuta daude. C itxurako, bikoteetako mikrotubuluak 10 protofiruz osatuta

dago. Protofiru hauek tubulinaz eratuta daude. Inguruko bikoteen C moduko

mikrotubuluetan ere dineina 1 dago. Proteina honek ATPasa aktibitatea dauka eta

energia kimikoa, mugimendurako energía mekaniko bihurtzeko prozesua berak

burutzen du (Ogawa eta lank., 1977). Axonemaren egitura flageloaren zatiki guztietan

20 SARRERA

Doktore-T esia Asicf Valdivia Palacin 21

mantenduko da (9 + 2 mikrotubuluen egitura). Flageloaren beste zatiki aipagarri bat

zatiki ertaina dugu. Hemen, axonema inguratzen, mitokondriaz osatutako geruza bat

dago. Dimdienez, zatiki honetan sortzen da gametoaren mugimendurako beharrezkoa

den ATPa.

SARRERA 21


A crosom a

M em b fan a superficial Vacuola

Cubierta ontorior de la cabeza Cutáorla posterior de ta cabeza

Cuello

C uerp o

M itocottctôas

Pieza principal de la cola

Pieza torminal do ia cola

1.2. Irudia. Giza espermatozoidearen eskema. (Guyton eta Hall, 1997)

22 SARRERA


1.3.2. ESPERMATOZOIDEAREN HELTZEA

Tubulu seminiferoetan espermatogenesia eta espermiogenesia direlako

prozesuak burutu direnean, espermiazioa, edo espermatozoidearen, ugal-zelula

aintzindariekin osatutako sintzitiotik gertatuko da askapena. Prozesu honetan,

zitoplasmaren soberakinak erauzi behar dira. Honetarako, zitoplasma

espermatozoidearen lepoan metatzen da, hondar-gorputza deituriko lobulua osatuz.

Hondar-gorputza hau Sertoli zelulek fagozitatzen dute eta honez gero, espermatozoidea

aske gelditzen da. Baina erauzketa prozesuaren ondorioz, espermatozoidearen lepoan

tanta-zitoplasmatikoa izeneko hondarra geldituko da. Tanta hau erauztea izango da,

adibidez, espermatozoidearen heltzearekin harremanduriko aldaketa morfologiko bat.

Honela, espermatozoide askeak epididimora iragango dira. Epididimoan

aldaketa ugari jasango dituzte oraindik ere, sortu-berriko espermatozoideak. Izan ere,

barrabiletatik irtetzen diren espermatozoideak ez dira oraindik oozitoa emaltzeko gai

ugaztun askotan. Abilezia hau lortzeko aipatutako aldaketa morfologiko, fisiologiko eta

biokimiko sakonak eman behar izango dira. Aldaketa hauei guztiei,

espermatozoidearen heltze prozesua esaten zaie.

Heltze prozesuaxen helburu nagusiak edota espermatozoideak bereganatzen

dituen gaitasun espezifiko garrantzitsuenak bi dira: mugikortasunaren lorpena eta

oozitoa ezagutu eta berarekin fusionatzeko gaitasuna (Gatti eta lank., 2004). Heltze

prozesuaren aide garrantzitsuena epididimoan ematen bada ere, emakumearen ugal-

aparatuan bukatu egiten da, kapazitazioa eta erreakzio akrosomikoa bezalako

prozesuekin. Egia esan, espermatozoidea oozitoarekin fusionatzen den arte, etengabe

aldaketak jasaten dituen zelula izaten da.

Mugikortasunaren kasuan, espermatozoideak gradualki bereganatu egiten dute,

epididimoaren hasierako zatian zelula gehienak mugikortasunik gabekoak izatetik,

epididimoaren zati kaudalean kopuru maximora iritsi arte. Prozesu hau AMP ziklikoa

eta ATP-aren maila intrazelularren igoerari lotuta dago. Dirudienez, AMP ziklikoaren

SARRERA 23


igoerak (Dacheux eta Paquignon, 1980), besteak beste, bultzatzen ditu

mugikortasunaren mekanismo intrazeluarrak epididimoan. Izan ere, kalmodulinaren

maila zelularraren erorketa eta AMP ziklikoaren menpeko proteina kinasa

aktibitatearen igoera nabaria, korrelazioa dute flageloaren mugikortasunaren

hasierarekin (Pariset eta lank., 1985). Motilitatearen bereganatzean duten bestelako

faktore garrantzitsuak inguruneko ioien presentzia (kaltzioa, pH, bikarbonatoa) (Gatti

eta lank., 1993; Wade eta lank., 2003) eta sustrato energetikoen egote ala ez egotea,

ATP maila baxuak nahiz altuak mantendu ahal izateko.

Epididimoak proteina ugari jariatzen ditu. Izan ere, barrabiletatik datorren

jariakina desagertu egiten da epididimoaren hasierako zatikiaren aide proximalean eta

jariakin berriak topatuko ditugu. Jariapen epididimalaren ikuspegitik, zatiki

garrantzitsuenak epididimoaren hasiera edo aide apikala eta tartekoa edo corpus-a dira

(Gatti eta lank., 2004).

Bestalde, epididimoan, heltze-prozesuan, aldaketa garrantzitsuak gertatzen dira

espermatozoidearen mintzean. Honen adibidea dugu, espermatozoidearen mintzean,

espermatogenesiaren ondoren, dagoen AEB-aren (Angiotentsinaren Entzima

Bihurtzailea) isoforma germ in alar en (gAEB) desagerpena edo erauzketa (Gatti eta

lank., 1999; Metayer eta lank., 2002). Proteina ugari, izaten dira mintzetik erauziak

edota eraldatuak, heltze prozesuan zehar. Prozesua ez da ezaguna baina serin proteasak

prozesuan zerikusia dutela uste da (Frayne eta lank., 1998).

Epididimotik igarotzen direla, espermatozoideek ere proteina berriak

bereganatzen dituzte, beren mintzean txertatzen direnak. Prozesu hauek bideretzen

dituzten mekanismoak oraindik nahiko ezezagunak dira, baina hiru txertatzeko modu

orokor proposatzen dira: indar gutxiko mintza-proteina elkarteak, prozesamendu

proteolitikoaren ondoko txertaketa eta ezaugarri hidrofobikoak dituzten proteinak

izatea (Gatti eta lank., 2004). Bestelako txertaketak, epididimoko epitelioak askatutako

besikulen bidezkoak (Saez eta lank., 2003), ere eman daitezkela proposatu da.

24 SARRERA

Heltze prozesua, peptidasei lotutako prozesua da ere. Adibidez, Endopeptidasa

Neutroa, traktu genitalean heltzearekin erlazionatu izan da (Erdos eta lank., 1985).


SARRERA 25


1.3.3. ESPERMATOZOIDEAREN MOTILITATEA

Espermatozoideak, oozitoak ez bezala, zelula mugikorrak dira. Mugikortasun

hau espermatozoideen zereginerako ezinbesteko ezaugarria da. Honela, ugal-aparatu

arretik irten eta gameto emeraino iritsi behar dira, beren material genetikoa baldintza

estruktural egokian mantentzen dutela eta, oozitoa inguratzen dituzten geruzak

zeharkatzeko gaitasuna mantenduz, emalketa eman dadin. Honetarako, flageloaren

mugimenduez baliatzen da. Mugimendu honen oinaman, erreakzio kimiko ugari

daude. Espermatozoideen mugimendu flagelarra oso konplexua da eta ez da lan honen

helburua hemen aztertzea.

Gizakien espermatozoideen batazbesteko, Ierro zuzeneko abiadura 30 ¡j.m

segundukoa da 37°C tan, eta hau tenperaturaren arabera aldatuko da (Kraemer eta

lank., 1998). Espermatozoidearen flageloaren mugimenduaren oinarri fisikoa edo

mekanikoa, axonemaren fíruen (mikrotubuluen) elkarren arteko mugimendu erlatiboan

datza. Axoneman, 250 bat proteina parte hartzen dute; hauen artean proteina

zitoeskeletikoak (tubulina), proteina motoreak, proteina txaperonak, Ca++ lotzen duten

proteinak eta proteina kinasak nahiz fosfatasak, besteak beste (Inaba, 2003). Dineinak,

axonemaren tubuluei atxekitutako “besoak” osatzen dituzte. ATPasa aktibitatea

daukaten, kate peptidiko anitzeko proteinak dira. Proteina-proteina elkarrekintzen

bidez, ondoz ondoko tubuluen arteko irristaduraren arduradunak dira. Euren

ñintzionamendurako ATPa, erdiko zatikiaren, axonemaren inguruko, mitokondrioek

ekoizten dute.

Mugikortasunaren erregulazioa eta aktibazioa AMP ziklikoaren menpeko

prozesua da. AMP ziklikoak , AMP ziklikoaren menpeko proteina kinasa aktibatuko

du. proteina kinasa honek eta berak aktibatutako tirosina kinasak flageloaren proteina

egituralak (dineinak,...) fosforilatuko dituzte, fíruen arteko mugimendua sortaraziz.

Zelularen AMP ziklikoaren maila igotzeko, Ca++ ioiaren zelula kanpotiko bameraketa

eta espermatozoidearen Ca** bame-biltegien hustuketa gertatu behar da. Ca++-k,

m SARRERA


kalmodulinaren bidez, adenilato ziklasa aktibaizen duela honek AMP ziklikoa

ekoitziko du.

Espermatozoideen motilitatea eta kapazitazioa elkarri lotutako prozesualc dira.

Esan daiteke pareko prozesuak direla, izan ere, kapazitazioaren ondorioetako bat

mugikortasun espermatikoaren aktibazioa edota hiperaktibazioa da. Beraz,

kapazitazioarengan eragiten dute zenbait faktore, mugikortasunean ere eragina daukate.

Hala nola, zelula bameko pH-aren alkalinizazioa (dineinen aktibaziorako

ezinbestekoa), ioien elkartrukeak (sodio bameratzea,...), mintzeko kolesterol

edukinaren aldaketa,...

Espermatozoidearen motilitatearen piztean sustantzia askok zerikusia dute. “/«

vitro" egindako mugikortasunaren estimulazioan, xantinak, nukleotidoak, kalikreina,

kamitina,... erabili izan dira (Amelar eta lank., 1980). Aurrerago ikusiko dugu ere,

hainbat sustantziek (peptidoak) duten eragina, besteak beste, mugikortasunean.

SARRERA 27


1.3.4. KAPAZITAZIOA

Kapazitazioa espermatozoidearen heltzearen prozesu bat da, ugaztunetan

bakarrik gertatzen dena (Ramalho-Santos eta lank., 2002). Prozesu honen lehenengo

berriak 1951. urtean jaso ziren, ugaztunen espermatozoideek zenbait ordu emearen

ugal traktuan eman behar zituztela, obulua emaltzeko gaitasuna garatzeko (Austin,

1951; Chang, 1951). Kapazitazioa, beraz, espermatozoideek obulua emaltzeko

gaitasuna lortzeko jasan behar dituen aldaketen bilduma bezala definitu daiteke.

Bilduma honen barman, prozesu ezberdinak kontuan hartzen dira. Hauen

artean, arnasketa zelularraren igoera eta mugikortasun espermatikoaren patroiaren

aldaketa (hiperaktibazioa) (Yanagimachi, 1994), espermatozoidearen mintzetik

kolesterolaren erauzketa (Cross, 1998), mintz espermatikoen desegonkortzea

(Hammerstedt eta Parks, 1987), zelularen bameko pHa (bikarbonatoaren sarreragatik)

eta kaltzio mailen igoera (Vrenenburgh eta Parrish, 1995), bigarren mezularien zenbait

sistemen aktibazioa (Duncan eta Fraser, 1993), etab. Aldaketa garrantzitsuena

espermatozoidearengan, erreakzio akrosomikoa jasateko abileziaren bereganatzea da.

Kapazitazioaren prozesua oso lotuta dago, espermatozoidearen mintzarengan gertatzen

diren fluidotasunaren aldaketekin, ioien zelula bameko mailen aldaketekin eta

zelularen metabolismoaren aldaketarekin (Yanagimachi, 1994). Bestalde, badirudi,

duela denbora gutxi proposatutako espermatozoideen teoría kimiotaktikoarekin lotuta,

kapazitazioarekin hatera garatzen dira espermatozoidearen jokabide kimiotaktikoa.

Honekin harremanean ere, kapazitazioa prozesu itzulezina (espermatozoide bakoitza

bakarrik kapazitatu daiteke behin bere bizitza osoan) eta iragankorra (isuritutako

espermatozoide-populazio osoan ez dira espermatozoide guztiak batera kapazitatzen;

populazioa egoera kapazitatu-deskapazitatu ezberdinetatik igaro daiteke) déla esan

behar da (Cohen-Dayag eta lank., 1995).

Kapazitazioaren oinarrian prozesu biokimiko eta molekular konplexuak daude.

Prozesu honetan, mintzeko kolesterolaren proteina hartzaile solugarrietarantz

(albúmina) transferentzia gertatzen da (Cross, 1998). Honek, besteak beste, mintzaren

28 SARRERA


isurkortasuna aldatuko du, erreakzio akrosomikorako baldintzak erraztuz. Bestalde,

dirudienez, espennatozoidearen prozesu honetan inplikatutako zelulabameko

seinalizazio bideen artean, kaltzioaren menpekoak, AMP ziklikoaren menpekoak,

kinasen menpekoak eta REDOX baldintzen menpeko seinalizazio bideak ditugu. Bide

hauen arteko elkargurutzamenduak ere badaude (Baldi eta lank., 2002).

Kapazitazioan, epididimoko heltze prozesuari buruz komentatzen genuen

bezala, espermatozoidearen mintzaren aldaketak ez dira gertatzen espermatozoidearen

bameko espresio genikoagatik (edo ez, behintzat, maila adierazgarrian). Aldaketa

hauek inguruneko (plasma seminaleko, emearen ugal-hodiaren epitelioko,...)

substantziak eta molekulak bereganatzen lortzen dira. Kapazitazioaren prozesua 5-6

orduz luzatu daiteke gizakiaren kasuan (Browder eta lank., 1991).

Aurrerago aipatuko dugun bezala, jatorri prostatikoa duten eta plasma

seminalean dauden prostasoma izeneko besikulak, espermatozoidearen kapazitatzeko

gaitasuna murrizten dute. Besikula hauek kolesterolean joriak izaten dira, eta hau dela

eta, espermatozoidearekin baginan fusionatzean, espermatozoide-mintzaren

kolesterol/fosfolipido ratio-a aldatzen da, kapazitazioa zailduz. Gertakari honen

azalpen bezala, proposatu izan da, hauen fiintzioa espermatozoideen kaltzio-mailak

igotzea izatea, baina behar baino goizago erreakzio akrosomikorik eman gabe (Arienti

eta lank., 2004).

Peptido erregulatzaileak eta bere sistemen elementu erregulatzaileak

(hartzaileak, peptidasak,...) partehartzen omen dute kapazitazioaren prozesuan. Hala

nola, angiotentsina II-aren hartzaileak eta angiotensinaren entzima bihurtzailea (AEB),

(angiotentsinaz gain, entzefalinak degradatzen dituena, besteak beste) behatu izan dira

espermatozoidearen mintzean, Inteleukina 6 bitartekaria ere, kapazitazioa eta erreakzio

akrosomikoa estimulatzen duela deskribatu da. TRH-a eta honen antzeko peptidoak

(FPP, Gln-FPP,...) kapazitazio prozesuan parte hartzen dutela ikusi da (Fraser eta

Adeoya-Osiwa, 2001). Hala ere, FPP-ren kasuan behintzat, kapazitazioa bultzatu egiten

da kapazitatu gabeko zeluletan, baina erreakzio akrosomikoa, aldiz, inhibitu egiten da,

AMPc-ren ekoizpena erregulatuz.

SARRERA 29


1.3.5. ERREAKZIO AKROSOMIKOA

Espermatozoidearen erreakzio akrosomikoa akrosomaren kanpo aldeko mintza

eta espermatozoidearen mintz plasmatikoaren arteko fusio anitzak bame hartzen duen

prozesu exozitikoa da. Erreakzio akrosomikoa kapazitazioaren ondoren gertatzen da,

eta espermatozoidea kumulu-zelulen geruza (Corona Radiata) zeharkatzean hasten da.

Prozesu honen bidez akrosomaren edukina zelulatik kanporatua izaten da.

Akrosomaren edukinaren funtzio nagusia obuluaren inguruan dagoen geruzaren (Zona

Pellucida) zenbait osagai degradatzea da eta, ondorioz, emaltzea posible egitea,

Honela, erreakzio akrosomikoa momentu egokian ematea oso garrantzitsua da, bestela

emaltze prozesu osoak porrot egin dezake.

Akrosomaren bamean enztima litiko ugari daude. Euren artean, proteasak,

glukosidasak (Zona Pellucida-ren glukoproteinen geruzeko karbohidratoengan eragiten

dutenak) eta fosfatasa daude. Entzima akrosomiko ugarienen artean akrosina,

proakrosina, fosfatasa azidoa, beta-glukuronidasa, hialuronidasa, beta-glukosidasa,

beta-N-azetilglukosaminidasa, beta-galaktosidasa eta beta-N-azetilgalaktosaminidasa

ditugu, besteak beste (Mack eta lank., 1983).

Prozesu hau aktibatzeko progesteronaren estimulazioa eta ZP3-aren (Zona

Pellucida Protein 3) espermatozoidearen mintzarekin lotzea behar da (Baldi eta lank.,

2002). Orain déla gutxi, espermatozoidearen mintzeko aide apikalean progesteronaren

hartzaile ez-genomikoak deskribatu izan dira (Tesarik eta lank., 1992; Baldi eta lank,

1998). Badirudi, hauen efektuak eta ZP3-ren loturarenak, kaltzio maila intrazelularrak

nabariki igotzearen (300-500 nM) (Breitbart, 2002), ondorioa dakartela (Baldi, 2002),

eta honekin batera, erreakzio akrosomikoaren piztea.

30 SARRERA

Doktore-T esia Asiet Valdivia Palacin 31

1.4. HAZIAREN BESTELAKO OSAGAIAK

Espermatozoideez gain, ejakulatuan bestelako gaiak topatzen ditugu. Gai hauek,

ugal-aparatuaren bestelako guruin eta egiturek jariatzen dituzte. Gai guztien baturak

(osagai zelularra eta osagai jariatua) hazia osatzen du.

1.4.1. LIKIDO SEMINAL A

Osagai zelularra inguratzen duen gai likidoa. Honen parterik gehiena besikula

edo guruin seminaletatik (haziaren % 60a), prostatatik (%30a) eta Cowper-en

guruinetatik (guruin bulbouretaletatik) dator, eta Cowper-en jariakinak eta epididimotik

datorren espermak haziaren gainontzeko % 10a osatzen dute.

Prostataren sekrezioa, azidoa izaten da eta honen osagai nagusiak fosfatasa

azidoa, zink-a, fibrinolisina eta azido zitrikoa dira, besteak beste. Besikula seminalen

jariakina, ordea, basikoa izaten da eta bere osagaien artean espermatozoidearen iturri

energetiko oinarrizkoa osatzen duten fruktosa eta glukosa daude, prostaglandina,

fibrinogenoa eta bikarbonatoarekin batera. Cowper guruinen jariapena alkalinoa da.

Azido askorbikoa eta neuropeptido eta hormona ezberdinak ere topatu izan dira likido

seminalean. Haziaren eta, beraz, likido seminalaren pHa 7’2 eta 7’8-ren artean egon

ohi da, gizonezko osasuntsuengan.

Likido seminalaren osagaien funtzioak anitzak dira. Euren artean ATP-aren

ekoizpenerako sustrato energetikoak gehitu (fruktosa), motilitatea eragin eta

bideragarritasuna mantendu, espermatozoideen oxidazioa ekidin (azido askorbikoa,...),

eiakulatutako haziaren koagulazioa lehenbizi (fibrinogeno, semenogelina...) eta

likuefakzio edo urtzea ondoren (fibrinolisina).

SARRERA 31


1.4.2. PROSTASOMAR

Prostasomak, jatorri prostatikoa duten besikula txikiak dira (150-200 nm-ko

batazbesteko diametroa). Ronquist eta lankideek deskribatu zituzten lehenengoz

(Ronquist eta Brody, 1985). Hauen antzeko besikulak deskribatu izan dira beste

animalien plasma seminalean, baina askotan, hauen osagaiak eta funtzioak ez dira

gizakiarengan ematen diren berberak (Arienti eta lank., 2004).

Prostasomen osagai lipidiko nagusiak kolesterol eta esfingomielina dira

gehienbat, aldiz fosfatidilkolina ez da horren ugaria (Arvidson eta Iank., 1989; Arienti

eta lank., 1998). Hau garrantzitsua da espermatozoideen mintzaren osagai lipidikoa

kontrako antolaketa azaltzen duelako, fosfolipidoen edukina, kolesterola eta

esfmgomielinarena baino ugariagoa da. Hau, garrantzitsua da lehenago aipatutako,

kapazitazio prozesuan, kolesterolaren parte handiena mintz espermatikotik erauzia

izaten delako (Cross, 1998).

Osagai lipidikoaz gain, prostasomek ioi eta molekula txiki ugari (C a^’ Zn'1-1',

GDP, ADP, ATP) eta entzima anitz, hala nola, A fosfolipasa, ATPasa eta peptidasak

(Arienti eta lank., 2004). Prostasometako proteina ugari (139) izan dira identifikatuak

(Utleg eta lank., 2003). Horien artean, %33’8a entzimak ziren, proteina garraiotzaileak

%19a, proteina txaperonak %5’8a, GTP proteinak %14’4a eta seinaleen transdukzio

proteinak %17’3.

Bukatzeko, prostasometan markatzaile neuroendokrino ezberdinak deskribatu

dira. Hauen artean kromogranina B, Y neuropeptidoa eta hesteko peptido basoaktiboa,

adibidez (Stridsberger eta lank., 1996).

Prostasomen funtzio fisiologikoen artean espermatozoideen mugikortasuna

estimulatzea (Stegmayr eta Ronquist, 1982), haziaren urtzea (Lilja eta Laurel, 1984),

immunosupresioa (Kelly, 1995), bakterioen aurkako ekintza (Carlsson eta lank., 2000)

eta ekintza antioxidantea (Saez eta lank., 1998).

32 SARRERA

Doktore-Tesia Asiet Valdivia Palacín 33

Prostasomak espermatozoidearekin fusionatzen direla ikusi da (Arienti eta

lank., 1997). Fusio prozesu hau pH eta proteinen menpekoa déla behatu da. Fusio-

portzentaia, pH-a jeisten den heinean handitzen doa eta gutxitzen da, prostasoma eta

espermatozo ideen proteinen aldibereko deuseztearekin. Prostasoma eta

espermatozoideen arteko fusioa pH 5-ean ikertua izaten ohi da, baina 6 eta 7-ko pHtan

ere antzeman daiteke, pH 8-an desagertuz. pH aren aldaketa txikiek fusio prozesua

piztu dezakete. Isuriketa zatikatuaren (split ejaculation) lehenengo zatikiak, prostataren

jariakinarekin, hazi osoa baino azidoagoa dena, elkartu egiten dira, fusio hau erraztuz.

Bestalde, ugal hodi emearen pH azidoak fusio prozesua erraztu dezake.

Espermatozoide eta prostasomen arteko fusioa ez da oso handia, oso absolutua

(%10-20), baldintzarik onenetan ere, baina bada nahiko prozesu azkarra (10 bat

minututan bukatu egiten dena) (Arienti eta lank., 1997). Badirudi azkartasun hori oso

garrantzitsua dela funtzio fisiologikoaren aldetik.

Prostasomekin lotutako beste gertakari bat, espermatozoideetan kaltzioaren

maila intrazelularren igoera da. Prostasomak espermátozoideekin fusionatzean kaltzio

pultso bat sortzen da. Kaltzio ioiaren maila zelularrak kapazitazioa eta erreakzio

akrosomikoa pizteko garrantzi handia du. Aldiz, prostasomengan joria den kolesterolak

kapazitazioa inhibitzen du (Cross, 1998; Travis eta Kopf, 2002). Bi estimulu

kontrajarri hauen emaitza edo ondorio fisiologikoa espermatozoideen aktibazioa da,

mugikortasuna handituz, baina denboraz kanpoko erreakzio akrosomiko goiztiarra

galeraziz.

SARRERA 33


1.5. PEPTIDO ERREGULATZAILEEN

GARRANTZIFISIOLOGIKOA

l.S.1. PEPTIDO ERREGULATZAILEAK

Gure gorputzeko organo eta ehunen integrazio funtzionalean, ezinbestekoa

izaten da zelulen arteko komunikazio-sistema egokia existitzea. Zenbait zelulek (zelula

miokardikoek, esate baterako) komunikazio elektriko zuzenaz komunikatzen dira euren

artean. Hala ere, zelulen arteko komunikazio biderik hedatuenak oinarri kimikoa dute

(nerbio sistemaren sinapsietako neurotransmisoreak, sistema endokrinoko hormonak,

Sistema Immunearean bitartekari kimikoak...). Komunikazio kimikoan parte hartzen

duten sustantziak izaera kimiko oso anitzekoak izan daitezke (lipidikoak, aminoazido

eraldatuak,...). Sustantzia horien artean aktibitate biologikoa duten peptidoak daude.

Biopeptido, peptido erregulatzaile, neuropeptido, peptido bioaktibo edo hormona

peptidiko izenez ere ezagutzen diren sustantzia hauek.

Peptidoen partehartzea zelulen arteko komunikazio sisteman, eta bereziki

neuronen artean, honako aurkikuntzei esker ezarri zen:

1.- Ordurarte hipotalamikotzat hartutako hormonak, hipotalamo kanpoko

NSZeko guneetan topatzea (Leppaluoto eta lank., 1978)

2.- Hartzaile opioideekin selektiboki lortzeko gai diren peptidoen aurkikuntza

NSZ-ean (Simon, 1973); (Terenius, 1973)

3.- Horma gastrointestinalean edo erlazionaturiko guruinetan deskribatutako

peptidoen aurkikuntza garunean (Von Euler eta Pemow, 1977)

M SARRERA

Doktoie-Tesia Asiet Valdivia Palacín 35

4.- Oxitozina eta basopresina (Kelly eta Renaud, 1978) eta hipofisi-hormonen

jariapena kontrolatzen duten hipotalarao-hormonen jatorri neuronalaren aurkikuntza.

Horrek, ugaztunetan neurona peptidergikoaren kontzeptua ezarri zuen (Scharrer, 1978).


Hurrengo taulan, gorputzean isolaíutako peptido bioaktibo garrantzitsuenak

aurkezten dira:

Peptido opioideak Hipofîsi-peptidoak

Proopiomelanokortina (POMC) ACTH (POMC-tik erat.)

Beta-endorfma p-MSH (POMC-tik erat.)

N- azetil-b eta-endorfina

A Proentzefalina Peptido eastrointestinalak

Met-entzefalina Protakikininak

Leu-entzefalina P Substantzia (SP)

Amidorfina K Substantzia (SK)

Metorfamida Hesteetako polipept. basoaktiboa

Oktapeptidoa Kolezistokinina (CCK-8)

Heptapeptidoa Gastrina

B Proentzefalina (Dinorfinak) Neurotensina

p-Neoendorfina Neuropeptido

P-Neoendorfina Y Neuropeptidoa (NPY)

A Dinorfina (1-8), (1-17) Areko polipeptidoak

B Dinorfina (Rimorfma) Bonbesina

Leumorfina (B Dinorfina, 1-29) Intsulina

Peptido hipotaiamikoak Glukagona

TRH Sekretina

LHRH (GnRH) Bestelako peptidoak

Soraatostatina Angiotentsinak

Kortikoliberina (CRH) Bradikinina

Somatokrinina Kamosina

Basopresina Loaren peptidoak

Oxitozina Galanina

Neurofisina

1.2. Taula. Gorputzeko peptido bioaktibo garrantzitsuenak

36 SARRERA


1.5.2. PEPTIDO ERREGULATZAILEEN SINTESIA,

METAKETA ETA JARIAPENA

1.5.2.1. Biosintesia

Peptido bioaktiboen sintesi mekanismo nagusiak ezagutzen dira: (a)

oligopeptidoen sintesia mekanismo entzimatikoen bidez eta (b) ohizko mekanismo

erribosomikoen bidez sintetizatzeko, proteinen hidrolisi entzimatikoaren peptido

espezifikoak emanez.

Peptidoen sintesia erribosometan mRNA baten itzulepenaz sintetizatutako

peptido aintzindari baten ekoizpenaz hasten da (preprohormona, prepropeptidoa).

Aintzindari proteiko hau erretikulo endoplasmikoaren zistemetara pasatzen da, non

PRE aurresekuentzia degradatua izaten den. Honela pro-proteina edo propeptido bat

sortaraziko da eta Golgi-ren apar atura garraituko da. Hemen, porpeptidoaren

zatiakapena gertatuko da, peptido txikiagoak ekoitziz. Peptido hauek jariatze-

granuluetan bilduko dira.

1.5.2.2. Metatzea

Peptido bioaktiboak jariapen besikuletan metatzen dira eta garraio

zitoplasmikoz bukaera mintz plasmatikorantz eroaten dira, zuntz zitoeskeletikoen

bidez. Hor mantendu egingo dira, atsedenean, jariapen-kinada jaso arte.

SARRERA 37


1.5.2.3. Askapena

Peptido erregulatzaileen jariapen-mekanismoak eta neuro transmisora

klasikoenak antzekoak dira (Burgus eta lank., 1970; Douglas, 1973). Kinada

despolarizatzaile baten ondoren, kaltzioaren menpeko prozesuan (Thom eta lank.,

1978) jariatuak izaten dira. Jariapenaren eredu klasikoa, nerbio-sinapsietan ematen

dena izaten da. Hemen, axoiaren zehar garraiatua izaten den ekintza potentziala,

axoiaren bukaeran despolarizazioa ematen da, C a^ ioiaren zaharrera bideratuz eta,

ondorioz, jariapen-besikula eta mintz plasmatikoaren fusioa ematen da, peptidoak gune

sinaptikora kanporatuz. Irudi hau, orokorrean, baliogarria izaten da beste ehunetako

peptidoen jariapenean. Kasu hauetan kinada seinale kimiko bat izan daiteke, baina

prozesua oso antzekoa da.

1.5.2.4. Hartzaileak

Peptido bioaktiboak odolean, sinapsira, edo bestelako fluidotara (hazia)

jariatuak izan daitezke, itu-zelula batera iritsiko direlarik Itu-zelula hauekin lotuz,

eragingo dute biopeptidoek euren efektu fisiologikoak Honetarako, itu-zelulek euren

mintz plasmatikoan, peptido bakoitzekin lotura espezifikoak egiteko gaitasuna duten

proteinak espresatuko dituzte. Proteina hauei mintzeko hartzaile deitzen zaie. Bame

peptido aren eta hartzailearen arteko elkarrekintzak kanal ioniko jakinetan

iragazkortasun aldaketak edo zelula bameko bigarren mezularien agerpena eragin

dezake.

Peptido erregulatzaileen hartzaileek oso dentsitate baxuak dituzte (100 fmol/mg

proteina inguru), baina oso afinitate altua; gutxi gorabehera, neurotransmisore

klasikoek bere hartzaileekiko dutena baino ehun aldiz altuagoa.

Hartzaile peptidikoak G proteinetara lotutako hartzaile metabotropikoak dira.

Mintzaren zeharreko zazpi domeinu hidrofobiko, zenbait glikosilazio gune N-

mutuirean eta kinasa erregulatzaileentzako fosforilazio guneak dituzte. Gainera,

38 SARRERA

Doktote-Tesia Asier Valdivia Palacíh 39

hartzaile peptidikoen azpimaila asko deskribatu dira; heterogeneotasun handi honek,

parte hartzen duten prozesuen aniztasuna isladatzen du.

1.5.2.5. Inaktibazioa

Peptido batek sortzen duen eraginaren iraupena eta intentsitatea, hartzailearen

inguruan dauden peptido horren kontzentrazioaren gutxitzean parte hartzen duten

mekanismoen menpe dago. Prozesu hau bí modutara gertatu ahal da: bukaera

sinaptikoetatik eta ondoko glia-zeluletatik gune sinaptikora askatu diren peptidoen

bereganatzeaz, edo anderakuntza entzimatikoz.

Peptido bioaktiboen inaktibaziorako bide nagusia, hauen hidrolisi entzimatikoa

da, bai exopeptidasa zein endopeptidasen bidez. Exopeptidasak peptidoak amino

(aminopeptidasa) zein karboxilo (karboxipeptidasa) muturretatik hidrolizatzen dituzte,

aminoazido bakarra askatuz. Endopeptidasak proteina eta peptido bameko loturetan

eragiten dute. Peptido erregulatzaile gehienak, mintzari loturiko zelula kanpoko

peptidasek inaktibatzen dituzte. Hala ere, kontuan izan behar dugu peptidasa

solugarrien eginkizuna.

Azkenik, peptidoaren ezabapenerako mekanismoa, peptido-hartzaile

konplexuaren barneratzea da, hormona peptidikoekin gertatzen den modura

(Willingham eta lank., 1980; King eta Cuatrecasas, 1981; Edwardson eta McDermott,

1982; Beaudet eta lank., 1998; Lin eta lank., 2000).

SARRERA 39

40 Asier Valdivia Doktote-Tesia

1.5.3. BARNE PEPTIDO OPIOIDEAK (BPO) ETA EUREN

ERAGIN FISIOLOGIKOAK

1.5.3.1. Orokortasunak eta deskribapen historikoa

Lehen azaldu bezela, 1973an lehenengoz hartzaile opioideak aurkitu ondoren

bameko sustantzi opioideak egon behar zutenaren susmopean jarri zituen ikertzaileak.

Izan ere, urte bat lehenago, Akil eta lankideek (1972, 1976) garuneko gune batzuetan

elektrikoki kitzikatuz lorturiko analgesia naloxonaren bitartez Iehengoratu zitekeela

ikusi zuten. Terenius eta Whalstrôm (1974) eta Kosterlitz eta Waterfield-ek (1975) ere

garun-estraktuez osatutako prestakin batzuk opiazeoen antzeko aktibitatea zutela

egiaztatu zuten. 1975an Hughes eta lankideek txerriaren burmuinean opiazeoek bezela

jokatzen zuten neuropeptido bi isolatu zituzten, entzefalina izenaz bataiatuak:

Metionina entzefalina (met-entzefalinaj eta leuzina entzefalina (leu-entzefalina).

Hurrengo urteetan endorfmak (Li eta lank., 1976) eta dinorfinak (Goldstein eta

lank., 1979;1981) aurkitu zituzten.

Bame peptido hauen arteko erlazio molekularra beren prekurtsore molekularrak

klonatu zirenean argitu zen. Lehenengoz karakterizatu zena, proopiomelanokortina

(POMC), P-endorfina eta ACTH aren prekurtsorea, izan zen (Nakanishi eta lank.,

1979). Gero entzefalinen prekurtsorea, proentzefalina, eta dinorfinena (prodinorfina)

klonatu ziren (Comb eta lank., 1982; Kakidani eta lank., 1982).

Beraz, hamar urte barman opiazeo-antzeko bame sistema egon zitekeela

susmatzetik hartzaile opioideak, beren bameko ligandoak eta hauen prekurtsoreak

direnen hiru geneak identifikatzera pasa zen.

1997an, endomorfina bezala ezagutzen diren peptido berri bi aurkitu ziren

(Zadina eta lank., 1997).

40 SARRERA


I.5.3.2. BPOen sailkapena, ezaugarri molekularrak, eta

kokapena

Gaur egun 20 peptido opioide ezagutzen dira. Guztien, nozizeptina eta

endomorfina izan ezik, ezaugarria amino-muturretik karboxi-muturrera errepikatutako

aminoazido sekuentzia da:

Tyr-Gly-Gly-Phe-Meí

edo

Tyr-Gly-Gly-Pbe-Letí (met/leu entzefalinen egitura)

Era honetara, BPO-en familia 5-tik 32 aminoazidorainoko (P-endorfina) luzera

izan dezaketen peptidoz osatzen da, guztiek dutelarik gutxienez met edo leu-entzefalina

sekuentzi bat euren bamean. Peptido hauek lehen aipatutako hiru prekurtsoreen

apurketaren bidez sintetizatzen dira, opioide aktibitateko molekula bihurtuz.

Met-en tzefaliña: T yr- Gly-Gly-Phe-MetLeu-entzefalina: Tyr-Gly- Gly-Phe-Leu

P-endorfina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Gly-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-

Val-Thr-Leu—Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile~Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-

Lys-Gly-Glu

Dinorfina A (1-17): Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-

Asp-Asn-Gln

Dinorfina B(l-13): Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Gln-Phe-Lys-Val-Val-Thr

a-Neoendorfina: T yr-Gly- Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-T yr-Pro-Lys

Nozizeptina: Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-

Ala-Asn-Gln

Endomorfinak: T yr-Pro-Trp-Phe-NH2

1.3. Taula. Ugaztunen peptido opioide naturalak. (Florez, 1998)

SARRERA 41

42 Asier Valdivia Doktoie-Tesia

Proentzefaliña (PE) NSZ-ean eta mu in adrenalean sintetisatzen da. Tripsina,

endopeptidasa eta N-karboxipeptidasa motako entzimen eraginez 243 aminoazidoko

proteina honetatik 7 peptido opioide ezberdin sor daitezke. Garrantzitsuenak

entzefalinak (met edo leu entzefalina) dira. Burmuinean isolatutako entzefalina

konbertasa izeneko karboxipeptidasa bat da pentapeptido hauen sintesiaren arduraduna

(Hughes, 1983). PE-ak met-E-ren lau kopia ditu (Akil eta lank., 1998).

Prodinorfinak (PD) dinorfma A (1-8) (1-17), B (1-13), p-nco-cndorfina, e.a.

peptido gordetzen ditu.

Proopiomelanokortina (POMC) opioide aitzindarien artean bame opioideak ez

diren peptidoak gordetzen dituen bakarra da. Izan ere, P-endorfina peptido opioideaz

gain, hormona adenokortikotropoa (ACTII), a eta fi lipotropina (LPH), a eta [V

melanotropina (MSH), eta beste zenbait peptidoren prekurtsorea da. Kasu honetan ere

molekula hauek sisntetisatzen dituen entzima ezagutzen da, POMC entzima

bihurtzailea hain zuzen (Turner eta lank., 1987).

Entzefalinak, dinorfinak eta endorñnak nahiko espezifízitate baxuz lotzen

zaizkie hiru hartzaile opioideei. Entzefalinak 6-hartzailearen lotugai naturalak bezela

ezagutzen dira, baina ^-hartzaileei ere lotzen zaizkie. Dinorfinak K-hartzaileari lotzen

zaizkio eta P-endorfinak |u-hartzailea eta baita ó-hartzailea ia afínitate berez ezagutu

ditzake (Roques, 1999).

Gaur egun, bost aminoazidoko egitura amankomun gabeko eta opioide

aktibitatea duten peptido berriak ere ezagutzen dira (endomorfina, nozizeptina).

Nozizeptina edo orfanina FQ (OFQ), ORL-1 hartzaile opioidearen lotugai

naturala, 17 aminoazidoz osatutako peptidoa da. Bere amino muturreko lehen eta

bostgarren aminoazidoak tirosina eta leu/met izan beharrean, fenilalanina eta threonina

dira (P/je-Gly-Gly-Phc-r/zr) (Meunier eta lank., 1995; Reinscheid eta lank., 1995).

OFQ-aren prekurtsorea pronozizeptina edo proorfanina FQ da. Gizakien eta

42 SARRERA


karraskarien NSZ estraktuetan (Reinscheid eta lank., 2000) eta baita gaizkatan ere

klonatu izan da. Arrain espezie honetan klonatu izanak opioide klase honen eta besteen

arteko erlazio ebolutiboa ulertzeko aurrerapausua izan liteke (Danielson eta lank.,

2001).

Prekurtsore honen mRNA maila altuak sistema linbikoan deskribatu dira,

nozizeptinak duen estres-aurkako aktibitatea azpimarratuz; gero knock-out arratoietan

ikusi den bezela (Reinscheid eta lank., 2000).

Pronozizeptinak OFQ-z gain peptido biologikoki aktibo bi gorde ditzake.

OFQ2-a adibidez ahalmen analgesiko handia duela deskribatu da (Amodeo eta lank.,

2000).

OFQ edo nozizeptina, azkenengo urteetan ikertzaile ezberdinek deskribatutako

opioideen aitrkako familia harnean kokatzen dute (Harrison eta lank., 1998).

Endomorfma 1 eta 2 (EM 1 edo 2) jj.-hartzaileari afinitate handiz lotzen

zaizkion arren, tetrapeptido hauen aminoazido sekuentziak Tyr-Pro-Trp-Phc edo Tyr-

Pro-Phe-Phe dira (Zadina eta lank., 1997). Oraindik ez da bere aitzindaria klonatu.

Lehen azaldu den bezala, bai bame peptido opioideak eta beste biopeptido

motak peptidasen bitartez inaktibatzen dira. Hurrengo atal batean, entzima hauen

deskribapen sakona egingo da tesiaren gaiarekin bat doalako.

SARRERA 43


1.5.4. TRH HORMONA ETA BERE ANALOGOAK

I.5.4.I. Orokortasunak eta deskribapen historikoa

Tirotropinaren hormona askatzailea (TRH edo tiroliberina) hormona askatzaile

hipotalamikoen taldearen osagaia da. Hormona talde honetatik lehenengo isolatu eta

karakterizatu zena izan zen, aurrcko hipofisitik zenbait hormona trofiko askatzeko duen

gaitasuna zela eta (Boler eta lank., 1969). Hormona hauek, neurona hipotalamikoetan,

nagusiki, sintetizatzen dira eta odol-zirkulazio lokalera askatzen dira, hipotalamo-

hipofisi-porta sistemaren bidez.

THR-ak, aurreko hipo lisian, tirotropina (tiroidearen hormona estimulatzailea,

TSH), hazkuntzaren hormona (GH) eta prolaktinaren sintesi eta jariatzearen

arduraduna da (Morley, 1981).

Hipotalamoak hipofisi-tiroide ardatzaren aktibitatea kontrolatzen duela,

berrogeitamargarren hamarkadatik ezaguna zen, baina hogei urte pasatu ziren, TRH-a

ardi- eta txerri-ehun hipotalamikotik kimikoki isolatu zen arte. p-Glu-His-Pro-NH2

sekuentzia peptidikoa duen tripeptidoa zela ikusi zen eta 1969.ean sintetizatzea lortu

zen (Boler eta lank., 1969; Burgus eta lank., 1969). Tiroliberinaren egitura primarioa

ardi- eta txerri-ehun hipotalamikoan berdina zela frogatu zen (Burgus eta lank., 1970)

eta behi eta gizakiaren TRH-ak mugikortasun kromatografiko bera zutela ere behatu

zen (Bowers eta lank., 1965).

TRH-a konformazio eskakizun zorrotzak ditu bere aktibitate biologikorako.

Honela bada, tiroliberinaren egitura naturalatik urruntzen den edozein formak,

aktibitate aldaketa handia du (Guillemin eta Burgus, 1972).

44 SARRERA

Doktore-Tesia Asier Valdivia Patacín 45

TRH-ari buruzko lehenengo ikasketak TSH, GH eta prolaktinaren jariapena

eragiteko, aurreko hipofisiaren gain dituen ekintza neuroendokrinoctan oinarritzen

baziren ere, TRH-ak NSZ-ean ere eragin garrantzitsuak zituela, berehala argitu zén.

TRH-ak parte hartzen du : (1) kitzikapen neuronala aldatuz, (2) transmisoreen

askapena eta turaover-ra handituz, (3) NSZ-ean alerta areagotuz, (4) odol-presioa,

gorputz-tenperatura eta amas-zatiketa handituz, (5) elikagai eta likidoen hartzea

aldatuz, (6) aktibitate motorea handituz eta (7) analgesia sortuz (Jackson, 1982;

Griffiths eta Bennett, 1983; Griffiths, 1985; Sharif, 1988; Burt eta Sharif, 1989).

Binding esperimentuez (Hawkins eta lank., 1987; Sharif, 1988) eta teknika

autoradiografikoez (Manaker eta lank., 1986; Palacios eta Dietl, 1987), ugaztunen

NSZ-aren hainbat aldetan, TRH-aren hartzaileen maila altuak, heterogeneoki banatuta

aurkitzen zirela frogatu zuten. Honek, TRH-a neurotransmisorea zelaren hipotesia

indartu zuen.

TRH-ak, bere askapen bidearen arabera, modu desberdinetan jokatu ahal du:

1. Odolera askatzean neurohormona moduan j okatzen du.

2. Hipotalamo hipofisi porta sistemara askatzean askatutako-hormona moduan

lan egiten du.

3. NSZ eta Nerbio Sistema Periferiko (NSP) mailako sinapsietara askatzean,

neurotransmisore eta neuromoduladore moduan aritzen da.

4. Zelula ez neuronaletara askatzean, alboko zeluletan bitartekari parakrino eta

autokrino moduan jokatzen du.

1.5.4.2. TRH-aren peptido analogoak

1989-an TRH hormonaren antzeko egitura zuen tripeptidoa isolatu zuten

untziaren prostata eta guruinetan (Cockle eta lank., 1989a), TRH-arekiko zuen

SARRERA 45


ezaugarri bereizgarria, TRH tripeptidoaren erdiko histidina hondarraren ordez,

glutamiko hondar bat azaltzen zuela zen. Handik gutxira, peptido bera giza hazian

deskribatu zuten (Cockle eta lank., 1989b) eta beste Ian batzuetan peptido hura, beste

espezie batzuen hipofisian deskribatu zen (Ashworth eta lank., 1991). Geroxeago, beste

TRH-aren antzeko tripeptido bi isolatu ziren, erdiko aminoazidoa Phe edo Gin

aminoazidoaz zutenak (Khan eta lank., 1992). pGlu-Glu-Pro tripeptidoak

espermatozoideen kapazitazioan eta emaltzeko abilezian eragina zuela ezarri zen

(Green eta lank., 1994) eta berehala peptido honi FPP (Fertilization Promoting Peptide)

izena eman zitzaion (Cockle eta lank., 1994). Ondoren, FPP-aren hartzaile espezifikoa

topatu izan zen, TCP-11 espermatozoideen azaleko proteina hain zuzen ( Fraser eta

lank., 1997).

1.5.4.3. TRH-aren banaketa gorputzean.

TRH-aren banaketa Nerbios Sisteman oso anitza da. Dirudienez, peptido honen

% 70a hipotalamotik (bere jatorri lekutik) kanpo omen dago (Leppaluoto eta lank.,

1978). Hipotalamotik kanpo, garun-kortexean eta enborrean behatu izan da TRHa

(Jackso etaReichlin, 1974; Morley, 1979).

TRHa arratoien organo periferikoetan (gibelean, giltzurrunean, arean,

bihotzean, barrabiletan, obulutegian) eta gorputzeko likidoetan (odolean, giza-hazian)

kokatu da (Safran eta lank,, 1982; Pekary eta lank., 1983; Lamberton eta lank., 1984;

del Rio-Garcia eta Smyth, 1990). TRH-aren hartzaileen banaketa ere ehun

periferikoetan ikertu da (Fukusumi eta lank., 1995).

Oilaskoetan TRH-a topatu da garunean, hipofisian, tiroide guruinean eta

gonadetan, hazkuntzan, ugalketan eta digestioan zerikusirik izan ahal duela pentsatzen

da (Geris eta lank., 2000).

46 SARRERA


1.5.4.4. TRH-aren ezaugarri molekularrak, anderatze

metabolikoa eta bere produktuak

TRH-ak, bere egitura déla eta, entzima proteolitiko askoren aurrean

erresistentzia du, baita pepsina, papaina edo termolisinaren antzeko aktibitate

entzimatiko inespezifikoen aurrean (Burgus eta Guillemin, 1970). Aide batetik,

tripeptidoaren amino muturraren ziklazioa eta karboxilo muturrean duen amida taldea

déla eta, exopeptidasen aurrean erresistentzia du. Bestaldetik, bameko prolina déla eta

endopeptidasa gehienek ezin dute hidrolizatu.

Dena den, TRH-aren anderakuntza kataliza dezaketen, gutxienez, hiru entzima

identifikatu dira: prolil endopeptidasa, piroglutamil peptidasa I eta piroglutamil

peptidasa n.

TRH-a peptidasen bidez inaktibatzen da, gorputzaren atal desberdinetan:

garuna, hipofisia, bizkar-muina, gibela, giltzurrunak, area, guruin adrenalak eta odola

(Griffiths eta McDermott, 1983).

Entzima anderatzaileen presentziak leku hauetan guztietan, TRH-a

inaktibatzeko gaitasunaz gain, ehunetan bere edukia, bere ekintzaren iraupena eta bere

eraldaketa, biologikoki aktiboak diren zati txikiagotara, kontrolatzeko ahalmena ere

isladatu ahal du (Griffiths eta McDermott, 1983).

Anderatzearen produktuak

TRH-aren prozesamendu entzimatiko primarioaren ondoren nagusiki bi

metabolito eratzen dira:

SARRERA 47


1 - TRH azidoa:

Prolil endopeptidasa entzimaren aktibitatearen ondorioz sortzen den metabolito

primarioa da. Erradioinmunosaiakeraz, detektatu zen lehenengo aldiz, arratoiaren

burmuinean (Emerson eta lank., 1980) eta gizaki-gemuan (Bhandrau eta Emerson,

1980). Molekula honen garun-bentrikulu bameko injekzioak, “wet dog shaking”

izenarekin ezagutzen den konportamendua eragiten du (Boschi eta lank., 1980).

2- His-Pro diketopiperazina edo ziklo (His-Pro):

TRH-a piroglutamil peptidasa entzimen bidez hidrolizatzean His-ProNH2

sortzen da eta hau, espontaneoki ziklatzen da His-Pro diketopiperazina emateko

(Peterkofsky eta lank., 1982; Prasad eta lank., 1982).

Bere aitzindaria (TRH-a) baino kontzentrazio handiagotan aurkitzen da

burmuinean. Bertan eragin ugari ditu. Aktibitate endokrinoa du (Brabant eta lank.,

1981) eta NSZ-ean zenbait ekintza burutzen ditu, adibidez, kortexeko neuronak

kitzikatzea (Stone, 1983). Odolean (Mori eta lank., 1982; Duntas eta lank., 1993), hodi

gastrointestinalean (Mori eta lank., 1982) eta gemuan (Perry eta lank., 1965) ere topatu

da.

1.5.5.5. TRH-aren hartzaileak

1990.ean TRH-aren hartzailea identifikatu zen lehenengo aldiz genea klonatuz

bere espresioa lortu zuenean (Straub eta lank., 1990). Hartzaile hau ugaria zen aurreko

hipofisian eta burmuinaren atal neuroendokrinoetan, baina ez beste askotan.

Bestalde, NSZ-ean TRH-aren lotura guneak autoradiografiaz aztertu zirenean,

lortutako datuek, tripeptidoak banaketa zabalagoa erakusten zuela frogatu zuten. Honek

guztiak beste hartzaile baten presentzia iradokitzen zuen. Honela, 1998.ean, TRH-aren

hartzaileen azpitalde berri baterako kodifikatzen zuen cDNA klonatu zen (Cao eta

lank., 1998). TRH hartzaile honi TRH-R2 deitu zioten, lehenago aurkitutakoaz

desberdintzeko (TRH-R1).

48 SARRERA


TRH-aren hartzaileak bizkar-muinean, giltzurrunetan, biriketan, bihotzean,

guruin adrenalean, arren ugalketa sisteman eta sistema gastrointestinalean topatu dira,

ikasketa hauetan zein motatako hartzaileak diren zehaztu ez bada ere (Bhargava eta

Gulati, 1988; Shi eta lank., 1996; Horita, 1998; Bilek, 2000). Badirudi hartzaile

bakoitzaren erregulazioa zelula motarekiko espezifikoa déla (Gershengom eta Thaw,

1991). Orain ere TRH-aren peptido analogoa den FPP trip epti do aren hartzailea

(TCP11) deskribatu izan da giza espermatozoidetan (Ma eta lank., 2002).

SARRERA 49


1.5.5. PEPTIDO ERREGULATZAILEAK ETA

UG ALKORT ASUN A

Ekintza biologikoa duten peptidoak, giza eta ugaztunen hazian topatu izan dira.

Kasu gehienetan euren funtzioa gizonezkoen ugalkortasunarcn fisiologian ez da

ezaguna, baina peptido hauen eragin zehatz batzuk badira ezagunak.

Peptido bioaktiboek ugalkortasunaren oso prozesu ezberdinetan partehartzen

dute. Y Neuropeptidoa, adibidez, hodi seminiferoetan eta barrabiletan deskribatu izan

da eta bere ekintza espermatogenesiaren erregulazio autokrino eta parakrinoaren

bamean proposatu da (Wengçr eta lank., 1990). Bestalde, Y Neuropeptidoak haziaren

isuritzean zerikusia du (Steers, 1994).

Leptinak ere ugal-aparatu arran eta gizakien hazian deskribatuak izan dira

(Glander eta lank., 2002; Camina eta lank., 2002) eta bere funtzioa oraindik ezagutzen

ez bada ere, sustantzia honentzako hartzaileak behatu izan dira isuritutako haziaren

espermatozoideen mintzean eta espermatozoidearen mintzaren osotasunarekin

erlazionatu izan da (Jope eta lank., 2003).

Aipamen bat besterik ez dugu egingo gonadotropinen (FSH eta LH) garrantziari

buruz, luzeegia eta konplexuegia izan baitaiteke hormona hauek ugalkortasunaren

fisiologian adierazten dituzten xehetasun guztiak direla eta. Gainera, hau ez da lan

honen helburua. Beste egituretan sartu gabe, haziaren plasman deskribatu dituzten

lanak (Shirai eta lank., 1975). Esan behar da gonadotropinen hartzaileak

espermatozoidetan behatu izan direla ere (Eblen eta larik., 2001).

Oxitozina ere behatu izan da giza hazian, eta hazi parametroekin, batez ere

mugikostasunarekin harremanean jarri nahi izan den arren, emaitzak kontraesankorrak

dira eta ez da harreman estatistikorik behatu (Goverde eta lank., 1998).

50 SARRERA


Gastrina eta Kolezistokinina (CCK), barrabiletan eta zelula

espermatogenikoetan (ugaztunen espezie ezberdinetan CCK-ren kasuan) behatu izan

dira hurrenez hraren. Gastrina espermatozoidearen akrosomaren inguruan behatu izan

da. Hau delà eta, gastrina (gizakian) eta CCK (bestelako ugaztunetan) erreakzio

akrosomikoa ematean askatuak izaten direla proposatu da (Schalling eta lank., 1990).

Honi lotuta, bonbesinaren analogoa den GRP-ren (Gastrin releasing peptide) efektua

hazian, aztertua izan da. Motilitate, kapazitazioa eta bestelako parametroak eraginik

pairatzen ez dituzten arren, erreakzio akrosomikoa pairatzen duten zelula kopurua

aldatu egiten dela ikusi da, peptido honekin tratatzean (Levy eta lank., 1996).

ADH edo basopresinaren kasuan, hormona peptidiko hau espermatozoideen

mugikortasun murritzarekin eta oligozoospermiarekin harremandu izan da (Puri eta

Puri, 1985). Orohar, FSH, inhibina, arginina-basopresina (AVP), kalzitonina,

serotonina, oxitozina, adrenokortikotropina (ACTH), gastrina, sekretina, eta

somatostatina behatu izan dira gizakiaren barrabiletako ehunean, guztien funztioak oso

finkatuak ez egon arren (Mehta eta lank., 1995).

Beste hormona hipotalamiko garrantzitsua ugalkortasunean GnRH edo

gonadoliberina da. Peptido bioaktibo hau, hipotalamo-hipofisi-ugal aparatua osatzen

duten ardatz fisiologikoaren lehenengo urratsa izateaz gain, espermatozoideek Zona

Pellucida-rekm lotzeko duten gaitasuna areagotzen dute (Morales, 1998). GnRH-ren

jariapena, besteak beste, bame peptido opioideek (BPO) inhibitu egiten dute (Fabbri

eta lank., 1989).

1.5.5.1. Barne Peptido Opioideak ugalkortasunean

Bame peptido opioideak (BPO) ugal funtzioaren prozesu askorekin erlazionatu

izan dira. Esan egingo dugu opioideak duela denbora nahiko deskribatu izan direla giza

hazian. Honela, p-endorfina kantitate altuetan behatu izan da plasma seminalean

(Davidson eta lank., 1989). Entzefalinak, adibidez, oso hedatuak daude ugal-organo

ezberdinetan (Fujisawa eta lank., 1996). Peptido opioideak duela 20 bat urte deskribatu

omen ziren giza hazian (Sastry eta lank., 1982; Fraioli eta lank., 1984) eta hasiera-

SARRERA 51


hasieratik lotu izan dira espermatozoideen mugikortasun murriztuarekin (Fraioli eta

lank., 1984; Foresta eta lank., 1985; Sastry eta lank. 1991). Ez hori bakarrik; sustantzia

opioide exogenoen (Heroina, metadona,...) eragina ugal-fisiologian aztertua izan zen

(Cicero eta lank., 1975) sustantzia hauek ere hazi-parametroetan eta bereziki

espermatozoideen mugikortasunean, kalteak sortarazten zituztela proposatu zen (Ragni

eta lank., 1985).

Opioideak ugal funtzioaren puntu askotan erregulazioa eragiteko gai diren

peptido bezala deskribatu izan dira. Funtzio hauen guztien arteko ezaugarri

amankonuna, egiten duten eraenketaren mezua bereziki “inhibitzailea” izaten déla Hala

ñola, espermatozoideen motilitatearen jeitsiera, hodi deferentearen muskuluaren

uzkurdura inhibitu, bikotearen erantzun immunea motelduz,... (Fabbri eta lank., 1989).

Ez dago opioideak eta espermatozoideen kapazitazioa harremanean argi jartzen

duen lanik, baina besikula edo guruin seminalen jariakina, endorfinak eta bestelako

peptidoak dituena, espermatozoidearen kapazitazioarekin erlazionatu da (Aumuller eta

Riva, 1992). Proentzefalinaren kasuan, espermatogenesiaren, zelula germinalek

ekoitzitako, faktore parakrinoa izateaz gain, propeptido hau akrosoman mantendu eta

erreakzio akrosmikoan ingurunera askatu egiten déla behatu izan da, emaltze

prozesuan nolabaiteko garrantzia izan dezakeela proposatuz (Kew eta lank., 1990).

Honi lotuta, badaude Met-entzefalinaren analogoez, erreakzio akrosomikoaren

inhibizioa, dosi-menpeko moduan, deskribatzen dituzten lanak (Foresta eta lank.,

1986).

Entzefalinak, eta opiazeoak orohar, espermatozoideen mugikortasunarekin

erlazionatu izan direla esan dugu. Hala ere, opiazeo exogenoen efektua motilitatearen

aurkakoa déla behatu den bitartean (Cicero eta lank., 1975; Fraioli eta lank., 1984 ;

Ragni eta lank.,1985; Foresta eta lank., 1985), beste batzuk entzefalinak, eta zehazki

met-entzefalinak, in vitro, espermatozoidearen mugikortasuna ordutan luzatu

ditzakeela ikusi dute (Fujisawa eta lank., 1996), eta astenozoospermikoen hazian

topatutako met-entzefalinaren kantitatea, normozoospermikoenean topatutakoaren

aldean, askoz txikiagoa déla ere behatu dute.

52 SARRERA

Doktore-T esia Asier Valdivia Palacín 53

Peptido opioideak giza haziaren eta ugalkortasunaren prozesuetan duten

garrantzia indartzeko, duela gutxi opioideen |i hartzailea zaldien espermatozoideen

mintzean deskribatu da (Albrizio eta lank., 2005). Lan berean, espermatozoideen

kapazitazioan eta mugikortasunean eragina izan dezakeela proposatzen dute, hartzaile

horrekiko antagonista bat erabiliz (naloxona). Antagonista honekin inkubatzean,

espermatozoideen kapazitazioa estimulatu egiten zen, ziuraski kaltzio mai la

intrazelularrak igoz.

1.5.5.2. TRH Hormona eta bere peptido analogoak

ugalkortasunean

TRH (tiroliberina) eta honen antzeko peptidoen presentzia giza hazian

aspalditik ezaguna da (Pekary eta lank., 1983). Peptido honen jatorria hazi-isurian,

prostatikoa déla proposatu da ere. Handik urte batzutara, TRH-aren egitura osoa

antzekoa zuten tripeptidoak isolatu ziren giza hazian; hala ñola, pGlu-Glu-ProNH2 eta

pGlu-Phe-ProNH2 (Cockle eta lank., 1989) (Gkonos eta lank., 1994). Berehala

proposatu zen sustantzia hauek espermatozoidearen funtzioan eta fisiología

prozesuetan izan zezaketen garrantzia. Pglu-Glu-Pro-NH2, TRH-aren peptido

analogoak, arratoi-espermatozoideen kapazitazioa in vitro bultzaten zuela eta emaltze-

gaitasuna (errakzio akrosomikoaren berebiziko handipenik gabe) handitzen zuela

behatu zen (Green eta lank., 1994). Peptido honi FPP (Fertilization Promoting Peptide)

izena ezarri zitzaion (Cockle eta lank., 1994). Hortik gutxira, TRH-a bera eta FPP-a,

hazi-likidoan degradatzen zituen prolil endopeptidasa entzimaren aktibitate antzekoa

topatu zen (Siviter an Cockle, 1995). Hala ere, deskribatutako peptido horien artean

bakarrik FPP-ak bakarrik eragiten zuela, adierazgarriki, gizakien espermatozoideen

kapazitazioa ikusi zen (Green eta lank., 1996a).

Gizakiaren hazian azaltzen duen batazbesteko kontzentrazioan (50 nM), eta

TRH eta pGlu-Phe-ProNH2 peptidoen aldean, soilik FPP-ak azaltzen du kapazitazio

eragiteko gaitasuna. Hortaz, eragina hartzaile baten bidez egitekotan, FPP-arekiko

SARRERA 53


hartzaile espezifiko batez, eta ez TRH-aren hartzailearen bid.cz, lortu behar zela

ondorioztatu zuten (Green eta lank., 1996). Bestalde, prozesu honetan zelulaz kanpoko

Ca++ kontzentrazio mínimo bat (90 p.M) beharrezkoa zela behatu zuten. Gainera,

kapazitazioaren fase berantiarretan gehituta, FPP-ak akrosomaren galera espontaneoa

inhibitzen zuela ikusi zen, baina erreakzio akrosomikoa pairatzeko gaitasuna ez zen

galtzen; progesteronaren (erreakzio akrosomikoaren eragile físiologikoa) bidez,

erreakzio hau jasotzeko gai ziren FPP-z tratatutako espermatozoideak (Green eta lank.,

1996). Honela, FPP-aren efektua Adenosinaren parekoa zela ikusi zen, eta adenilato

ziklasaren zelula bameko seinale-bidearen bidez kapazitazioa eragiten zuela proposatu

zuten.

FPP-arentzako hartzaile espezifikoaren genea Fraser eta lankideek topatu zuten,

arratoien espermatozoidetan (Fraser eta lank., 1997).

Kaltzitoninaren eta Angiotensina II-aren eragina giza hazian antzekoa déla

ikusirik, sustantzia hauen guztien gabezia hazian edota hartzaile espezifíkoen kalteak

edo mutazioak, ugalkortasun eskasaren zergati garratzitsuak izan daitezke (Fraser eta

Adeoya-Osiguwa, 2001)

54 SARRERA


1.6. PEPTIDASEN GARRANTZI

FISIOLOGIKOA

1.6.1. SARRERA

1.6.1.1. Entzima proteolitikoak

Sistema biologikoetan ematen diren ia erreakzio guztiak entzimak deritzen

makromolekula espezifikoen bitartez katalizatzen dira. Entzimen ezaugarri

garrantzitsuenak bere ahalmen katalitikoa (gizakiak sorturiko katzalizatzaileak baino

askoz boteretsuagoa) eta espeziñzitatea dira.

Entzima proteolitikoak, lotura peptidikoen apurketa hidrolitikoaren

katalizatzen dutenak dira. Hauek sailkatzerakoan bi talde bereiz daitezke:

Protein as ak, bere ekintza proteinen gain egiten duten entzimak dira (ehun

baino aminoazido gehiagoz osatutako egituren gain). Hauek exoproteinasak edo

endoproteinasak (ugarienak) izango dira proteina katearen kanpo aldean edo erdialdean

egiten badute bere ekintza katalitikoa. Zelula kanpoan (tripsina, errenina, e.a.) edo

bamean (katepsinak, kalpaina,...) kokatuta egon daitezke.

Peptidasak, peptidoen (ehun unitate baino gutxiagoko katea) apurketa

hidrolitikoaren katalizatzaileak dira eta hauek ere exo eta endopeptidasetan sailkatzen

dira. Exopeptidasen barruan aminopeptidasak eta karboxipeptidasak aurkitzen dira.

Lehenengoek amino muturrean (karga positiboduna) eta besteek karboxilo muturrean

(karga negatiboduna) egiten dituzte bere ekintzak. Endopeptidasek peptido erdian

ekiten dute, adibidez; angiotensinaren entzima bihurtzailea (AEB), kalpainak eta

endopeptidasa neutroa 24.11.

SARRERA 55


Entzima proteolitikoak biopeptido ezberdinen sintesi eta anderakuntzarako

proposatuak izan dira. Sintesiari dagokionez, peptido erregulatzaileen deskribapena

egiterakoan azaldu den bezela, prekurtsore proteiko baten apurketaren ondorioz

peptido aktiboak sortzen dira. Peptido aktibo hauen inaktibazioa berriz, peptidasen

ekintzaren ondorioz ematen da, zati inaktibo txikiagoak edo aminoazidoak askatuz

(endo edo exopeptidasak diren arauera).

1.6.1.2. Peptidasak

70. hamarkadaren bukaeran, Ondetti eta lankideek AEB-ren inhibizioak

hipertentsio-kontrako efektua eragiten zuela ikusi zutenean (Ondetti eta lank., 1977)

peptidasekiko interesa asko suspertu zen. Hiru urte beranduago zink metalopeptidasa

zehatz baten inhibizioak analgesia sor zezakeela ikusi zuten. Entzima hori

endopeptidasa 24.11 edo entzefalinasa izenaz bataiatu zuten (Roques eta lank., 1980).

Peptidoen anderatzaileak diren entzimei buruzko ikerketak aurrera joan ahala,

biomolekula hauek (baita beren sustratuak ere) gorputz o so an oso hedatuak daudela

argi gelditu zen. Gainera kontzeptu hau, “peptidasa bat, sustratu bat”, aide batera utzi

zen (Schwartz, 1983; Kenny, 1986). Gaur egun onartuta dago peptidoak

sustratuarekiko espezifizitate nahiko zabala duten entzima kopuru mugatu batek

hidrolizatzen dituztela.

Peptidasa hauen artean batzuk mintz zelularrean integratzen dira, bere gune

aktiboa aide extrazelularrean kokatuta dute (ektoentzimak), eta talde prostetikoan zinka

daukaten metaloproteinak dira (Turner eta lank., 1987; Maroux, 1987). Hala ere,

badaude zitosolikoak diren peptidasak (Wagner eta lank., 1981; Hersh, 1982) eta baita

gune aktiboa zelula bamera begira duten peptidasa integralak ere (Dyer eta lank.,

1991).

56 SARRERA


80. hamarkadan eginiko ikerketa askotan bai neuroncn eta bai zelula glialen

mintzetan peptidasa ugari aurkitu dira, neuropeptidoen inaktibazioaren arduradun

nagusiak direla proposatuz (Turner eta lag., 1985; McKelvy eta Blumberg, 1986;

Lynch eta Snyder, 1986; Turner, 1986).

Aminopeptidasak peptido ezberdinen N-muturreko aminoazidoen lotura

peptidikoa hidrolisatzen dute. Egitura kimikoa argi egon ez arren gehienak talde

prostetiko bezala Zn2+-a daramaten metaloproteinak (Vallee eta Galdes, 1984) edo tiol

proteinak (O’Cuinn eta lank., 1990) direla dakigu. Peptidasa hauen tamaina oso

aldakorra da, 25-300 kDa tartekoa (Taylor, 1993),

Orain arte eginiko ikerketa ezberdinek biopeptido bakoitzarekiko espezifikoak

diren peptidasarik ez dagoela diote. Dirudienez, espektru zabaleko peptidasa gutxi

batzuk neuropeptido askoren anderakuntzaren arduradunak dira. Hala ere, oraindik

beharrezkoak dira ikerketa gehiago ikuspuntu hau ziurtatzeko.

Sustratuekiko espezifizitate gutxi dutenez eta orokorrean ikertutako izaki

bizidun eta ehun mota gehienetan aminopeptidasa aktibitatea ikus daitekenez, entzima

hauen sailkapen zehatza egitea ez da erraza (Taylor, 1993).

SARRERA 57


1.6.2. ENTZEFALINEN ENTZIMA ANDERATZAILEAK.

AMINOPEPTIDASAK ETA ENDOPEPTIDASA

NEUTROA

Entzefalinen anderakuntzan parte hartzen duten entzimak aminopeptidasak,

endopeptidasa neutroa 24.11, karboxipeptidasak, katepsina C eta angiotentsinaren

entzima bihurtzailea (AEB) dira, 1.3. irudian ikus daitekeen bezala.

1.3. Irudia. Entzefalinen entzima anderatzaileak.

Hala ere azkeneko 30 urteetan egindako lan askok entzefalinen anderakuntzaren

arduradun nagusiak aminopeptidasak eta endopeptidasa neutroa 24.Ü (entzefalinasa)

direla azpimarratzen dute.

70. hamarkadan eginiko lan batzuk entzefalinen erdibizitza nahiko laburra zela

bai “in vivo” zein “in vitro” egoeran adierazi zuten, animaliei pentapeptido hauen dosi

altuekin tratatu eta analgesia ahula eta laburra azaltzen zela ikusi ondoren (Belluzi eta

lank., 1976 ). Gainera tyr-gly edo gly-phe lotura peptidikoak hidrolisiarengandik

babestuta zuten entzefalina sintetikoak eman ondoren analogo hauen botere

analgesikoa handiagoa zela frogatu zen (Pert eta Iank., 1976; Foumié-Zaluski eta Iank.,

1979). Beraz zelulen mintzan peptidasa aktibitatea zuten ektoentzimak egon behar

{Katepsina C[ AEB

58 SARRERA


zirenaren susmoa egiaztatzen hasi zen. Honela, arratoiaren NSZ-ko estriatuko

mintzetan tyr gly gly tripeptidoa askatzen zuen entzima aurkitu zen (Malfroy eta lank,

1978). Entzefalinasa izena hartutako entzima honen ekintza fisiologikoa frogatuta

gelditu zen bere lehenengo inhibitzaile sintetikoa (tiorfana) erabili zenan, honek

naloxonarekin itzulgarria zen propietate nozizeptiboa baitzuen (Roques eta lank.,

1980). 1983-an Zn2+-metalopeptidasa hau endopeptidasa neutroa 24.11 bezala

deskribatu zen (.NEP edo EC 3.4.24.11) (Relton eta lank., 1983).

Bestalde, entzefalinen tyr-gly lotura peptidikoaren apurketa fisiologikoaren

arduraduna aminopeptidasa N zela frogatu zen bere inhibitzailea den kelatorfanak

sortutako analgesiaren ondorioz (Waksman eta lank., 1985). Era berean, Hui eta

lankideek (1983) puromizina antibiotikoarekiko sentikorra zen beste aminopeptidasa

bat (puromycin-sensitive aminopeptidase edo PSA) deskribatu zuten, zeinek

entzefalinak hidrolisatu eta tirosina aminoazidoa askatzen zuen.

Gaur egun aminopeptidasa N eta entzefalinasaren inhibitzaile sintetiko berriak

(RB 101) eta kelatorfana bera, animalietan lortutako nozizepzioaren aurkako efektuak

direla eta, etorkizunean opiazeoen altematiba edo laguntzaile moduan erabil zitezkeen

analgesiko berri bezala proposatu dira (Ortega-Alvaro eta lank., 1998; Noble eta lank.,

1999). Izan ere, inhibitzaile hauen eragin analgesikoa amas-depresio arrisku gabeko

efektua dela frogatu da, opiazeoekin gertatzen ez den bezala (Boudinot eta lank.,

2001).

Tesi honetan entzefalinak anderatzen dituzten peptidasen deskribapen zabala

egin denez, hauen adierazpen berezia egingo dugu:

I.6.2.I. Endopeptidasa neutroa (Nep, EC 3.4.24.11)

Endopeptidasa neutroa glikosilatutako zink metalopeptidasa bat da. Peptidasa

honek aminoazido hidrofobikoekiko espezifikotasun handia azaltzen du (Kerr eta

Kenny, 1974). Ektoentzima hau 90 bat KDa-eko kate polipeptidiko bakar batez osatuta

dago (Relton eta lank., 1983). Pisu hau, entzimaren glikosilazio-mailaren arabera alda

SARRERA 59


daiteke. Entzima hau, mintz plasmatikoko proteina intégrala bezala hartzen den arren,

badira forma solugarriak deskribatzen dituzten ikerketak (Spillantini eta lank., 1990).

Dirudienez, entzima hau ia ugaztun oroetan azaltzen da (Gee eta lank., 1983)

eta ehun anitzetan deskribatu izan da, hala ñola, giltzurruna, birika, nerbio sistetema

zentrala, gizonezkoen ugal aparatuan, odolean, gemuan, neutrofiloetan,

fibroblastoetan,... (Erdos eta Skidgel, 1989). Giltzurrunetan maila aítuenetakoak

azaltzen di tu (Kerr eta Kenny, 1974). Garunetan eta nerbio sistema zentralean

deskribatu zenetik (Sullivan eta lank., 1978), garrantzi fisiologiko altuko zereginekin

lotu izan da, hala ñola, minaren fisiologian (Roques eta lank. 1980).

Entzima honek, entzefalinaz gain, kininak, P substantzia, Peptido Natriutetiko

Aurikularra, etab, anderatzen ditu. Endopeptidasa neutroa Zn++ eta bestelako katioi

dibalenteen bidez (maila txikiagoan) aktibatu egiten da, EDTA bezalako kelatzaile

metalikoak inhibitu egiten duten bitartean. Inhibitzaile espezifikoen artean tiol-

inhibitzaileak dira garrantzitsuenak, Tiorfanaren (Roques eta lank. 1980) familiakoak

(azetofan, sinorfan,...). Beste talde bat, fosforilatutako inhibitzaileena,

fosmaridonarena, alegia, izango litzateke.

1.6.2.2. Puromizinarekiko sentikorra den alanina

aminopeptidasa (PSA edo EC 3.4.11.14)

Puromizina hazkuntza bakterianoetan isolaturiko antibiotikoa da (Porter eta

lank., 1952). Espektru antibakteriano zabaleko molekula hau entzefalinen

anderakuntzaren inhibitzailea zela ikusi zen orain déla 20 urte, nahiz eta lortutako

eragina beste inhibitzaile batzuena (bestatina adibidez) baino askoz eskasagoa izan

(Chaillet, 1983). Urte gutxi beranduago definituta gelditu ziren garun mintzetan

entzefalinak anderatzen dituzten aminopeptidasa mota bi. Bata, puromizinarekiko

sentikorra zena (PSA) (Hui eta lank., 1983; Hersh eta lank., 1985), eta bestea, ez zena

antibiotiko honekin inhibitzen (alanina aminopeptidasa N edo M, APN) (Gros eta lank.,

1985; Matsas eta lank., 1985). Hori déla eta bestatinak, entzima bien inhibitzailea,

puromizinak baino nozizepzio aurkako aktibitate hobea aurkezten zuen.

60 SARRERA

Doktore-T esia Asier Valdivia Palacio. 61

Entzefalinak anderatzen dituen PSA-k isoforma bi ditu; hau da, egitura berbera

aurketzten duten entzima solugarri bat (alanil aminopeptidasa solugarria) eta mintzari

lotutako beste bat (alanil aminopeptidasa Mû edo AP Mil). Azken hau ez da mintzan

kokatutako proteina integral bat ez baitu aurkezten mintzari lotzeko domeinu berezirik.

Horregatik, proteina anfitropikoen taldean sartu dute zenbait ikertzailek. Dirudienez,

AP MII-ak mintzean kokatzeko beste proteina integralekin elkarrekiten du (Dyer eta

lank., 1990).

Giza PSA klonatu eta neuronetan (ezta glian, ezta garun basoetako endotelioan)

azaltzen zela agertu zuten (Tobler eta lank., 1997). Izan ere, AP Mil-a garunean

espezifíkoki agertzen déla deskribatu den bitartean, forma solugarria oso hedatua dago

ehun ezberdinetan, (bihotza, gihar eskeletikoa, giltzurruna, gíbela, e.a.) (McLellan eta

lank., 1988).

PSA-k eta APN-ak oligopeptido eta proteina askoren N-muturreko alanina,

tirosina, fenilalanina eta metionina aminoazidoak hidrolisatzen dituzte. Fisiologikoki,

entzefalinez gain, beste oligopeptido batzuen anderakuntzan parte hartzen dutela

deskribatu da (Tayíor A, 1993). Adibidez, bame peptido opioideen artean

prodinorfinaren eratorriak diren dinorfina antzeko peptidoak hidrolisatzen dituzte; beti,

13 aminoazido baino gutxiago dituzten peptidoak direnean. Izan ere, 1989-an Gibson

eta lankideak, dinorfina A (1-17) -k Leu-entzefalinaren hidrolisia inhibitzen zuela

ikustean, tamaina honetako peptidoak eta handiagoak zitosoleko alanina

aminopeptidasa aktibitatearen erregulatzaileak izan zitezkeela proposatu zuten.

Beharbada ordura arte animali ereduekin egindako garunbideko BPO tratamenduen

efektuak zuzenak eta ez-zuzenak izan litezke. Hau da, efektu ez-zuzena BPO-en

anderatzaileak diren aminopeptidasen inhibizioaren ondorioz gerta liteke.

SARRERA 61


1.6.2.3. Alanina aminopeptidasa N edo M (puromizinarekiko

ez-sentikorra) (APN edo EC 3.4.11.2)

Entzima hau 1985-an arratoi garun mintzetan isolatu eta entzefalinak

anderatzen dituen entzima delà frogatu zenetik (Gros eta lank., 1985; Waksman eta

lank., 1985) gorputzeko beste organo edo ehunetan ere deskribatu da (giltzumma,

gibela, hesteak, e.a) (Hersh eta lank., 1987). Azkeneko urteetan, linfozitoen CD13

markatzailea del a ikusi ondoren, immunitatearekin lotutako ikerketa asko egiten ari

dira entzima honi buruz (Shimizu eta lank,, 2002). APNa II motako mintzeko proteina

da (Giros eta lank., 1985).

APN-aren inhibitzaile naturalei dagokionez, PSA eta dinorfina “luzeekin”

gertatzen den bezala, P substantziak eta bradikininak entzima hori inhibitzen duela

deskribatu da (Xu eta lank., 1995).

Giros-en taldeak (1985) APN-ak entzefalinen anderakuntzan PSA-k baino

eragin gehiago duela proposatu zuen eta, ideia honi jarraituz, gaur egun prestatzen ari

diren katabolismo honen inhibitzaile berriak APN-a eta entzefalinasaren inhibitzaileak

dira (Roques BP, 1999). Hala ere, NSZ-an APN-ak bere ekintza nola eta non egiten

duen ez dago argiegi. Egia esan, duela gutxi arte entzima honek bere ekintzaren zati

handiena garuneko endotelio baskularrean egiten duela usté izan da (Solhonne eta

lank., 1987). Baina entzima honen inhibitzaile markatuak erabiliz, APN-a NSZ-ko

gune ezberdinetan azaltzen dela ikusi da (Noble eta lank., 2001).

Beste peptido ezagunen artean APN-ak angiotensina 111-a inaktibatu dezakeela

ikusi da (Reaux eta lank., 1999).

62 SARRERA

Doktote-Tesia Asier Valdivia Palaein 63

1.6.3. TRH ETA HONEN PEPTIDO ANALOGOAK

ANDERATZEN DITUZTEN PEPTIDASAK

Hiru dira TRH-ren anderakuntza aurrera ermaten duten peptidasa ezagunenak:

Piroglutamil Peptidasa I (pGlu-X lotura hidrolisatzen du), Piroglutamil Peptidasa II

(pGlu-His loturarekiko espezifikotasuna du) eta Prolil Endopeptidasa (Karboxilo

muturreko prolinaren deamidazioa egiten du TRH eta peptido analogoetan).

1.4. Irudia. TRH eta honen peptido analogoa den FPP-ren (Fertilization

Promoting Peptide) entzima anderatzaileak.

SARRERA 63


1.6.3.1. Prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26)

Prolina biologikoki aktiboak diren peptido askoren aminoazido sekuentzian

kokatzen da, hauen egitura molekularrean eta peptidasa ezberdinekiko erresistentzian

garrantzitsua delarik (Turner, 1986). Lehenengoz 1971 an deskribatutako prolil

endopeptidasak (PEP), prolil oligopeptidasa ere deitua, peptido hauek prolina

aminoazidoaren karboxilo muturretik hidrolisatzen ditu (Walter eta lank., 1971).

Prolil endopeptidasaren aktibitatea, giza umetokien homogenizatuak,

oxitozinatik (Cys-T yr-Il e-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2) leuzilglizinamida

peptidoaren askapena gauzatzeko gai zirela behatu zenean aurkitu zen (Walter eta

lank., 1971). Geroago, aktibitate hau, garai hartan "post-proline cleaving enzyme"

deitua, arkume giltzurrunatik purifikatua izan zen eta peptido askoren prolina

aminoazidoaren karboxilo aldetik hidrolisia eragiten zuela ikusi zen (Koida eta Walter,

1976), bi prolinen arteko lotura izan ezik. Garunean antzeko aktibitate entzimatikoa

ediren zen, prolil endopeptidasa izenarekin izendatu zena (Orlowski eta lank., 1979).

Entzima hau prolil oligopeptidasa izenarekin ere ezagutzen da.

Prolil endopeptidasa serin-proteasen taldearen barruan koka dezakegu. Entzima

metal astunei sentikorra da EDTA erabiliz prolil endopeptidasaren egonkortasun

handiagoa lortzen baita. Zn2+, Co2+, Fe2+ -ek erabateko inhibizioa sortzen dute eta

Mn2+, Ca2+ eta Mg2+ -ek inhibizio partziala (Orlowski eta lank., 1979).

Entzima hau gizaki edo arratoiaren garunean zabalki deskribatu da (Kato eta

lank., 1980; Wilk S, 1983; Kalwant eta lank., 1991). Hortik kanpo bestelako ehun

periferiko ezberdinetan ere behatu izan da. Hala ñola giltzurruna, testikuluak, gihar

eskeletikoa, biriketan, linfozitoak, fíbroblastoak, e.a. (Kato eta lank., 1980; Yoshimoto

eta lank., 1979; Goossens eta lank., 1996; Orlowski eta lank., 1979).

64 SARRERA


Gainera, serumean (Maes eta lank., 1994b) agertzeak, entzimaren forma jariatua

ere dagoela pentsarazten digu. Giza-hazian, espermatozoideetan (Yoshida eta lank.,

1999) dago. Obulutegian, folikuluen granulu zeluletan eta fluxuan ere detektatu da

(Kimura eta lank., 1998).

Hasiera batean bakarrik zitosolean aurkitzen den entzima delà pentsatu izan

bada ere (Dresdner eta lank., 1982), gaur egun mintzari lotutako isoforma bat dagoela

dakigu, neuronen kasuan sinaptosometan mailan aurkitu daitekeena hain zuzen

(O’Leary eta lank., 1995 eta 1996).

Prolil endopeptidasak aminoazidoaren karboxilo muturretik prolina duten

peptidoak, azil-Yaa-Pro-Xaa modukoak, anderatzen ditu. Entzimak ezin du proteina

luzeagoak hidrolizatu, eta deskribatu da 3000 Da baino gehiagoko peptidoak ezin

dituela anderatu. Peptidoek, amino terminalean N-amina askea dutenean, ez ditu

anderatzen. Bi prolinen arteko lotura peptidikoaren hidrolisia ere, ezin du aurrera

eraman (Cunningham eta O'Connor, 1997) eta bakarrik trans konformazioan dauden

prolinak ezagutzen ditu (Lin eta Brandts, 1983). Zenbaitetan, prolinaren ordez, alanina

duten substratuak ere hidroliza ditzake, baina aktibitatearen galera handia du. Prolil

endopeptidasak, besteak beste, hurrengo peptidoetan eragiten du: TRH, GnRH,

angiotensina I, bradikinina, p-endorfina, neurotensina, oxitozina, P sustantzia eta

basopresina (Walter eta lank., 1971; Koida eta Walter, 1976; Tate, 1981; Emson eta

lank., 1982; Greene eta lank., 1982; Camargo eta lank., 1984; Moriyama eta lank.,

1988; Mendez eta lank., 1990; Stanziola eta lank., 1999). Prolil endopeptidasak,

hauetako zenbait peptidoen aktibitatea, erregulatzen du; bestetan, peptido aktiboak

eratzen ditu bere aitzindarietatik.

Adibidez Angiotensina I (Asp-Arg-Val-Tyr-Ue-His-Pro-Phe-His-Leu) eta

Angiotensina II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)-aren prolinen karboxilo muturrean

eragiten du Angiotensina (1-7) (Angiotentsina III) emateko, biologikoki aktiboa den

heptapeptidoa. Beste adibide bat aipatze arren, P substantzia (Arg-Pro-Lys-Pro-Glu-

SARRERA 65


Glu-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) bere bigarren prolina aminoazidoaren karboxilo

muturra hidrolizatzen du

Prolil endopeptidasaren banaketa zabalak eta biologikoki aktiboak diren peptido

askorengan duen eraginak, entzima honek funtzio biologiko garrantzitsu edo/eta

espezifikoak izan ditzakela iradokitzen digu

Azkeneko hamarkadan prolil endopeptidasari buruzko ikerketa ugari argitaratu

dira, gaixotasun ezberdinen ñsiopatologiarekin erlazionatuta baitago. NSZ-ren kasuan,

Alzheimer, Parkinsona, Huntington, e.a. endekapenezko gaixotasun neurologikoetan

entzima honen aktibitatearen aldaketak ikusi dira (Mantle eta lank., 1996). Izan ere,

entzima honek oroimenarekin zerikusia duela eta, gaur egun PEP-ren inhibitzaileekin

azterketa preklinikoak egiten hasi dira karraskari, tximino eta gizakian (Schneider eta

lank., 2002; Morain eta lank., 2002) emaitza onak agertuz. Prolil endopeptidasaren

aktibitate-mailaren aldaketak, buru-gaisotasunekin (depresioa, eskizofrenia, asaldura

bipolarrak,...) erlazionatzen dituzten ikerketa-lanak ere badaude (Maes eta lank., 1995;

Williams eta lank., 1999)

Maila periferikoan entzima hau espermatozoideen mugikortasunarekin (Kimura

eta lank., 2002), glomerulonefritisarekin (Naghetinni eta lank., 2001), sprue edo

gaixotasun zeliakoarekin (Shan eta lank., 2002), e.a erlazionatu da.

1.6.3.2. Piroglutamil peptidasa I (EC 3.4.19.3)

Piroglutamil peptidasa I-ak (PAP; EC 3.4.19.3), peptidoetatik amino muturreko

piroglutamil aminoazidoak hidrolizatzen ditu oso modu selektiboan (McDonald eta

Barret, 1986).

Amino muturreko L-azido glutamikoa ziklatzen denean, L-pGlu emateko,

zenbait ezaugarri berezi hartzen dute peptidoek. Aide batetik peptidoaren batazbesteko

bizitza, tamaina bereko beste peptidoena baino luzeagoa izaten da, peptidasa gehienak

66 SARRERA

Doktote-Tesia Asie* Valdivia Palacín 67

ez baitira gai L-pGlu-X lotura hidrolizatzeko. Dena den, egitura hau duten peptidoen

erregulazioa aurrera eramateko gai diren entzimak beharrezkoak dira. Honela bada,

lotura hau apurtuko duten zenbait peptidasa deskribatu dira: piroglutamil peptidasa I

eta piroglutamil aminopeptidasa H

Aktibitate hau duten peptidasei omega peptidasak deitzen zaie aminopeptidasak

deitu beharrean, hauen substratuek ez dutelako N-muturrean amino-talde askerik.

Piroglutamil peptidasa II (EC 3.4.19.6) hobekien ezagutzen dena da, ikerlan

ugari kaleratu baitira entzima honi buruz (O’Connor eta O'Cuinn, 1985; Zagon eta

McLaughlin, 1989). Mintzari loturiko metalopeptidasa bat da. Muskuluan eta nerbio

sisteman, batez ere sinaptosometan, agertzen da (Wilk eta Wilk, 1989; Czekay eta

Bauer, 1993; Awade eta lank., 1994). Oso espezifitate handia du TRHarekiko, beste

substraturík ez baitu hidrolizatzen.

Piroglutamil peptidasa I entzimak, piroglutamil peptidasa II-a bezala L-pGlu-X

lotura hidrolizatzen duen arren, zenbait desberdinatasun ditu aurrekoaren aldean. Hau,

zistein peptidasa zitosolikoa déla deskribatu da (Cummins eta O'Connor, 1996).

Piroglutamil peptidasa I Bacillus amyloliquefaciens-eúk isolatu zen lehenengo

aldiz, bere ezaugarri entzimatikoak karakterizatuz (Tsuru eta lank., 1978). Aurrerago

bere genea klonatu eta sekuentziatzea lortu zen (Yoshimoto eta lank., 1993).

Mutagenesi zuzendutako analisiaren bidez, katalisian zisteina batek zeregina zuela

aurkitu zen, Cys-144 hain zuzen ere (Yoshimoto eta lank., 1993). Entzima Escherichia

coli-n espresatzea lortu zen eta x-izpiak erabiliz kristalizatu zen, bere hiru

dimentsiotako egitura argituz (Odagaki eta lank., 1999).

Ugaztunen piroglutamil peptidasa I-a 23700 Da-etako monomero moduan

deskribatu da. Bakterioen eta ugaztunen entzimaren azpiunitatea SDS-PAGE bidez, 22-

25 KDa-etakoa zela neurtu zen.

SARRERA 67


Ikerlan gehienek soilik zitosolean aurki daitekeela dioten bitartean (Cummins

eta lank., 1998) badira mintzean entzima hau neurtu izan dutenak eta, beraz, isoforma

biko entzima dela (Alba eta lank., 1995).

Piroglutamil peptidasa 7-ek, espektru zabaleko aminopeptidasa, piroglutamiko

hondarra duten peptido gehienak anderatu ditzake (Browne eta lank., 1983). Entzima

hau, gizakiaren eta arratoiaren garun kortexean eta beste organo batzuetan isolatu da;

baita ugaztunak ez diren beste animalietan eta bakterioetan ere (Cummins eta lank.,

1998). Duela gutxi, ikerlan batean gizakiaren PG I klonatu da (Dando eta lank., 2003),

Entzima giltzurrunetan (Mantle eta lank., 1990) eta muskulu eskeletikoan (Lauffart eta

Mantle, 1988) deskribatzen duten artikuluak argitaratu dira.

Piroglutamil peptidasa I-ak hidrolizatzen dituen peptido aktiboen artean

hurrengoak topa genezake: TRH, LHRH, neurotensina, bonbesina eta gastrinak

(Fujiwara eta lank., 1979; Browne eta O'Cuinn, 1983; Awade eta lank., 1994). Beste

konposatu xenobiotikoak ere hidrolizatzen ditu (Abe eta lank., 2003). Ikus

dezakegunez, piroglutamil peptidasa II baino substratu gehiago hidrolizatzeko

gaitasuna du.

Bere funtzio fisiologikoa peptidoen metabolismoan ez dago oso argi, entzima

solugarri gehienekin gertatzen den bezala. Posible da minduta edo zahartuta dauden

bixikuletatik zelula b amera askatutako edo gehiegi ekoiztutako neuropeptidoen

katabolismoan parte hartzea (O’Cuinn eta lank., 1990; Bauer, 1987) edota beste

entzima batzuekin ikusi den bezala hauek gune extrazelularrera askatzea eta bertan

egitea beren fimtzioa (Vincent eta lank., 1996; Cummins eta lank., 1998).

Ugaztunetan, piroglutamil peptidasa I entzimak, piroglutamil peptidasa II

bezala, TRH seinalizazio bidean (Boler eta lank., 1969) eta neurotensinen sisteman

(Mineyama eta Saito, 1998) zerikusia du. Bakterioetan, PAP aktibitateak N-muturrean

blokeatuta dauden peptidoen toxizitatea gutxitzeko (Awade eta lank., 1994) eta

elikagaiak bereganatzeko funtzioa du (Doolittle eta Armentrout, 1968).

68 SARRERA

Doktore-Tesia As ier Valdivia Palacín 69

Piroglutamil peptidasa I hipertensioaren patogenesian zerikusia duela behatu

da, entzima honek, parte hartzen baitu odol presioa kontrolatzen duten peptido askoren

metabolismoan. Animalia hipertentsoetan piroglutamil peptidasa I aktibitatea,

neurohipofisian eta guruin adrenalean, asko igotzen déla ikusi da. Horregatik, bi guruin

hauen arteko erantzun koordinatuan parte har dezakela pentsatzen da (Prieto eta lank.,

1998).

Piroglutamil peptidasa I entzimaren aktibitatea bularreko minbizian maila

baxuagoak ditu, patogenesi honetan eginkizunik izan ahal duela adieraziz (Carrera eta

lank., 2003).

Bestaldetik, Alzheimer gaixotasunean metatzen diren /3-amiloide peptidoen

artean, N-muturrean glutamil hondarra duten peptidoak daude (Lamer, 1999).

Zahartzaroan edo estres egoeretan, jS-amiloidetako glutamil aminoazidoa ziklatu ahal

da, piroglutamil hondarra emanez eta piroglutamil peptidasa I entzimaren substratu

bihurtuz, N-muturrean piroglutamil aminoazidoa duten plakek, glutamikoa dutenek

baino errazago ematen dituzte peptido agregatuak (He eta Barrow, 1999), plaka senilen

metatzeari lagunduz. Hau déla eta piroglutamil peptidasa I plaka senilen metatzearen

prebentziorako entzima déla ohar daiteke (Ramirez-Exposito eta lank., 2001).

SARRERA 69


1.6.4. PEPTIDASEN GARRANTZIA GIZA

UGALKORTASUNEAN

N Aminopeptidasa (ApN) duela gutxi deskribatu izan zen giza hazian (Huang

eta lank., 1997; Ryan eta lank., 1993). Arienti eta lankideek CD13/N aminopeptidasa

deskribatu zuten haziaren prostasometan, entzima hau espermatozoideetara

prostasomen fusioaren bidez transferitua izaten zela proposatuz (Arienti eta lank.,

1997). Beste ikasketa batzuk ere espermatozoideetan entzima honen aktibitatea

deskribatu dute (Schaller eta Glander, 2000).

Hazian deskribatutako Endopeptidasa Neutroa (NEP), hasieratik bradikinina eta

angiotensinaren degradazioari lotuta azaldu da. Honela, Angiotensinaren Entzima

Bihurtzailea (AEB/ACE/ECA) eta NEP haziaren plasmen eta zelula espermatikoetan

(gutxiago), deskribatuak izan dira (Boettger eta lank., 1993). Arratoien barrabiletatik

klonatu izan da NEP-aren antzeko entzima, baina zatiki solugarrian diharduena,

mintzetik jariatua edo banatua izaten dena (Ghaddar eta lank., 2000). Bestalde, NEP II

izendatu duten metaloproteasa bat ere klonatu izan da eta arratoien tubulu

seminiferoetan espresatzen déla ikusi da (Ouimet eta lank., 2000).

Bradikininarentzat proposatutako espermatozoideen motilitatearen ahalmenean

duen eragin aktibatzailea kontutan izanik, NEP eta AEB-ren inhibitzaileak erabiliz,

efektu hau egonkortu eta handitu egiten déla ikusi izan da (Siems eta lank.,

2003).Bestalde, NEP en espresioa behatu izan da uteroan eta granulosaren zeluletan.

(Pintado eta lank., 2003).

Berriz ere, duela gutxi, NEP delako Endopeptidasa Neutroaren isoforma

solugarria edo jariatuaren genearen espresioa behatu izan da, espermatidak inguratzen

dituzten Sertoli zelulen zitoplasman eta espermatideen zitoplasma sinzitialaren

70 SARRERA


besikuletan, entzima honî espermatogenesian zeregin garrantzitsuren bat (oraindik

argitu gabekoa) leporatuz (Thomas eta lank., 2004).

Prolil endopeptidasa animali-hazian deskribatu zen lehenengo aldiz, aszidio

izeneko tunikatuaren hazian hain zuzen ere (Yokosawa eta lank., 1983). Boettger eta

bere lankideek, aharian eta ordotsan bradikininaren degradazioa aztertzen ari zirela,

entzima honen presentzia espezie hauen hazian arbuiatu egin zuten arren (Boettger eta

lank., 1993), geroxeago entzima hau untziaren hazian zegoela antzeman zuten, TRH

eta FPP-ren entzima anderatzaile honen jatorria ez zela apurtutako espermatozoideek

plasma seminalera askatutakoa, ugal guruin laguntzaileren batek jariatua baizik (Siviter

and Cockle, 1995). Sardinzarraren barrabiletatik isolatu eta purifikatu zuten prolil

endopeptidasa, eta espermatozoidearen mugikortasunarekin erlazionatu zuten. Izan ere,

prolil endopeptidasaren inhibitzaileez sardinzarraren espermatozoideak inkubtatzean,

hauen motilitatea jeitsi egiten zen (Yoshida eta lank., 1999).

Duela gutxi saguetan egindako ikerketak iradokitzen dutenez, Prolil

Endopeptidasaren genearen produktua, espermatide fasean dauden zeluletan, maila

altutan topatu izan da. Horregatik entzima honek espermiogenesian zeregin

garrantzitsua izan dezakela iradoki da (Kimura eta lank., 2002). Lan berberean,

epididimoaren bukaerako tartean (cauda epididimis) eskuratutako espermatozoideetan

topatu izan da ere Prolil Endopeptidasa. Gertakari hau arraro samarra da; izan ere,

entzima hau zatiki solugarrikoa bezala deskribatu ohi izan da, eta espermatozoide

epididimarioak euren zitosolaren edukin gehiena galdu izaten dute euren heltze

prozesuan. Honela, Prolil Endopeptidasa mintzari estuki elkartuta azaldu behar den

entzima zitosolikoa dugu. Bukatzeko, eta entzimaren presentzia espermatozoidearen

tarteko zatikian kokatzen zela behatu ondoren, entzimaren inhibitzaileekin inkubatu

zituzten, hauek espermatozoideen mugikortasuna adierazgarriki murrizten zutela

behatuz (Kimura eta lank., 2002).

Piroglutamil peptidasa I eta Il-a, hazi-plasman, TRH eta FPP peptidoen

degradazioan parte hartzen duten entzimak direla deskribatua izan da (Siviter eta

SARRERA 71

Cockle, 1995). Titi tximinoaren (Callithrix jacchus) hazian ere deskribatua izan da

aktibitate hau, peptido berdinekin erlazionatuta (Kennedy eta lank., 1997).

72 Asier Valdivia___________________________________________ Doktore-Tesia

72 SARRERA


HELBURUAK

HELBURUAK 73


74 HELBURUAK

Doktote-T esia Asier Valdivia Palacio. 75

2. HELBURUAK

Giza ugaíkortasunaren ezagutza aintzinetik izan da gizartearentzat helburu

garrantzitsua. Bizidun guztietan dagoen ugaltzeko grina edo nahia, euren esentzia

genetiko hurrengo belaunaldi batera hedatzera bultzatzeko grina (Dawkins, 1976),

guztien bizimodua markatzen duen eragingarri nagusietakoa da. Gizakion artean,

betidanik izan da ugalkuntzaren prozesua, biziaren sorrera ikertzera eta ezagutzera

bideratutako esfortsu jarraia.

Gero eta gehiago dira ugalkuntzaren koritzeptua ikuspegi ezberdinetetaik

begiratu behar déla esaten dutenak. Izan ere, ugalkuntza, gure gizarteetan, faktore

ugariren menpe dago. Ugal osasunaren faktoreez gain (dieta, bizimodua, ingurunea,...),

eragingarri sozioekonomikoak, kulturalak, etabar, kontuan hartu behar dira.

Mendebaldeko gizarte moderno etan giza ugaíkortasunaren fenomenoa arreta

handiz aztertzen da. Izan ere, herrialde hauetan populazioaren zahartzea eta populazio-

piramideen alderanztea, jaiotze-kopuruaren islada dira. Arrazoi ezberdinengatik

gertatzen den ugal-adinaren atzerapena izan daiteke zergatietako bat. Atzerapen honek

ekar ditzakeen ugal-osasunaren asaldurak oso ikertuak izaten ari dira gaur egun.

Bestalde, ugal funtzio fisiologikoaren ezagutza orokorra gero eta garrantzi handiagoa

hartzen ari da ikerkuntza biomedikoaren alorrean, honen bidez, ugal-osasunaren

baldintzak hobetzeko eta arazoak gainditzeko informazio egokiena lortu ahal izateko.

Doktore Tesi hau giza ugaíkortasunaren alorrean peptido bioaktiboen

metabolismoak eduki dezakeen garrantziaren inguruan zenbait alderdi argitzera

HELBURUAK 75


zuzendua dago. Ikerkuntza-lan hau giza haziaren fisiologian ildo berri batean

murgiltzeko saioa bezala ulertu behar da, peptido bioaktiboen anderakuntza giza hazian

ez baita ia aztertu. Honela, gorputzeko beste organu eta sistemetan peptido bioaktiboen

eragin fisiologikoak aztertzen dituzten lan mordoa egonik, giza hazian peptido hauen

garrantzia nolakoa den oso ikerkuntza gutxitan aztertua izan da eta are gutxiago

peptido hauen metabolismoa eta funtzioa eraentzen dituzten sistema entzimatikoak.

Helburu orokor honen zehazpen bezala, zenbait helburu zehatzago aipatu

beharko genituzke. Izan ere, eta tesi honen esperimentazio-aldia bukatzean egiaztatu

ahal izan dugun bezala, oso eremu zabalari buruz ikertzen ari garela kontutan izan

behar da, tesi bakar batean bildu eta sakondu ezin daitekena.

Aide batetik, peptido bioaktiboen anderakuntzan parte hartzen duten zenbait

entzima garrantzitsuen aktibitateak giza hazian identifikatzea, ezberdintzea, baloratzea

eta beste ehunetan behatutakoekin konparatzea izango genuke lehenengo asmoa. Atal

honen barruan, berriz ere, gure ikerkuntza mugatu behar izan dugu, ezin baititugu

deskribatu diren peptidasa guztiak hazian ikertu. Kasu honetan, entzefalinak anderatzen

dituzten peptidasa nagusiak (N aminopeptidasa eta endopeptidasa neutroa), eta TRH

hormona eta honen zenbait molekula analogo anderatzen dituzten peptidasa

garrantzitsuenen aktibitateak (piroglutamil peptidasa I eta prolil endopeptidasa) aztertu

izan dira. Honen barruan, azpihelburu bezala, aktibitate hauek hazian ezberdindu eta

identifikatu ahal izateko saioak (substantzia inhibitzaile nahiz aktibatzaileen bidez),

beste ehunetan lortutako aktibitate balioekin konparaketa eginez, aktibitate hauen heina

edo tamaina finkatzea eta baloratzea eta saio-entzimatiko zehatzak egiteko baldintza

esperimentalen fmkapena (sustrato-kontzentrazio optimoaren determinazioa) aipatuko

ditugu.

Beste aide batetik, giza haziaren metabolismo peptidikoaren fisiologian

esanguratsuagoak eta espezifikoagoak diren ikerketak egiteko grinarekin, giza haziaren

zenbait patologietan peptido bioaktibo hauen sistema erregulatzaileak (anderatzaileak,

zehazki) inolako zerikusirik ote zuten frogatu nahi izan genuen, eta zerikusirik

izateko tan, honen inguruko ahalik eta zehaztasun gehien lortu. Honetarako, haziaren

76 HELBURUAK


zatikapen azpizelularrerako teknika egokituz, haziaren zenbait zatikitan

(espermatozoideen zatiki solugarria, espermatozoideen mintzei lotutako zatikia, likido

edo fluido seminala eta prostasomak), patologia ezberdinen artean, entzima

anderatzaile edo peptidasa hauen aktibitateen arteko ezberdintasunik ote zegoen behatu

genuen.

Hemendik aurrera, eta eremua mugatu dugun arren, ikerkuntza hauek bide ugari

eta oso ezberdinetara hedatu daitezkelaz jabetu gara.

HELBURUAK 77


78 HELBURUAK


MATERIALA ETA

METODOAK

MATERIALA ETA METODOAK 79


80 MATERIALA ETA METODOAK


3. MATERIALA ETA

METODOAK

Doktore tesi hau Euskal Herriko Unibertsitateko ikerketa errektoreordetzak

bideratutako hiízarmen baten bidez, Medikuntza eta Odontología Fakultateko

Fisiología Sailean eta Bilboko Euskalduna-Bilbao Klinikako Seminologia eta Ugalketa

Lagunduko Unitatean burutu izan da. Lagin biologikoen (gizatiarrak eta arratoienak)

erabilpena Gurutzetako Hospitaleko Batzorde Etikoaren onespenez egin da. Giza

haziaren erabilpena, emaleen Onespen Informatuaz egin da.

3.1. ERABILITAKO EHUN BIOLOGIKOEN

LORPENA

Tesi honetan erabilitako arratoiak Sprague Dawley arrazako aixatoi albinoak

(Ratus norvégiens) izan dira. Euskal Herriko Unibertsitateko Abeldegian haziak izan

dira. Erabilitako animalia guztiak 3 hilabeteko adina (arratoi helduak) zuten eta arrak

ziren. Hauetatik honako ehun hauek isolatu ziren: Garuna, bihotz-bentrikuloko

miokardioa, izterreko muskulua, birika, giltzurruna eta gíbela.

Giza hazi laginak Bilboko Euskalduna-Bilbao Klinikatik lortu izan dira.

Emaileak, ugalketarako arazoak dituzten bikoteetako partaideak edota inseminazio

artifizialerako emaile osasuntsuak eta ugalkorrak ziren.



3.2. MATERIALA

3.2.1. PRODUKTU KIMIKOAK

Hona hemen, esperimentuetan erabilitako erreaktibo kimikoen zerrenda:

- Alanina-p-naftilamida. Sigma //Aldrich.

- Azetato sodikoa. Merck.

- Azido Klorhidrikoa 12 N. Probus SA.

- Azido Azetiko Glaziala. Probus S.A.

•• Azido Ortofosforikoa %85. Merck.

- Bchi-albumina. Sigma // Aldrich.

- Bestatina. Sigma // Aldrich.

- Coomasie urdin distiratsua G-250. Sigma // Aldrich.

- DAG (N'Dansyl-D-Ala-Gly). Sigma // Aldrich.

- DAGNPG (N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitro-Phe-Gly). Sigma // Aldrich.

- Dimetil Sulfoxidoa (DMSO). Sigma // Aldrich,

- DL-Ditiotreitol (DTT). Sigma // Aldrich.

- EDTA. Merck.

- Etanol absolutua. Probus S.A.

- Fosforamidon. Sigma // Aldrich.

- Kloral Hidratoa. Merck.

- Leuhistina. Sigma // Aldrich.

- Magnesio Sulfatoa. Merck.

P -Naftilamina. Sigma // Aldrich.

- Nembutal. Serva.

- Piroglutamil-p-Naftilamida. Sigma // Aldrich.

- Propilenglikola. Panreac.

- Puromizina. Sigma // Aldrich.

Sakarosa. Panreac.


Doktore-T esia Asiet Valdivia Palacín 83

Sodio Kloruroa. Merck.

Sodio Fosfato Dibasikoa. Merck.

Sodio Fosfato Monobasikoa. Merck.

- Tiorfan. Sigma // Aldrich.

- Tris (hidroximetil)aminometanol (Trizma base). Sigma // Aldrich.

- Tritón X-100. Sigma // Aldrich.

- Z-Gly-Pro-[3-Naftilamida. Bachem.



3.2.2. TRESNERIA ETA EKIPAMENDUA

- Abiadura handiko zentrifugailu hozgama Sorvall RC 28S.

- Angelu finkozko Sorvall SM-24 crrotorea, polietilenozko hodi bereziekin.

- Angelu finkozko KONTRON TFT 45.6 errotorea, polietilenozko (titaniozko

tapoidunak) hodiekin.

- Angelu finkozko KONTRON TFT 65.13 errotorea, polietilenozko (titaniozko

tapoidunak) hodiekin.

- Bolumen aldakorreko (0-25 (J.L, 0-100 ¡aL) mikropipeta kapilareak. Drummond.

Bolumen aldakorreko pipeta automatikoak. Nychiryo eta Brand.

- Boumen aldakorreko dispensadorea (l-5ml). Eppendrof Multipette 4780.

Bolumen ezberdinetako plastikozko pipeta puntak. Beortek.

Espektrofluorofotometroa. Shimadzu RF-540.

Espektrofluorofotometriarako kuartzozko kubetak (3ml).

- Espektro fotómetro a. Shimadzu UV-2401 PC.

- Espektrofotometriarako plastikozko eta kuartzozko kubetak (1 eta 3 mi).

- CPS-240A zelula-kokagailu termokontrolagarria.

- Hodien eskuzko irabiagailua. Reax 2000. Selecta.

- Homogeneizagailua, teflonezko enboloduna. Heidolph.

- Homogcneizatzeko, beirazko ontzitxoak (1, 2, 5 mi).

- Inkubadorea. Hotcold S, 0°-60°C bero-tartea. Selecta.

- Kolorimetroa. SPECTRONIC 601. Bausch & Lomb.

- pH-metroak Micro-pH 2001 eta Micro-pH 2002. Crison.

- Mettler LV-2 dosifikadore elektrikoa.

- Zehaztasunezko Balantza. R180D. Sartorius.

- Termoegonkortutako irabiagailu magnetikoa. Agimatic.

- Ultrazentrifugagailua. KONTRON CENTRIKON T2070.

- Gradilak. Beortek.

- Material kirurgikoa.

- Plastikozko saiodiak (3ml / 5ml). Eurotubo.

- Beirazko materiala (ontziak, probetak, matrazeak,...).


Doktore-T esia Asier Valdivia Palacin 85

3.3. SOLUZIOAK ETA BUFFERRAK

3.3.1. SOLUZIOINDARGETZAILEAK

Tris-HCl 0,2 M, pH 7,4

- Trizma base 0,2M

- Ur distilatua (pH 7,4-n doitu egiten da HC1 1N erabiliz)

Prestatzeko modua: (1000 ml). Trizma baseren 24,22g uretan disolbatu, pHa doitu eta

ur distilatu gehiago gehitu, bukaerako bolumena lOOOmlkoa izan arte.

Tris-HCl lOmM

- Tris-HCl 0,2M, pH 7,4

- Ur distilatua

Prestatzeko modua: (100ml) 0,2 M-eko buffer-aren 5 ml hartu eta ur distilatuz diluitu,

100-eko bolumena bukaeran izan arte.

Tris-HCl 30mM, 130mM NaCl

- Tris-HCl 0,2M pH 7,4

- NaCl

- Ur distilatua

Prestatzeko modua: (100 ml) 0,2 M-eko buffer-aren 15 ml hartu eta ur distilatuz

diluitu, 100-eko bolumena bukaeran izan arte. NaCl-ren 0,76 gr gehitu eta diluitu.



Fosfato 0,2M, pH 7,4 Buffer-a

Sodio Fosfato monobasikoa 38 mM

- Sodio Fosfato dibasikoa 162 mM

- Ur distilatua

Prestatzeko modua: A soluzioa'. (Sodio fosfato monobasikoa 0,2 M): sodio fosfato

monobasikoaren 27,6 g pisatzen dira eta 1000 ml ur distilatutan disolbatzen dira. B

soluzioa (sodio fosfato dibasikoa 0,2 M): Sodio fosfato dibasikoaren 28,6 g pisatu eta

1000 mi ur distilatutan disolbatzen dira.

Fosfato 0,2 M tanpoi-disoluzioaren 1000 mi prestatzeko, A disoluzioaren 190 ml eta B

disoluzioaren 810 mi nahastu egiten dira.

Azetato 0,1 M, pH 4,2 tanpoi-soluzioa

- Azido azetiko glaziala 73,6 mM

Sodio azetatoa 26,4 mM

- Ur distilatua

Prestatzeko modua: A soluzioa (azido azetikoa 0,2 M): 11,55 mi eta 1000 ml-tara

eramaten dira ur distilatuz. B soluzioa (sodio azetatoa 0,2 M): Sodio azetatoaren 27,6 g

1000 ml ur distilatutan disolbatu egiten dira.

Azetato 0,1 M tanpoiaren 1000 mi prestatzeko: A soluzioaren 368 ml eta B soluzioaren

132 mi nahastu eta ur distilatuz, bukaerarako bolumenera eraman.


Doktote-Tesia Asiet Valdivia Paíacín 87

3.3.2. BESTELAKO SOLUZIOAK

Bradford erreaktiboa (proteina kantitatea zehazteko erabilitako soluzioa)

- Coomasie urdin distiratsua 0,117 mM

- Etanola %5-ean

- Azido Ortofosforikoa%15-ean

Prestatzeko modua: 1000 ml prestatzeko, 100 mg Coomasie urdin distiratsu pisatu

behar dira, 50 ml etanolean disolbatuz. Azido ortofosforikoaren 100 ml gehitzen dira

eta azkeneko bolumenera ur distilatuz eramten dira. Prestakina bi orduz nahastu egiten

da, irabiatuz. Gehiegizko kolorantea, disolbatu ez dena, erauzteko asmoz, disoluzioa

birritan iragazi egiten da, iragaz-paperez.

Auestesiarako prestakina (Equitensin)

- Kloral hidratoa %4-an (0,257 M)

- Nembutal %1-ean

- M gS04 %2-an (0,086 M)

- Etanola % 10-ean

- Propilen-Glikola %40an

Prestatzeko modua: Kloral hidratoren 21,25 g, etanolaren 49’4 ml~tan disolbatzen dira.

Jarraiki, nembutalaren 4,86 g, propilen-glikol 198 ml eta magnesio sulfatoren 10,64 g

gehitzen zaizkio, bukaerako bolumenera 500 ml ur distilatuz eramanez.

Perfusiorako soluzioa

- NaCl 0,15M

- Fosfato tanpoia 0,25 mM

MATE RIALA ETA METODOAK 87

88 Asier Valdivia Doktofe-Tesia

Plasmako peptidasak erauzteko erabiltzen da perfusio prozesua.

Prestatzeko modua: 1000 mi prestatzeko, NaCl-ren 9 g pisatzen dira eta ur distilatuan

disolbatzen dira, fosfato tanpoiaren (0,2 M) 125 mi gehitzen zaizkio eta bukaerako

bolumenera eramaten da, ur-distilatua gehituz.



3.3.3. SAIO ENTZIMATIKOTARAKO SUSTRATO

SOLUZIOAK

Tesi honen helburuetako bat, ondoren patología seminalekin erlazioan jarriko

diren zenbait aktibitate entzimatikoren ikerketarako baldintza zinetikoak finkatzea

izango da (sustrato kontzentrazioa, inhibidore eta gehigarrien erabilpena,...). Beraz,

sustrato-soluzioei buruz hitzegiterakoan, aurretiko aktibitateei buruzko ikasketetan

erabilitako erreferentzia kontzentrazioari buruz arituko gara (s kontzentrazioa), garun

ehunarekin erabilitako sustrato kontzentrazioa hain zuzen ere. Tesi honen bigarren

fasean erabilitako sustrato kontzentrazio finalak s kontzentrazio honekíko ezberdinak

izango dira kasu askotan. Hona hemen aktibitate entziraatiko bakoitzerako sustrato aren

erreferentzi a kontzentrazioak :

Alanina aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko sustrato soluzioa

- Ala-p-naftilamida 125 (_iM

- Behi-albumina 0,1 mg/ml

- Fosfato tanpoia 50 mM

Soluzio hau APN entzimaren aktibitatea neurtzeko da. Sustrato hori, APN entzinw,

gain, PSA k degradatu egiten du ere bai. Tesi honetan frogatuko dugun moduan, PSA-k

ez du aktibitate adierazgarririk giza hazian.

Prolil Endopeptidasa aktibitatea neurtzeko sustrato soluzioa

- Z-Gly-Pro-P-naftilamida 125 ¡iM

- Behi-albumina 0,1 mg/ml


MATERIA1A ETA METODOAK 89


Piroglutamil peptidasa aktibitatea neurtzeko sustrato soluzioa

- pGlu-{3-nañilamida 125

- Behi-albúmina 0,1 mg/ml


Endopeptidasa Neutroaren (NEP) aktibitatea neurtzeko sustrato soluzioa

- N Dansyl-Aia-Gly-p-nitro-Phe-Gly (DAGNPG) 50 |-iM

Behi-albumina 0,1 mg/mL

- Tris-HCl tanpoia 50 mM, pH 7,4

3.3.4. ZATIKIAZPIZELULARREN PURUTASUN

SAIOETARAKO SOLUZIOAK

Laktato Deshidrogenasa (LDH) aktibitatea neurtzeko soluzioa

- NADH (NADH/NAD+ zuzen estandarra egiteko) 0,2 mM

Pirubatoa 1,6 mM

- NaCl 200 mM

- Behi-albumina 0’ 1 mg/mL

- Tris-HCl tanpoia 80 mM, pH 7,2


Doktore-Tesia Asier Valdivia Palacin 91

3.4. METODOAK

3.4.1. EHUNENISOLAMENDUA ETA GIZA HAZIAREN

LAGINEN LORPENA

Tesi honetan arratoi eta giza ehunak erabili dira. Arratoiak, Sprague-Dawley

arrazako arratoi txuriak (Ratus norvegicus) izan dira. Guztiak arrak izan dira. Arren

erabiltzearen zergatia, hauen neuropeptido eta peptidasa mailak, bestelako aldagai

ñsiologiko askoren modura, emeek euren ugal-ziklo hormonalagatik pairatu ditzaketen

aldagarritasuna ekiditzearena da. Arratoietatik, honako ehun hauek isolatu dira:

Muskulu-ehuna (izterretik lortua) (Mu), gibei-ehuna (Gi), birika (Bi), giltzumma (Gil),

bihotz-ehuna (Bih.) eta garuna (Ga). Animalia guztiak EHU-ko abeltegi nagusian

hazitakoak izan dira.

Giza haziaren laginak, Euskalduna-Bilbao Klinikaren Hazi-bankuko

Laborategiak eta Lagunduriko Ugalketa Unitateak, eta Euskal Herriko Unibertsitateak

xedatu zuten hitzarmenari esker lortu egin dira. Euskalduna-Bilbao Klinikan jaso

egiten ziren emaile eta gaixoengandik, euren onespen informatuaz.

Ikasketa hau, lagin biologikoen eta giza laginen erabilpena dela eta,

Osakidetzaren Ikerkuntza Klinikoaren Batzorde Etikoaren oniritziaz burutu da.



3.4.2. HAZI-LAGINEN ESPERMIOKOPURUAREN,

MUGIKORTASUNAREN, MORFOLOGIAREN ETA

BIDERAGARRITASUNAREN AZTERKETA

Hazi laginak, Euskalduna Klinikaren Seminologia Laborategian aztertuak izan

ziren. Isuriketaren orduerdi ostean, minimoz (haziaren guztizko urtzea eman zedin). eta

ordu bi bete baino lehen (mugikortsunaren erorketa sakona gertatzen hasten denean),

aztertu egin ziren, trebatutako espezialistengatik.

Zelulen kontaketarako, Makler Kamara arrunta erabili zen. Makler k am ara,

erdialdean ehun lauki berdinez osatutako sareta laukiarra duen hemozitometroa da.

Bertan, hazi laginaren tanta txikia ipintzen da, gainean kuartzozko tapaki edo kubrea

jartzean, saretaren eremuan 10 ul-ko hazi bolumena besterik ez du uzten, soberan

dagoena saretaren kanpoan geratzen delarik. Merkatuko kamararik íauena dugu,

Makler motakoa, zelulen pilaketa galerazten dueña. Honez gain, fase-kontrastezko

Nikkon mikroskopioaz, X 20-ko handipenezko objektiboarekin, erabili zen.

Kontaketan, elkarren ondoko hamar laukietako zelula (espermatozoide) mota

bakoitzaren kopuruak kontatzen dira birritan, bi aldien batazbestekoa egiten delarik.

Prozedura hau seminograman azterzten diren paramétra guztiekin egiten dea, hala ñola,

espermatozoideen mugikortasuna (A, B, C eta D motako zelulak eta euren

proportzioa), espermatozoide bizi eta totalen arteko proporzioa, morfologia eta

espermatozoideen kopuru totala eta haziaren mi bakoitzeko. Bideragarritasunaren

(espermatozoide bizien proportzioa) estimazioa egiteko eosina tindapena erabili da.



Haziaren azterketarako erizpideak

Hazi patologien estimazio eta sailkapenerako O.M.E.-ren erizpideak eta

nomenklatura erabili izan dira (O.M.E., 1999).

Espermatozoideen kontzentrazioa:

Giza hazi-laginen espermatozoideen edukina oso aldakorra izanik ere, badaude

erreferentziazko balio batzuk minmotzat jotzen direnak. Honela, 20 x 106

espermatozoide ml-ko edota 40 x 106 espermatozoide isuritze bakoitzeko, baino

gutxiago agertzen duten laginak, Oligozoospermiko-tzat joko dira. Era berean,

espermatozoiderik azaltzen ez duten haziak, Azoospermikoak izango dira.

Mugikortasuna:

• A motako mugikortasuna: higidura progresiboa (Ierro zuzena) eta azkarra

erakusten duten espermatozoideen proportzioa.

• B motako mugikortasuna: higidura ez-progresiboa (sigi-sagakoa) edota

motelegia erakusten duten espermatozoideen proportzioa.

• C motako mugikortasuna: tokitik mugitzen ez diren edota ibilbide zirkular

hertsia egiten duten espermatozoide mugikorren proportzioa.

• D motako mugikortasuna: mugimendurik ez duten espermatozoideen

proportzioa (geldiak) .

O.M.E.k gomendatzen duenez, A mota eta B motako espermatozoideak batera,

espermatozoide guztien % 50 baino gutxiago badira, edota A motakoak %25a baino

gutxiago badira, hazi lagina astenozoospermikoa déla onartuko da.



Bideragarritasuna:

Hildako espermatozoide eta bizien arteko proportzioa bame hartzen duen

parametroa dugu hauxe. O.M.E.-ren erizpideei jarraituz, giza hazi lagin batean

espermatozoideen %50 edo gehiago bizirik egon behar dute, bideragarritasunaren

ikuspegitik nórmala delà esateko. Honela, hemendik beherako portzentaiekin azaltzen

diren haziak, nekrozoospermikoak direla esango dugu.

Morfología:

Kontzeptu honek espermatozoideen itxurari buruz egiten digu. Hazi lagin baten

espermatoide guztien %15a baino kopuru baxuagoa baldin badira forma nórmala

dutenak, hazi hori teratozoospermikoa déla esango dugu.

Aldagai hauen guztien (eta beste zenbaiten) balioak, hein normalean erakusten

dituzten laginak normozoospermikoak kontsideratzen dira. Parametro hauen guztien

balorazioa eta azterketa Euskalduna Klinikako profesionalek egin zuten.



3.4.3. LAGIN ENTZIMATIKOEN LORPENERAKO

PROZEDURAK

Bi protokolo ezberdin erabili izan dira lan honetan, ehun biologikoekin

esperimetatzeko prestaketa egokia izan ditzaten. Lehenengo prozedura mota, giza

haziaren eta animali ehunen laginen zatiki solugarri eta mintzari lotutakoen

homogenatuak lortzera zuzendua zegoen. Bigarrena, apur bat konplexuagoa, patologia

ezberdineko haziekin egindako ikasketa burutzeko erabili ziren zatiki zelular eta

parazelularren eskurapenera bideratua zegoen.

Homogenatuen lorpenerako protokoloa.

1.- Ehunak tris-HC! 10 mM tanpoi hipotonikoren 2ml-tan ipini. Hazi laginak

(izoztuta gorde izan direnak) urtzen utzi eta tris-HCl 10 mM tanpoi hipotonikoren

2 ml-tan diluitu (Shock osmotikoa eraginez).

2.~ Ehunak homogeneizatzen dira, tefloizko enboloa duen homogeneizagailu

mekanikoaren bidez, minutu batez (minimo) 800 bira-minutuko abiaduran. Hazi

diluituak ere antzeko prozesua jasaten zuen.

3.- Animalien ehunetatik homogenizaziotik lortutako gaiak ultrazentrifugatzen da

100.000 g-tan, 35 minutuz. Giza haziaren homogeneizazio-produktuak 2 orduz,

100.000 g-tan ultrazentrifugatu ziren.

4.- Zentrifugazioaren ostean lortutako gainjalkinak (SI) eta pellet-ak (Pl)

banatzen dira. Pellet-ak Tris-HCl 10 mM-ez garbituak izan ondoren, tanpoi honen

2 mL-tan berreseki eta homogeneizatzen (30 segunduz) dira.

5.- Gainjalkinak eta berresekitako pellet-ak berriz ere ultrazentrifixgatzen dira,

animali ehunak 35 minutuz, 100.000 g-tan, eta giza hazia 2 orduz (abiadura

berean).


-96 Asier Valdivia Doktore-Tesia

6,- Sl-en ultrazentnfugazioaz eskuratutako gainjalkinak (S2) gordetzen ditugu

(Pellet-a bota). P1 pellet-en ultrazentnfugazioaz eskuratutako pellet berna (P2)

kontserbatu dugu (gainjalkina bota).

7.- P2 pellet berriak berriz ere Tris-HCl 10 mM-ez garbitzen dira, eta tanpoi

beraren 2 mL-tan berreseki eta homogeneizatzen dira (30 segunduz, 800 b/min)

Honela, mintzen zatikiko homogenatuak (Hm) lortuko dira haziarentzat eta

animali ehunentzat. S2 gainjalkinak, ordea, zatiki solugarrien homogenatuak

izango dira.

Honela, honako laginak lortuko genituzke, prozedura honen bidez:

HOMOGENATU MINTZEKO

SOLUGARRIAK HOMOGENATUAK

(Hs) (Hm)

Animali-EhunakGi-S, Mu-S, Bir-S, Gil-S,

Ga-S, Bih-S

Gi-M, Mu-M, Bir-M, Gil-

M, Ga-M, Bih-M

Giza hazia Ss Sm

Ikus daitekenez, ultrazentrifiigazio bi egiten dira, ezaugarri berdinekoak eta

jarraian. Honen helburua, zatikien purutasuna ziurtatzea eta kutsadura ahalik eta gehien

ekiditea da. Zelulen apurketa, tanpoi hipotonikoaren bidez (Tris-HCl 10 mM) egiten

da, homogeneizazio mekanikoaren bidez ere prozesua sakontzen den arren.

Esan bezala, honela lortutako laginen homogenatuak haziko peptidasen

aktibitateen heina zehazteko eta garunetarako garatu izan den teknika (aktibitate

entzimatikoa behatzekoa) hazi-ehunaren ikerketari doitzeko erabili izan dira. Arratoi-

ehunen homogenatuak konparaketak egiteko erabili dira.


Doktofe-Tesia Asiet Valdivia Palacín 97



Haziaren zatiki zelular eta parazelularren eskurapenerako protokoloa

Honen bidez, lau zatiki azpizelular/parazelular lortuko ditugu:

Zatikiaren ¡zena Zatikia

SpS Espermatozoideen zatiki solugarria

SpM Espermat. Mintzari lotutako zatikia

Ls Likido seminala

P Prostasomak

1.- Hazi lagin freskoak jaso eta Tris-HCl 30 mM, NaCl 130 mM tanpoi disoluzio

isotonikoaz diluitzen (1:1) dira.

2.- Laginak zentrifugazio motel baiera eramaten dira (600 g, 10 minutuz).

3,- Gainjalkinak (SI) gordetzen dira. Pellet-ak Tris-HCl 30 mM, NaCl 130 mM

tanpoiaz garbitu, eta 2 mL gehituta, zentrifugako hodietan berreseki

(homogeneizatu gabe), hodi-irabiagailuaren abiadura motel batean eta eskuz,

pellet-a askatu eta banatu arte (kontuz, bitsa atera ez dadin).

4,- Berresekitako pellet-ak (PI), berriz ere, aurreko baldintzetan zentrifugatzen

dira (600g, 10 min.).

5.- Oraingo honetan, gainjalkinak arbuiatu eta berriz ere pellet-ak (P l’) garbitu

eta berresekiyzen dira Tris-HCl 30 mM, NaCl 130 mM buffer-ean.

6,- SI gainjalkinak eta PI* pellet-ak zentrifugazio berri batera eraman ziren

(800g, 15 min.)

7,- SI gainjalkinaren pellet-a arbuiatzen zen, P l’-ren gainjalkinarekin egiten zen

moduan. Honela, S2 (Sl-en zentrifugazioaren gainjalkina) eta P2 (PI’

zentrifugazioaren ondoko pellat-a) izango ditugu.

8.- P2, honako honetan, Tris-HCl 10 mM tanpoi hipotonikoaz berreseki eta

homogeneizatzen da. Zatiki honetan espermatozoideak daude, eta pausu honen

bidez apurtzen ditugu, zitosolen edukina kanporatua izaten dela.


9.- Homogeneizatutako P2 pellet-a, (preSp zatikia, oraindik aurrera) eta S2

gainjalkina (Ls+P zatikia) izoztuko dira.

10.- preSp eta Ls+P zatikiak urtzen utziko dira, inguruko tenperaturan.

11.- preSp zatikia ultrasonatzen da (6 pultso, bakoitza 30” , eta 15” -ko tarteak

eginez). Honen helburua, espermatozoideen mintzen zatiak handiegiak ez izatea

(mintzen zatitzea hobetzea).

12.- preSp eta Ls+P zatikiak ultrazentrifugatzen dira, bakoitza programa ezberdin

batez. PreSp zatikia 35 minutuz, 100.000 g-tan eta Ls+P 2 orduz (eta azelerazio

berean). Honen arrazoia, Ls+P zatikian dauden prostasoma (P) izeneko partikula

txikiek, hauspeatzeko denbora gehiago behar dutela da.

13.- Ls+P zentriñigazio-produktuaren gainjalkina (preLs) eta hauspeakina (preP)

banatu eta gorde egiten dira. Hauspeakina edo pellet-a garbitu, homogeneizatu eta

berreseki egiten da, Tris-HCl 10 mM tanpoiaz. PreSp zatikiaren pelletarekin

(preSpM) gauza bera. Gainjalkinak gordetzen dira (preSpS eta preLs).

14.- Bananduriko zatiki guztiak berriz ultrazentrifugatzen dira. preLs eta preP,

berriz 100.000 g-tan 2 orduz, eta preSpS eta preSpM, 35 minutuz.

15.- preSpM eta preP zatikien ultrazentrifugazioaren pelletak garbituak,

berresekituak eta homogeneizatuak izaten dira Tris_HCl 10 mM tanpoiaz.

Honela, SpM eta P zatikiak lortuko ditugu, PreLs eta preSpS zatikien

gainjalkinak, Ls eta SpS zatikiak izango dira, hurrenez hurren.




HAZI GORDIN AREN

LAGINA

1r

ZENTRIFUG. 600 g,10 min.

i ZENTRIFUG. ¡ ! ZENTRIFUG. ¡1 800 g ! ! 600 g !; !5 min. ¡ ¡ 10 min. ;

Ls + P P1'(garbitu eta berreseki)

Gainjalkinaarbuiatu

,----------- kSHOCK

OSMOTIKOA

IZOZTU— , ----------------------------1

¡ ZENTRIFUG. I-20° C Esperm. Pellet 4 I 800 s !

** ¡ 15 min. •

b’RTU(ing.Tn) Espermat.

Ls + P,----------- 1

^ ¡ IJT.TRAZF.NT. 1^ 1 100.000 g !

1 2 ordu. ¡

ULTRASONATU( 6 x 3 0 ”)

preLs preP(gainjal) (pellet)

ULTRAZENT. 100.000 g

2 ordu

! ULTRAZENT. I * 100.000 g ! ; 2 ordu !

preSps preSpm(gainjal.) (pellet-a)

\garb.ber.h.

ULTRAZENT. 100.000 g

2 ordu.

, Esperm.. solugarria

(SpS)

Esperm.mintza(SpM)



3.4.4. AKTIBITATE ENTZIMATIKOA NEURTZEKO

TEKNIKA

Ikerketa honetan ikasi izan diren peptidasen aktibitatea ikertzeko

fluoreszentziazko teknikak erabili izan dira. Fluoreszentzia molekula askok duten

ezaugarri fisikoa da. Molekula hauek elektroi kitzikagarriak dituzte euren orbital

molekularretan. Elektroi hauek, lotura kimikoen parte ez direnak, energía jasotzean

(argiaren moduko erradiazio batetik, adibidez) energi-egoera altuago batera pasa

daitezke denboralki. Elektroiaren energia-egoera aldatzeko, energia maila minimo

batekoa izan behar du (elektroiaren energia-egoera basala zein den arabera aldatzen

delarik). Energia-igorpena eten egiten denean, egoera kitzikatuan dagoen elektroia

“gehiegizko” energia hori kanporatuko du, egoera basalera bueltatzeko (hauxe bait da

energia minimodun egoera). Energi askapen hau era ezberdinetan gerta daiteke (bero

moduan,...). Askapena argi moduan ematen denean, argi horri fluoreszentzia deituko

diogu.

Peptidasen aktibitatea neurtzeko, oso erabiliak izan dira P-naftilaminaren

eratorri aminoazidikoak. P-naftilamina sustantzia fluoreszentea da, baina aminoazido

bati lotuta dagoenean, amida lotura baten bidez (aminoazil-p-naftilamida moduan), ez

du fluoreszentziarik igortzen. Peptidasen ekintza dala eta, p-naftilamina askatua izaten

den heinean, entseiu-ingurunean fluoreszentzia gora egiten du. Sustrato fluorogenikoa

kontzentrazio asean egonik, entzimen aktibitatearen menpe (edo zehazki, entzima

kantitatearen menpe) egongo da soilik. Hori déla eta, suposa daiteke proteina ugari

dagoen ehunetan, aktibitate (eta fluoreszentzia, beraz) gehiago behatuko déla, baldintza

fisiologikoen eragina eztaliz. Honela, proteina eta entzimatan joria den lagin batean

behatzen dugun aktibitatea eta proteinatan txiroagoa den beste baten aktibitatearekin

konparaezinak izango lirateke. Arazo hau ekiditzeko, proteina kantitatearen neurketa

egiten genuen, aztertzen genuen lagin bakoitzean, Bradford metodoa erabiliz

(aurrerago azaldua).



3.4.4.1. Aminopeptidasen eta prolil endopeptidasaren

aktibitateen behaketa

Aminopeptidasen ikasketarako sustrato artifizialen aretan erabilienak p-

naftilaminaren deribatu aminoazidikoak izan dira. Honela, aminoazidoa, amida lotura

baten bidez lotuta egoten da P-nafti lamina molekulari, aminoazil-p-naftilamida

molekula moduan. Molekula honek ez du fluoreszentziarik igortzen. Aldiz,

aminopeptidasa jakin baten ekintzak aminoazidoa P-naftilaminatik askatzen duenean,

P-nañilamina askea ziklatu egiten da ahalmen fluoreszentea bereganatuz. Gure

esperimentuetan erreakzio entzimatikoa ikertzeko, agertzen den p-naftilamina

(produktu fluoreszentea) 345 nm-ko uhin luzera (X,ex) duen argi igorpen batez eszitatu,

eta 412 nm-ko uhin luzeran (Âem) p-naftilamina honek, egonkortzeko, igortzen duen

fluoreszentzia neurtzen dugu. Lortutako fluoreszentziaren balio numerikoak, p-

naftilamina kontzentrazio jakinez egindako fluoreszentzia patroi-zuzen batean

interpolatzen ditugu, erreakzioan zehar sortu de P-naftilamina kantitatea kalkulatzeko

(Greenberg, 1962; Alba eta lank.., 1989). N Aminopeptidasa eta Piroglutamil Peptidasa

I-en aktibitateak honelako sustratoen bidez (Alanil-P-Naftilamida eta Piroglutamil-P~

Naftilamida) aztertu egin ziren.

Prozedura:

Ehunaren lagina, giza tenperatura fisiologikoan (37° C), sustrato fluorogeniko

artifizialaren soluzioarekin inkubatzen da 30 minutuz. Laginean dauden

aminopeptidasek sustratoa (aa-p-Naftilamida) degradatuko dute aminoazidoa eta p-

naftilamina askatuz.

[ÂMINOPEPTIDASAKl

aa-P-Nañilamida -> aa + P-naftilamina



30 mimituen buraan, erreakzioa gelditzeko, azetiko/azetato disoluzio baten ml

bat gehitzen da, ingurunearen pH-a jeisteko. Ondoren, inkubazio hodi bakoitzaren

edukina espektrofluorimetroan neurtzen da.

Prolil endopeptidasaren kasua oso antzekoa da. Kasu honetan, entzima hau

endopeptidasa bat izanik, apurtu beharreko lotura kimikoa dipeptido baten bamean

kokatzen da. Erabilitako sustratoa Z-Gly-Pro-p-naftilamida (zGlizil-Prolil-p-

Naftilamida) izango da.

3.4.4.2. Entzefalinasa aktibitatearen behaketa

Entzefalinasa edo endopeptidasa neutroaren (NEP) aktibitatea neurtzeko ere,

teknika fluorimetrikoa erabiliko dugu. Kasu honetan ere, lagina sustrato soluzioarekin

30 minutuz inkubatuko dugu, 37° C-tan. Ezberdintasuna, eta erabilitako sustratoa ez

delà p-naftilaminaren deribatua. Fluorogenoa N-Dansyl-D-Ala-Gly-pN02-Phe-Gly

(DAGNPG) sustratoa da. Hemen bai sustratoa bai produktua fluoreszenteak dira (aa-p-

Naftilamidaren kasuan, soilik produktua, P-Naftil amina, zen fluoreszentea). Honek

sustrato-produktu patroi-zuzen konbinatua egitera behartzen gaitu, fluoreszentzia

balioak interpolatzeko.

SN-Dansyl-D-Ala-Gly-pN02-Phe-Gly —> N-Dansyl-D-Ala-Gly-NH2 +

COOH-Phe-Gly

Erabilitako uhin-luzerak hauek dira:

À,ex -> 342 nm

A-em 562 nm


104 Asier Valdivia D oktoie-T esia

Entzimen aktibitatearen kalkulua

Peptidasen aktibitatearen balioak, Peptidasa Aktibitate-Unitatetan

(P.A.U./U.A.P.) ematen da. Unitate hauek, sustrato fluorogenikoaren pikomol bat

minutuko, hidrolizatzen duen entzima kantitatea adierazten dute. Azkeneko emaitzak

aktibitate espezifiko bezala ematen da; hau da, Peptidasa Aktibitate-Unitateak, mg

proteina bakoitzeko (pmol aa-p-naftilamida hidrolizatua / min / mg proteina).

Entzefalinasaren kasuan unitateak era berean ematen dira: Entzefalinasa Aktibitate-

Unitateak, proteinaren miligramo bakoitzeko.

Hazi-patologien arteko aktibitateen konparaketaren ikerketan, datuak aktibitate

espezifiko moduan emateaz gain (P.A.U./ mg proteina), aktibitatea hazi lagin

bakoitzaren espermatozoide kopuruarekiko eman zen (P.A.U./ Espermatozoide milioi),

aztertutako espermatozoideen zatikietan (espermatozoideen zatiki solugarria eta

espermatozoideen mintzari lotutako zatikiak).



3.4.5. PROTEINEN KONTZENTRAZIOAREN

KUANTIFIKAZIOA

Lagínetan dagoen proteina kontzentrazioa kalkulatzeko metodoa, Coomasie

Urdin Distiratsu izeneko koloranteak polipeptidoekiko duen afinitatean oinarritzen da

(Bradford, 1976). Teknika kolorimetrikoa da, hau da, zenbait konposatu kimikok argia

absorbatzeko duten gaitasunean oinarritzen da. Bradford metodoa proteina

mikrogramoak ere detektatzeko gai da, método errepikakorra eta azkarra izanik.

Oinarria eta prozedura

Kolorantea proteinetara lotzen da, gai kimiko horren absortzio uhin-luzeran

aldaketa sortuz, 465 nm-tik 595 nm-tara pasaz. Absortzioaren gehikuntza, kolorantea

saturantea izanik, proteina kontzentrazioarekiko zuzenki proporztionala da. Honela,

absortzioaren gehikuntza espektro fotómetro edota kolorimetroan neurtuz, proteina

kantitate ezagunekin egindako absotzio patroi-zuzen batean interpolatu daiteke.

Lagin bakoitzaren 10 ¡j.1, 2,5 ml Bradford erreaktiborekin inkubatzen dira 7

minutuz. Lagin bakoitzeko hiru saihodi prestatzen dira hórrela, metodoaren

errepikakortasuna eta zehaztasuna optimizatzearren. Saihodi bakoitzaren edukinaren

absorbantzia kolorimetroan neurtzen da, absortzioaren uhin-luzera kontrolatzen duen

monokromadorea 595 nm-tan finkatuz.

Patroi-zuzena egiteko, behi-seroalbuminaz prestatutako kontzentrazio jakineko

alikuota baten bolumen ezberdinez egindako eskala prestatzen da. Hodi bakoitzean

alikuotaren p.1 ezberdinak jarriko ditugu (0 |il-tik, 25|il-ra) eta bakoitza 2 ml Bradford

erreaktiboarekin inkubatuko dugu 7 minutuz. Era honetan antolatutako patroi-zuzena

kolorimetroan neurtzen da, aurreko parametroekin. Lortutako absortzio emaitzak,

kontzentrazioarekiko proportzionaltasun zuzena azaltzen duen Y = aX + b funtzio

zuzenera doitzen direla ikusiko dugu. Zuzen horretan interpolatuko ditugu gure

laginekin lortutako absorbantziaren balioak.



3.4.6. SUSTRATO-KONTZENTRAZIO EGOKIAREN DOIPENA

Tesi honen helburuetako bat, aktibitateak konparatzeko kontzentrazioa doitzea

da. Aktibitateak konparagarriak izan daitezen, entzimaren abiadura maximoan aztertu

behar dira. Abiadura maximoa, Michaelis-Menten-en zinetika jarraitzen duten

entzimekin, eta hauxe da aztertutako peptidasek jarraitzen dutena, sustratoa

kontzentrazio asegarrian dagoela lortzen da, saioa irauten duen denbora guztian zehar.

Hortaz, tesiaren hasierako atalean, aktibitate ezberdinak defmitu eta deskribatzen

ditugunean, entzima horiek aztertzeko beharrezkoa den sustrato kontzentrazioa doitu

behar dugu, 30 minutuko saio baterako.

Baina giza hazirako sustrato-kontzentrazio egokiak definitzeko, erreferentzia

bat erabili behar dugu. Hortarako, aproposena garunetako ikerkuntzan erabilitako

kontzentrazioa erreferentzi bezala erabiltzea deritzogu. Erreferentziazko kontzentrazio

honi S deituko diogu. S kontzentrazioa jatorritzat hartuta, sustrato-kontzentrazio

hazkorrak eta beherakorrak erabiltzen zituen patroi-kurba osatu zen. Hau da, S

kontzentrazio aren múltiplo ak ziren sustrato kontzentrazioez, saio entzimatikoak burutu

ziren. Honela, sustrato bakoitzaren honelako kontzentrazioak bame hartzen dituen

eskala osatuko da:

OS - 0,25S - 0,5S - S - 2S - 4S - 8S - X6S

16S (2 mM)-ko sustrato-kontzentrazioa bakarrik DAGNPG (NEP entzimaren

sustratoa) erabili izan da. Bestelako aktibitate entzimatikoen sustratoekin, (pGlu-(3-

Nañilamidaren eta Ala-[3-Naftilamidaren kasuetan) 8S (1 mM) izan da saiatutako

kontzentraziorik altuena eta Z-Gly-Pro-P-Naftilamidaren kasuan (8S kontzentrazioan

sustratoa prezipitatzen baitu) 2S (250 ¡iM) erabili dugu kontzentrazio máximo bezala.

Sustratoak albuminadun fosfato bufferean prestatu dira eta buffer bera erabili da

diluzioak egiteko. Entseiua, giza haziaren zatiki solugarria eta mintzari lotutakoaren

homogenatuetan saiatu zen.



Sustrato-kontzentrazio ezberdinen soluzioak eskema honi jarraituz pretatu dira:

6,61 mg pGlu-f}-NA

8s (ImM)

26 ml P+ albúmina

13 ml 8s

+ 4s (500 nM)

13 ml P+ alb.

13 ml 4s

+ 2s (250 mM)

13 m lP+ alb.

13 ml 2s

+ s (125 nM)

13 m lP+ alb.

13 ml s

+ 0,5s (75 nM)

13 ml P+ alb.

13 ml 0’5s

+ 0,25s(37,5 nM)

13 m lP+ alb.



3.4.7. INHIBITZAILEEN ETA SUBSTANTZIA

GEHIGARRIEN BIDEZKO AKTIBITATE

ENTZIMATIKOEN BEREIZKETA

3.4.7.I. Aktibatzaile tipikoak: EDTA eta DTT

Entseiu entzimatikoetan askotan erabiltzen ohi dira sustantzia gehigarriak, bai

ikertu nahi dugun entzimaren aktibitatea areagotzeko edota mantentzeko (aktibatzaile

edota babesleak), bai aztergaia den entzimaren aktibitatea, antzeko ekintza (sustrato

beraren gaineko ekintza, adibidez) duten entzimengandik ezberdintzeko.

Kasu honetan, aztertutako entzimengan beste ehunetan saiatu izan diren

sustantzia babesle bi, EDTA eta DTT, giza hazian topatzen diren aztertutako

entzimetan duten efektua aztertuko dugu.

EDTA, sustantzia kelatzailea da; hau da, ioi metalikoak bahitu egiten ditu

ingurunetik. Ekintza horrek odolaren antikoagulatzaile bezala erabilia izatera zuzendu

du. Bestalde, gogoratu behar dugu, aminopeptidasak eta endopeptidasak,

metalopeptidasak direla. Honek esan nahi du, beren gune aktiboan ioi metalikoak

dituztela haien ekintza burutzeko (Zn^ normalean). Antzeko ezaugarri fisiko-kimikoak

dituzten ioiek, beraz, entzimaren aktibitatean eragina izan dezakete. Hau ekiditeko,

EDTA erabiltzen ohi da, sustrato soluzioaren ioi-kutsaduraren efektua galerazteko,

hain zuzen.

DTTren (Ditiothreitol) kasuan, helburua entzimaren sulfhidrilo edo Tiol taldeak

babestea da. Talde kimiko hauek entzima askoren konformazio aktiboa mantentzen

dituzten disulfuro zubiak oxidaziotik babesteaz gain, gune aktibo ugaritan topa

daitezke, eta entzimaren ekintzan garrantzi handia dute. DTT eragile erreduktore

sendo a duen 2 talde sulfhidrilo eta 3 karbonodun azukrea dugu. Honen gehikuntzaz

ingurunea erreduktore bihurtzen da, entzimaren Tiol taldeen oxidazioa zailago

bihurtuz. Honela, entzimaren aktibitatea ez da kaltetzen.



Aipatutako bi gai kimiko hauek aktibatzaile bezala hartzen badira ere, hauen

benetako ekintza entzimaren jatorrizko aktibitatearen endakapena edo murrizpena

galeraztea da, maila altuenean, saiakuntza dirauen bitartean behintzat, mantenduz.

Honela, sustantzia kimiko bi hauen eragina ikertzeko, bai eta ekintza hau

positiboa (Hau da, entzimaren aktibitatea indartzen dutela beren presentziaz) izanez

gero, hauen kontzentrazio optimoa topatzeko, honako prozedura esperimentala erabili

zen.

Aide batetik, aurretik egindako esperimentuekin lortutako sustrato

kontzentrazio eta lagin kantitate optimoak erabili ziren. Beraz, aktibitate bakoitzerako

sustrato kontzentrazio egokia zuen albuminadun fosfato tanpoi egokia prestatu zen.

Fosfato buffer horren bolumen batean 32 mM-eko DTT kontzentrazioa (16 mM-ekoa

EDTA-ren kasuan) prestatzen zen. Kontzentrazio máximo horretatik hasita,

sustratodun bufferraren bidez, diluzioak prestatu egin ziren.



Honela, adibidez:

33,07 mg pGlu-P-NA

260 ml P + albúmina

+ => :\2 mM DTT

256,6 mg DTT

26 ml 32 mM DTT

+ => ;L6 mM DTT

26 ml P+ alb.+ pGlu-P-NA

26 ml 16 mM DTT

+ 8 mM DTT

26 ml P+alb.+ pGlu-P-NA

26 ml 8 mM DTT

+ => 4 mM DTT

26 ml P+ alb.+ pGlu-p-NA

26 ml 4 mM DTT

+ => 2 mM DIT!


26 ml 2 mM DTT

+ => 1 mM DTT


26 ml 1 mM DTT

+ => 0,5 mM DTT


0 mM DTT



EDTA-ren saiakuntzan erabilitako EDTA kontzentrazioak hauexek izan ziren:

0; 0,125 Mm; 0,25 mM; 0,5 mM; 1 mM; 2 mM; 4 mM; 8 mM; 16 mM.

Garunean egindako ikerkuntzetan 2 mM-eko DTT eta EDTA kontzentrazioak

erabiltzen ziren.

3.4.7.2. Inhibitzaile espezifikoen erabilpena

Esperimentu hauek bakarrik Mintzeko Alanina Aminopeptidasa (APN) eta

Endopeptidasa Neutroa (NEP) edo enkefalinasa entzimen kasuetan burutu ziren. Honen

arrazoia, bi entzima hauek degradatzen dituzten sustratoak, beste entzima batzuk ere

degradatzen dituztela, da. Entzima hauen ikerkuntzarako, sustrato bera degradatzen

duten entzima kutsatzaileak espezifikoki inhibitu behar dira. Alderantziz ere,

inhibitzaile hauek erabilita, behatzen ari garen fluoreszentzia, benetan ikertu nahi

dugun entzimaren aktibitateari sor zaion ala beste entzima batek eraginda ote denentz

jakin dezakegu.

APN eta NEP entzimen, erabilitako sustrato arekiko, entzima kutsatzaileak

hauexek dira: APN-ren kasuan PSA edo puromizinarekiko sentikorra eta NEP-en

kasuan AEB/ACE (Angiotensinaren Entzima Bihurtzailea).

Esan beharra dago ez dagoela erabateko espezifikotasuna azaltzen duen

inhibitzailerik; beti dute eragina aktibitate bat baino gehiagotan. Honela, Alanina

Aminopeptidasaren Solugarriaren (PSA) kasuan, puromizina da inhibitzailerik

espezifikoenetakoa, kontzentrazio altuetan APN ere inhibitzen duen arren. AEB/ACE

inhibitzeko Kaptopril erabiltzen dugu.

Bestalde, entzima kutsatzaileen inhibizioa burutzeaz gain, alderantzizko

ikerketa egin zen; hau da, APN eta NEP-en inhibizio entseiuak. APN inhibitzeko

Leuhistina erabili zen eta NEP-entzako Tiorfan eta Fosforamidon.



Prozedura, aurreko kasuetan bezala, sustrato kontzentrazio egokia mantenduz,

inhibitzaile kontzentrazio maximodun disoluzio batetik hasita, diluzioak prestatuz

burutu zen. Erabilitako kontzentrazioak (0-koaz kanpo):

Puromizina: 0,625pM-etik, 1280 ¡iM-eraino

Kaptopril: 1,953 nM-etik, 250 nM-eraino

Tiorfan: 0,08 nM-etik, 320 nM-eraino

Fosforaraidon : 0’08 nM-etik, 320 nM-eraino

Leuhistina: 15,625 nM-etik, 16000 nM-eraino



3.4.8. EHUNEN ARTEKO AKTIBITATE

PEPTIDASIKOEN KONPARAKETA

Atalaren hasieran aipaíutako arratoi ehunak eta giza haziaren arteko

konparaketa egin zen. Honen helburua, aurretik aipatuta genuenez, aztertutako

entzimen aktibitatearen neurriaren ikuspegi orokorra izatea eta peptidasa hauen

garrantzia aztertzeko lehenengo erizpide kuantitatibo bat lortzea da.

Ikerketa edo saiakuntza hauek auirera eramateko, ehunak erauzi eta prozesatu

ondoren (zentrifiigazio, homogeneizazio, tratamendu osmotiko, etab.), lan honetan

egindako ikerketa guztietan bezala, aktibitate entzimatikoen neurketaren saiakera egin

zen, fluorimetriaren bidez. Honetarako erabilitako sustratoen kontzentrazioa, aurreko

entseiuetan lortutako emaitzetan oinarrituta, giza haziarentzako behatutako

kontzentrazio optimoa erabili zen, sustantzia gehigarrien kontzentrazio egokia ere

erabiliz.


114 Asier Valdivia Doktoïe-Tesia

3.4.9. METODO ESTATISTIKOAK

Emaitzen analisi estatistikoa Bariantzaren Analisia (ANOVA) eginez aztertu

zen. Adierazgarritasunaren muga minimoa p<0,05-an ezarri zen. Honela aztertu ziren

hazi-patologia ezberdinen batazbesteko aktibitate entzimatikoak, zatiki azpizelular

ezberdinetan. Post-hoc analisirako B.E.A./D.M.S. (Batazbestekoen arteko

Ezberdintasun Adierazgarria) test-a erabili zen. Analisi estatistikorako SPSS 11.5

software-a erabili zen. Bi aldagaietako korrelazio linealak kalkulatu ziren, entzima

bakoitzaren, zatiki bakoitzeko zatikien eta aldagai seminologiko ezberdinen artean.



EMAITZAK

EMAITZAK 115

116 Asier Valdivia Palacín Doktote-T esia

116 EMAITZAK


4. EMAITZAK

4.1. TEKNIKAREN DOIKETA

4.1.1. SUSTRATO KONTZENTRAZIO OPTIMOA

Haziko aktibitate peptidasikoen ikerketa hasi ahal izateko, lehenbizi aktibitate

hauen heina finkatzea beharrezkoa zen. Suposatzen genuen bezala, aktibitate mailak

ezberdinak izateagatik, haziaren ikerketarako behar izango genituen sustrato

fluorogenikoaren kontzentrazioak beste ehun batzuetan erabilitakoen ezberdinak

izango dira. Aktibitate entzimatikoak euren artean konparagarriak izan daitezen, hauen

behaketa, entzimek abiadura maximoan (Vmax) dihardutela egin behar da. Praktikan,

denbora-tarte (saio entzimatikoa diharduen bitartekoa) eta lagin entzimatikoaren

bolumen jakin batzuetarako, entzimek degradatu beharreko sustrato a kontzentrazio

asean egon behar duela ziurtatu behar dugu. Beraz, lehenengo saiakerak, sustratoaren

kontzentrazio hazkorrez patroiak osatzea eta hortik aktibitate bakoitzerako sustrato

kontzentrazio optimoa estimatzea bilatuko dute. Erreferentziazko sustrato

kontzentrazio [S] bezala, garunean beste ikerkuntza batzuetan erabili izan diren

kontzentrazioak hartuko ditugu, berauek patroiaren erdiko kontzentrazio bezala utzita.

Saiakeraren errferentziazko denbora 30 minutu ziren eta aktibitate bakoitzaren

behaketarako, garunean erabilitako lagin bolumenak garuneak erabilitakoak (10 p.1

Ala-P-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen ikerkuntzan eta 50 (il gainontzeko

sustratoen aktibitate degradatzaileekin).

Saiakera hauetan hazi homogenatuak erabili ziren; hau da, haziaren eduki

guztiaz osatutako banaketa gordinak. Hauen zatiki solugarria eta mintzari lotutakoa

EMAITZAK 117

118 Asier Valdivia Palacín Doktote-Tesía

bereizi egin ziren. Gerta daiteke, aktibitate berdin baterako, zatiki solugarriarentzat eta

mintzari lotutakoarentzat sustrato-kontzentrazio optimoa berdina ez izatea; kasu

hauetan bietako kontzentrazio altuena aukeratuko da optimo bezala.

Ala-P-Naftilamidaren degradazioa aztertzean (4.1. Inidia), argi ikusten da 4S

(500 ¡iM) kontzentrazioan lortu egiten déla abiadura maximoa. Hortik gorako

kontzentrazioetan, aktibitateak ez du nabarmenki gora egiten. Hori izango da, beraz,

aktibitate degradatzaile honi, aipatutako baldintzetan, ezarriko diogun sustrato

kontzentrazio.

DAGNPG (N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitro-Phe-Gly) (4.2. Irudia eta taula),

sustratoaren degradazioa aztertzean irtenbide konplexuagoa bilatu behar izan genuen.

Sustratoaren izaera bereziagatik (sustratoa eta produktua, biak, fluoreszentzia igortzen

dute) eta topatu genituen aktibitate altuengatik ez genuen 16S inguruko

kontzentrazioaren inguruan baino, erreakzioaren asetze-puntua (abiadura

maximoarena) topatzen. Hartu genuen erabakia sustrato kontzentrazio a 90 pM finkatu

eta saiakera bakoitzean erabiliko genuen lagin kantitatea 5 aldiz jeistea izan zen. Hau

da, lagin bolumena 10 ^iL-tara doitu. Honela ziurtatu egiten da erreakzioa abiadura

maximoan gertatzen déla.

PGlu-P-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen azterketarako, mintzari

lotutako zatikian erreakziorako kontzentrazio egokiena 2S (250 mM)

kontzentrazioaren inguruan topatu zen, eta zatiki solugarrian 4S (500 jxM) puntuaren

inguruan, bi zatikientzat azken hau, 500 pM hobetsi zelarik (4.3. Irudia).

Z-Gly-Pro-p-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen kasuan, 2S-tik gorako

kontzentrazio ak prestatzerakoan sustratoak hauspeatu egiten zuen prestatutako

soluzioan. 2S kontzentrazioa hautatu genuen, beraz, egoki bezala.

118 EMAITZAK

Doktore-Tesia Asier Valdivia Paladín 119

EMAITZAK 119

120 Asier Valdivia Palacín Doktote-Tesia

SUSTRATOAREN KONTZENTRAZIO OPTIMOA

Ala-|3-Naftilamida

Sustrato

kontz.

x 125 \M

Aktibitatea Ehunekotan (%)

Ss Sm Ss Sm

0,25 24.713 31.543 19,48 6,48

0,5 45.575 62.566 35,93 12,85

1 74.961 119.537 59,09 24,55

2 106.768 235.561 84,17 48,38

3 126.422 362.501 99,66 74,46

4 126.851 463.338 100 95,15

8 112.832 486.851 88,95 100

4.1. Taula. Ala-p-Nañilamidaren kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-patroia,

giza haziaren homogenatu-laginen 10 ¡ul-rentzat. Hazi-homogenatuen zatiki

solugarriaren eta mintzari lotutakoaren batezbesteko aktibitateak adierazten dira,

aktibitate espezifiko moduan (unitateak = P.A.U. / mg proteina) eta ehunekotan (%),

(Ss = Hazi-homogenatu solugarria; Sm = Mintzari lotutako hazi-homogenatua),

Sustratoaren kontzentrazioak 125 [iM-en biderkagaiak dira.

120 EMAITZAK



Ala-p-N aftilamida

500000 ■

450000 -

400000 •

o 350000 ■L_a 300000 ■O)E 250000 ■

3 200000 •<CL 150000 ■

100000 ■

50000 ■

<jJ

2 3 4 5 6 7

sustrato-kontzentrazioa x 125 |iM

4.1. Irudia. Lerroen bidezko, Ala-f3-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen

irudikapena, sustrato beraren kontzentrazioaren arabera. Haziaren homogenatuen zatiki

solugarriak eta mintzarí lotutakoak erabili izan dira (10 jal). Abzisa-ardatzean, Ala-{3-

Naftilamidaren kontzentrazio ezberdinak jartzen (non 1=125 jxM den). Ordenatuen

ardatzean aktibitate espezifíkoa adierazten da.

EMAITZAK 121

122 Asier Valdivia Palacín D oktore-T es ia


DAGNPG

Sustrato-kontz. x 50 |u.M


Sm Sm

0,25 15 8,5

0,5 26,5 15

1 45,8 26

2 78,8 44,7

4 117,2 66,4

8 176,4 100

16 174,8 99,1

4.2. Taula. DAGNPG-ren kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-patroia, giza

haziaren homogenatu-laginen 10 Lil rentzat. Hazi-homogenatuen mintzati lotutako

zatüdaren batezbesteko aktibitatea adierazten da, aktibitate espezifiko moduan (unitateak

= U.A.P./ mg Proteina) eta ehunekotan (%). (Sm = Mintzari lotutako hazi-homogenatua).

Sustratoaren kontzentrazioak 50 [J,M-en biderkagaiak dira.

122 EMAITZAK

Doktore-T esia As ief Valdivia Palacín 123


DAGNPG

Sustrato-kontzentrazioak x 50 jj.M

4.2. Irudia. Lerroen bidezko, DAGNPG-ren aktibitate degradatzailearen irudikapena,

sustrato beraren kontzentrazioaren arabera. Haziaren homogenatuen mintzari lotutako

zatikia erabili izan da (50 fil). Abzisa-ardatzean, DAGNPG-ren kontzentrazio

ezberdinak jartzen (non 1=50 /xM den). Ordenatuen ardatzean aktibitate espezifikoa

adierazten da.

EMAITZAK 123

124 Asier Valdivia Palacín Doktore-T esia


pGlu-P-Naftilamida

sustrato- kontz.

x125 fjiM


Ss Sm Ss Sm

0,25 12,67 21,09 18,30 37,98

0,5 15,94 26,62 23,03 47,94

1 24,24 35,18 35,02 63,35

2 38,43 55,53 55,52 100

4 69,22 49,48 100 89,1

8 62,56 53,50 90,38 97,5

4.3. Taula. pGlu-P-Naftilamidaren kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-

patroia, giza haziaren homogenatu-laginen 50 jxl-rentzat. Hazi-homogenatuen zatiki

solugarriaren eta mintzari lotutakoaren batezbesteko aktibitateak adierazten dira,

áktibitate espezifiko moduan (unitateak = U.A.P./ mg Proteina) eta ehunekotan (%).

(Ss = Hazi-homogenatu solugarria; Sm = Mintzari lotutako hazi-homogenatua).

Sustratoaren kontzentrazioak 125 jj.M-en biderkagaiak dira.

124 EMAITZAK

Doktote-T esia Asiet Valdivia Palacin 125


pGlu-P-Naftilamida

[sustrato] x 125 fj.M

4.3. Ii'udia. Lerroeti bidezko, pGlu-p-Naftilamidaren aktibitate degradatzailearen

irudikapena, sustrato beraren kontzentrazioaren arabera. Haziaren homogenatuen zatiki

solugarriak eta mintzari lotutakoak erabili izan dira (50 fil), Abzisa-ardatzean, pGlu-fî-

Nañilamidaren kontzentrazio ezberdinak jartzen (non 1—125 jxM den). Ordenatuen

ardatzean aktibitate espezifikoa adierazten da.

EMAITZAK 125

126 Asier Valdivia Palacín Doktore-Tesia

126 EMAITZAK



4.1.2. AKTIBITATE ENTZIMATIKOEN BEREIZKETA

4.1.2.1. Inhibitzaile espezifikoen erabilera

Behin aktibitate degradatzaile bakoitzerako saiakeraren baldintza zinetikoak

(sustrato-kontzentrazio optimoa) finkatu ditugunean, aktibitate horien entzima

arduradunak zeintzuk diren zehaztu behar dugu. Honetarako, sustrato bakoitzarengan

eragin ditzaketen gai kimiko inhibitzaile espezifikoak edota aktibitate maila optimoak

eragiten duten substantzia gehigarriak (aktibatzaile ekintza dutenak) erabiliko ditugu.

Inhibizioa aztertzen dugunean, parametro zinetiko garrantzitsu bat izan behar

da kontutan: I.C. 50. Parametro honen bidez, lagin baten aktibitate entzimatiko zehatz

baten %50a inhibitzeko behar den inhibitzaile kontzentrazioa adierazi nahi da.

Kontzentrazio hau, entzima eta inhibitzailearen arteko afinitateak eta sustrato eta

entzimaren menpekoak mugatzen dute. Kasu guztietan, erabili dugun sustrato

kontzentrazioa, ehun bakoitzerako, aktibitate degradatzailearen sustrato kontzentrazio

optimoa izan da.

Zenbait aktibitateen zehazketarako, haziaz gain, arratoi-garunak erabili izan

dira. Honen helburua, ganmetako inhibizio patroiak eta entzimen deskribapena askoz

ere ezagunagoak izanik, haziarengan eman daitekeen inhibizio-patroiaren ulermena

hobetzea da.

Inhibizioa aztertzen dugunean, datuak konparagarriak izan daitezen,

aktibitateak ehunekotan adierazi dira. Kasu batzutan, haziaren datuak garunekoekin

konparatuta azaltzen dira; honen arrazoia, garunean, aidez aurretik, behatu diren

inhibidoreen efektuak, hazian behatzen direnekin konparatzean, argitasun handiagoz

EMAITZAK 127


azaldu daitekelako entzima baten presentzia edo beste baten ez egotea. Beste batzutan

haziaren datuak berez adierazgarriak izango dira eta garunarekiko konparaketak ez du

informazio gehiagorik emango.

Aztertu dugun lehenengo inhibitzailea Puromizina izan da. Puromizina, Ala-p-

naftilamida sustratoa degradatzen duten PS A entzimaren inhibitzailea da, bere forma

solugarrian eta mintzari lotutakoan. Bi entzima hauek eta APN entzimak sustrato bera

degradatzen dute, baina puromizinaren ekintza inhibitzailea PSA-rengan handiagoa da.

Puromizinaren I.C. 50 PSArentzat 0,6-1,4 pM tartean dagoela deskribatu da (ehun

ezberdinetan) (Solhone eta lank., 1987; Yamamoto eta lank., 1998). Garunaren zatiki

homogenatu solugarriaren kasuan, ikusten den bezala, puromizinarekiko sentikortasun

handiagoa antzema daiteke, haziarekin konparatzerakoan eta 80 ¡iM-eko puromizina

kontzentrazioan aktibitatea guztiz inhibituta azaltzen da. Bertan lortutako I.C. 50a

beste ehunetan behatu izan direnen antzekoa da (0,9 pM). Garunaren, mintzari lotutako

zatikian, inhibizioaren prozesuarekiko erresitentzia handiagoa beha daiteke, APN-ren

presentziagatik (puromizinarekiko sentikortasunik gabekoa). Mintzari lotutako

zatikian, garunean, 80 pM-eko puromizina kontzentrazioan oraindik ere aktibitatearen

%12a dirau (4.4. Taula).

Haziaren kasuan lortutako inhibí zio-kurba, garunean topatutakoaren oso

ezberdina da. Hemen, homogenatuen zatiki solugarrian nahiz mintzari lotutakoan,

inhibizio profil bera aurkezten dute, garunarekin konparatuz, puromizinarekiko

erresistenteagoak direlarik. Honela, 80 pM-cko puromizina kontzentrazioan

aktibitatearen %40 daukagu eta betran lortutako I.C. 50a 65 p.M-ekoa da (4.4. Irudia).

I.C. 50-aren balio hau, beste ehunetan purifikatutako APN-aren balioekin bat dator (50

-78 uM) (Huang eta lank., 1997; Solhone eta lank., 1987). Ondorioz, esan genezake,

giza hazian dagoen Ala-p-Naftilaminaren aktibitate degradatzailea, APN entzimari sor

zaiola.

Badaude ehun anitzetan Ala-p-Naftilamida ahulki degradatzeko gaitasuna

duten zenbait entzima, hala ñola, Leuzil aminopeptidasa (Leu-Ap, E.C. 3.4.11.1), B

aminopeptidasa (AP B, E.C. 3.4.11.6) eta A aminopeptidasa (AP A, E.C. 3.4,11.7).

Beraz, eta hazian topatutako aktibitate-maila altuak direla eta, komenigarria zen APN-

128 EMAITZAK


aren inhibitzaile espezifikoren bat erabiltzea, behatzen ari ginen aktibitatea entzima

honi bakarrik zor zitzaiola egiaztatzeko. Honda, Leuhistina inhibitzailearen

kontzentrazio hazkorrez prestatutako inhibiziozko patroi kurba osatu zen (4.5. Taula),

hazi homogenatuekin. Lortutako I.C. 50-a 0,65 ¡xM-ekoa izan zen, purifikatutako

ApN-arekin lortutakoaren oso balio antzekoa (I.C. 50 0,83 |iM) (Aoyagi eta lank.,

1991). Inhibitzaile honen 16 ¡aM-eko kontzentrazio an entzimaren aktibitatea erabat

ezabatua azaltzen zen.

DAGNPG sustratoa, Endopeptidasa Neutroaren (NEP, E.C. 3.4.24.11) sustratoa

izateaz gain, Angiotentsinaren Entzima Bihurtzaileak (ECA, ACE, E.C. 3.4.15.2) ere

degradatu egiten du, lotura berdinarekiko afinitatea baitu. Beraz, esperimentu

bereizgarriak egin dira, aide batetik, hazian NEP entzimaren egotea finkatzeko (NEP-

aren inhibitzaile espezifikoak erabiliz, Tiorfan, Fosforamidon...) (4.6. Taula eta irudia)

eta bigarrenik, DAGNPG-aren degradazioan haziko ACE-aren erantzukizuna

estimatzeko (Kaptopril, ACE-aren inhibitzaile espezifikoaz) (4.7. Taula eta Irudia).

EMAITZAK 129


INHIBITZAILE ESPEZIFIKOAK

Ala-p-Naftilamidaren degradazioa

Puromizina

Garuna Giza-hazia

Aktibitatea (%) Aktibitatea (%)

[Pur] |xM Gs Gm Ss Sm

0 100 + 3,09 100 ±4,1 100 ±5,1 100 + 4,44

0,625 60,3 ± 3,97 67,3 ±4,31 97,4 ± 4,34 98,6 ± 3,84

1,25 42,0 ± 2,95 52,9 ± 3,20 95,5 ±4,40 96,5 ± 3,60

2,5 27,1 ±4,11 40,8 ± 3,08 94,5 ±3,71 93,2 ± 3,64

5 16,6 ± 3,30 33,7 ± 3,84 88,7 ±4,63 89,8 ±3,10

10 9,22 ± 2,35 24,7 ± 2,46 83,3 ± 3,86 81,4 ± 3,54

20 5,45 + 1,20 19,3 ± 1,69 69,6 ± 3,61 72,1 ±3,58

40 3,07 ± 0,97 15,5 ± 1,57 57,6 ±3,21 59,4 ± 2,88

80 1,96 + 0,80 11,9 ± 2,10 42,9 ± 2,94 44,2 ± 2,51

160 1,35 ±0,61 9,67 ± 1,30 29,3 ±2,19 32,1 ±2,02

320 1,21 ±0,38 8,37 ± 1,95 18,1 ±1,32 20,3 ± 1,76

640 0,89 ± 0,24 6,88 ± 1,30 9,84 ± 1,12 11,5± 1,10

1280 5,36 ± 0,68 6,41 ± 0,80

IC 50 (nM) 0,977 1,55 60,78 64,78

4.4. Taula. Ala-p-N aftilarnidaren aktibitate degradatzailea, puromizinaren kontzentrazio

hazkorrez osatutako inhibizio-patroia. Aktibitatearen ehuneko (%) batezbesteko baüoak

eta erroreak adierazten dira (n=10) . Aztertutako lagin homogenatuak, garunaren eta

haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak barne hartzen dituzte (Gs = garunaren

zatiki solugarria, Gm = garunaren mintzari lotutako zatikia, Ss — Haziaren zatiki

solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).

130 EMAITZAK




Puromizina

Puromizina (|xM)

4.4. Irudia. Puromizinaien eragina Ala-p-Naftüamidaren degradazioan. Aktibitate

portzentaiaren jaitsiera putomizinaren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,

garunaren eta haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak barne hartzen dituzte (Bs

= garunaten zatiki solugarria, Bm = garunaren mintzari lotutako zatikia, Ss = Haziaren

zatiki solugarria, Sm — haziaren mintzari lotutako zatikia).

EMAITZAK 131




Leuhistina

Aktibitatea (%) Giza hazia

[Leu] nM Ss Sm

0 100 ± 4,10 100 ± 4'00

15,625 97,0 ± 4,40 98,2 + 3,95

31,25 93,7 ± 3,58 94,3 ±4,10

62,5 89,0 ± 4,36 91,6 + 4,51

125 79,8 ± 3,85 82,8 ± 3,30

250 68,3 ± 3,20 71,2 ±4,20

500 51,1 ±3,49 54,2 ±3,10

1000 37,0 ± 3,24 38,4 ± 2,64

2000 23,5 ± 2,64 25,1 ±2,81

4000 13,1 ± 1,20 15,7 ± 1,67

8000 7,16 ±1,68 8,76 ± 1,81

16000 3,39 ±1,10 4,88 ± 1,20

IC 50 (nM) 537,9 633,5

4.5. Taula. Ala-p-Naftilamidaren aktibitate degradatzailea, Leuhistinaren kontzentrazio

liazkorrez osatutako inhibizio-patroia. Aktibitatearen ehuneko (%) batezbesteko balioak

eta erroreak adierazten dita (n=10) . Aztertutako lagin homogenatuak, haziaren zatiki

solugarriak eta mintzari lotutakoak bame hattzen dituzte (Ss = Haziaren zatiki solugarria,

Sm — haziaren mintzari lotutako zatikia).

132 EMAITZAK

Doktote-Tesia Asiet Valdivia Palacín 133


Ala-J3-Naftilamidaren degradazioa

Leuhistina

Leuhistina (nM)

4.5, Irudia, Leuhistinaren eragina Ala-P-Naftilamidaren degradazioan. Aktibitate

portzentaiaten jaitsiera puiromizinaren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogcnatuak,

garunaren eta haziaren zatiki solugamak eta mintzari lotutakoak barne hartzen. dituzte (Ss

= Haziaren zatiki solugama, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).

EMAITZAK 133



DAGNPG-ren degradazioa

Tiorfan eta Fosforamidon

Tiorfan Fosforamidon

[Inhibitzailea] (nM) Aktibitatea (%) Aktibitatea (%)

0 100 + 7,06 100 ±5,12

0,078 98,3 ±5,41 86,2 + 4,53

0,156 96’0 + 4,28 79,6 ±5,16

0,312 92,3 ±4,13 67,3 ± 4,64

0,625 86,7 ± 5,86 56,3 ± 6,34

1,25 79,4 + 4,64 41,6 ±5,23

2,5 64,7 ± 5,23 28,6 ±4,60

5 50,1 ±3,61 15,5 ± 1,67

10 32,9 ±3,86 7,61 ± 2,05

20 18,4 + 2,31 5,65 ± 1,55

40 10,9± 1,15 3,74 ± 3,74

80 6,83 ± 1,89 2,68 ± 0,87

160 6,10 ± 2,11 2,13 ±1,22

320 5,62 ± 1,55 1,72 + 0,56

IC50 5 0,835

4.6. Taula. DAGNPGren aktibitate degradatzailea, Tiorfan-en eta Fosforamidon-en

kontzentrazio hazkorrez osatutako inhibizio-patroia. Aktibitatearen ebuneko (%)

batezbesteko balioak eta erroreak adierazten dita (n=10). Aztertutako lagín

homogenatuak, mintzari lotutakoak dira (Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).

134 EMAITZAK




Tiorfan eta Fosforamidon

Inhibitzailea (nM)

4.6. Irudia. Tiorfan eta Fosforamidon-aren eragina DAGNPG-ren degradazioan.

Aktibitate portzentaiaren jaitsiera tiorfan eta fosforamidonaren. eraginez (n™10).

Aztertutako lagin homogenatuak, haziaren mintzari lotutako zatikiak bame hartzen dituzte

(Sm — haziaren mintzari lotutako zatilda).

EMAITZAK 135




Kaptopril

[Kaptopril](nM)

Aktibitatea (%)

Ss Sm

0 100 + 5,61 100 + 6,30

1,953 68,6 ± 2,43 79,31 ±4,81

3,906 49,0 + 1,37 72,41 ± 2,50

7,812 31,4 ±4,41 51,74 ±2,84

15,625 21,6 ±2,13 34,48 ± 3,42

31,25 6,20 + 6,15 10,60 + 4,63

62,5 5,88 + 2,20 10,34 ± 1,80

125 0,98+1,74 10,40 + 1,11

250 0 + 0,98 10,20 ± 2'00

4.7. Taula. DAGNPGren aktibitate degradatzailea, Kaptoprilaren kontzentrazio

hazkorrez osatutako inhibizio-patroia. Aktibitatearen ehuneko (%) batezbesteko balioak

eta erroreak adierazten dita (n=10) . Aztertutako lagin homogenatuak, zatiki solugarriak

eta mintzari lotutakoak dita (Ss = Haziaren zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari

lotutako zatikia).

136 EMAITZAK




Kaptopril

[Kaptopril] (nWl)

4.7. Iludía. Kaptoprilaren eragina DAGNPG-aren degradazioan. Aktibitate

portzentaiaren jaitsiera kaptoprilaren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,

garunaren eta haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak barne hartzen dituzte (Ss

= Haziaren zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).

EMAITZAK 137



4.1.3. AKTIBITATE ENTZIMATIKOEN BEREIZKETA

4.I.3.2. Substantzia gehigarriak: EDTA eta DTT

Entzima batzuen ekintza besteengandik bereizteko, inhibitzaile espezifikoak

erabili beharrean, bestelako substantzia gehigarriak erabili daitezke. Hauek aktibatzaile

moduan ekin dezakete, zenbait entzimen ekintza areagotzea lortzen dutelako. Hauen

adibidea DTT (Ditiotreitol) dugu. DTT-ak, PGA I entzimaren aktibatzailea izanik,

PGA II-ren aktibitatea inhibitu egiten du (O’Cuinn eta lank., 1990). DTT-ak, prolil

endopeptidasaren aktibatzailea dela ere deskribatu izan da ( Zofaghari eta lank., 1986).

pGlu-p-naftilamida (0,5 mM) sustratoaz, eta DTT-aren kontzentrazio hazkorrez

osatutako aktibitate-patroia osatu zen (4.8. Irudia). Argi ikus daiteke pGlu-p-

Naftilamidaren aktibitate degradatzailea areagotu egiten dela, DTT-aren

kontzentrazioa gora egiten duenean. Esperimentu bera egin zen, Z-Gly-Pro-P-

Naftilamidaren (0,25 mM) degradazioa ikertuz. Hemen ere, DTT-aren eraginez,

aktibitateak gora egiten zuen (4.10. Irudia).

EDTA katioi dibalenteak (Ca++, M g^, Zn^,.--) kelatzen dituen substantzia bat

da. Ikerketa ezberdinek, peptidasa ezberdinen aktibitateengan eragina (aktibazioa nahiz

inhibizioa) omen duela deskribatu da. Bai pGlu-|3-Naftilamidaren, bai Z-Gly-Pro-p-

naftilamidaren aktibitate degradatzailean, giza hazian, izan ditzakeen eragina aztertu

izan da (4.9. eta 4.11. Irudiak). Esperimentu hauetan ez da EDTA-ren eragin

aipagarririk behatu.

138 EMAITZAK


EMAITZAK 139


SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK

pGlu-p-Naftilamidaren degradazioa

DTT

Aktibitatea

[DTT] mM Ss Sm

0 100,2 ±5,64 136,4 ±6,36

0,5 120,1 ±7,24 151,8 ±3,22

1 100,9 ± 8,37 167,2 ± 10,6

2 138,8 ±4,50 182,6 ± 13,3

4 167,7 ± 14,7 206,0 ± 15,4

8 187,6 ±21,3 239,0 ± 18,3

16 232,9 ± 20,2 290,0 ± 16,5

32 293,0 ± 12,8 376,7 ±11,3

4.8. Taula. p Glu - fi-N a ftilami dar en aktibitate degradatzailea, DTTaren kontzentrazio

hazkorrez osatutako aktdbitate-patroia. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak eta

erroreak adieiazten dira (n=10) (Unitateak = P.A.U./'mg proteina). Aztertutako lagin

homogenatuak, zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak dira (Ss = Haziaren zatiki

solugama, Sm — haziaren mintzari lotutako zadkia).

140 EMAITZAK



pGlu-P-Naftilamidaren degradazioa

DTT

[DTTl mM

4.8. Irudia. DTTaren eragina pGlu--p-Naftüamidaren degiadazioan. Aktibitate

espezifikoaten igoera DTTaren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,

haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak bame hartzen dituzte (Ss = Haziaren

zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).

EMAITZAK 141



pGlu-P-Naftilamidaren degradazioa

EDTA

aktibitatea

[EDTA] mM Ss Sm

0 141,7 ±4,50 139,6 ±7,40

0,125 144,5 ±7,42 143,7 ±9,12

0,25 139,2 ±13,7 142,2 ±4,53

0,5 138,0 ±8,54 140,0 ±3,33

1 138,8 + 3,62 138,5 ±6,57

2 140,1 ±5,51 145,3 ± 10,5

4 132,4 ±5,23 145,3 ±4,20

4.9. Taula. pGlu-p-Naftilamidaren aktibitate degradatzailea, EDTAren kontzentrazio

hazkorrez osatutako aktibitate-patroia. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak eta

erroreak adierazten dira (n= 10) (Unitateak = P.A.U./mg proteina). Aztertutako lagin

homogenatuak, zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak dira (Ss = Haziaren zatiki

solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).

142 EMAITZAK



pGlu-j3-Naftilamidaren degradazioa

EDTA

[EDTA] mM

4.9. Iiudia. EDTArcn eragjna pGlu-P-Naftilamidaren degradazioan. Aktibitate

espezifikoaren igoera EDTAren. eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,

haziaren zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak barne hartzen dituzte (Ss = Haziaren

zatiki solugarria, Sin = haziaren mintzari lotutako zatikia).

EMAITZAK 143



Z-Gly-Pro- P-Naftilamidaren degradazioa

DTT

Aktibitatea

[DTT] mM Ss Sm

0,00 236,9 ± 11,2 68,31 ±7,47

0,50 163,4 ±7,25 136,1 ± 14,2

1,00 247,7 ± 8,40 217,6 ±4,56

2,00 259,0 ± 3,54 260,9 ± 6,78

4,00 349,1 ± 6,70 302,0 ± 16,8

8,00 410,3 + 21,2 371,6 ±23,7

16,00 524,8 ± 14,6 518,4 ± 18,2

32,00 621,9 ±22,3 703,1 ±24,0

4.10. Tauía. Z-Gly-Pro-|3-Naftilamidaren aktibitate degradatzailea, DT Taren

kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-patroia. Aktibitate espezifikoaren

batezbesteko balioak eta erroreak adierazten dita (n=10) (Unitateak = P.A.U./tng

proteina). Aztertutako lagin homogenatuak, zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak dita

(Ss = Haziaren zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).

144 EMAITZAK



Z-GIy-Pro-{3-Naftilamidaren degradazio a

DTT

[DTT] mM

4.10. Irudia. DTTaren eragina Z-Gly-Pro-P-Naftilamidaren degradazioan. Aktibitate

espezifikoaren igoera DTTaren eraginez (n= 10). Aztertutako lagin homogenatuak,



EMAITZAK 145


SUBSTANTZIA GEHIGARRIAK.

Z-Gly-Pro- P-Naftilamidaren degradazioa

EDTA

aktibitatea

[EDTA] mM Ss | Sm

0 85,4 ± 5,35 124,4 + 9,36

0,125 120,9 ± 17,8 95,7 ± 6,48

0,25 60,4 ± 25,6 48,8 ± 27,2

0,5 108,7 ±4,34 103,3 + 6,50

1 104,1+6,25 91,8 ±23,3

2 48,2 + 14,8 24,6 ±4,37

4 79,1 ±3,56 58,0± 20,6

4.11. Taula. Z-Gly-Pro-p-Naftikmidaren aktibkate degradatzailea, EDTAren

kontzentrazio hazkorrez osatutako aktibitate-patroia. Aktibitate espezifikoaren

batezbesteko balioak eta erroreak adierazten dira (n=10) (Unitateak — P.A.U./mg

pioteina). Aztertutako lagin homogenatuak, zatiki solugarriak eta mintzari lotutakoak dira

(Ss = Haziaren zatiki solugarria, Sm = haziaren mintzari lotutako zatikia).

146 EMAITZAK


SURSTANTZIA GEHIGARRIAK

Z-Gly-Pro-j3-Naftilamidaren degradazioa

EDTA

[EDTA] mM

4.11. Ifudia, EDTAren eragina Z-Gly~Pro-(3-Naftilamidaren degradazioan. Aktibitate

espezifikoaren igoera EDTAren eraginez (n=10). Aztertutako lagin homogenatuak,



EMAITZAK 147


4.2. AKTIBITATE ENTZIMATIKOAK:

EHUNEN ARTEKO KONPARAKETAK

Ikertu diren entzimen aktibitateak ah al i k eta hoberen deskribatzeko,

esanguratsua izan daiteke hazian lortzen diren aktibitate-balioak eta ikertuak izan diren

beste ehunetan lortutako balioak konparatzea. Era honetan, entzima hauek giza

haziaren fisiologian izan ditzaketen garrantziaren inguruko beste datu bat lor daiteke,

Esperimentu talde honetan arratoi-ehunen eta giza haziaren homogenatuak erabili izan

dira, aurreko ataletan deskribatutako esperimentazio baldintzetan (sustrato

kontzentrazio optimoa erabiliz, inhibitzaileak,...).

N aminopeptidasaren kasuan (APN), argi ikusten da mailarik altuenak giza

hazian eta arratoi-giltzurrunean behatzen direla (4.12. Irudia), batez ere, mintzari

lotutako zatikian. Bi ehun hauek, birikarekin batera, mintzari lotutako zatikian, zatiki

solugarrian baino aktibitate maila altuagoak dituzte. Garunaren aldean, haziko

homogenatuen zatiki solugarrian nahiz mintzari lotutakoan, APN-ren aktibitatea 3 eta

16 aldiz handiagoa da hurrenez hurren (4.12. Taula).

APN-arekin gertatzen den moduan, endopeptidasa neutroaren (NEP) aktibitate

maila altuenak giltzummean, birikan eta giza hazian behatu dira hemen ere. Berriz ere,

haziko homogentatuetako bailoak garunekoak baino askoz aktibiate maila altuagoak

dituzte (10 aldiz). Entzima hau, mintzeko zatikian bakarrik deskribatu izan da, beraz ez

dago, zatiki solugarriaren daturik (4.13. Irudia).

Piroglutamil Peptidasa I (PGA I) aktibitate maila altuenak giltzummean (batez

ere), birikan eta garunean topatu izan dira. Kasu honetan, giza hazia erdimailako

aktibitatea aurkezten du. Ehun guztietan zatiki solugarriko aktibitateak handiagoak

148 EMAITZAK


izanda, haziaren kasuan zatiki solugarria eta mintzari lotutakoaren mailak oso

parekoak dira (4.14. Irudia).

Prolil endopeptidasaren kasuan, hazi-homogenatuetan behatutako aktibitateak,

beste ehunetakoak baino txikiagoak dira, modu nabari batean. Kasu guztietan, zatiki

solugarriak, mintzari lotutakoak baino aktibitate handiagoak ditu. Kasu honetan,

garuna eta birika dira, aktibitate-maila altuenak dituzten ehunak (4.15. Taula eta

irudia).

EMAITZAK 149


EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA

N Aminopeptidasa (APN)

aktibitatea

EHUNAK soiugarria mintza

Muskulua 6948 ± 657 4415 ±511

Bihotza 118071798 1945 ±401

Birika 4813,±325 9357 ± 220

Garuna 22654 ±1501 5954 ± 960

Giltzurruna 13311 ± 1989 125501 ± 13494

Giza hazia 9364218711 13120217628

4.12. Taula. APN aminopeptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, biliotza,

bitika, garuna eta giltzurrun ehunak, arratoi-ehunak dira (n=10). Ehunen homogenatuen,

zatiki solugarriaren eta mintzari lotutakoaren batezbesteko aktibitateak eta euren erroreak

adieiazten dira, aktibitate espezifiko moduan (unitateak = P A.U. / mg Proteina).

150 EMAITZAK




Ehunak

4.12. Itudia. APN aminopeptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,

birika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dka (n=10). Ehunen homogenatuen

zatiki solugarria eta mintzari lotutakoa aztertu egin dira. Aktibitatearen balioak, aktibitate

espezifikoa adierazten dute.

EMAITZAK 151



Endopeptidasa Neutroa (NEP)

aktibitatea

EHUNAK Mintza

Muskulua 16,0 + 3,92

Bihotza 4,08 ± 0,57

Birika 43,3 + 5,75

Garuna 6,92 ± 1,44

Giltzurruna 131,7 ± 4,29

Giza hazia 68,3 ± 9,47

4.13. Taula. Endopeptidasa Neutroaren akdbitatea eliun ezberdínetan. Muskulua,

bihotza, bkika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dita (n=10). Ehunen

homogenatuen mintzari lotutako zatikiaren batezbesteko aktibitateak eta euxen erroreak

adierazten dira, aktibitate espezifiko moduan (unitateak = PA .U ./ mg Proteina).

152 EMAITZAK


EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKO A


160 "

140 ■

Ehunak

4.15. Irudia. Endopeptidasa Neutroaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua,

bihotza, birika, garuna eta gil tzumm-ehunak, atíatoi-ehunak dira (n=10). Ehunen

homogenatuen mintzari lotutako zatikiak aztettu egin dita. Aktibitatearen balioak,

aktibitate espezifikoa adierazten dute.

EMAITZAK 153


EHÜNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA.

Piroglutamil Peptidasa I

aktibitatea

EHUNAK Solugarria mintza

Muskulua 99,40 ± 18,15 77,27 ± 38,63

Bihotza 294,2 ± 65,44 41,28 ±20,64

Birika 639,2 ± 92,54 109,7 ± 54,85

Giltzurruna 1900,3 ±225,8 276,5 ± 138,2

Garuna 406,7 ± 23,27 120,4 ±60,21

Giza hazia 202,9 ± 30,20 208,7 + 51,40

4.14. Taula. Piroglutamil Peptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,

bitika, garuna eta gjltzumm-ehunak, arratoi-ehunak dita (n=10). Ehunen homogenatuen

zatiki solugarriaren eta mintzari lotutakoaten batezbesteko aktibitateak eta euren erroreak

adierazten dita, aktibitate espezifiko moduan (unitateak = P.A.U./ mg Proteina).

154 EMAITZAK



Piroglutamil Peptidasa I

2500 -i

Ehunak

4.14. Irudia. Piroglutamil peptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,

birika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dira (n=10). Ehunen homogenatuen

zatiki solugarrian eta mintzari lotutakoan aztertu egin dira. Aktibitatearen balioak,

aktibitate espezifikoa adierazten dute.

EMAITZAK 155



Prolil Endopeptidasa

Aktibitatea

EHUNAK sofugarria Mintza

Muskulua 2913,08 121,93

Bihotza 2891,17 109,77

Birika 3977,27 234,02

Giltzurruna 1676,56 299,19

Garuna 4400,36 854,38

Giza hazia 405,16 240,34

4.15. Taula. Prolil endopeptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,

birika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dixa (11= 10). Ehunen homogenatuen

zatiki solugarriaren eta mintzari lotutakoaren batezbesteko aktibitateak eta euren erroreak

adierazten dira, aktibitate espezifiko moduan (unitateak = P.A.U./ mg Proteina).

156 EMAITZAK


EHUNETAKO AKTIBITATE ENTZIMATIKOA.


a?& Q>°&

Ehunak

ü s o l u g a r r i a

■ m i n t z a

&

4.15. Ifudia. Prolil endopeptidasaren aktibitatea ehun ezberdinetan. Muskulua, bihotza,

birika, garuna eta giltzurrun-ehunak, arratoi-ehunak dita (n=10). Ehunen homogenatuen

zatiki solugarrian eta mintzari lotutakoan aztertu egin dira. Aktibitatearen balioak,

aktibitate espezifikoa adietazten dute.

EMAITZAK 157


158 EMAITZAK



HAZI-PATOLOGIAK

Tesi honen bigarren xedea, aztertutako peptidasen karakterizazioa egin

ondoren, peptidasa hauek haziaren zenbaít patologiarekin erlazionatzea da.

Honetarako, aktibitate entzimatiko bakoitza, haziaren diagnostiko-talde ezberdinetan

aztertu egin zen.

Lau talde diagnostiko nagusitan bildu genituen hazi-laginak: normozoospermikoak,

astenozoospermikoak, nekrozoospermikoak eta astenoteratozoospermikoak. Hazi-lagin

patologikoetan, haziaren patología bat baino gehiago izatea oso nórmala da, batez ere,

nekrozoospermia aurkezten duten hazietan. Honela, oso zaila da nekrozoospermiaren

talde patologiko purua (bakarrik patología bakarra dituzten haziak) osatzea. Beraz,

talde batzu ekrozoospermikoen taldean bateratu ziren. Honetarako, Nekrozoospermia,

besteen gainetiko garratzia zuen patología bezala jotzea erabaki genuen,

nekrozoospermia azaltzen zuten lagin guztiak (bestelako patologiak ere izan arren)

automatikoki talde berean sailkatuz. Honezkero, taldeak hórrela antolatu ziren:

• Normozoospermikoak: Normozospermikoak soilik biltzen ditu (Talde purua)

• Astenozoospermikoak: Astenozoospermikoak soilik biltzen ditu (Talde purua)

• Nekrozoospermikoak: Nekrozoospermia azaltzen duten hazi-lagin guztiak

biltzen ditu (nekrozoospermiko puruak, astenoekrozoospermikoak,

astenonekroteratozoospermikoak eta nekroteratozoospermikoak)

• AstenoTeratozoospermikoak: astenoteratozoospermikoak soilik biltzen ditu

(Talde purua)

Bestelako patologiak aztertu arren, lagin-kopuru urria izateagatik, ikerketatik

kanpo utzi behar izan ziren.

EMAITZAK 159


Emaitzak bi eratara aurkeztu egiten dira. Aide batetik, giza haziaren lau zatikiren

aktibitate espezifikoak (P.A.U. / mg proteina) ikertu ziren. Zatiki hauek

espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), espermatozoideen mintzari lotutako zatikia

(SpM), likido semin ala (Ls) eta prostasomen zatikia (P) izan ziren. Endopeptidasa

neutroaren kasuan, soilik aztertu zen prostasomen zatikia, beste zatikietan aktibitaterik

azaltzen ez duelako. Emaitzak ere, zatiki zelularretan (SpS eta SpM) soilik, aktibitate

entzimatikoa espermatozoide kopuru osoarekiko moduan adierazi ziren (P.A.U. /

espermatozoide milioi). Beste bi zatikietan (Ls eta P) horrelako aktibitate adierazpena

ez da aurkeztu, oso esanguratsua izango ez litzatekelako, jatorri ezberdineko haziaren

osagaiak direlako (lehenengoa besikula seminaletatik jariatua eta bigarrena prostata-

guruinetik).

N Aminopeptidasaren (APN) aktibibitate espezifikoa aztertzean beha daiteke,

nekrozoospermia duten hazien zatiki zelularretan (espermatozoideetan) aktibitatea

altuagoa dela, normozoospermikoen taldearen aldean. Ezberdintasuna estatistikoki

adierazgama izaten da espermatozoideen zatiki solugarrian (SpS) (p<0,01), eta

espermatozoideen mintzari lotutako zatikian (SpM) (p<0,05)(4.16 irudia). Aldiz,

astenozoospermikoek eta astenoteratozoospermikoek aktibitate baxuagoak azaltzen

zituzten, normozoospermikoen aldean (p<0,05). prostasomen (P) eta likido

seminalaren (Ls) zatikietan ere astenozoospermikoek aktibitate baxuagoak azaltzen

zituzten, baina kasu honetan, ezberdintasunak ez dira estatistikoki adierazgarriak.

Aktibitatea espermatozoide kopuruarekiko ematen denean, asteno eta

nekrozoospermikoen arteko ezberdintasun adierazgama dago , espermatozoideen

zatiki solugarrian (SpS) (4.17. irudia).

Endopeptidasa neutroaren (NEP) kasuan, prostasomen zatikia aztertu da, besteetan,

aurretik esan bezala, ez bait dago entzima honen aktibitaterik. Kasu honetan ez da

ezberdintasun estatistiko adierazgarririk topatu talde patologikoen artean (4.18. irudia).

Piroglutamil peptidasa I aktibitatea aztertzean (4.19. irudia), nekrozoospermiadun

hazi-laginek, normozoospermikoek baino aktibitate espezifiko altuagoak zituzten

(p<0,05) espermatozoideen zatiki solugarrian. Ez dago ezberdintasun estatistikoki

160 EMAITZAK

Doktore-T esia Asier Valdivia Paíacín 161

esanguratsurik bestelako hazi-zatikietan. Ezberdintasun hauek mantendu egiten dira

aktibitatea espermatozoideen milioiekiko adierazten dugunean (4.20.) (p<0,05).

Aktibitate maila altuagoak topatu izan dira ere Prolil Endopeptidasa aktibitatea

aztertzean (4.21. irudia) nekrozoospermiadun hazi-laginen taldean,

normozoospermikoen aldean (p<0,05), baina kasu honetan, espermatozoideen mintzari

lotutako zatikian. Hemen ere, aktibitatea espermatozideen milioiekiko ematen

dugunean, ezberdintasunak mantentzen dira (p<0,05) (4.22. irudia)

EMAITZAK 161

162 Asier Valdivia Palacín D oktote-Tesia

AKTIBITATE PEPTIDASIKOA HAZI

PATOLOGIKOETAN


Aktibitate Espezifikoa

PATOL. SpS SpM Ls P

N 25814 ±3727 41121± 9068 107512± 14325 368120 ±91574

A 10236 ±1577 31994 ±3938 92733 ± 14399 283138 ±32434

Ne 44628 ± 5081 112748 ±24747 105020 + 11070 382482 ± 27213

AT 18045 ±5874 14376 ±2412 139289 ±23672 346508 ±59213

4.16. Taula. N aminopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki ezberdinetan.

Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ mg proteina) eta erroreak

adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziren (N =

Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = Asteno-

Teratozoospermia). Aztertutako lau hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria

(SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta

Prostasomak (P) izan dira.

162 EMAITZAK

Doktore-Tesia As ier Valdivia Palacio 163


P ATOLOGIKOET AN


e 300000Q.D>E 250000

SpS SpM Ls

Haziaren zatiki azpizelularrak

■ N0A□ Ne□ AT

4.16. Itudia. N aminopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoetan. Lau talde

patologiko ezberdintzen dira (N = Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne =

Nekrozoospermia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10). Aztertutako

hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen mintzari

lotutako zatikia (SpM), Lákido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) izan dira. Aktibitate

espezifikoa adierazten da. ÁNOVA-ren adierazgarritasuna adierazten da (*) p< 0,05; (**)

p<0,01.

EMAITZAK 163



PATOLOGIKOETAN


Aktibitatea / Espermat. kopurua

PATOLOGIAK SpS SpM

N 17,0 ±6,16 43,4 + 9,88

A 9,70 ±3,07 39,7 ± 11,3

Ne 45,2 ± 15,4 96,9 ± 29,2

AT 2,25 ± 0,84 47,9 ±14,7

4.17. Taula. N Aminopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki zelularretan.

Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ espermatozide x 106) eta erroreak

adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziien (N =

Nortnozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = Asteno-

Teratozoosperinia). Aztertutako haziaren zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria

(SpS) eta Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM) dira.

164 EMAITZAK



PATOLOGIKOETAN


140 n

IN

El Ne

□ AT

SpS SpM

Haziaren zatiki zelularrak

4.17. Irudia. N aninopeptidasaren aktibitatea, espermatozoide kopuruaren arabera, giza

hazi patologikoetan. Lau talde patologiko ezberdintzen dira (N ~ Normozoospermia, A =

Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde

bakoitzak ti >10). Aztertutako hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS) eta

Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM) izan dita. Aktibitate espezifikoa

adierazten da eta ANOVA-ren adierazgarritasuna ere adierazten da (*) p< 0,05; (**)

p<0,01.

EMAITZAK 165



PATOLOGIKOETAN



PATOLOGIA P

N 130,1 ± 15,1

A 93,3 ± 10,4

Ne 105,2 ± 9,0

AT 120,0 ± 13,1

4.18. Taula. Endopeptidasa neutroaien aktibitatea giza hazi patologikoen prostasomen

(P) zatikian. Aktibitate espezifikoaten batezbesteko balioak (P.A.U./ mg proteina) eta

erroreak adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan banatu ziren (N =


T eratozoosp ermia).

166 EMAITZAK



PATOLOGIKOETAN


N A Ne AT

Prostasomak

4.18. Itudia. Endopeptidasa neutroaren aktibitatea giza hazi patologikoetan. Lau talde

patologiko ezberdintzen dita (N = Normozoospennia, A = Astenozoospermia, Ne ~

Nekrozoospermia, AT = Asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10). Prostasomen

(P) zatikian aztertu izan da. Aktibitate espezifikoa adierazten da eta ANOVA-ren

adierazgamtasuna ere adierazten da (*) p< 0,05; (**) p<0,01.

EMAITZAK 167



PATOLOGIKOETAN

Piroglutamil Peptidasa I (PGA I)


PATOLOGIAK SpS SpM Ls P

N 116,7 + 12,1 256,0 ± 38,7 172,4 ±88,2 169,7± 29,7

A 149,4 ±29,2 256,7 ± 46,9 144,4 ±63,0 197,7 ±50,8

Ne 273,5 + 20,5 292,8 ±13,6 185,5 ±31,6 213,7 + 8,18

AT 139,5 ±14,3 198,9 + 54,7 119,8+47,3 117,5 ± 18,3

4.19. Taula. Pkoglutamil Peptidasa I-aten aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki

ezberdinetan. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ mg proteina) eta


Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoo spermia, AT = Asteno-


(SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminaia (Ls) eta

Pros tas omak (P) izan dira.

168 EMAITZAK



PATOLOGIKOETAN


3 5 0 -

3 0 0 -

o 2 5 0 ■ i_Q-OJE 200-

ó

100

50 ■

SpS SpM Ls P


4.19. Irudia. Piroglutamil Peptidasa I-aren aktibitatea giza hazi patologikoetan. Lau talde


Nekrozoospertnia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10). Aztertutako


lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) izan dira. Aktibitate

espezifikoa adierazten da eta ANOVA-ren adierazgarritasuna ere adierazten da (*) P<

0,05; (**) p<0,01.

EMAITZAK 169



PATOLOGIKOETAN


Aktibitatea / Espermat. Kopurua

PATOLOGIAK SpS SpM

N 0,27 ± 0,0965 0,62 ± 0,0983

A 0,23 ±0,0312 0,77 ±0,1522

Ne 0,44 ± 0,0975 0,99 ±0,1789

AT 0,29 ± 0,0432 0,84 ±0,2103

4.20. Taula. Pkoglutamil Peptidasa I-aren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki

zelularretan. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ espermat.ozide x 106)

eta erroreak adierazten dira (n > 10). Hazi-laginak lau talde patologikoetan baña tu ziren (N

= Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT = Asteno-

Teratozoospermia). Aztertutako haziaren zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugatria

(SpS) eta Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM) dira.

170 EMAITZAK



PATOLOGIKOETAN


oT-x 1 .

SpS SpM


■ N

0 A

0 Ne

□ AT

4.20. Irudia. Piroglutamil Peptidasa I-aren aktibitatea, espermatozide kopuruaren arabera,

gÍ2 a hazi patologikoetan. Lau talde patologiko ezberdintzen dira (N = Normozoospermia,

A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT — asteno-teratozoospermia), (talde

bakoitzak n >10). Aztertutako hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS) eta

Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia ere (SpM) izan dira. Aktibitate espezifíkoa

adierazten da eta ANOVA-ren adierazgarritasuna ere adierazten da (*) p< 0,05; (**)

p<0,01.

EMAITZAK 171



PATOLOGIKOETAN


Aktibitate Espezifíkoa

PATOLOGIAK SpS SpM Ls P

N 726,7 ±106,9 271,9 ±32,6 140,3 ±9,23 168,2 ± 10,6

A 1106 ±269,2 245,9 ± 26,1 139,0 ± 13,9 164,0 ± 13,2

Ne 1334 ± 120,4 395,8 ± 22,0 150,2 ± 11,7 146,5 ±17,1

AT 705,5 ± 377,9 150,3 ±67,3 122,7 ± 12,0 152,7 ±10,7

4.21. Taula. Prolil Endopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki

ezberdinetan. Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ mg proteina) eta



Teratozoospermia). Aztertutako lau hazi-zadkiak, Espermatozoideen zatiki solugarria

(SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta

Prostasomak (P) izan dira.

172 EMAITZAK



PATOLOGIKOETAN


SpS SpM Ls

■ N

HA UNe

□ AT


4.21. Irudia. Prolil Endopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoetan. Lau talde


Nekrozoospermia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10). Aztertutako


lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) izan dira. Aktibitate

espezifikoa adierazten da eta ANOVA-ren adierazgarritasuna ere adierazten da (*) p<

0,05; (**) p<0,0l.

EMAITZAK 173



PATOLOGIKOETAN


Aktibitatea / Espermat. kopurua

PATOLOGIAK SpS SpM

N 0,64 ± 0,2572 0,79 ±0,1579

A 1,18 ±0,2217 0,97 ±0,1675

Ne 1,13 ±0,3707 1,46 ± 0,2437

AT 1,08 ±0,2826 0,73 ±0,1351

4.22, Taula. Prolil Endopeptidasaren aktibitatea giza hazi patologikoen zatiki zelularretan.

Aktibitate espezifikoaren batezbesteko balioak (P.A.U./ espermatozoide x 106) eta


Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne = Nekrozoospermia, AT “ Asteno-


(SpS) eta Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM) dka.

174 EMAIT2AK



PATOLOGIKOETAN


*

SpS SpM


■ N

EA□ Ne

□ AT

4.22. itudia. Prolil Endopeptidasaren aktibitatea, espermatozoide kopuruaren atabera

(aktibitatea / espermatozoide milioiak), giza hazi patologikoetan. Lau talde patologiko

ezberdintzen dira (N = Normozoospermia, A = Astenozoospermia, Ne =

Nekrozoospetmia, AT = asteno-teratozoospermia), (talde bakoitzak n >10), Aztertutako

hazi-zatikiak, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS) eta Espermatozoideen mintzari

lotutako zatikia (SpM) dira. Aktibitate espeziñkoa adierazten da eta ANOVA-ren

adierazgarritasuna ere adierazten da (*) p< 0,05; (**) p<0,01.

EMAITZAK 175


176 EMAITZAK


4.4. AKTIBITATE PEPTIDASIKOA ETA

HAZIAREN PARAMETRO EZBERDINAK

Korrelazioak

ANOVA eta hipotesi-kontrasteaz gain, interesgarria zen, nolabaiteko korrelazio

matematikorik ote zegoen, aktibitate ezberdinen eta seminogramaren parametro

ezbedinen artean, frogatzea. Honela, zenbait korrespondentzia topatu ziren, zatiki

ezberdinetako (Espermatozoideen zatiki solugarria, Espermatozoideen mintzari

lotutako zatikia, Likido seminala eta Prostasomak) aktibitateen balioen eta hazi-

parametro ezberdinen artean.

Aztertutako hazi-neurri edo parametroak hiru kontzeptu nagusiri so egiten

zieten. Aide batetik, mugikortasuna islatzen duten zenbait parametro harremandu

ziren, hala ñola, A motako espermatozoideen portzentaia lagin bakoitzean (A mota %),

B motako espermatozoideen portzentaia (B mota %), bi hauen arteko batura (A+B %),

Espermatozoide mugikor baina progresibitaterik gabekoen portzentaia (C mota %),

mugikortasunik gabeko espermatozoideen portzentaia (D mota %), eta bi hauen arteko

batura (C+D mota %). Bestalde, lagin bakoitzeko espermatozoideen

bideragarritasunarekin korrelazioa bilatu zen, nekrozoospermiaren balorazioaren bidez

(Hildakoak %). Azkenik, espermatozoideen kontzentrazio a (Sperm/ml) eta aktibitate

peptidasikoak harremandu ziren.

N aminopeptidasaren (ApN) kasuan, ez zen inolako korrelaziorik behatu Likido

Seminalean (Ls) jasotako aktibitate-balioen eta haziaren parametroen artean. Bestelako

zatikietan, ordea, zenbait parametrorekin korrelazio adierazgarria behatu zen. C+D

taldearekin, Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS) eta mintzari lotutakoa (SpM) eta

EMAITZAK 177


Prostasomak (P), korrelazio negatibo adierazgarria (p<0,01) eman zuten. D motako

espermatozoideen portzentaiak ere, aurreko zatikiekin korrelazio negatibo

adierazgarria (p<0,05) izan zuen. SpS eta SpM zatikien aktibitate balioak eta hildako

espermatozoideen portzentaiak korrelazio positibo adierazgarria azaltzen zuten

(p<0,01). Gauza bera gertatzen zen, bi zatiki hauen eta espematozoideen

kontzentrazio aren balioen artean (p<0,01 etap<0,05) (4.23. Taula)

Endopeptidasa neutroaren aktibitate-balioek (Prostasometan soilik) ez zuten

inolako korrelazio adierazgarririk azaltzen aztertutako neurri seminologikoekin (4.24.

Taula).

Pirglutamil peptidasa I-aren kasuan, soilik espermatozoideen zatiki solugarrian

(SpS) behatu izan dira korrelazio adierazgarriak. Hauek, hildako espermatozoideen

portzentaiarekin positiboak izan dira (p<0,01) eta C+D motatakoen portzentaiarekin

eta espermatozoideen kontzentrazioarekin negatiboak (p<0,01) (4.25. Taula).

Prolil Endopeptidasaren kasuan, korrelazio negatibo adierazgarria (p<0,05)

behatu izan da B motako espermatozoideen portzentaiaren artean eta SpM zatikiko

aktibitate-balioen artean. A+B baturaren portzentaiaren eta aktibitate-balioen arteko

korrelazio positibo adierazgarria (p<0,05) behatu izan da P zatikian (4.26. Taula).

178 EMAITZAK


EMAITZAK 179


AKTIBITATE PEPTIDASIKOA ETA HAZIAREN

PARAMETRO EZBERDINAK


korrelazioaSpS SpM Ls P

A mota % Pearson -0,016 -0,012 0,067 0,079adieraz. 0,903 0,926 0,572 0,520

B mota % Pearson 0,028 0,010 0,075 0,089adieraz. 0,830 0,936 0,530 0,470

A + B % Pearsonadieraz.

0,0290,823

-0,0030,980

0,0910,442

0,1070,383

C mota %Pearsonadieraz.

-0,2430,064

-0,1830,157

0,1180,323

-0,1990,106

D mota %Pearson -0,326* -0,278* -0,197 -0,239*adieraz. 0,011 0,029 0,096 0,049

C + D % Pearsonadieraz.

-0,417**0,001

-0,342**0,007

-0,1080,366

-0,321**0,008

Hildakoak %Pearson 0,461** 0,339** -0,061 0,165adieraz. < 0,001 0,007 0,609 0,178

Sperm/ml Pearson -0,390** -0,283* 0,093 -0,132adieraz. 0,002 0,026 0,432 0,282

4.23. Taula. N aminopeptidasaren aktibitatea eta zenbait parametro seminalen arteko

korrelazioa. Mugikortasuna (A mota%, B mota%, A+B%, C mota%, D mota%, C+D

mota%), Bideragarrítasuna (HiIdakoak%) eta espermatozoide-kontzentrazioa (Sperm/mi),

haziaren zatiki ezberdinekin eriazionatu dira (Sps = Espermatozoideen zatiki solugarria;

SpM = Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia; Ls - Likido seminala; P =

Prostasomak). Korrelazioen adierazgarritasun estatistikoa * (p<0,05) eta ** (p<0,0l)

ikurren bidez adierazi da.

180 EMAITZAK





korrelazioaP

A mota % Pearsonadieraz.

0,0780,521

B mota % Pearsonadieraz.

-0,1250,305

A + B % Pearsonadieraz.

-0,0320,795

C mota % Pearsonadieraz.

-0,1440,239

D mota % Pearsonadieraz.

-0,0430,724

C + D % Pearson 0,05adieraz. 0,861

Hildakoak % Pearsonadieraz.

-0,1450,240

Sperm/ml Pearsonadieraz.

-0,0100,935

4.24. Taula. Endopeptidasa neutroaren aktibitatea eta zenbait paramétra seminalen

arteko kortelazioa. Mugikortasuna (A mota%, B mota%, A+B%, C mota%, D mota%,

C+D mota%), Bideragarntasuna (Hildakoak%) eta espermatozoide-kontzentrazioa

(Sperm/ml), haziaten zatiki ezberdinekin erlazionatu dira (Sps = Espermatozoideen zatiki

solugarria; SpM = Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia; Ls = Likido seminala; P =

Prostasomak). Korrclazioen adierazgarritasun estatistikoa * (p<0,05) eta ** (p<0,01)


EMAITZAK 181

182 Asier Valdivia Palacín Doktote-T esia





A mota % Pearsonadieraz.

-0,0150,931

-0,0350,810

0,1120,400

0,0060,967

B mota % Pearsonadieraz.

0,0810,639

-0,0230,875

0,1290,329

0,2210,096

A + B %Pearsonadieraz.

0,0360,835

-0,0390,788

0,1520,252

0,1270,341

C mota % Pearsonadieraz.

-0,1430,412

0,0410,777

-0,1500,260

-0,0890,509

D mota %Pearsonadieraz.

-0,2850,092

-0,2320,105

-0,1120,399

-0,1840,167

C + D % Pearsonadieraz.

-0,368*0,030

-0,2050,154

-0,1940,146

-0,2180,104

Hildakoak % Pearsonadieraz.

0,458**0,005

0,2640,064

0,1550,242

0,1770,184

Sperm/ml Pearsonadieraz.

-0,353*0,035

-0,1820,205

-0,1250,346

-0,1190,373

4.25. Taula. Pkoglutamil peptidasa I-aren aktibitatea eta zenbait parametro seminalen

arteko kortelazioa. Mugikoitasuna (A mota%, B mota%, A+B%, C mota%, D mota%,

C+D mota%), Bideragarritasuna (Hildakoak%) eta espermatozoide-kontzentrazioa

(Sperm/ml), haziaren zatiki ezberdinekin erlazionatu dita (Sps = Espermatozoideen zatiki

solugarria; SpM = Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia; Ls = Likido seminala; P =

Prostasomak). Kotrelazioen adierazgarritasun estatistikoa * (p<0,05) eta ** (p<0,01)

ikurren bidez adietazi da.

182 EMAITZAK

Doktoie-Tesia Asier Valdivia Palacín 183





A mota % Pearson -0,069 0,056 0,009 0,201adieraz. 0,666 0,714 0,946 0,103

B mota % Pearson 0,070 -0,304* 0,084 0,203adieraz. 0,659 0,042 0,504 0,099

A + B % Pearson -0,014 -0,129 0,054 0,263*adieraz. 0,929 0,399 0,670 0,032

C mota % Pearson -0,031 0,072 -0,091 0,009adieraz. 0,847 0,639 0,473 0,945

D mota % Pearson -0,183 -0,176 0,010 -0,103adieraz. 0,247 0,248 0,934 0,406

C + D % Pearson -0,204 -0,098 -0,054 -0,097adieraz. 0,201 0,523 0,667 0,437

Hildakoak % Pearson 0,023 0,289 0,099 -0,157adieraz. 0,139 0,054 0,427 0,206

Sperm/ml Pearson -0,058 -0,033 0,033 0,076adieraz. 0,717 0,829 0,795 0,541

4.26. Taula. Prolil endopeptidasaren aktibitatea eta zenbait parametro seminalen arteko

korrelazioa. Mugikortasuna (A mota%, B tnota%, A+B%, C mota%, D mota%, C+D

mota%), Bideragarritasuna (Hildakoak%) eta espermatozoide-kontzentrazioa (Sperm/ml),

haziaren zatiki ezberdinekin eriazionatu dira (Sps = Espermatozoideen zatiki solugarria;

SpM = Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia; Ls = Likido seminala; P =

Prostasomak). Korrelazioen adierazgarritasun estatistikoa * (p<0,05) eta ** (p<0,01)


EMAITZAK 183


184 EMAITZAK


4.5. ZATIKIENISOLAMENDUAREN

DOITASUNA. LAKTATO

DESHIDROGENASA

Haziaren zatiki azpizelularren isolamendua modu egokian egiten genuela

behatzeko, markatzaile entzimatiko baten bidez, zatiki ezberdinen purutasuna frogatu

genuen. Honetarako, Laktato Deshidrogenasa (LDH) entzima solugama erabili

genuen. Entzima honek, batez ere kokapen zitosolikoa du. Honela, zatikien lorpen

prozesua egokia izanda, ez genuke, Prostasomen (P) zatikian ezta esparmotozoideen

mintzari lotutako zatikian (SpM), aktibitate adierazgarririk behatu behar. Era berean,

zelularen metabolismo energetikoaren entzimetako bat izanik, bere agerpena haziaren

Likidoan (Ls) ez luke oso garrantzitsua izan behar. Espero den aktibitaterik nagusiena,

espermatozoideen zatiki solugarrian behatu beharko genuke.

Lortutako emaitzek, esperotakoarekin bat datoz. LDH aktibitatearen maila

altuenak espermatozoideen zatiki solugarrian (SpS) behatu ziren, zatiki honen

edukinaren jatorri nagusia zitosolikoa bait da. Bestelako zatikietan behatutako LDH

aktibitateak 20 bat aldiz txikiagoak izaten dira (4.27. Taula eta Irudia).

(OHARRA: Hemendik aurrera, irudien numerazioa ez du aurreko irudiekin ondoz-

ondoktasuna errespetatzen. Taulen numerazio bera eman zaie, ulergarritasuna eta

Taula/Irudi koherentzia mantentzearren)

EMAITZAK 185


ZATIKIEN ISOLAMENDUAREN DOITASUNA

Laktato Deshidrogenasa (LDH)

Zatikiak aktibitatea ehunekotan (%)

SpS 100 ±5,3

SpM 4,64 ± 1,2

Ls 6,2 ± 2,5

P 2,2 ± 0,94

4.27. Taula. Laktato Deshidrogenasaren aktibitatea ehunekotan hazi-zatiki ezberdinetan.

Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia

(SpM), Likido seminaia (Ls) eta Prostasomak (P) dira, (n = 10)

186 EMAITZAK


ZATIKIEN ISOLAMENDUAREN DOITASUNA

Laktato Deshidrogenasa (LDH)

COa>ra15+-<

<

SpM Ls

Hazi-zatikiak

4.27. Irudia. Laktato Deshidtogenasaren aktibitatea ehunekotan hazi-zatiki ezberdinetati.

Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia

(SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) dira. (N “ 10)

EMAITZAK 187


188 EMAITZAK


4.6. IKERTUTAKO PEPTIDASEN

BANAKETA HAZI-ZATIKIEZBERDINETAN

Lan honetan ikertutako aktibitate peptidasikoak ez dira homogeneoki hazian

banatzen. Haziaren osagai nagusi ezberdinetan, aktibitate batzuk, besteak baino

adierazgarriagoak izaten dira.

Orohar, aktibitate mailarik altuenak aurkezten dituen zatikia Prostasomena (P)

da entzefalinen anderatzaileentzat (APN eta NEP) (4.28. taula). Bestalde,

Espermatozoideen zatiki solugarria, Prolil Endopeptidasaren kasuan besterik ez da

gailentzen bestelako aktibitateekin konparatuz (4.28. d irudia).

Aipagarriena, Endopeptidasa Neutroaren (NEP) aktibitatea bakarrik

prostasometan behatzen déla izaten da.

EMAITZAK 189


IKERTUTAKO PEPTIDASEN BANAKETA

HAZIAREN ZATIKIETAN

ZatikiakAktibitate Entzimatikoaren Portzentaia (%)

APN NEP PGA / PEP

SpS 7 0 16 55

SpM 9 0 36 21

Ls 18 0 24 11

P 66 100 24 13

4.28. Taula. N aminopeptidasa (APN), Endopeptidasa Neutroa (NEP), Piroglutamil

Peptidasa I (PGA I) eta Prolil Endopeptidasa (PEP) entzimen aktibitateak ehunekotan

hazi-zatiki ezberdinetan. Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS), Espermatozoideen

mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak (P) dira, (n = 10)

190 EMAITZAK


IKERTUTAKO PEPTIDASEN BANAKETA

HAZIAREN ZATIKIETAN

b) Zatikiak NB=>

c) Zatikiak PGA I d ) Zatikiak FEP

4.28. Itudia. a) N aminopeptidasa (APN), b) Endopeptidasa Neutroa (NEP),.c)

Piroglutamil Peptidasa I (PGA I) eta d) Piolil Endopeptidasa (PEP) entzimen aktibitateak

ehunekotan hazi-zatiki ezberdinetan. Espermatozoideen zatiki solugarria (SpS),

Espermatozoideen mintzari lotutako zatikia (SpM), Likido seminala (Ls) eta Prostasomak

(P) dira, (n = 10)

EMAITZAK 191


192 EMAITZAK


EZTABAIDA

EZTABAIDA 193


194 EZTABAIDA


5. EZTABAIDA

Gizonezkoen ugalkortasunaren físiologiaren ezagutzan oraindik hutsune ugari

dago betetzeko. Hauen bamean gertatzen diren prozesu ugariren erregulazioaren

elementuak eta euren garrantzia zehazteke diraute. Hala ñola, giza hazian, biopeptido

erregulatzaile mota ezberdinen eta hauen funtzio eta efektu posibleen berri eman den

arren, hauei lotutako beste elementuei buruz oraindik ikertzeko dago. Honela,

peptidoen hartzaileak eta peptidoen anderakutza, eta beraz ekintza, eraentzen dituzten

peptidasen ikerkuntza, interesgarria gerta daiteke ugalkortasunaren prozesu askoren

en-egulazioa ulertzeko.

Helburuetan komentatu genuen bezala, Doktore-Tesi hau atal nagusi bi ditu.

Lehenik eta behin, giza haziko aktibitate peptidasikoen identifikazioa, deskribapena eta

konparaketa egitearena. Bigarren atal batean, hazi-patologia ezberdinak peptidasen

aktibitate hauekin harremanik baduten behatuko da.

5.1. GIZA HAZIKO PEPTIDASAK

Atal honetan, haziko aktibitate peptidasikoen identifikazioa eta deskribapena

egin genuen. Badira gure aurretik peptidasa ezberdinak, gizakiaren eta bestelako

espezieen hazian deskribatu dituzten lanak. Hala ñola, Dipeptidil Peptidasa II (Gossrau

eta Lodja, 1980) eta IV (Vanhoof eta lank., 1992; Wilson eta lank., 1998) deskribatu

izan dira ugaztunetan. AEB/ACE (Hohlbrugger eta lank., 1982), NEP edo

Endopeptidasa neutroa (Erdos eta lank., 1985), Prolil endopeptidasa eta Piroglutamil

peptidasa (Siviter eta Cockle, 1995), N aminopeptidasa (Arienti eta lank., 1997b) etc.

Haziaren fisiologian izan duten garrantzia déla eta, Doktore-Tesi honetan, TRH

hormona eta analogoen (FPP) anderakuntza eta Entzefalinen anderakuntza burutzen

zuten peptidasak aztertzea erabaki genuen. Honetarako, biopeptido hauek apurtzen

EZTABAIDA 195


dituzten peptidasak susbstantzia gehigarrien bidez eta inhibitzaile espezifikoen bidez

ezberdindu ziren.

S .l.l. ENTZEFALINEN PEPTIDASA ANDERATZAILEEN

BEREIZKETA

Entzefalinen anderakuntzan diharduten bide entzimatiko nagusiak bi dira:

Endopeptidasa Neutroak (NEP, EC 3.4.24.11), Entzefalinasa izenaz ere ezaguna dena

(Hersh, 1982), burutzen dueña eta Aminopeptídasek burutzen dutena. Azken hauen

barruan bi entzima dira entzefalinengatik afmitate altua dutenak, hala ñola,

puromizinarekiko Sentikorra den Alanil aminopeptidasa (PSA, EC 3.4.11.14) eta N

Aminopeptidasa (APN, EC 3.4.11.2.).

Angiotensina I-aren Entzima Bihurtzaileak (AEB/ACE, 3.4.15.2) entzefalinak

apurtzeko gaitasuna duen arren, hauengatik duen afmitatea txikia da.

Puromizina erabiltzen denean, PSA eta APN-ren aktibitateak bereizteko,

antzeko inhibizio-profíla behatzen da haziaren zatiki guztietan, bai solugarrietan bai

mintzari lotutakoetan. Profil hau bestelako ehunetan behatutako APN-aren profilaren

antzekoa da (Huang eta lank., 1997; Solhone eta lank., 1987). Aurkikuntza honek

hazian neurtutako aktibitatea APN-ri zor zaiola iradokitzen du, aktibitatea soilik

kontzentrazio altuentan inhibitze baita,

Gainera, sulfhidrilo-gehiagarriak, merkaptoetanol eta DTT-aren modukoak,

PSA aktibatzen dute baina ez APN. DTT-arekin entseiua burutu zenean, ez zen inolako

efekturik behatu Ala-p-naftilamidaren degradazioan, haziaren homogenatuetan. Honek,

berriz ere, Ala-p-naftilamidaren degradazioa hazian burutzen duen entzima APN déla

eta ez PSA.

Honen aldeko beste nabaritasuna leuhistina inhibitzailearen eragina da.

Leuhistinak, kontzentrazio baxuetan, PSA eta APN-ren inhibitzaile espezifiko bezala

196 EZTABAIDA

Doktore-T esia Asiei Valdivia Palacín 197

eragiten du, bestelako aminopeptidasen aktibitatetan inolako eraginik sortu gabe.

Berriz ere, inhibitzaile honekin lortutako datuek behatutako aktibitatea APN-ri

dagokiola adierazten digute.

Giza haziak aminopeptidasa aktibitate altuak erakusten ditu, hauek batez ere

prostasometan kokatzen direlarik. Aktibitate altu honek, entzimaren kontzentrazio

altuarekin harremana izan dezake, APN-a hazi-plasmako proteina guztien ehuneko 0,5-

1-a izan daitekela esaten duten ikerketekin bat eginik (Huang eta lank., 1997).

Bestalde, ikerketa honetan adierazten ditugun espermatozoideen gainazaleko

APN-ren aktibitate balioak, bertan APN-ren aktibitaterik ez dagoela adierazten duten

bestelako ikerketei (Arienti eta lank., 1997b) kontrajartzen zaizkie. Ikerketa horiek

esaten dutenez, espermatozoideek gainazalean adierazten duten APN aktibitatea,

prostasomak espermatozoideekin fuisonatzean (emakumearen ugal-traktuan edota pH

arinki azidoan) bereganatutakoa izango litzateke, baina gure esperimentuak

ejakulatutako haziarekin, prostasomekin fusionatu aurretik, burutu izan dira,

espermatozoideen mintzean azaltzen den APN aktibitatea beste jatorri batekoa izan

behar duela iradokiz. Aipatutako lanean erabilitako teknika espektrofotometrikoa, guk

erabilitako fluorimetrikoa baino sentikortasun gutxiagokoa izatea, izan daiteke lan

horretan APN aktibitaterik ez antzematearen arrazoia.

APN mintzeko entzimatzat hartzen den arren, hau hazi-likidoan azaltzea ez da

ustekabekoa. Izan ere, deskribatu izan da, bestelako mintzari lotutako entzima batzuk,

hala nola, Dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) (Ohkubo eta lank., 1994) eta

Angiotentsinaren Entzima Bihurtzailea (AEB/ACE) (Hooper eta lank., 1997), bikapa

lipidikotik erauziak edo askatuak izaten direla, proteolisi-mekanismoen bidez. Hauxe

izaten da APN-ren kasua, papainaren bidez (Louvard eta lank., 1975) eta proteina

sekretasa (Hooper eta lank., 1997) baten bidez mintzetik erauzia izaten dena. APN-a

zitosolean agertzea harrigarria denez, lehen aldiz lan honetan izan baita deskribatua,

zatiki honetako aktibitatea kutsadura kontu bat dela pentsa daiteke. Haña ere, LDH-

arekin lortutako zatikien purutasun datuek eta erabilitako laginen prozesamendurako

jarraitutako protokolo zorrotzak ez dute kutsaduraren aldeko arrazoirik ekartzen.

EZTABAIDA 197


Endopeptidasa Neutro aren, entzefalinen hidrolisia aztertzeko DAGNPG

sustratoa erabili zen Florentin eta lankideek (1984) deskribatu zuten metodoan

oinarrituta.

DAGNPG-ren aktibitate degradatzailea haziaren zatiki ezberdinetan

aztertzerakoan, bakarrik prostasomen zatikietara mugatzen zela ikusi genuen. Zatiki

hone tan aktibitate honen maila altuak jaso ziren; garunetako homogenatuekin

konparatuta 18 aldiz altuagoak. AEB/ACE-a giza hazian egoteagatik (Vanha-Perttula

eta lank., 1985) eta entzima honek DAGNPG substratoa degradatzeko duen gaitasuna

delà eta, Kaptopril izeneko AEB-ren inhibitzailearekin saioak egin ziren. Dakigunez,

AEB-k DAGNPG degradatzeko gai da, baina maila baxuagoan (Heder eta lank., 1988).

Kaptoprilaren bidez AEB-ri sor zaion aktibitatea desagertarazi egingo dugu. Saioak

egin ondoren, Kaptoprilaren 500 nM-eko kontzentrazioa erabiltzea erabaki genuen.

Kontzentrazio baxuegoekin ere, ikus daitekenez, aktibitatea egonkortu egiten da, baina

horiek ez dira kontzentrazio praktikoak, erabilitako buffer kantitateak prestatzeko.

Azkenik, NEP-en inhibitzaile espezifikoak, tiorfan eta fosforamidon erabili

ziren eta lortutako emaitzek, entzima hau egiten zuten DAGNPG-ren anderakuntzaren

erantzule nagusia.

Laburbilduz, entzefalinen anderakuntzan diharduten peptidasen aktibitate altuak

behatu dira, prostasomen zatikia aktiboena izanik. Lortutako datuak, aktibitate hura

APN-ri eta NEP-i zor zaiela ematen du. NEP-entzat lortutako emaitzak lehenengo aldiz

erakusten dute aktibitate hau prostasomen zatikian. Gainera NEP eta APN-ren maila

altuak, hazia, entzima hauen purifikaziorako ehun aproposa izan daitekela iradokitzen

dute. Honen adibidea DPP IV entzima da, proteina hau giza prostasometan isolatu izan

da, bi purifikazio-urratsetan, aktibitatearen berreskurapen altuarekin.

Azkenik, aztertutako entzimak erakusten dituzten aktibitate-maila altuak, eta

altuenak prostasomen zatikian izanda, besikula hauek espermatozoideen

mugikortasunean, haziaren urtzean, inmunosupresioan, kapazitazioan... eta antzeko

198 EZTABAIDA


prozesuetan parte hartzen dutela kontutan hartuz, peptidasak prozesu hauetan guztictan

nolabaiteko zeregina izan ditzaketela pentsa daiteke. Are gehiago. entzima hauek

peptidoen anderakuntzan, mintzeko ektopeptidasa moduan, edota atxekidurarako

proteina moduan (CD13 eta CD 10), partehartzen dutela kontutan izaten badugu. Beraz,

peptidasa hauen funtzioak argituak izaten diren heinean, prostasomen zeregina

ugaikuntzan hobeto ulertuko da.

5.1.2. TRH HORMONA ETA ANALOGOAK

ANDERATZEN DITUZTEN PEPTIDASEN BEREIZKETA

Hiru dira TRH-a anderatzen duten peptidasa nagusiak. Horietako bi

aminopeptidasak dira; hala ñola, Piroglutamil Peptidasa I eta H (PGA I eta II). Bestea,

Prolil Endopeptidasa dugu. FPP-ren kasuan, PGA II ez da gai sustrato hau

hidrolizatzeko.

Entzima hauen saioek DTT-ren presentzian, hazian dagoen Piroglutamil

Peptidasa (PGA); I motakoa déla zehazten digute, DTT-a PGAI-en aktibatzailea baina

PGA H-aren inhibitzailea (O’Cuinn eta Iank., 1990). Emaitza hau, PGAI-k FPP-a

(Fertilization Promoting Peptide), TRH hormonaren haziko peptido analogo ugariena,

anderatzeko gai izatearen datuarekin bat dator. Alderantziz, PGA Il-k ezin izaten du

peptido honen anderatzea burutu, pGlu-His lotura soiiik hidrolizatzeko gai izategatik,

eta FPPak pGlu-Glu lotura du. Honetaz gain, TRH eta FPP-aren anderatzea DTT-aren

bidez azkartzen déla deskribatu izan da (Cockle eta Iank., 1994), PGA I hazian dagoela

berretsiz.

Piroglutamil Peptidasa I (PGA I) entzima kokapen zitosolikoa du ehun

gehienetan (O’Cuinn eta Iank., 1990; Yoshimoto eta Iank., 1979), “mintzari elkartua”

bezala ere deskribatu izan delarik (Yoshimoto eta Iank., 1979). Ikerketa honetan

entzima honen aktibitatea haziaren zatiki ezberdinetan ikasi dugu. Bitxia gertatzen da,

entzima honen aktibitate-mailarik altuenak haziaren zatiki mintzakaretan agertzea

(espermatozoideen mintzetan eta prostasometan). Emaitza hau ez dirudi entzima

EZTABAIDA 199


zitosolikoen kutsadura bati zor zaionik, LDH entzima markatzaile zitosolikoaren

aktibitate balio baxuak lortzen baitira haziaren mintzazko zatikietan (%4,5 eta %2,2

espermatozoideen mintzen zatikian eta prostasometan hurrenez hurren). Emaitza

hauek, mintzari elkartutako Piroglutamil Peptidasa I, ugalkutzaren fisiologian ala

patologian zeregin garrantzitsuren bat izan dezakela pentsarazten digute. Prostasomak

haziaren parte diren zelula kanpoko organuluak dira. Prostasometan eta

espermatozoideen mintzatan izateagatik, Piroglutamil Peptidasa I, hazi-likidoan

jariatutako TRH, FPP eta bestelako peptido analogoen aktibitatea, euren hidrolisiaren

bidez erregulatuz ekin dezakela ematen du, eta beraz, kapazitazioa bezalako prozesu

físiologikoak modulatuz (Fraser eta lank., 1997; Green eta lank., 1996).

Prolil Endopeptidasa entzimak nagusiki kokapen zitosolikoa dauka ehun

gehienetan (Cunningham eta O’Connor, 1997). Hauxe ere giza haziarentzat betetzen

déla dirudi, ehun honetan entzima honen aktibitate-maila altuena espermatozoideen

zatiki solugarrian jasotzen baita. Honela, enzima honek izango duen betebeharra maila

intrazelularrekoa izango da bereziki, espermatozoide-zeluletan. Hala ere, entzima

hoñen aktibitatea, bestelako zatikietan ere behatu izan denez, entzima honek likido

seminaleko peptido bioaktiboen anderakuntzan parte har dezakela, esan nahi du

(Siviter and Cockle, 1995).

200 EZTABAIDA

Doktore-Tesía Asier Valdivia Palacín 201

5.1.3. PEPTIDASAK. EHUNEN ARTEKO

KONPARAKETA

Arratoi ehunak. giza hazíarekin konparatu ditugu. Bcasitako peptidasak zabalki

izan dira deskribatuak ugaztunen ehun anitzetan (Jardinaud eta lank., 2004; Irazusta eta

lank., 2002; Rosenblum eta Kozarich, 2003; Awade eta lank., 1997). Interesgarria

diradi ehunen arteko konparaketa, giza haziarekin batera egitea.

Ikasi izan ditugun aktibitateetan, prolil endopeptidas arena izan ezik, hazian

lortutako aktibitate mailak altuenak edo altuenetakoak izan dira. Gehienetan ere,

giltzummean behatutako balioak, haziaren parekoak izaten dira, edo behintzat gertutik

jarraitzen diete. Giltzumma eta ugal-aparatua jatorri mesodermikoa izatea, izan daiteke

antzekotasun honen azalpen posible bat.

Honela, aminopeptidasek eta NEP-ek azaltzen dituzten aktibitate-maila altuek,

haziaren prozesu fisiologikoetan izan ditzaketen garrantziaren berri emango lekiguke.

ApN eta NEP-en kasuan, beste ikerketa batzutan hazian deskribatu izan dituzten

peptido opioideen maila altuak, hala ñola, entzefalinak (Fabri eta lank., 1989) eta (3-

endorfina (Davidson eta lank., 1989), peptidasa hauen mail a altuekin bat egiten dute.

Hau guztia, berriki ugaztunetan topatu izan diren m motako hartzaile opioidearen

aurkikuntzarekin batera, haziaren fisiologian nolabaiteko erregulazio opioidea

badagoela iradokitzen du.

Bestalde, giltzummean peptido erregulatzaile ugarik egiten dute euren funtzioa,

hala ñola, angiotensina, bradikinina, basopresina,... Hortaz, bertan peptido hauen

ekintzaren elementu erregulatzaile nagusiak, peptidasak, maila altuetan behatzea

logikoa dirudi.

EZTABAIDA 201


202 EZTABAIDA


5.2. GIZA HAZIAREN PATOLOGIAK ETA

PEPTIDASEN AKTIBITATEAK

Atal honetan, hazi lagin patologikoen zatiki ezberdinetan (espermazoideen

zatiki solugarria, espermatozoideen mintza, likido seminala eta prostasomak) aztertu

izan dira. Kontutan - izan diren hazi-patologiak espermatozoideen

bideragarritasunarekin, mugikortasunarekin eta morfologiarekin daude harremanean.

Lehenengo biak izaten dira, batez ere, peptido bioaktiboen sistemen bidez nolabaiteko

eraenketa fisiologikoa jasan dezaketen egoerak. Morfologian ere, espermatogenesiaren

prozesua ezaugarri honekin harreman zuzenean egonik eta espermatogenesian edota

heltzean, eta hau burutzen dituzten eremu histologikoetan entzefalinak (eta euren

peptidasak) zerikusia dutela ikusi denez (Kilpatrick eta lank., 1987; Mehta eta lank.,

1994; Garret eta lank,, 1990; Monsees eta lank., 1998; Osada eta lank., 2001),

nolabaiteko garrantzia izan dezaketela planteatu daiteke,

5.2.1. ENTZEFALINEN ENTZIMA ANDERATZAILEAK

ETA HAZI-PATOLOGIAK

APN-ren aktibitate handiagoa behatu izan da Nekrozoospermikoen (Ne)

espermatozoideen zatiki solugarri eta mintzari lotutakoan, Normozoospermikoetan (N)

lortutako balioen aldean. Are gehiago, APN-ren aktibitateak, zatiki solugarrian nahiz

espermatozoidearen mintzean, espermatozoide hilen ehunekoarekin korrelazio

adierazgarria zuela (Aldagai biko korrelazioen analisia) behatu da, nekrozoospermiak

eta N aminopeptidasaren aktibitateak zerikusia dutela esaten digularik. Peptidasen

aktibitate altuak eta heriotz zelularra beste ehunetan ere deskribatua izan da. Honela,

aminopeptidasen inhibitzaile espezifikoen emateak, zelulak heriotzetik babesten dituela

ikusi izan da (Shishido eta lank., 1999), eta muridoen prolil endopeptidasaren maila

altua adierazten duten T zelulek, aktibazioaren bidez eragindako heriotz zelularrerako

EZTABAIDA 203


sentikorragoak dira (Odaka eta lank., 2002). APN-ren espresioa gehitua ikusi izan da

neutrofilo apoptotikoetan, eta ektoproteasen aktibitateak handiagoak izaten ohi dira

HeLa zelula apoptotikoetan, alderantziz, zelula bideragarrietan aldaketa txikiagoak

ikusten diren bitartean (Piva eta lank., 2000). Hala eta guztiz ere, oraindik ez da jakina

APN-ren aktibitate-raaila handiak eta nekrozoospermiaren arteko harremana zergatia

ala ondoriokoa ote den.

Heriotz zelularrerako sentikortasuna eta aminopeptidasa aktibitate altuak, hauek

entzefalinen hidrolisiarekin erlazionatu behar dira, ehun eta Ierro zelular ezberdinetan,

entzefalinak eta bestelako opioideak zelulen superbizipena handitzen dutelako eta

nekrosia eta apoptosiaren aurrean babesten dituztelako (Hayashi eta lank., 2002).

Honela, hazi nekrozoospermikoen espermatozoideen zatiki solugarrian eta mintzari

lotutakoan behatutako APN-ren aktibitate-maila altuak, entzefalinen maila baxuen

arduradunak izango dira, eta ondorioz, espermatozoideak heriotz zelularrerako

sentikorragoak izango dira. Hala eta guztiz ere, bestelako ikerketa batzuk babesaren

zeregina egokitzen diete peptidasei. Esate baterako, linfozito eta neutrofiloetan peptido

opioideak apoptosia errazten dute (Singhal eta lank., 2001; Sulowska eta lank., 2003),

eta aminopeptidasa zitosolikoak zelularen bideragarritasuna mantentzeko

ezinbestekoak omen direla ere deskribatu da (Constam eta lank. 1995). Era berean, N

aminopeptidasa maila altuak azaltzen dituzten zelula leukemikoak apoptosiaren

aurreko babesa izaten dute (Mishima eta lank., 2002), eta aminopeptidasen

inhibitzaileak apoptosia eragiten dute zelula tumoraletan (Sekine eta lank., 2001).

N Aminopeptidasaren maila baxuagoak behatu izan ziren hazi

asienozoospermikoetan (A) ezberdintasun hauek espermatozoideen zatiki solugarrrian

adierazgarriak gertetzen zirelarik. Honekin hatera, korrelazio negatibo adierazgarria

antzeman zen APN-ren aktibitatea eta espermatozoide ez-mugikorren (D eredukoak)

ehunekoaren artean, prostasomen zatikian, N aminopeptidasa eta mugikortasunaren

arteko harremana badagoela adierazten dueña. Honekin lotuta, prostasomak isuritako

espermatozideen mugikortasunaren eragileak direla deskribatu izan da (Carlsson eta

lank., 1997). Are gehiago, APN prostasometatik espermatozoideen mintzara

transferitua izaten déla deskribatu izan da, espermatozoiden ezaugarri biologikoak

204 EZTABAIDA


aldatzearren (Axienti eta lank., 1997). APN-ren aktibitate baxuak motilitate gutxiko

hazi-laginetan, bere prostasometako aktibitate altuarekin batera, APNak prostasomen

mugikortasunaren efektu areagotzailearekin zerikusia duela esaten digute.

Astenozoospermia oso ohizko hazi-patologia izaten da heroinazaleetan (Ragni

eta lank., 1988), espermatozoideen mugikortasuna sistema opioidearen bidez

modulatuta egon daitekela azalduz. Zehazki, heroina-emate kronikoaren bidez

mugikortasunaren jeitsiera batera eramaten duela dirudi. Ordea, aldarazitako

entzefalinen espresioa duten saguetan espermatozide-mugikortasun aldarazia duela

ikusi izan da (O’Hara eta lank., 1994). Gure emaitzak peptido opioideen maila altuak

mugikortasunaren aurkako efektua dutela esaten duen hipotesiarekin bat datoz,

mugikortasunik gabeko espermatozoideen proportzio handia duten haziak, APN-ren

aktibitatearen maila baxuekin erlazionatu izan direlako, eta hone! a entzefalinen maila

altua mantendu daitezkelako. Hala ere, ugalezintasun mota batzuetan,

espermatozoideen maila peptidasikoen aldaketak efektu konpentsatzailea izatea

proposatu izan da (Neinmark eta lank., 1998); honela, aminopeptidasen maila baxuak,

astenozoospermiari lotutako entzefalinen maila baxuekin harremandu daitezke

(Fujisawa eta lank., 1996). Izan ere, entzefalinak espermatozoideen mugikortasuna

gutxitu (Fraioli eta lank., 1984; Foresta eta lank., 1986) ala handitu (Fujisawa eta lank.,

1996) egin dezaketela proposatu izan da.

Entzefalinak euren ekintza, batez ere, mintzaren kanpoaldeko hartzaileei lotuta

burutzen dutenez, espermatozoideen zatiki solugarrian, espermatozoideen zitosolak

bame dituena, behatutako aktibitate handien esanahia ez da, momentum, agerikoa. Hala

eta guztiz ere, entzefalinak maila intrakrinoan izan dezaketen zeregina garrantzitsua

izan daiteke, Ventura eta lankideek proposatzen dutenez, peptido opioideen bestelako

kokapenak deskribatzen dituztenean (Ventura eta lank., 1998). Gainera,

aminopeptidasak akrosometan dauden entzefalinen gain eragin dezakete; hauek

espermatozoidetatik erauziak izaten dira, erreakzio akrosomikoaren ondoren (Kew eta

lank., 1990).

EZTABAIDA 205


Gure ikerketan, korrelazio negatiboa behatu dugu espermatozoideen kopurua militro

bakoitzeko eta APN-ren aktibiatearen, espermatozoideen zatiki solugarian, artean.

Honek, espermatogenesian eman daitezken akatsak, zitosoleko APN-ren maila altuekin

erlazionatu behar direla adierazi dezake. Honen inguruan aipagarria da, peptido

opioideak, zelula germinal eta Sertoli zelulen arteko elkarrekintza parakrinoetan

inplikatu izan direla, espermatogenesiaren prozesuaren mantentzerako garrantzitsuak

omen direlarik (Fabri eta lank., 1985; Morris eta lank., 1987).

Endopeptidasa Neutroa (NEP) bakarrik prostasomen zatikian deskribatu izan

da. Kokapen espezifiko honek haziko Endopeptidasa Neutroa prostatan sortarazten

déla esaten digu, hauxe bait da prostasomen sorrera-lekua (Ronquist eta Brody, 1985),

Patologien arteko ezberdintasun adierazgarririk ez behatzeak, bere aktibitate

mugatuarekin batera, espermatozoideen mugikortasunean eta bideragarritasunean,

APNa Endopeptidasa Neutroa baino garrantzitsuagoa déla esaten digu. Gainera, NEP-

aren, patología ezberdinen artean, aktibitatea konstante mantentzeak, APN-aren

aktibitateen aldaketen espezifikotasima indartzen du.

Laburbilduz, emaitza hauek, APN-aren aktibitatearen aldaketek gizonezkoen

ugalurritasunarekin erlazionatuta egon daitezkela adierazten digute, espermatozoideen

mugikortasun, bideragarritasun eta espermatogenesian. APN-ren ikerketa sakonagoek,

gizonezkoen ugal hodian, gizonei lotutako estrategia terapeutiko berriak garatzen

lagundu dezakete.

5.2.2. TRH ETA ANALOGOEN ENTZIMA

ANDERATZAILEAK ETA HAZI PATOLOGIAK

Piroglutamil Peptidasa I eta Prolil Endopeptidasaren aktibitateek, maila

altuagoak azaltzen zituzten nekrozoospermiadun gaixoen hazi zatikietan. Hala eta

guztiz ere, ez da bestelako ezberdintasun estatistiko adierazgarririk behatu haziaren

zatiki zehatz bateko aktibitatea eta bestelako patologiadun haziaren dagokion

206 EZTABAIDA


zatikiarekin konparatzerakoan. Aktibitate entzimatiko altuen eta nekrozoospermiaren,

eta ez bestelako azpiugalkortasun baldintzen, arteko harremana, aktibitate maila altu

hauek espermatozoideen induzitutako heriotzean inplikatuta daudela pentsatzera

eramaten gaituzte. Izan ere, harreman hau bestelako ehimetan frogatu izan da.

Adibidez, garuncan, prolil endopeptidasaren irihibitzaile selektiboen ematea TRH-aren

anderatzea inhibituz, zelulak heriotzetik babesten dituela ikusi da (Shishido eta Iank.,

1999), eta prolil endopeptidasa maila altuak azaltzen dituzten muridoen T zelulak

aktibazíoaren bidezko induzitutako heriotz zelularrarekiko sentikorrak direla ere behatu

izan da (Odaka eta Iank., 2002). Prolil Endopeptidasaren mailarik altuenak zatiki

zitosolikoan azaltzen direnez, ez da usté entzima honek kanpoko hartzaileetara lotzen

diren peptidoen erregulazioan garrantzi handirik edukitzea. Ordea, peptidasa

zitosolikoak ezinbestekoak dirudite zelularen bideraganitasuna mantentzeko (Constam

eta Iank., 1995).

Peptidasa hauen maila altuak espermatozoideei heriotz zelularrerako

sentikortasuna ematen ornen diete, muridoen T zelulekin eta Prolil Endopeptidasarekin

gertatzen den moduan (Odaka eta Iank., 2002), zelula bamean dauden, heriotzetik

babesten duten peptidoen (TRH eta analogoak) mailak jeitsiaraziz baliteke. Hala ere,

pentsa daiteke aktibitate peptidasikoen mailaren igoera, heriotzaren zelularen ondorio

bat izatea, soberan geratzen den zelularen materiala prozesatzeko. Hala eta guztiz ere,

peptidasa aktibitate altuak heriotz zelularraren ondorioa badira, aktibitatearen

handipena zatiki guztietan itxoin zitekeen eta ez zatiki zehatzetan, hemen ikusten

dugun moduan. Ikerketa gehiago behar izango lirateke peptidasa hauen maila altuak

nekrozoospermiarekin harremanean daudenak, espermatozoideen heriotzaren zergatia

ala ondorioa ote diren argizteko.

Azkenik, peptidasa aktibitate hauek ikertu diren talde guztietan errore

estandarra nahiko handia da, eta honek bestelako faktore garrantzitsu batzuk aktibitate

entzimatiko hauekin erlazionatzen direla, ikasitako patologiaz gain.

EZTABAIDA 207


Laburbi Iduz, Piroglutamil Peptidasa I eta Prolil Endopeptidasa entzimen

aktibitateak giza hazian ikertu ondoren, entzima hauek nolabaiteko egiteko bat,

nekrozoospermiari lotutako ugalurritasunean, dutela pentsa daiteke.

5.2.3. GIZA HAZIKO PEPTIDASAK ETA PEPTIDOAK.

LANERAKO HIPOTESIAK

Bestalde, peptidasen arteko ekintza koordinatuak edo, behintzat,

elkargurutzatuak daudela pentsa daiteke datu hauen arabera. Izan ere, bradikinina

APN-ren inhibizio konpetitiboa egiten duen sustantzia izanik eta motilitatearen

estimulatzaile bezala deskribatua izan déla kontutan hartuta, honen degradazioa

burutzen duen prolil endopeptidasak, mugikortasunean nolabaiteko eragina sortarazi

dezakela pentsa daiteke. Hala ere, ezin izan dugu prolil endopeptidasaren eta

astenozoospermiaren arteko harreman estatistikorik behatu.

APN solugarriaren astenozoospermikoetan behatzen diren maila baxuak, prolil

endopeptidasaren maila baxuekin batera emango balira, azken honek bradikininaren

degradazio gutxituarekin erlazionatuko genuke eta bradikinak APN-a inhibitzen duela

esa zitekeen. Esan bezala, ez prolil endopeptidasaren aktibitate murrizturik behatu

astenozoospermikoetan baina bai korrelazio positibo bat prostasometan behatutako

aktibitate bailoen eta A+B espermatozoide mugikorren baturaren artean.

Opioideek espermatozoideen mugikortasunean sortarazten duten efektua oso

eztabaidatua da oraindik. Entzefalinak, ugal aparatu arran zabalki espresatutako

peptidoak dira. Astenozoospermikoen hazi-plasman behatutako entzefalina mailak,

ohizkoak baino baxuagoak direla deskribatu den arren, ikerketa berean, met-

entzefalinarekin egindako inkubazioen bidez, met-entzefalinak mugikortasuna

mantentzen laguntzen duela deskribatzen da (Fujisawa eta lank., 1996).

Bestalde, badira entzefalinek espermatozoideen efektu moteltzailea dutela

esaten duten ikerketak (Foresta eta lank., 1985).

208 EZTABAIDA


Era berean, hazitik isolatutako prostasomak espermatozoideen mugikortasunean

efektu areagotzailea dutela esaten duten ikerketak badaude (Carlsson eta lank., 2003).

Kontuan izanik, gure emaitzek diotenez, endopeptidasa neutroa (NEP) prostasometan

soilik dagoela, entzima honen, entzefalinen degradatzaile bezala duen ekintzari

buruzko lotura posible batean pentsatzea erraza da. Prostasometan ere, APN-aren

aktibitatea altua da. Beraz, gure datuak, entzefalinen degradazioak mugikortasunaren

aide egiten duela esaten dutenez, entzefalinek mugikortasunarekiko efektu murriztailea

esaten duten ikerketekin bat datoz.

Honekin batera, esan behar da bame peptido opioideek GnRH-ren askapena

inhibitzen dutela (Fabbri eta lank., 1989). Era berean, GnRH, LH eta FSH eta,

ondorioz, hormona sexualen askapenarekin erlazionatuta dago. Hormona hauek

ugalkuntzarekin erlazioantutako funtzio ugari dituzte (espermatogenesia,...). GnRH-ak

berak, espermatozoideek Zona Pellucida-ú lotzeko gaitasunean garrantzia duela

frogatu izan da (Morales, 1998; Morales eta lank., 1999). Honi, GnRH-ren II motako

hartzailearen transkriptoak espermatozoide helduetan detektatu izan direla (van Biljon

eta lank., 2002) lotu behar zaio. Gogora dezagun ere, Zona Pellucida-vekm lotzea

erreakzio akrosomikorako eta, beraz, emalkutzaren prozesurako faktore garrantzitsua

zela (Baldi eta lank, 2002). Berriz, biopeptido erregulatzaile sistema biren (opioideena

eta gonadotropinena) balizko elkargurutzamendua, peptidasen bidez ezartzeko aukera

daukagu. Kau honetan, piroglutamil peptidasa I aktibitatea aintzat hartu behar dugu;

izan ere, entzima honek LHRH (GnRH) anderatzeko gaitasuna dauka, eta entzima

honen deskribapena, haziaren zatiki ezberdinetan, egin dugu lan honetan.

Piroglutamil peptidasa I eta heriotz zelularrarekiko babes-funtzioa aipatu dugu

lehenago. Modu berean, entzima honen FPP (Fertilization Promoting Peptide)

bezalako, emalkuntzaren sustantzia gaitzaileen apurketan izan dezakeen garrantzia

agerian utzi da. Azkenik, erreakzio akrosomikoa eta emalkuntzarako ezinbestekoa den

espermatozoide-Zona Pellucida elkarrekintzan, entzima honek izan dezakeen

inplikazioa iradoki daiteke.

EZTABAIDA 209


Opioideen garrantziaren, eta beraz bere sistemaren elementuen garrantzi

posiblearen beste adierazle bat, kanpoko sustantzia opiazeoak haziarengan dituzten

eraginak dira. Anitzak dira, opioide exogenoen haziarekiko duten eragin kaltegarriak

defendatzen dituzten ikerketak. Hauen artean, espemiatozoidearen ultraestrukturaren

akatsak, hauetako batzuk mugikortasunaren elementuekin (axonemaren egitura,...)

erlazionatutakoak, (El-Gothamy eta El-Samahy, 1992), mugikortasunaren jeitsiera

(Ragni eta lank., 1985; Ragni eta lank., 1988), eta abar, deskribatu dira. Honela, APN-

ak astenozoospermikoetan baxuagoa izateak, eta honen ondorioz emango ziren

entzefalinen (Bame peptido opioideak) haziko maila altuek, nolabaiteko harremana

iradokitzea po sib lea dirudi.

Aipatzekoa da ere, kininen (angiotensinak, bradikinina) metabolismoari,

espermatozoideen funtzioan eta ugal funtzioan, orohar, zerengin garrantzitsuak egotzi

zaizkiola (Schill etaMiska, 1992).

Honela, adibidez, angiotensina Il-k, prolil endopeptidasa eta NEP-en sustratoa

dena, espermatozoideen abiadura areagotzeko gai izaten da, inkubazioz (Mizutani eta

Schill, 1985; Vinson eta lank., 1995). Bradikininak ere gaitasun hau azaltzen du, baina

inkubazioa 22°C-tan egiten denean. Bradikininaren mugikortasunaren areagotzea nM-

eko kontzentrazioetan gertatzen déla, baina hau ez omen déla bradikininaren BK2

hartzaileen bidez gertatzen, diote Siems eta lankideek (2003). Bestalde, Kininasa II

entzimaren, zelula espermatikoetan azaltzen den AEB/ACE-ren isoentzimaren,

inhibitzaileekin hazia inkubatzean, mugikortasuna estimulatzen déla behatu da (Somlev

eta Subev, 1998). Bradikininak ere, zelula germinalen ugalketan eta proliferazioaren

erregulazioan, BI eta B2 hartzaileen bidez, partehartzea proposatu izan da

(Atanassova, 2003).

Gure lan honetan ez da prolil endopeptidasa edo NEP-aren inplikaziorik behatu

astenozoospermiarekin. Hala ere, hauen inhibitzaileak erabilita, espermatozoideen

mugikortasuna ñola aldatzen den ikasi duten ikerketek, hauek espermatozoidearen

motilitatea gutxitzen dutela diote, bide batez, prolil endopeptidasa espermatozoidearen

isatsean detektatu dutelarik (Kimura eta lank., 2002).

210 EZTABAIDA


Era berean, angiotensina Il-k, erreakzio akrosomikoa bultzatzen du

kapazitatutako zezen espermatozoideetan. Esan dugu prolil endopeptidasak eta

piroglutamil peptidasak bíderagarritasun zelularrarekin eta FPP bezalako,

emalkuntzaren estimulatzaideak diren, peptidoen kontrolan inplikatuta egon daitezkela.

Zergatik ez emalkuntzarako beharezkoa den erreakzio akrosomikoan, angiotensinaren

mailak moduiatuz?

EZTABAIDA 211


212 EZTABAIDA


ONDORIOAK

ONDORIOAK 213


214 ONDORIOAK


6. ONDORIOAK

Arestian aztertutako emaitzei so eginik, eta hasieran, lan honetarako,

finkatutako helburuak kontutan hartuz, honako ondorio hauek atera ditugu doktore tesi

honetan:

1.- Hazian behatutako peptidasek oso aktibitate-maila altuak dituzte, beste ehunen

aldean. N aminopeptidasak eta endopeptidasa neutroak, beste ehunetan baino aktibitate

gehiago azaltzen dute giza hazian, bai mintzari lotutako zatikietan, bai zatiki

solugarrietan. Prolil endopeptidasak eta piroglutamil peptidasa I-ek ere oso aktibitate

maila altuak azaltzen dituzte.

2.- Entzefalinen entzima anderatzaile nagusiak N aminopeptidasa eta endopeptidasa

neutroa dira giza hazian. PSA (Puromizinarekiko sentikorra den aminopeptidasa) ez

baita behatu eta

3.- Behatu eta aztertutako entzefalinen entzima anderatzaileen (ApN eta NEP)

aktibitatea zatiki mintzakaretan (espermatozoideen mintza eta prostasomak) topatzen

da nagusiki. Hala ere, ApN-ren maila altuak behatu izan dira zatiki solugarrietan.

Endopeptidasa neutroa soilik prostasometan behatu ahal izan dugu. Prostasomek,

haziaren fisiologian eta espermatozoideen prozesu zelular garrantzitsutan hartzen dute

parte.

4.- TRH, FPP eta hauen kideak piroglutamil peptidasa I-aren eta prolil

endopeptidasaren bidez anderatuak dira giza hazian. Entzima hauek zatiki solugarrietan

aktibitate-maila altuagoak dituzten arren, mintzeko zatikietan maila aipagarriak dituzte.

ONDORIOAK 215


5.- N aminopeptidasak aktibitate adierazgarriki baxuagoak ditu astenozoospermikoen

espermatozoideen zatiki solugarrian. Datu honek, entzefalinen eragin moteltzailea

indartu egiten du eta astenozoospermikoen hazian behatu diren opioide maila altuekin

ere bat dator.

6.- N aminopeptidasaren espermatozoidetako aktibitatearen eta hildako espermatozoide

kopuruaren artean lotura dago eta hildakoen kopuru handia denean, aktibitatea,

espermatozoidetako zatikietan, gora egiten du. Honek adierazten digu, peptidasek eta

bereziki ApN-k, nolabaiteko zeregina dutela espermatoideen heriotz prozesuetan.

7.-Piroglutamil peptidasa Iek aktibitate maila altuak ditu nekrozoospemikoen

espermatozoideen zatiki solugarrian. Hau, TRHa eta peptido analogoek duten eragin

zitobabeslearen ezabapenarekin lotu genezake eta peptidasa hauen maila altuek heriotz

zelularrarekiko sentikortasun handiagoarekin lotzen dituzten hipotesiekin bat dator.

8.- Prolil endopeptidasak, nekrozoospermikoen espermatozoideen mintzetan duen

maila altuagoak, entzima honek zelulen heriotzaren aurreko sentikortasuna handitzen

duela esaten duten ikerketekin bat dator.

9.- Peptido bioaktiboek ugalkuntzan dituzten zeregin fisiologiko garrantzitsuak

kontuan izanik, bere erregulazioan parte hartzen duten peptidasek ere ugalkortasunaren

eta haziaren fisiologian egiteko garrantzitsua izatea erraz onar daiteke.

216 ONDORIOAK


BIBLIOGRAFIA

BIBLIOGRAFIA 217


218 BIBLIOGRAFIA


BIBLIOGRAFIA

Abe K, Watanabe N, Kosaka T, Yamada M, Tokui T, Ikeda T (2003) Hydrolysis of synthetic substrate, L-pyroglutamyl p-nitroanilide is catalyzed solely by pyroglutamyl aminopeptidase I in rat liver cytosol. Biol Pharm Bull 26:1528- 1533.

Abou-Haila A, Tulsiani DR (2000) Mammalian sperm acrosome: formation, contents, and function. Arch Biochem Biophys 379:173-182.

Agarwal A, Saleh RA, Bedaiwy MA (2003) Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fértil Steril 79:829-843.

Agrawal Y, Vanha-Perttula T (1987) Effect of secretory particles in bovine seminal vesicle secretion on sperm motility and acrosome reaction. J Reprod Fértil 79:409-419.

Akil H, Mayer DJ, Liebeskind JC (1976) Antagonism of stimulation-produced analgesia by naloxone, a narcotic antagonist. Science 191:961-962.

Akil H, Owens C, Gutstein H, Taylor L, Curran E, Watson S (1998) Endogenous opioids: overview and current issues. Drug Alcohol Depend 51:127-140.

Alba F, Arenas JC, Lopez MA (1995) Comparison of soluble and membrane-bound pyroglutamyl peptidase I activities in rat brain tissues in the presence of detergents. Neuropeptides 29:103-107.

Albrizio M, Guaricci AC, Maritato F, Sciorsci RL, Mari G, Calamita G, Lacalandra GM, Aiudi GG, Minoia R, Dell'Aquila ME, Minoia P (2005) Expression and subcellular localization of the mu-opioid receptor in equine spermatozoa: evidence for its functional role. Reproduction 129:39-49.

Amann RP, Howards SS (1980) Daily spermatozoal production and epididymal spermatozoal reserves of the human male. J Urol 124:211-215.

Amodeo P, Lopez Mendez B, Guerrini R, Salvadori S, Temussi PA, Tancredi T (2000) Pain peptides. Solution structure of orphanin FQ2. FEBS Lett 473:157-160.

Arienti G, Carlini E, Palmerini CA (1997) Fusion of human sperm to prostasomes at acidic pH. J Membr Biol 155:89-94.

BIBLIOGRAFIA 219


Arienti G, Carlini E, Verdacchi R, Cosmi EV, Palmerini CA (1997) Prostasome to sperm transfer of CD13/aminopeptidase N (EC 3.4.11.2). Biochim Biophys Acta 1336:533-538.

Arienti G, Carlini E, Verdacchi R, Palmerini CA (1997) Transfer of aminopeptidase activity from prostasomes to sperm. Biochim Biophys Acta 1336:269-274.

Ashworth RJ, Morrell JM, Aitken A, Patel Y, Cockle SM (1991) Pyroglutamylglutamylprohneamide is present in rat anterior and posterior pituitary gland. J Endocrinol 129:Rl-4.

Atanassova NN (2003) B2 bradykinin receptor mediates the stimulatory effect of bradykinin on rat germ cell proliferation in vitro. Andrologia 35:13-16.

Aumuller G, Riva A (1992) Morphology and functions of the human seminal vesicle. Andrologia 24:183-196.

Austin CR (1951) Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res (B) 4:581-596.

Awade AC, Cleuziat P, Gonzales T, Robert-Baudouy J (1994) Pyrrolidone carboxyl peptidase (Pep): an enzyme that removes pyroglutamic acid (pGlu) from pGlu- peptides and pGlu-proteins. Proteins 20:34-51.

Baccetti B, Capitani S, Collodel G, Strehler E, Piomboni P (2002) Recent advances in human sperm pathology. Contraception 65:283-287.

Baldi E, Luconi M, Bonaccorsi L, Forti G (1998) Nongenomic effects of progesterone on spermatozoa: mechanisms of signal transduction and clinical implications. Front Biosci 3:D1051-1059.

Baldi E, Luconi M, Bonaccorsi L, Forti G (2002) Signal transduction pathways in human spermatozoa. J Reprod Immunol 53:121-131.

Bauer K (1987) Adenohypophyseal degradation of thyrotropin releasing hormone regulated by thyroid hormones. Nature 330:375-377.

Beaudet A, Nouel D, Stroh T, Vandenbulcke F, Dal-Farra C, Vincent JP (1998) Fluorescent ligands for studying neuropeptide receptors by confocal microscopy. Braz J Med Biol Res 31:1479-1489.

Belluzzi JD, Grant N, Garsky V, Sarantakis D, Wise CD, Stein L (1976) Analgesia induced in vivo by central administration of enkephalin in rat. Nature 260:625- 626.

220 BIBLIOGRAFIA


Bhandrau L, Emerson CH (1980) Evidence for the presence of the putative TRH metabolite, deamido-TRH, in human urine. J Clin Endocrinol Metab 51:410- 412.

Bhargava HN, Gulati A (1988) Binding of 3H-(3-MeHis2) thyrotropin-releasing hormone to spinal cord membranes of spontaneously hypertensive and Wistar- Kyoto normotensive rats. Pharmacology 37:349-355.

Bilek R (2000) TRH-like peptides in prostate gland and other tissues. Physiol Res 49 Suppl 1:S 19-26.

Boettger A, Kertscher U, Steinmann C, Baeger U, Siems WE, Heder G (1993) Degradation of bradykinin in semen of ram and boar. Biochem Pharmacol 45:1983-1988.

Bogenrieder T, Finstad CL, Freeman RH, Papandreou CN, Scher HI, Albino AP, Reuter VE, Nanus DM (1997) Expression and localization of aminopeptidase A, aminopeptidase N, and dipeptidyl peptidase IV in benign and malignant human prostate tissue. Prostate 33:225-232.

Boler J, Enzmann F, Folkers K, Bowers CY, Schally AV (1969) The identity of chemical and hormonal properties of the thyrotropin releasing hormone and pyroglutamyl-histidyl-proline amide. Biochem Biophys Res Commun 37:705- 710.

Boschi G, Launay N, Rips R (1980) Induction of wet-dog shakes by intracerebral 'acid' TRH in rats. Neurosci Lett 16:209-212.

Boudinot E, Morin-Surun M, Foutz AS, Foumie-Zaluski M, Roques BP, Denavit- Saubie M (2001) Effects of the potent analgesic enkephalin-catabolizing enzyme inhibitors RB101 and kelatorphan on respiration. Pain 90:7-13.

Bowers CR, Redding TW, Schally AV (1965) Effect of thyrotropin releasing factor (TRF) of ovine, bovine, porcine and human origin on thyrotropin release in vitro and in vivo. Endocrinology 77:609-616.

Brabant G, Wickings EJ, Nieschlag E (1981) The TRH-metabolic histidyl-proline- diketopiperazine (DKP) inhibits prolactin secretion in male rhesus monkeys. Acta Endocrinol (Copenh) 98:189-194.

Browder LW, Erickson, C.A., Jeffery, W.R. (1991) Developmental Biology, IH edition Edition: Saunders College Publishing.

Browne P, O'Cuinn G (1983) An evaluation of the role of a pyroglutamyl peptidase, a post-proline cleaving enzyme and a post-proline dipeptidyl amino peptidase, each purified from the soluble fraction of guinea-pig brain, in the degradation of thyroliberin in vitro. Eur J Biochem 137:75-87.

BIBLIOGRAFIA 221


Burgus R, Dunn TF, Ward DN, Vale W, Amoss M, Guillemin R (1969) [Synthetic polypeptide derivatives with thyrotropin releasing factor hypophysiotropic activity]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D 268:2116-2118.

Burgus R, Guillemin R (1970) Hypothalamic releasing factors. Annu Rev Biochem 39:499-526.

Bustos-Obregon E, Courot M, Flechon JE, Hocher eau-de-Rc vi crs MT, Holstein AF (1975) Morphological appraisal of gametogenesis. Spermatogenetic process in mammals with particular reference to man. Andrologia 7:141-163.

Camargo AC, Almeida ML, Emson PC (1984) Involvement of endo-oligopeptidases A and B in the degradation of neurotensin by rabbit brain. J Neurochem 42:1758- 1761.

Camina JP, Lage M, Menendez C, Grana M, Garcia-Devesa J, Dieguez C, Casanueva FF (2002) Evidence of free leptin in human seminal plasma. Endocrine 17:169- 174.

Cao J, O'Donnell D, Vu H, Payza K, Pou C, Godbout C, Jakob A, Pelletier M, Lembo P, Ahmad S, Walker P (1998) Cloning and characterization of a cDNA encoding a novel subtype of rat thyrotropin-releasing hormone receptor. J Biol Chem 273:32281-32287.

Carlsen E, Giwercman A, Keiding N, Skakkebaek NE (1992) Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Bmj 305:609-613.

Carlsson L, Nilsson O, Larsson A, Stridsberg M, Sahlen G, Ronquist G (2003) Characteristics of human prostasomes isolated from three different sources. Prostate 54:322-330.

Carlsson L, Pahlson C, Bergquist M, Ronquist G, Stridsberg M (2000) Antibacterial activity of human prostasomes. Prostate 44:279-286.

Carlsson L, Ronquist G, Stridsberg M, Johansson L (1997) Motility stimulant effects of prostasome inclusion in swim-up medium on cryopreserved human spermatozoa. Arch Androl 38:215-221.

Carrera MP, Ramirez-Exposito MJ, Valenzuela MT, Garcia MJ, Mayas MD, Martinez- Martos JM (2003) Serum pyrrolidone carboxypeptidase activity in N-methyl- nitrosourea induced rat breast cancer. Horm Metab Res 35:502-505.

Chaillet P, Marcais-Collado H, Costentin J, Yi CC, De La Baume S, Schwartz JC (1983) Inhibition of enkephalin metabolism by, and antinociceptive activity of, bestatin, an aminopeptidase inhibitor. Eur J Pharmacol 86:329-336.

222 BIBLIOGRAFIA


Chang MC (1951) Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature 168:697-698.

Chang MC, Berkery D, Schuel R, Laychock SG, Zimmerman AM, Zimmerman S, Schuel H (1993) Evidence for a cannabinoid receptor in sea urchin sperm and its role in blockade of the acrosome reaction. Mol Reprod Dev 36:507-516.

Cicero TJ, Bell RD, Wiest WG, Allison JH, Polakoski K, Robins E (1975) Function of the male sex organs in heroin and methadone users. N Engl J Med 292:882-887.

Cockle SM, Aitken A, Beg F, Morrell JM, Smyth DG (1989) The TRH-related peptide pyroglutamyglutamylprolinamide is present in human semen. FEBS Lett 252:113-117.

Cockle SM, Aitken A, Beg F, Smyth DG (1989) A novel peptide, pyroglutamylglutamylproline amide, in the rabbit prostate complex, structurally related to thyrotrophin-releasing hormone. J Biol Chem 264:7788-7791.

Cockle SM, Prater GV, Thetford CR, Hamilton C, Malone PR, Mundy AR (1994) Peptides related to thyrotrophin-releasing hormone (TRH) in human prostate and semen. Biochim Biophys Acta 1227:60-66.

Cohen-Dayag A, Tur-Kaspa I, Dor J, Mashiach S, Eisenbach M (1995) Sperm capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors. Proc Natl Acad Sci U S A 92:11039-11043.

Comb M, Seeburg PH, Adelman J, Eiden L, Herbert E (1982) Primary structure of the human Met- and Leu-enkephalin precursor and its mRNA. Nature 295:663-666.

Constam DB, Tobler AR, Rensing-Ehl A, Kemler I, Hersh LB, Fontana A (1995) Puromycin-sensitive aminopeptidase. Sequence analysis, expression, and functional characterization. J Biol Chem 270:26931-26939.

Cosentino MJ, Cockett AT (1986) Structure and function of the epididymis. Urol Res 14:229-240.

Cross NL (1998) Role of cholesterol in sperm capacitation. Biol Reprod 59:7-11.

Cummins PM, O'Connor B (1996) Bovine brain pyroglutamyl aminopeptidase (type- 1): purification and characterisation of a neuropeptide-inactivating peptidase. Int J Biochem Cell Biol 28:883-893.

Cummins PM, O'Connor B (1998) Pyroglutamyl peptidase: an overview of the three known enzymatic forms. Biochim Biophys Acta 1429:1-17.

Cunningham DF, O'Connor B (1997) Proline specific peptidases. Biochim Biophys Acta 1343:160-186.

BIBLIOGRAFIA 223


Czekay G, Bauer K (1993) Identification of the thyrotropin-releasing-hormone- degrading ectoenzyme as a metallopeptidase. Biochem J 290 ( Pt 3):921-926.

Dacheux JL, Paquignon M (1980) Relations between the fertilizing ability, motility and metabolism of epididymal spermatozoa. Reprod Nutr Dev 20:1085-1099.

Dando PM, Fortunato M, Strand GB, Smith TS, Barrett AJ (2003) Pyroglutamyl- peptidase I: cloning, sequencing, and characterisation of the recombinant human enzyme. Protein Expr Purif 28:111-119.

Danielson PB, Hoversten MT, Fitzpatrick M, Schreck C, Akil H, Dores RM (2001) Sturgeon orphanin, a molecular "fossil" that bridges the gap between the opioids and orphanin FQ/nociceptin. J Biol Chem 276:22114-22119.

Davidson A, Vermesh M, Paulson RJ, Graczykowski JW, Lobo RA (1989) Presence of immunoreactive beta-endorphin and calcitonin in human seminal plasma, and their relation to sperm physiology. Fértil Steril 51:878-880.

De Gandarias JM, Irazusta J, Silio M, Gil J, Saitua N, Casis L (1998) Soluble and membrane-bound pyroglutamy 1-peptidase I activity in the developing cerebellum and brain cortex. Int J Dev Biol 42:103-106.

Debuse M (1998) Lo esencial en sistema endocrino y aparato reproductor: Harcourt.

del Rio-Garcia J, Smyth DG (1990) Distribution of pyroglutamylpeptide amides related to thyrotrophin-releasing hormone in the central nervous system and periphery of the rat. J Endocrinol 127:445-450.

Doolittle RF, Armentrout RW (1968) Pyrrolidonyl peptidase. An enzyme for selective removal of pyrrolidonecarboxylic acid residues from polypeptides, Biochemistry 7:516-521.

Douglas WW (1973) How do neurones secrete peptides? Exocytosis and its consequences, including "synaptic vesicle" formation, in the hypothalamo- neurohypophyseal system. Prog Brain Res 39:21-39.

Dresdner K, Barker LA, Orlowski M, Wilk S (1982) Subcellular distribution of prolyl endopeptidase and cation-sensitive neutral endopeptidase in rabbit brain. J Neurochem 38:1151-1154.

Duntas L, Nelson DK, Grab BM, Rosenthal J, Maier V (1993) A fast protein liquid chromatography (FPLC) method for study of thyrotropin-releasing hormone (TRH) and its metabolite histidyl-proline diketopiperazine (CHOP) in human blood: degradation in liver and pancreatic diseases. Neuropeptides 25:357-361.

224 BIBLIOGRAFIA


Dyer SH, Slaughter CA, Orth K, Moomaw CR, Hersh LB (1990) Comparison of the soluble and membrane-bound forms of the puromycin-sensitive enkephalin- degrading aminopeptidases from rat. J Neurochem 54:547-554.

Eblen A, Bao S, Lei ZM, Nakajima ST, Rao CV (2001) The presence of functional luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptors in human sperm. J Clin Endocrinol Metab 86:2643-2648.

Edwardson JA, McDermott JR (1982) Neurochemical pathology of brain peptides. Br Med Bull 38:259-264.

el-Gothamy Z, el-Samahy M (1992) Ultrastructure sperm defects in addicts. Fértil Steril 57:699-702.

Emerson CH, Vogel W, Currie BL (1980) Concentrations of thyrotropin-releasing hormone (TRH) and deamido-TRH, and TRH deamidase activity in brain. Endocrinology 107:443-449.

Emson PC, Goedert M, Williams B, Ninkovic M, Hunt SP (1982) Neurotensin: regional distribution, characterization, and inactivation. Ann N Y Acad Sci 400:198-215.

Erdos EG, Schulz WW, Gafford JT, Defendini R (1985) Neutral metalloendopeptidase in human male genital tract. Comparison to angiotensin I-converting enzyme. Lab Invest 52:437-447.

Erdos EG, Skidgel RA (1989) Neutral endopeptidase 24.11 (enkephalinase) and related regulators of peptide hormones. Faseb J 3:145-151.

Evers JL (2002) Female subfertility. Lancet 360:151-159.

Fabbri A, Jannini EA, Gnessi L, Ulisse S, Moretti C, Isidori A (1989) Neuroendocrine control of male reproductive function. The opioid system as a model of control at multiple sites. J Steroid Biochem 32:145-150.

Favier AE (1992) The role of zinc in reproduction. Hormonal mechanisms. Biol Trace Elem Res 32:363-382.

Fernandez D, Valdivia A, Irazusta J, Ochoa C, Casis L (2002) Peptidase activities in human semen. Peptides 23:461-468.

Flesch FM, Gadella BM (2000) Dynamics of the mammalian sperm plasma membrane in the process of fertilization. Biochim Biophys Acta 1469:197-235.

Florentin D, Sassi A, Roques BP (1984) A highly sensitive fluorometric assay for "enkephalinase," a neutral metalloendopeptidase that releases tyrosine-glycine- glycine from enkephalins. Anal Biochem 141:62-69.

BIBLIOGRAFIA 225


Foresta C, Caretto A, Indino M, Betterle C, Scandellari C (1986) Localization of met- enkephalin on human spermatozoa and evidence for its physiological role. Arch Androl 17:19-24.

Foresta C, Tramarin A, Scandellari C, Arslan P (1985) Effects of a met-enkephalin analogue on motility, 02 consumption, and ATP content of human spermatozoa. Arch Androl 14:247-252.

Foumie-Zaluski MC, Perdrisot R, Gacel G, Swerts JP, Roques BP, Schwartz JC (1979) Inhibitory potency of various peptides on enkephalinase activity from mouse striatum. Biochem Biophys Res Commun 91:130-135.

Fraioli F, Fabbri A, Gnessi L, Silvestroni L, Moretti C, Redi F, Isidori A (1984) Beta- endorphin, Met-enkephalin, and calcitonin in human semen: evidence for a possible role in human sperm motility. Ann N Y Acad Sci 438:365-370.

Fraser LR (1998) Fertilization promoting peptide: an important regulator of sperm function in vivo? Rev Reprod 3:151-154.

Fraser LR (1998) Role of fertilization promoting peptide (FPP) in modulating mammalian sperm function. Front Biosci 3:D1187-1191.

Fraser LR, Adeoya-Osiguwa SA (2001) Fertilization promoting peptide—a possible regulator of sperm function in vivo. Vitam Horm 63:1-28.

Fraser LR, Hosseini R, Hanyalogou A, Talmor A, Dudley RK (1997) TCP-11, the product of a mouse t-complex gene, plays a role in stimulation of capacitation and inhibition of the spontaneous acrosome reaction. Mol Reprod Dev 48:375- 382.

Frayne J, Jury JA, Barker HL, Perry AC, Jones R, Hall L (1998) Macaque MDC family of proteins: sequence analysis, tissue distribution and processing in the male reproductive tract. Mol Hum Reprod 4:429-437.

Fujisawa M, Kanzaki M, Okada H, Arakawa S, Kamidono S (1996) Metenkephalin in seminal plasma of infertile men. Int J Urol 3:297-300.

Fujiwara K, Kobayashi R, Tsuru D (1979) The substrate specificity o f pyrrolidone carboxylyl peptidase from Bacillus amyloliquefaciens. Biochim Biophys Acta 570:140-148.

Fukusumi S, Ogi K, Onda H, Hinuma S (1995) Distribution of thyrotropin-releasing hormone receptor mRNA in rat peripheral tissues. Regul Pept 57:115-121.

Garrett JE, Garrett SH, Douglass J (1990) A spermatozoa-associated factor regulates pro enkephalin gene expression in the rat epididymis. Mol Endocrinol 4:108-118.

226 BIBLIOGRAFIA


Gatti JL, Chevrier C, Paquignon M, Dacheux JL (1993) External ionic conditions, internal pH and motility of ram and boar spermatozoa. J Reprod Fértil 98:439- 449.

Gatti JL, Druart X, Guerin Y, Dacheux F, Dacheux JL (1999) A 105- to 94-kilodalton protein in the epididymal fluids of domestic mammals is angiotensin I- converting enzyme (ACE); evidence that sperm are the source of this ACE. Biol Reprod 60:937-945.

Gee NS, Matsas R, Kenny AJ (1983) A monoclonal antibody to kidney endopeptidase- 24.11. Its application in immunoadsorbent purification of the enzyme and immunofluorescent microscopy of kidney and intestine. Biochem J 214:377- 386.

Geris KL, Berghman LR, Ladram A, Kuhn ER, Darras VM, Harvey S (2000) Modulation of the growth hormone-releasing activity of thyrotropin-releasing hormone in the chicken by its gene-related peptide preproTRH((160- 169))(Ps4): enhanced somatostatinergic tone? Neuropeptides 34:51-57.

Gershengom MC, Thaw CN (1991) Regulation of thyrotropin-releasing hormone receptors is cell type specific: comparison of endogenous pituitary receptors and receptors transfected into non-pituitary cells. Endocrinology 128:1204- 1206.

Ghaddar G, Ruchon AF, Carpentier M, Marcinkiewicz M, Seidah NG, Crine P, Desgroseillers L, Boileau G (2000) Molecular cloning and biochemical characterization of a new mouse testis sohible-zinc-metallopeptidase of the neprilysin family. Biochem J 347:419-429.

Gibson AM, McDermott JR, Lauffart B, Mantle D (1989) Specificity of action of human brain alanyl aminopeptidase on Leu-enkephalin and dynorphin-related peptides. Neuropeptides 13:259-262.

Giros B. GC, Solhonne B, Schwartz JC (1985) Characterization of aminopeptidases responsible for inactivating endogenous met-enkephalin in brain slices using peptidase inhibitors and aminopeptidase M antibodies. Mol Pharmacol 29:281- 287.

Gkonos PJ, Kwok CK, Block NL, Roos BA (1994) Identification of the human seminal TRH-like peptide pGIu-Phc-Pro-NH2 in normal human prostate. Peptides 15:1281-1283.

Glander HJ, Lammert A, Paasch U, Glasow A, Kratzsch J (2002) Leptin exists in tubuli seminiferi and in seminal plasma. Andrologia 34:227-233.

BIBLIOGRAFIA 227


Goldstein A, Tachibana S, Lowney LI, Hunkapiller M, Hood L (1979) Dynorphin-(l- 13), an extraordinarily potent opioid peptide. Proc Natl Acad Sci U S A 76:6666-6670.

Goossens F, De Meester I, Vanhoof G, Scharpe S (1996) Distribution of prolyl oligopeptidase in human peripheral tissues and body fluids. Eur J Clin Chem Clin Biochem 34:17-22.

Gossrau R, Lojda Z (1980) Study on dipeptidylpeptidase II (DPP II). Histochemistry 70:53-76.

Goverde HJ, Bisseling JG, Wetzels AM, Braat DD, Pesman GJ, Sweep FC, Meuleman EJ (1998) A neuropeptide in human semen: oxytocin. Arch Androl 41:17-22.

Green CM, Cockle SM, Watson PF, Fraser LR (1994) Stimulating effect of pyroglutamylglutamylprolineamide, a prostatic, TRH-related tripeptide, on mouse sperm capacitation and fertilizing ability in vitro. Mol Reprod Dev 38:215-221.

Green CM, Cockle SM, Watson PF, Fraser LR (1996) Fertilization promoting peptide, a tripeptide similar to thyrotrophin-releasing hormone, stimulates the capacitation and fertilizing ability of human spermatozoa in vitro. Hum Reprod 11:830-836.

Green CM, Cockle SM, Watson PF, Fraser LR (1996) A possible mechanism of action for fertilization promoting peptide, a TRH-related tripeptide that promotes capacitation and fertilizing ability in mammalian spermatozoa. Mol Reprod Dev 45:244-252.

Greene LJ, Spadaro AC, Martins AR, Perussi De Jesus WD, Camargo AC (1982) Brain endo-oligopeptidase B: a post-proline cleaving enzyme that inactivates angiotensin I and H. Hypertension 4:178-184.

Griffiths EC, Baris C, Visser TJ, Klootwijk W (1985) Thyrotrophin-releasing hormone inactivation by human postmortem brain. Regul Pept 10:145-155.

Griffiths EC, McDermott JR, Smith AI (1982) Mechanisms of brain inactivation of centrally-acting thyrotrophin-releasing hormone (TRH) analogues: a high- performance liquid chromatography study. Regul Pept 5:1-11.

Gros C, Giros B, Schwartz JC (1985) Identification of aminopeptidase M as an enkephalin-inactivating enzyme in rat cerebral membranes. Biochemistry 24:2179-2185.

Guillemin R, Burgus R (1972) The hormones of the hypothalamus. Sci Am 227:24-33.

228 BIBLIOGRAFIA


Guyton AC, Hall, J.E. (1997) Tratado de Fisiología Médica, IX edición Edition: McGraw-Hill Interamericana.

Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, Nakajima ST, Coutifaris C, Carson SA, Cisneros P, Steinkampf MP, Hill JA, Xu D, Vogel DL (2001) Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med 345:1388-1393.

Hammerstedt RH, Parks JE (1987) Changes in sperm surfaces associated with epididymal transit. J Reprod Fértil Suppl 34:133-149.

Harrison LM, Kastin AJ, Zadina JE (1998) Opiate tolerance and dependence: receptors, G-proteins, and antiopiates. Peptides 19:1603-1630.

Hawkes WC, Turek PJ (2001) Effects of dietary selenium on sperm motility in healthy men. J Androl 22:764-772.

Hawkins EF, Wade R, Engel WK (1987) Lack of usefulness of DN-1417 for characterization of a CNS receptor for thyrotropin-releasing hormone. J Neurochem 49:239-245.

He W, Barrow CJ (1999) The A beta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length A beta. Biochemistry 38:10871-10877.

Heder G, Bottger A, Siems WE, Halatsch WR, Steinmann C (1988) [The determination of neutral metalloendopeptidase (enkephalinase A) in biological material]. Pharmazie 43:637-639.

Heinlein CA, Chang C (2004) Androgen receptor in prostate cancer. Endocr Rev 25:276-308.

Hersh LB (1982) Degradation of enkephalins: the search for an enkephalinase. Mol Cell Biochem 47:35-43.

Hersh LB (1985) Characterization of membrane-bound aminopeptidases from rat brain: identification of the enkephalin-degrading aminopeptidase. J Neurochem 44:1427-1435.

Hersh LB, Aboukhair N, Watson S (1987) Immunohistochemical localization of aminopeptidase M in rat brain and periphery: relationship of enzyme localization and enkephalin metabolism. Peptides 8:523-532.

Hohlbrugger G, Schweisfurth H, Dahlheim H (1982) Angiotensin I converting enzyme in rat testis, epididymis and vas deferens under different conditions. J Reprod Fértil 65:97-103.

BIBLIOGRAFIA 229

230 Asier Valdivia Doktoíe-T esia

Hooper NM, Karran EH, Turner AJ (1997) Membrane protein secretases. Biochem J 321 ( Pt 2):265-279.

Hooper NM, Keen J, Pappin DJ, Turner AJ (1987) Pig kidney angiotensin converting enzyme. Purification and characterization of amphipathic and hydrophilic forms of the enzyme establishes C-terminal anchorage to the plasma membrane. Biochem J 247:85-93.

Horak S, Polanska J, Widlak P (2003) Bulky DNA adducts in human sperm: relationship with fertility, semen quality, smoking, and environmental factors. Mutat Res 537:53-65.

Horita A (1998) An update on the CNS actions of TRH and its analogs. Life Sci 62:1443-1448.

Huang K, Takahara S, Kinouchi T, Takeyama M, Ishida T, Ueyama H, Nishi K, Ohkubo I (1997) Alanyl aminopeptidase from human seminal plasma: purification, characterization, and immunohistochemical localization in the male genital tract. J Biochem (Tokyo) 122:779-787.

Hughes J (1983) Biogenesis, release and inactivation of enkephalins and dynorphins. Br Med Bull 39:17-24.

Hui KS, Wang YJ, Lajtha A (1983) Purification and characterization of an enkephalin aminopeptidase from rat brain membranes. Biochemistry 22:1062-1067.

Irazusta J, Larrinaga G, Gonzalez-Maeso J, Gil J, Meana JJ, Casis L (2002) Distribution of prolyl endopeptidase activities in rat and human brain. Neurochem Int 40:337-345.

Jackson IM, Reichlin S (1974) Thyrotropin-releasing hormone (TRH): distribution in hypothalamic and extrahypothalamic brain tissues of mammalian and submammalian chordates. Endocrinology 95:854-862.

Jardinaud F, Banisadr G, Noble F, Melik-Parsadaniantz S, Chen H, Dugave C, Laplace H, Rostene W, Foumie-Zaluski MC, Roques BP, Popovici T (2004) Ontogenic and adult whole body distribution of aminopeptidase N in rat investigated by in vitro autoradiography. Biochimie 86:105-113.

Jones R (1998) Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J Reprod Fértil Suppl 53:73-84.

Jones RC (1998) Evolution of the vertebrate epididymis. J Reprod Fértil Suppl 53:163- 181.

230 BIBLIOGRAFIA


Jope T, Lammert A, Kratzsch J, Paasch U, Glander HJ (2003) Leptin and leptin receptor in human seminal plasma and in human spermatozoa. Int J Androl 26:335-341.

Jouannet P, Wang C, Eustache F, Kold-Jensen T, Auger J (2001) Semen quality and male reproductive health: the controversy about human sperm concentration decline. Apmis 109:333-344.

Kakidani H, Furutani Y, Takahashi H, Noda M, Morimoto Y, Hirose T, Asai M, Inayama S, Nakanishi S, Numa S (1982) Cloning and sequence analysis of cDNA for porcine beta-neo-en4orphin/dynorphin precursor. Nature 298:245- 249.

Kalwant S, Porter AG (1991) Purification and characterization of human brain prolyl endopeptidase. Biochem J 276 ( Pt l):237-244.

Kato T, Nakano T, Kojima K, Nagatsu T, Sakakibara S (1980) Changes in prolyl endopeptidase during maturation of rat brain and hydrolysis of substance P by the purified enzyme. J Neurochem 35:527-535.'

Kato T, Okada M, Nagatsu T (1980) Distribution of post-proline cleaving enzyme in human brain and the peripheral tissues. Mol Cell Biochem 32:117-121.

Kelly RW (1995) Immunosuppressive mechanisms in semen: implications for contraception. Hum Reprod 10:1686-1693.

Kennedy AM, Morrell JM, Siviter RJ, Cockle SM (1997) Fertilization-promoting peptide in reproductive tissues and semen of the male marmoset (Callithrix jacchus). Mol Reprod Dev 47:113-119.

Kenny AJ (1986) Regulatory peptide metabolism at cell surfaces: the key role of endopeptidase-24.11. Biomed Biochim Acta 45:1503-1513.

Kerr MA, Kenny AJ (1974) The purification and specificity of a neutral endopeptidase from rabbit kidney brush border. Biochem J 137:477-488.

Kew D, Muffly KE, Kilpatrick DL (1990) Proenkephalin products are stored in the sperm acrosome and may function in fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A 87:9143-9147.

Kew D, Muffly KE, Kilpatrick DL (1990) Proenkephalin products are stored in the sperm acrosome and may function in fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A 87:9143-9147.

BIBLIOGRAFIA 231


Khan Z, Aitken A, García JR, Smyth DG (1992) Isolation and identification of two neutral thyrotropin releasing hormone-like peptides,pyroglutamylphenylalanineproline amide and pyroglutamylglutamineproline amide, from human seminal fluid. J Biol Chem 267:7464-7469.

Kidd SA, Eskenazi B, Wyrobek AJ (2001) Effects of male age on semen quality and fertility: a review of the literature. Fértil Steril 75:237-248.

Kilpatrick DL, Borland K, Jin DF (1987) Differential expression of opioid peptide genes by testicular germ cells and somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A 84:5695-5699.

Kim J, Coetzee GA (2004) Prostate specific antigen gene regulation by androgen receptor. J Cell Biochem 93:233-241.

Kimura A, Matsui H, Takahashi T (2002) Expression and localization of prolyl oligopeptidase in mouse testis and its possible involvement in sperm motility. Zoolog Sci 19:93-102.

Kimura A, Ohnishi J, Okimura H, Hamabata T, Takahashi T (1998) Localization of prolyl endopeptidase mRNA in small growing follicles of porcine ovary. Mol ReprodDev 50:121-127.

King AC, Cuatrecasas P (1981) Peptide hormone-induced receptor mobility, aggregation, and internalization. N Engl J Med 305:77-88.

Kodentsova VM, Vrzesinskaya OA, Spirichev VB (1994) Male fertility: a possible role of vitamins. Ukr Biokhim Zh 66:17-22.

Koida M, Walter R (1976) Post-proline cleaving enzyme. Purification of this endopeptidase by affinity chromatography. J Biol Chem 251:7593-7599.

Kosterlitz HW, Waterfield AA (1975) In vitro models in the study of structure-activity relationships of narcotic analgesics. Annu Rev Pharmacol 15:29-47.

Kucheria K, Sax en a R, Mohan D (1985) Semen analysis in alcohol dependence syndrome. Andrologia 17:558-563.

Kunzle R, Mueller MD, Hanggi W, Birkhauser MH, Drescher H, Bersinger NA (2003) Semen quality of male smokers and nonsmokers in infertile couples. Fértil Steril 79:287-291.

Lamberton RP, Lechan RM, Jackson IM (1984) Ontogeny of thyrotropin-releasing hormone and histidyl proline diketopiperazine in the rat central nervous system and pancreas. Endocrinology 115:2400-2405.

232 BIBLIOGRAFIA


Lamer AJ (1999) Hypothesis: amyloid beta-peptides truncated at the N-terminus contribute to the pathogenesis of Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 20:65- 69.

Lauffart B, Mantle D (1988) Rationalization of aminopeptidase activities in human skeletal muscle soluble extract. Biochim Biophys Acta 956:300-306.

Leppaluoto J, Koivusalo F, Kraama R (1978) Thyrotropin-releasing factor: distribution in neural and gastrointestinal tissues. Acta Physiol Scand 104:175-179.

Levy R, Eustache F, Pilikian S, Clavel C, Cordonier H, Benchaib M, Lomage J, Pinatel MC, Guerin JF (1996) Effect of gastrin-releasing peptide on sperm functions. Mol Hum Reprod 2:867-872.

Li CH, Lemaire S, Yamashiro D, Doneen BA (1976) The synthesis and opiate activity ofbeta-endorphin. Biochem Biophys Res Commun 71:19-25.

Lilja H, Laurell CB (1984) Liquefaction of coagulated human semen. Scand J Clin Lab Invest 44:447-452.

Lin JW, Ju W, Foster K, Lee SH, Ahmadian G, Wyszynski M, Wang YT, Sheng M (2000) Distinct molecular mechanisms and divergent endocytotic pathways of AMPA receptor internalization. Nat Neurosci 3:1282-1290.

Lin LN, Brandts JF (1983) Evidence showing that a proline-specific endopeptidase has an absolute requirement for a trans peptide bond immediately preceding the active bond. Biochemistry 22:4480-4485.

Louvard D, Maroux S, Vannier C, Desnuelle P (1975) Topological studies on the hydrolases bound to the intestinal brush border membrane. I. Solubilization by papain and Triton X-100. Biochim Biophys Acta 375:235-248.

Lynch DR, Snyder SH (1986) Neuropeptides: multiple molecular forms, metabolic pathways, and receptors. Annu Rev Biochem 55:773-799.

Ma Y, Zhang S, Xia Q, Zhang G, Huang X, Huang M, Xiao C, Pan A, Sun Y, Lebo R, Milunsky A (2002) Molecular characterization of the TCP 11 gene which is the human homologue of the mouse gene encoding the receptor of fertilization promoting peptide. Mol Hum Reprod 8:24-31.

Mack S, Bhattacharyya AK, Joyce C, van der Ven H, Zaneveld LJ (1983) Acrosomal enzymes o f human spermatozoa before and after in vitro capacitation. Biol Reprod 28:1032-1042.

Maes M, Goossens F, Scharpe S, Calabrese J, Desnyder R, Meltzer HY (1995) Alterations in plasma prolyl endopeptidase activity in depression, mania, and schizophrenia: effects of antidepressants, mood stabilizers, and antipsychotic drugs. Psychiatry Res 58:217-225.

BIBLIOGRAFIA 233


Maes M, Goossens F, Scharpe S, Meltzer HY, D’Hondt P, Cosyns P (1994) Lower serum prolyl endopeptidase enzyme activity in major depression: further evidence that peptidases play a role in the pathophysiology of depression. Biol Psychiatry 35:545-552.

Malfroy B, Swerts JP, Guyon A, Roques BP, Schwartz JC (1978) High-affinity enkephalin-degrading peptidase in brain is increased after morphine. Nature 276:523-526.

Manaker S, Eichen A, Winokur A, Rhodes CH, Rainbow TC (1986) Autoradiographic localization of thyrotropin releasing hormone receptors in human brain. Neurology 36:641-646.

Mantle D, Falkous G, Ishiura S, Blanchard PJ, Perry EK (1996) Comparison of proline endopeptidase activity in brain tissue from normal cases and cases with Alzheimer's disease, Lewy body dementia, Parkinson's disease and Huntington's disease. Clin Chim Acta 249:129-139.

Matsas R, Stephenson SL, Hryszko J, Kenny AJ, Turner AJ (1985) The metabolism of neuropeptides. Phase separation of synaptic membrane preparations with Triton X-l 14 reveals the presence of aminopeptidase N. Biochem J 231:445-449.

McDonald JK, Barret, A. (1986) Mammalian proteases: A Glossary and Bibliography. London.

McKelvy JF, Blumberg S (1986) Inactivation and metabolism of neuropeptides. Annu Rev Neurosci 9:415-434.

McLellan S, Dyer SH, Rodriguez G, Hersh LB (1988) Studies on the tissue distribution of the puromycin-sensitive enkephalin-degrading aminopeptidases. J Neurochem 51:1552-1559.

Mehta MK, Garde SV, Sheth AR (1995) Occurrence of FSH, inhibin and other hypothalamic-pituitary-intestinal hormones in normal fertility, subfertility, and tumors of human testes. Int J Fértil Menopausal Stud 40:39-46.

Mehta ND, Don J, Zinn SA, Millette C, Wolgemuth DJ, Kilpatrick DL (1994) Proenkephalin gene expression in testicular interstitial cells is down-regulated coincident with the appearance of pachytene spermatocytes. Endocrinology 135:1543-1550.

Mendez M, Cruz C, Joseph-Bravo P, Wilk S, Charli JL (1990) Evaluation of the role of prolyl endopeptidase and pyroglutamyl peptidase I in the metabolism of LHRH and TRH in brain. Neuropeptides 17:55-62.

234 BIBLIOGRAFIA


Metayer S, Dacheux F, Dacheux JL, Gatti JL (2002) Germinal angiotensin I-converting enzyme is totally shed from the rodent sperm membrane during epididymal maturation. Biol Reprod 67:1763-1767.

Meunier JC, Mollereau C, Toll L, Suaudeau C, Moisand C, Alvinerie P, Butour JL, Guillemot JC, Ferrara P, Monsarrat B, et al. (1995) Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377:532- 535.

Mineyama R, Saito K (1998) Partial purification and some properties of pyroglutamyl peptidase from Enterococcus faecalis. Microbios 94:47-62.

Mishima Y, Matsumoto-Mishima Y, Terui Y, Katsuyama M, Yamada M, Mori M, Ishizaka Y, Ikeda K, Watanabe J, Mizunuma N, Hayasawa H, Hatake K (2002) Leukemic cell-surface CD13/aminopeptidase N and resistance to apoptosis mediated by endothelial cells. J Natl Cancer Inst 94:1020-1028.

Mizutani T, Schill WB (1985) Motility of seminal plasma-free spermatozoa in the presence of several physiological compounds. Andrologia 17:150-156.

Mobbs BG, Johnson IE, Connolly JG (1980) The effect of therapy on the concentration and occupancy of androgen receptors in human prostatic cytosol. Prostate 1:37-51.

Monsees TK, Gomig M, Schill WB, Miska W (1998) Possible involvement of proteases in the regulation of spermatogenesis. Andrologia 30:185-191.

Morain P, Lestage P, De Nanteuil G, Jochemsen R, Robin JL, Guez D, Boyer PA (2002) S 17092: a prolyl endopeptidase inhibitor as a potential therapeutic drug for memory impairment. Preclinical and clinical studies. CNS Drug Rev 8:31-52.

Morales P (1998) Gonadotropin-releasing hormone increases ability of the spermatozoa to bind to the human zona pellucida. Biol Reprod 59:426-430.

Morales P, Vantman D, Madariaga M (1999) Sperm penetration through the human zona pellucida as a predictor of in vitro fertilization. Andrologia 31:131-135.

Mori M, Jayaraman A, Prasad C, Pegues J, Wilber JF (1982) Distribution of histidyl- proline diketopiperazine [cyclo (His-Pro)] and thyrotropin-releasing hormone (TRH) in the primate central nervous system. Brain Res 245:183-186.

Moriyama A, Nakanishi M, Sasaki M (1988) Porcine muscle prolyl endopeptidase and its endogenous substrates. J Biochem (Tokyo) 104:112-117.

BIBLIOGRAFIA 235


Morley JE, Garvin TJ, Pekary AE, Hershman JM (1977) Thyrotropin-releasing hormone in the gastrointestinal tract. Biochem Biophys Res Commun 79:314- 318.

Morley JE, Sawin CT, Carlson HE, Longcope C, Hershman JM (1981) The relationship of androgen to the thyrotropin and prolactin responses to thyrotropin-releasing hormone in hypogonadal and normal men. J Clin Endocrinol Metab 52:173-176.

Morris ID, Bardin CW, Musto NA, Thau RB, Gunsalus GL (1987) Evidence suggesting that germ cells influence the bidirectional secretion of androgen binding protein by the seminiferous epithelium demonstrated by selective impairment of spermatogenesis with busulphan. Int J Androl 10:691-700.

Multigner L, Oliva A (2002) Secular variations in sperm quality: fact or science fiction? Cad Saude Publica 18:403-412.

Munkelwitz R, Gilbert BR (1998) Are boxer shorts really better? A critical analysis of the role of underwear type in male sub fertility. J Urol 160:1329-1333.

Naghettini AV, Nogueira PC, Juliano M, Bueno AA, Casarini DE, de Abreu Carvalhaes JT (2001) Tubular urinary enzymes in acute post-infectious glomerulonephritis. Pediatr Nephrol 16:719-722.

Nakanishi S, Inoue A, Kita T, Nakamura M, Chang AC, Cohen SN, Numa S (1979) Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-beta-lipotropin precursor. Nature 278:423-427.

Noble F, Banisadr G, Jardinaud F, Popovici T, Lai-Kuen R, Chen H, Bischoff L, Parsadaniantz SM, Foumie-Zaluski MC, Roques BP (2001) First discrete autoradiographic distribution of aminopeptidase N in various structures of rat brain and spinal cord using the selective iodinated inhibitor [125I]RB 129. Neuroscience 105:479-488.

Noble F, Foumie-Zaluski MC, Roques BP (1999) [Enkephalin catabolism inhibitors and antalgics of the future: from preclinical research to clinical trials]. Therapie 54:121-133.

O'Connor B, O'Cuinn G (1985) Purification of and kinetic studies on a narrow specificity synaptosomal membrane pyroglutamate aminopeptidase from guinea-pig brain. Eur J Biochem 150:47-52.

O'Cuinn G, O'Connor B, Elmore M (1990) Degradation of thyrotropin-releasing hormone and luteinising hormone-releasing hormone by enzymes of brain tissue. J Neurochem 54:1-13.

O'Cuinn G, O'Connor B, Elmore M (1990) Degradation of thyrotropin-releasing hormone and luteinising hormone-releasing hormone by enzymes of brain tissue. J Neurochem 54:1-13.

236 BIBLIOGRAFIA

Doktote-T esia Asier Valdivia Palacín 237

Odagaki Y, Hayashi A, Okada K, Hirotsu K, Kabashima T, Ito K, Yoshimoto T, Tsuru D, Sato M, Ciardy J (1999) The crystal structure of pyroglutamyl peptidase I from Bacillus amyloliquefaciens reveals a new structure for a cysteine protease. Structure Fold Des 7:399-411.

Odaka C, Mizuochi T, Shirasawa T, Morain P, Checler F (2002) Murine T cells expressing high activity of prolyl endopeptidase are susceptible to activation- induced cell death. FEBS Lett 512:163-167.

O'Hara BF, Donovan DM, Lindberg I, Brannock MT, Ricker DD, Moffatt CA, Klaunberg BA, Schindler C, Chang TS, Nelson RJ, et al. (1994) Proenkephalin transgenic mice: a short promoter confers high testis expression and reduced fertility. Mol Reprod Dev 38:275-284.

Ohkubo I, Huang K, Ochiai Y, Takagaki M, Kani K (1994) Dipeptidyl peptidase IV from porcine seminal plasma: purification, characterization, and N-terminal amino acid sequence. J Biochem (Tokyo) 116:1182-1186.

O'Leary RM, Gallagher SP, O'Connor B (1996) Purification and characterization of a novel membrane-bound form of prolyl endopeptidase from bovine brain. Int J Biochem Cell Biol 28:441-449.

O'Leary RM, O'Connor B (1995) Identification and localisation of a synaptosomal membrane prolyl endopeptidase from bovine brain. Eur J Biochem 227:277- 283.

Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW (1977) Design of specific inhibitors of angiotensin-converting enzyme: new class of orally active antihypertensive agents. Science 196:441-444.

Orlowski M, Wilk E, Pearce S, Wilk S (1979) Purification and properties of a prolyl endopeptidase from rabbit brain. J Neurochem 33:461-469.

Ortega-Alvaro A, Chover-Gonzalez AJ, Lai-Kuen R, Mico JA, Gibert-Rahola J, Foumie-Zaluski MC, Roques BP, Maldonado R (1998) Antinociception produced by the peptidase inhibitor, RB 101, in rats with adrenal medullary transplant into the spinal cord. Eur J Pharmacol 356:139-148.

Osada T, Watanabe G, Kondo S, Toyoda M, Sakaki Y, Takeuchi T (2001) Male reproductive defects caused by puromycin-sensitive aminopeptidase deficiency in mice. Mol Endocrinol 15:960-971.

Ouimet T, Facchinetti P, Rose C, Bonhomme MC, Gros C, Schwartz JC (2000) Neprilysin H: A putative novel metalloprotease and its isoforms in CNS and testis. Biochem Biophys Res Commun 271:565-570.

BIBLIOGRAFIA 237


Palacios JM, Dietl MM (1987) Regulatory peptide receptors: visualization by autoradiography. Experientia 43:750-761.

Pan C, Cardarelli PM, Nieder MH, Pickford LB, Gangwar S, King DJ, Yarranton GT, Buckman D, Roscoe W, Zhou F, Salles A, Chen TH, Horgan K, Wang YH, Nguyen T, Bebbington CR (2003) CD 10 is a key enzyme involved in the activation of tumor-activated peptide prodrug CPI-0004Na and novel analogues: implications for the design of novel peptide prodrugs for the therapy of CD10+ tumors. Cancer Res 63:5526-5531.

Pardo G, Legua V, Remohi J, Bonilla-musoles F (1985) [Review and update: marijuana and reproduction]. Acta Ginecol (Madr) 42:420-429.

Pariset CC, Feinberg JM, Dacheux JL, Weinman SJ (1985) Changes in calmodulin level and cAMP-dependent protein kinase activity during epididymal maturation of ram spermatozoa. J Reprod Fértil 74:105-112.

Pekary AE, Hershman JM, Friedman S (1983) Human semen contains thyrotropin releasing hormone (TRH), a TRH-homologous peptide, and TRH-binding substances. J Androl 4:399-407.

Pert CB, Pert A, Chang JK, Fong BT (1976) (D-Ala2)-Met-enkephalinamide: a potent, long-lasting synthetic pentapeptide analgesic. Science 194:330-332.

Peterkofsky A, Battaini F, Koch Y, Takahara Y, Dannies P (1982) Histidyl-proline diketopiperazine: its biological role as a regulatory peptide. Mol Cell Biochem 42:45-63.

Pintado CO, Pinto FM, Pennefather JN, Hidalgo A, Baamonde A, Sanchez T,Candenas ML (2003) A role for tachykinins in female mouse and ratreproductive function. Biol Reprod 69:940-946.

Pizzi M, Boroni F, Benarese M, Moraitis C, Memo M, Spano P (1999) Neuroprotective effect of thyrotropin-releasing hormone against excitatory amino acid-induced cell death in hippocampal slices. Eur J Pharmacol 370:133-137.

Porkka KP, Visakorpi T (2004) Molecular mechanisms of prostate cancer. Eur Urol 45:683-691.

Porter JN HR, Hesseltie CW, Krupka G, Lowery JA, Wallace WS, Bohonos N,Williams JH (1952) Antibiot. and Chemoterapy.

Prasad C, Mori M, Wilber JF, Pierson W, Pegues J, Jayaraman A (1982) Distribution and metabolism of cyclo (His-Pro): a new member o f the neuropeptide family. Peptides 3:591-598.

238 BIBLIOGRAFIA


Prieto I, Martinez A, Martinez JM, Ramirez MJ, Vargas F, Alba F, Ramirez M (1998) Activities of aminopeptidases in a rat saline model of volume hypertension. Horm Metab Res 30:246-248.

Puri S, Puri VN (1985) Urinary vasopressin in male infertility. Arch Androl 14:263- 265.

Ragni G, De Lauretis L, Bestetti O, Sghedoni D, Gambaro V (1988) Gonadal function in male heroin and methadone addicts. Int J Androl 11:93-100.

Ragni G, De Lauretis L, Gambaro V, Di Pietro R, Bestetti O, Recalcati F, Papetti C (1985) Semen evaluation in heroin and methadone addicts. Acta Eur Fértil 16:245-249.

Ramirez-Exposito MJ, Robert-Baudouy J, Mayas MD, Garcia MJ, Ramirez M, Martinez-Martos JM (2001) Acetylcholinesterase inhibitor SDZ ENA 713 (Rivastigmine) increases brain pyrrolidone carboxyl peptidase activity. Eur Neuropsychopharmacol 11:381-383.

Raz E (2004) Guidance of primordial germ cell migration. Curr Opin Cell Biol 16:169- 173.

Reaux A, Foumie-Zaluski MC, David C, Zini S, Roques BP, Corvol P, Llorens-Cortes C (1999) Aminopeptidase A inhibitors as potential central antihypertensive agents. Proc Natl Acad Sci U S A 96:13415-13420.

Reinscheid RK, Nothacker H, Civelli O (2000) The orphanin FQ/nociceptin gene: structure, tissue distribution of expression and functional implications obtained from knockout mice. Peptides 21:901-906.

Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A, Ardati A, Henningsen RA, Bunzow JR, Grandy DK, Langen H, Monsma FJ, Jr., Civelli O (1995) Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G protein-coupled receptor. Science 270:792-794.

Relton JM, Gee NS, Matsas R, Turner AJ, Kenny AJ (1983) Purification of endopeptidase-24.11 ('enkephalinase') from pig brain by immunoadsorbent chromatography. Biochem J 215:519-523.

Ronquist G, Brody I (1985) The prostasome: its secretion and function in man. Biochim Biophys Acta 822:203-218.

Roques BP, Noble, F., Foumie-Zaluski M.C. (1999) Endogenous opioid peptides and analgesia: Cambridge University Press.

BIBLIOGRAFIA 239

240 Asier Valdivia Doktofe-T esia

Roques BP, Fourni e-Zaluski MC, Soroca E, Lecomte JM, Malfroy B, Llorens C, Schwartz JC (1980) The enkephalinase inhibitor thiorphan shows antinociceptive activity in mice. Nature 288:286-288.

Rosenblum JS, Kozarich JW (2003) Prolyl peptidases: a serine protease subfamily with high potential for drug discovery. Curr Opin Chem Biol 7:496-504.

Ryan JW, Chung AY, Nearing JA, Valido FA, Shun-Cun C, Berryer P (1993) A radiochemical assay for aminopeptidase N. Anal Biochem 210:27-33.

Saez F, Frenette G, Sullivan R (2003) Epididymosomes and prostasomes: their roles in posttesticular maturation of the sperm cells. J Androl 24:149-154.

Saez F, Motta C, Boucher D, Grizard G (1998) Antioxidant capacity of prostasomes in human semen. Mol Hum Reprod 4:667-672.

Safavi A, Hersh LB (1995) Degradation of dynorphin-related peptides by the puromycin-sensitive aminopeptidase and aminopeptidase M. J Neurochem 65:389-395.

Safran M, Wu CF, Emerson CH (1982) Thyrotropin-releasing hormone metabolism in visceral organ homogenates of the rat. Endocrinology 110:2101-2106.

Sastry BV, Janson VE, Owens LK (1991) Significance of substance P- and enkephalin- peptide systems in the male genital tract. AnnN Y Acad Sci 632:339-353.

Sastry BV, Janson VE, Owens LK, Tayeb OS (1982) Enkephalin- and substance P-like immunoreactivities of mammalian sperm and accessory sex glands. Biochem Pharmacol 31:3519-3522.

Schaller J, Glander HJ (2000) Flow cytometric analysis o f enzymes in live spermatozoa before and after cryostorage. Andrologia 32:357-364.

Schalling M, Persson H, Pelto-Huikko M, Odum L, Ekman P, Gottlieb C, Hokfelt T, Rehfeld JF (1990) Expression and localization of gastrin messenger RNA and peptide in spermatogenic cells. J Clin Invest 86:660-669.

Scharrer B (1978) Peptidergic neurons: facts and trends. Gen Comp Endocrinol 34:50- 62.

Schill WB, Miska W (1992) Possible effects of the kallikrein-kinin system on male reproductive functions. Andrologia 24:69-75.

Schneider JS, Giardiniere M, Morain P (2002) Effects of the prolyl endopeptidase inhibitor S 17092 on cognitive deficits in chronic low dose MPTP-treated monkeys. Neuropsychopharmacology 26:176-182.

240 BIBLIOGRAFIA


Schuel H, Burkman LJ, Lippes J, Crickard K, Mahony MC, Giuffiida A, Picone RP, Makriyannis A (2002) Evidence that anandamide-signaling regulates human sperm functions required for fertilization. Mol Reprod Dev 63:376-387.

Schulze W (1982) Evidence of a wave of spermatogenesis in human testis. Andrologia 14:200-207.

Schwartz JC, de îa Baume S, Yi CC, Chaillet P, Marcais-Collado H, Costentin J (1983) Peptidases involved in the inactivation of exogenous and endogenous enkephalins. J Neural Transm Suppl 18:235-243.

Scott R, MacPherson A, Yates RW, Hussain B, Dixon J (1998) The effect of oral selenium supplementation on human sperm motility. Br J Urol 82:76-80.

Sekine K, Fujii H, Abe F, Nishikawa K (2001) Augmentation of death ligand-induced apoptosis by aminopeptidase inhibitors in human solid tumor cell lines. Int J Cancer 94:485-491.

Serrano II, Garcia-Suarez D (2001) Molecular aspects of mammalian fertilization. Asian J Androl 3:243-249.

Shah C, Modi D, Gadkar S, Sachdeva G, Puri C (2003) Progesterone receptors on human spermatozoa. Indian J Exp Biol 41:773-780.

Shan L, Molberg O, Parrot I, Hausch F, Filiz F, Gray GM, Sollid LM, Khosla C (2002) Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue, Science 297:2275-2279.

Sharif NA (1988) Chronic prolactin, gonadal and thyroid hormone treatments in vivo alter levels of TRH and muscarinic receptors in male and female rat tissues. Brain Res 449:364-368.

Sharma RK, Agarwal A (1996) Role of reactive oxygen species in male infertility. Urology 48:835-850.

Shen R, Sumitomo M, Dai J, Harris A, Kaminetzky D, Gao M, Bumstein KL, Nanus DM (2000) Androgen-induced growth inhibition of androgen receptor expressing androgen-independent prostate cancer cells is mediated by increased levels of neutral endopeptidase. Endocrinology 141:1699-1704.

Shi ZX, Xu W, Mergner WJ, Li QL, Cole KH, Wilber JF (1996) Localization of thyrotropin-releasing hormone mRNA expression in the rat heart by in situ hybridization histochemistry. Pathobiology 64:314-319.

Shimizu T, Tani K, Hase K, Ogawa H, Huang L, Shinomiya F, Soné S (2002) CD13/aminopeptidase N-induced lymphocyte involvement in inflamed joints of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 46:2330-2338.

BIBLIOGRAFIA 241


Shirai M, Matsuda S, Mitsukawa S, Nakamura M, Yonezawa K (1975) FSH, LH and testosterone levels in human seminal plasma. Tohoku J Exp Med 116:201-202.

Shishido Y, Furushiro M, Tanabe S, Shibata S, Hashimoto S, Yokokura T (1999) Effects of prolyl endopeptidase inhibitors and neuropeptides on delayed neuronal death in rats. Eur J Pharmacol 372:135-142.

Siems WE, Maul B, Wiesner B, Becker M, Walther T, Rothe L, Winkler A (2003) Effects of kinins on mammalian spermatozoa and the impact of peptidolytic enzymes. Andrologia 35:44-54.

Simon EJ (1973) In search of the opiate receptor. Am J Med Sci 266:160-168.Siviter RJ, Cockle SM (1995) Peptides related to thyrotrophin-releasing hormone are

degraded in seminal plasma by an enzyme similar to prolyl endopeptidase. J Endocrinol 144:61-66.

Solhonne B, Gros C, Pollard H, Schwartz JC (1987) Major localization of aminopeptidase M in rat brain microvessels. Neuroscience 22:225-232.

Somlev B, Subev M (1998) Effect of kininase II inhibitors on bradykinin-stimulated bovine sperm motility. Theriogenology 50:651-657.

Spillantini MG, Sicuteri F, Salmon S, Malfroy B (1990) Characterization of endopeptidase 3.4.24.11 ("enkephalinase") activity in human plasma and cerebrospinal fluid. Biochem Pharmacol 39:1353-1356.

Stanziola L, Greene LJ, Santos RA (1999) Effect of chronic angiotensin converting enzyme inhibition on angiotensin I and bradykinin metabolism in rats. Am J Hypertens 12:1021-1029.

Starz-Gaiano M, Lehmann R (2001) Moving towards the next generation. Mech Dev 105:5-18.

Steers WD (1994) Physiology of the vas deferens. World J Urol 12:281-285.

Stegmayr B, Ronquist G (1982) Stimulation of sperm progressive motility by organelles in human seminal plasma. Scand J Urol Nephrol 16:85-90.

Stone TW (1983) Actions o f TRH and cyclo-(His-Pro) on spontaneous and evoked activity of cortical neurones. Eur J Pharmacol 92:113-118.

Straub RE, Freeh GC, Joho RH, Gershengom MC (1990) Expression cloning of a cDNA encoding the mouse pituitary thyrotropin-releasing hormone receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 87:9514-9518.

Sullivan JM, Dluhy RG, Wacker WE, Solomon HS, Williams GH, Samaha JK (1978) Interrelationships among thiazide diuretics and calcium, magnesium, sodium, and potassium balance in normal and hypertensive man. J Clin Pharmacol 18:530-543.

242 BIBLIOGRAFIA


Sutton KA (2000) Molecular mechanisms involved in the differentiation of spermatogenic stem cells. Rev Reprod 5:93-98.

Tanemura K, Kurohmaru M, Kuramoto K, Hayashi Y (1993) Age-related morphological changes in the testis of the BDF1 mouse. J Vet Med Sci 55 ROSTIO.

Tanemura K, Kurohmaru M, Kuramoto K, Matsumoto M, Hayashi Y (1994) Age- related changes in cytoskeletal components of the BDFl mouse Sertoli cell. Tissue Cell 26:447-455.

Tate SS (1981) Purification and properties of a bovine brain thyrotropin-releasing- factor deamidase. A post-proline cleaving enzyme of limited specificity. Eur J Biochem 118:17-23.

Taylor A (1993) Aminopeptidases: towards a mechanism of action. Trends Biochem Sci 18:167-171.

Templeton A (1995) Infertility-epidemiology, aetiology and effective management. Health Bull (Edinb) 53:294-298.

Terenius L (1973) Characteristics of the "receptor" for narcotic analgesics in synaptic plasma membrane fraction from rat brain. Acta Pharmacol Toxicol (Copenh) 33:377-384.

Tesarik J, Mendoza C (1992) Defective function of a nongenomic progesterone receptor as a sole sperm anomaly in infertile patients. Fértil Steril 58:793-797.

Thomas JE, Rylett CM, Carhan A, Bland ND, Bingham RJ, Shirras AD, Turner AJ, Isaac RE (2005) Drosophila melanogaster NEP2 is a new soluble member of the neprilysin family o f endopeptidases with implications for reproduction and renal fonction. Biochem J 386:357-366.

Thom NA, Russell JT, Torp-Pedersen C, Treiman M (1978) Calcium and neurosecretion. Ann N Y Acad Sci 307:618-639.

Tobler AR, Constam DB, Schmitt-Graff A, Malipiero U, Schlapbach R, Fontana A (1997) Cloning of the human puromycin-sensitive aminopeptidase and evidence for expression in neurons. J Neurochem 68:889-897.

Tres LL, Rosselot C, Kierszenbaum AL (2004) Primordial germ cells: what does it take to be alive? Mol Reprod Dev 68:1-4.

Tsuru D, Fujiwara K, Kado K (1978) Purification and characterization of L- pyrrolidonecarboxylate peptidase from Bacillus amyloiliquefaciens. J Biochem (Tokyo) 84:467-476.

BIBLIOGRAFIA 243


Turner AJ (1986) Processing and metabolism of neuropeptides. Essays Biochem:69-119.

Turner AJ, Matsas R, Kenny AJ (1985) Are there neuropeptide-specific peptidases? Biochem Pharmacol 34:1347-1356.

Turner AJ, Matsas R, Kenny AJ (1985) Endopeptidase-24.11 and neuropeptide metabolism. Biochem Soc Trans 13:39-42.

Usmani BA, Harden B, Maitland NJ, Turner AJ (2002) Differential expression of neutral endopeptidase-24.11 (neprilysin) and endothelin-converting enzyme in human prostate cancer cell lines. Clin Sci (Lond) 103 Suppl 48:314S-317S.

Utleg AG, Yi EC, Xie T, Shannon P, White JT, Goodlett DR, Hood L, Lin B (2003) Proteomic analysis of human prostasomes. Prostate 56:150-161.

Vallee BL GA (1984) The metallobiochemistry of zinc enzymes. Adv Enzimol:283- 430.

Vanha-Perttula T, Ronkko S, Lahtinen R (1990) Hydrolases from bovine seminal vesicle, prostate and Cowper's gland. Andrologia 22 Suppl 1:10-24.

Vanhoof G, De Meester I, van Sande M, Scharpe S, Yaron A (1992) Distribution of proline-specific aminopeptidases in human tissues and body fluids. Eur J Clin Chem Clin Biochem 30:333-338.

Ventura C, Maioli M, Pintus G, Posadino AM, Tadolini B (1998) Nuclear opioid receptors activate opioid peptide gene transcription in isolated myocardial nuclei. J Biol Chem 273:13383-13386.

Vezina D, Mauffette F, Roberts KD, Bleau G (1996) Selenium-vitamin E supplementation in infertile men. Effects on semen parameters and micronutrient levels and distribution. Biol Trace Elem Res 53:65-83.

Vincent B, Beaudet A, Dauch P, Vincent JP, Checler F (1996) Distinct properties of neuronal and astrocytic endopeptidase 3.4.24.16: a study on differentiation, subcellular distribution, and secretion processes. J Neurosci 16:5049-5059.

Vinson GP, Puddefoot JR, Ho MM, Barker S, Mehta J, Saridogan E, Djahanbakhch O (1995) Type 1 angiotensin II receptors in rat and human sperm. J Endocrinol 144:369-378.

Vredenburgh-Wilberg WL, Parrish JJ (1995) Intracellular pH of bovine sperm increases during capacitation. Mol Reprod Dev 40:490-502.

244 BIBLIOGRAFIA


Wade MA, Jones RC, Murdoch RN, Aitken RJ (2003) Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction 125:175-183.

Wagner GW, Tavianini MA, Herrmann KM, Dixon JE (1981) Purification and characterization of an enkephalin aminopeptidase from rat brain. Biochemistry 20:3884-3890.

Waksman G, Bouboutou R, Devin J, Bourgoin S, Cesselin F, Hamon M, Fournie- Zaluski MC, Roques B (1985) In vitro and in vivo effects of kelatorphan on enkephalin metabolism in rodent brain. Eur J Pharmacol 117:233-243.

Walter R, Shlank H, Glass JD, Schwartz IL, Kerenyi TD (1971) Leucylglycinamide released from oxytocin by human uterine enzyme. Science 173:827-829.

Wen XH, Yang ZW (2000) Quantitative (stereological) study on the spermatozoal storage capacity of epididymis in rats and monkeys. Asian J Androl 2:73-77.

Wenger T, Bouhdiba M, Saint Pol P, Ciofi P, Tramu G, Leonardelli J (1990) Presence of neuropeptide—Y and its C-terminal flanking peptide immuno-reactivity in the seminiferous tubules of human testis. Andrologia 22:299-303.

WHO laboratory manual for the examination of huma semen and sperm-cervical mucus interaction. World Health Organization. 1999. Cambridge University Press.

Wilk S (1983) Prolyl endopeptidase. Life Sci 33:2149-2157.

Wilk SaW, E.K. (1989) Pyroglutamyl Peptidase II: a thyrotropin releasing hormone degrading enzyme: purification and specificity studies of the rabbit brain enzyme. Neurochem Int 15:81-90.

Williams RS, Cheng L, Mudge AW, Harwood AJ (2002) A common mechanism of action for three mood-stabilizing drugs. Nature 417:292-295.

Willingham MC, Maxfield FR, Pastan I (1980) Receptor-mediated endocytosis of alpha 2-macroglobulin in cultured fibroblasts. J Histochem Cytochem 28:818- 823.

Wilson MJ, Ruhland AR, Pryor JL, Ercole C, Sinha AA, Hensleigh H, Kaye KW, Dawkins HJ, Wasserman NF, Reddy P, Ahmed K (1998) Prostate specific origin of dipeptidylpeptidase IV (CD-26) in human seminal plasma. J Urol 160:1905-1909.

Winokur A, Utiger RD (1974) Thyrotropin-releasing hormone: regional distribution in rat brain. Science 185:265-267.

BIBLIOGRAFIA 245


Wong WY, Merkus HM, Thomas CM, Menkveld R, Zielhuis GA, Steegers-Theunissen RP (2002) Effects of folic acid and zinc sulfate on male factor subfertility: a double-blind, randomized, placebo-controlled trial. Fértil Steril 77:491-498.

Wong WY, Thomas CM, Merkus HM, Zielhuis GA, Doesburg WH, Steegers- Theunissen RP (2000) Cigarette smoking and the risk of male factor subfertility: minor association between cotinine in seminal plasma and semen morphology. Fértil Steril 74:930-935.

Wong WY, Thomas CM, Merkus JM, Zielhuis GA, Steegers-Theunissen RP (2000) Male factor subfertility: possible causes and the impact of nutritional factors. Fértil Steril 73:435-442.

Xu Y, Wellner D, Scheinberg DA (1995) Substance P and bradykinin are natural inhibitors of CD13/aminopeptidase N. Biochem Biophys Res Commun 208:664-674.

Yanagimachi R (1994) Mammalian Fertilization, In: Physiology of Reproduction (Knobil E, Neill, J., ed), pp 189-317. New York: New York Raven Press.

Yokosawa H, Miyata M, Sawada H, Ishii S (1983) Isolation and characterization of a post-pro line cleaving enzyme and its inhibitor from sperm of the ascidian, Halocynthia roretzi. J Biochem (Tokyo) 94:1067-1076.

Yoshida K, Inaba K, Ohtake H, Morisawa M (1999) Purification and characterization of prolyl endopeptidase from the Pacific herring, Clupea pallasi, and its role in the activation of sperm motility. Dev Growth Differ 41:217-225.

Yoshimoto T, Ogita K, Walter R, Koida M, Tsuru D (1979) Post-proline cleaving enzyme. Synthesis of a new fluorogenic substrate and distribution of the endopeptidase in rat tissues and body fluids of man. Biochim Biophys Acta 569:184-192.

Yoshimoto T, Shimoda T, Kitazono A, Kabashima T, Ito K, Tsuru D (1993) Pyroglutamyl peptidase gene from Bacillus amyloliquefaciens: cloning, sequencing, expression, and crystallization of the expressed enzyme. J Biochem (Tokyo) 113:67-73.

Yu ZH, Chow PH, Pang SF (1994) Identification and characterization of 2[125I]- iodomelatonin binding sites in the rat epididymis. J Pineal Res 17:195-201.

Zadina JE, Hackler L, Ge LJ, Kastin AJ (1997) A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. Nature 386:499-502.

Zagon IS, McLaughlin PJ (1989) Endogenous opioid systems regulate growth of neural tumor cells in culture. Brain Res 490:14-25.

246 BIBLIOGRAFIA


Zhang JP, Meng QY, Zhang LJ, Mao YL, Sun ZX (2002) [Study of correlation and effect of smoking on semen quality of men]. Zhonghua Nan Ke Xue 8:35-37.

Zorgniotti AW, Sealfon AI, Toth A (1980) Chronic scrotal hypothermia as a treatment for poor semen quality. Lancet 1:904-906.

WEBGUNEAK

http://dsc.discoverv.com/fansites/onthecase/humanbodv/zoom 03 .html (azaleko

argazkia)

http://www.biologv.queensu.ca/facultv/montgomerie.html

http ://www. sefertilidad .com

http://www.asesa.org

BIBLIOGRAFIA 247

http://dsc.discoverv.com/fansites/onthecase/humanbodv/zoom

http://www.biologv.queensu.ca/facultv/montgomerie.html

http://www.asesa.org


Doktore-Tesi hau Ikerkuntza Errektoreordetzak emandako íkerlarien

Formaziorako Doktoreaurreko dirulaguntzaz eta Euskara

Errektoreordetzak emandako Euskaraz Tesiak Egiteko dirulaguntzaz

egin ahal izan d a .

Giza haziko peptidasak eta gizonezkoen ugalkortasunaren ...

Documents

Transcript of Giza haziko peptidasak eta gizonezkoen ugalkortasunaren ...