PRÁCTICA: DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL

I. INTRODUCCION

La glucosa es una fuente importante de energía para la mayoría de las células del cuerpo, incluidas las del cerebro.

La glucosa en sangre, proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos, y de origen endógeno, que proviene del hígado por glucogenólisis. Por otra parte, hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina, por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo.

Diversos factores que inciden sobre la absorción, producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma, contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. En el caso del hígado, el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva, siendo el hepatocito permeable para este metabolito. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión, sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada, en particular en el tejido adiposo, el corazón y el músculo esquelético.

El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. Este proceso, por ello, se llama cotransporte, y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. En este caso la glucosa entra en la célula, posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. A su vez, el sodio, por la bomba de sodio y potasio, volvería a salir de la célula. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que, al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro.

El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento.

La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y postprandial, por el método de Glucosa oxidasa; tanto en personas normales como en casos patológicos.

II. REACTIVOS A UTILIZAR- Estándar: Solución de glucosa 1 g/l- GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml).- Reactivo 4- AF: Solución de 4 – aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92

mol/l. - Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l.- Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada, 50 partes

de Reactivo 4- AF, 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1,000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. Mezclar por inversión sin agitar. Rotular y fechar.

III. PROCEDIMIENTOSe tomarán dos muestras de sangre :

La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra.

La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora, como máximo, después de la ingesta alimenticia.

En esos momentos, se extraerán 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodérmica de 10 ml. y con aguja N° 20.

Colocar las muestras en tubos de ensayo, se deja reposar 10 minutos, luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. Separar el suero.

La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. Utilizar 4 tubos de ensayo:

B (Blanco), Dpre. (Desconocido preprandial) y Dpost. (Desconocido post prandial), colocar:

COMPONENTES B Dpre. Dpost.StandardMuestra (suero preprandial)Muestra (suero postprandial)Reactivo de trabajo

---------------1 ml

-----10 ul-----1 ml

----------

10 ul1 ml

Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC

Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco.

Cálculo de los resultados :1.00 g/l

Glucosa (g/l) = D x f donde f = -------------

Sy D = Dpre. y Dpost.

F= 311

IV. RESULTADOS

Las lecturas del espectrofotómetro a 505nm resultantes fueron:

TUBO DE ENSAYO LECTURA DEL ESPECTROFOTÓMETRO

Basal 0.096 nmDpre 0.751 nmDpost 0.990 nm

Cálculo de la concentración de glucosa

TUBO DE ENSAYO GLUCOSA (g/L)Basal 29.856Dpre 203.705Dpost 278.034

La glucosa pre-prandial hace referencia a las concentraciones de glucosa en sangre en ayunas. La persona a quien se le extrajo la muestra mantenía entre 4- 8 horas de ayuno.

La glucemia postprandial hace referencia a las concentraciones de glucosa en sangre después de comer. Los niveles de glucosa empiezan a aumentar a los 10 minutos tras el comienzo de una comida, como resultado de la absorción de los carbohidratos de la dieta.

En los resultados podemos observar que los valores de glucosa pre y postprandial son mayores a los valores normales. Por lo que se puede presumir que la muestra de sangre obtenida puede proceder de una persona diabética.

V. CUESTIONARIO

1. ¿Actualmente, cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores, que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa.

Si le hicieron un examen de glucemia en ayunas, un nivel entre 70 y 100 miligramos se considera normal.Si le hicieron un examen de glucemia aleatorio, los resultados normales dependen de cuándo fue la última vez que comió. La mayoría de las veces, los niveles de glucemia estarán por debajo de 125 mg/dL.

El término de intolerancia hidrocarbonada o intolerancia anormal a la glucosa se aplica a aquellos individuos que mantienen niveles de glucemia superiores a los aceptados como normales, pero inferiores a los considerados diagnósticos para la diabetes. (1)

VARIACIONES EN LOS VALORES (2)

2. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar.La concentración de glucosa en sangre arterial es más elevada que en sangre venosa debido al consumo de glucosa por parte de las células. En ayunas estas diferencias son del orden de 0.10 – 0.25 mmol/L, pero después de la ingestión de alimentos puede ser de hasta 0.80 mmol/L. (3)

3. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamentoClásicamente se han clasificado los métodos de determinación de la glucosa en 3 apartados diferentes:

Métodos que dependen del poder reductor de la glucosa. Métodos químicos. Métodos enzimáticos.

Actualmente, los 2 primeros se encuentran obsoletos. Los métodos enzimáticos consiguen una gran especificidad, ya que utilizan enzimas purificadoras que actúan selectivamente sobre la molécula de glucosa. (1)

Ejemplos de algunos métodos:

o Método de la glucosa hexocinasaEs el método más específico para la determinación de glucosa. Este procedimiento enzimático utiliza dos enzimas de gran especificidad: la hexocinasa y la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.

El NADH formado como consecuencia de la acción de la deshidrogenasa, se mide por el incremento de la absorbancia a 340nm, el cual es directamente proporcional a la concentración de glucosa en la muestra. Este procedimiento, denominado técnica de la hexocinasa, se ha utilizado para determinar glucosa en diversos líquidos biológicos (sangre, orina, LCR, pleurales, ascíticos, etc) mostrando una excelente correlación con el método de la glucosa oxidasa. (1)

o Método de la O – toluidinaSe basa en la condensación de azucares reductores con orto-toluidina en un medio de ácido acético glacial produciéndose en cromógeno. El color formado se mide mediante un espectrofotómetro a 630nm, siendo la intensidad de color de la solución directamente proporcional a la cantidad de glucosa existente en la misma. Se trata de un método en desuso, entre otras razones por que emplea reactivos corrosivos, no es posible automatizarla, la o-toluidina es potencialmente cancerígena y está sujeto a muchas interferencias. (4)

4. ¿Cuál son los criterios bioquímicos, relacionados con la glicemia, para el diagnóstico de diabetes mellitus?

El diagnóstico de diabetes se puede realizar de tres formas diferentes. • Síntomas de diabetes + una determinación de glucemia al azar > 200

mg/dl en cualquier momento del día.

• Glucemia en ayunas > 126 mg/dl. Debe ser en ayunas de al menos 8 horas.• Glucemia mayor de 200 mg/dl a las 2 horas de una sobrecarga oral de

glucosa. (La sobrecarga oral de glucosa debe seguir las normas de la Organización Mundial de la Salud)

Para realizar el diagnóstico sólo se precisa uno de los puntos, pero en ausencia de hiperglucemia inequívoca, estos criterios deben ser confirmados repitiendo alguno de ellos otro día. (5)

5. ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar?

Las hormonas como la insulina disminuyen la hiperglicemia, actúa después de comer; el glucagón aumenta la concentración de glucosa en la sangre y actúa en ayuno; la adrenalina aumenta la concentración sanguínea de glucosa. La hiperglucemia se refiere a la cifra de glucosa en sangre mayor a 126mg. y clínicamente se caracteriza por la tríada de poliuria (orinar muchas veces), polidipsia (sed y tomar mucho líquido) y polifagia (comer mucho, tener hambre).

Los niveles de glucosa durante el trabajo o ejercicios físicos disminuye, agotando en primer lugar las reservas de glucosa que se encuentran en los músculos y luego las reservas hepáticas. Produciendo en un primer momento una hiperglucemia, ya que los músculos no logran consumir todo lo liberado por el hígado, pero que después logra regularizarse. La hipoglicemia (o hipoglucemia) es la cifra de glucosa en sangre menor a 80mg (o 70 según el laboratorio), pero que se manifiesta clínicamente como temblor, sudoración, palpitaciones o hambre, en casos leves. En casos graves aparecen alteraciones de la concentración, irritabilidad, visión borrosa, letargo y coma.

En la menstruación para algunas mujeres los cambios cíclicos de estrógenos y progesterona provocan graves alteraciones en los niveles de glucemia antes, durante y después de la menstruación. (En esa fase, para algunas mujeres los niveles de glucemia son elevados y para otras, por el contrario, son bajos)

BIBLIOGRAFÍA

1. Portillo JD, Barrio MTF del, Salido FP. Aspectos básicos de bioquímica clínica. Ediciones Díaz de Santos; 1997. 308 p.

2. Bastarrachea RA, Laviada Molina H, Vázquez Chávez C. Análisis crítico de los nuevos criterios que sustentan el diagnóstico de pre-diabetes. Rev Endocrinol Nutr. 2004; 12(2):90–6.

3. Arderiu XF. Bioquímica clínica y patología molecular. Reverte; 1998. 556 p.

4. Doria GAGG, Nelsy Loango Chamorro, Clara María Mejía. Laboratorio de Bioquímica: Una Visión Práctica. ELIZCOM S.A.S; 159 p.

5. Calagua-Quispe M, Falen-Boggio J, Del Águila-Villar C, Lu-de Lama R, Rojas-Gabulli MI. Características clínicas y bioquímicas de la diabetes mellitus tipo 2 (DMt2) en el Instituto Nacional de Salud del Niño. An Fac Med. 2012 Apr; 73(2):141–6.

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

I. INTRODUCCIÓNLa glucosa es el azúcar que el cuerpo utiliza como energía. Los pacientes que padecen de diabetes no tratada tienen niveles altos de azúcar en la sangre. Las pruebas de tolerancia a la glucosa son una de las herramientas empleadas para diagnosticar la diabetes.

Un nivel de glucosa en la sangre por encima de lo normal se puede utilizar para diagnosticar diabetes tipo 2 o niveles altos de glucosa en la sangre durante el embarazo (diabetes gestacional). También se puede medir el nivel de insulina, la hormona producida por el páncreas, que transporta la glucosa desde la sangre hasta las células.

La prueba de tolerancia a la glucosa oral se utiliza para evaluar a las mujeres embarazadas en busca de diabetes gestacional entre las semanas 24 y 28 del embarazo. También se puede utilizar cuando se sospecha la enfermedad, aunque la glucemia en ayunas sea normal.

II. REACTIVOS A UTILIZAR- Estándar: Solución de glucosa 1 g/l- GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml).- Reactivo 4- AF: Solución de 4 – aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92

mol/l. - Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l.- Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada, 50 partes

de Reactivo 4- AF, 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1,000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. Mezclar por inversión sin agitar. Rotular y fechar.

III. PROCEDIMIENTOSe tomarán dos muestras de sangre :

La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra.

La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora, como máximo, después de la ingesta alimenticia.

En esos momentos, se extraerán 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodérmica de 10 ml. y con aguja N° 20.

Colocar las muestras en tubos de ensayo, se deja reposar 10 minutos, luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. Separar el suero.

La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. Utilizar 4 tubos de ensayo:

COMPONENTES B S Dpre. Dpost.StandardMuestra (suero preprandial)Muestra (suero postprandial)Reactivo de trabajo

---------------1 ml

10 ul----------1 ml

-----10 ul-----1 ml

----------

10 ul1 ml

IV. RESULTADOS

Las lecturas del espectrofotómetro a 505nm resultantes fueron:

Basal: 0,03Blanco: 0,2130 min: 0,441 hora: 0.372 horas: 0.36

Ahora hallaremos f:

Para el pre-prandial:

Glucosa (g/l) = (D-B)*f = (0.21-0.03)x 330 = 59.4 mg/dl

Para el post-prandial:

Después de 30 minGlucosa (g/l) = (D-B)*f = (0.44-0.03)x 330 = 135.3 mg/dl

Después de 1 horaGlucosa (g/l) = (D-B)*f = (0.37-0.03)x 330 = 112.2 mg/dl

Después de 2 horasGlucosa (g/l) = (D-B)*f = (0.36-0.03)x 330 = 108.9 mg/dl

f= 330

V. DISCUSIÓNLos valores sanguíneos normales para una prueba de tolerancia a la glucosa oral con 75 gramos, utilizada para detectar diabetes tipo 2 en personas que no estén embarazadas:

Ayunas: 60 a 100 mg/dL1 hora: menos de 200 mg/dL2 horas: menos de 140 mg/dL

Los resultados obtenidos en la práctica se encuentran dentro de los valores sanguíneos normales para la prueba.