Guia Bioquimica-2015

8/17/2019 Guia Bioquimica-2015

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UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMATICA

Laboratorio de Bioquímica Bio!o"ía Mo!ecu!ar

#UIA DE $R%CTICAS

BIO&U'MICA IBIO&U'MICA I(E)cue!a $ro*e)io+a! de &uímica,(E)cue!a $ro*e)io+a! de &uímica,

AUTORES-

M". A+a I. F. #uti/rre0 Rom1+

M". Car!o) M. Sa+ta Cru0 Car2ioM". O)car $. No!a)co C1rde+a)

Lima – Perú

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Correo) de !o) autore)-

Mg. Milagros Quintana Cáceda milagros [email protected] Ana Gutiérrez Román: [email protected] Santa Cruz Carpio: [email protected] !olaso Cár"enas: [email protected]

I+troducci4+

Para la comprensin de la !ioqu"mica# acti$idad intelectual abierta con

limitaciones que establece el m%todo cient"fico# se requiere una actitud decuriosidad despierta para obser$ar hechos en condiciones e&perimentales.

'a capacidad de obtener informacin precisa al má&imo de e&actitud#registrar# ordenar y presentar los datos en forma comprensibles a los obser$adoresindependientes que tengan acceso a ellos es una habilidad que no se logra sino es por la práctica personal del e(ercicio.

)l costo# espacio y tiempo disponible han hecho imposible el dise*o de prácticas en paralelo con la teor"a. )s por ello que la mayor"a de las escuelas de!iolog"a de $anguardia en la educacin biolgica han reducido radicalmente el

tiempo dedicado al 'aboratorio de !ioqu"mica. +in embargo# la e&perienciadidáctica# nos indica que la práctica de e&perimentos elementales y sencillos#aplicados a la biolog"a# estimula el inter%s cient"fico de los estudiantes de!ioqu"mica.

'a presente ,u"a de Prácticas# tiene la finalidad de cumplir con lossiguientes Obeti;o) E)2ecí*ico)-

1. )(ercitar a los alumnos en el m%todo cient"fico mediante el mane(o de t%cnicasgenerales y sencillas# aplicables a mltiples problemas particulares.

2. /esarrollar habilidad para programar e&perimentos# sistematizar el traba(o delaboratorio# manipular los equipos y realizar mediciones u obser$acionesrigurosas# as" como saber e&presar sus resultados.

0. Procurar el desarrollo de iniciati$a personal y de razonamiento lgico frente a problemas que se planteen# de tal modo que el alumno pueda realizar inno$aciones o $ariaciones en los m%todos de traba(o.

. /esarrollar el sentido de responsabilidad social para mane(ar los recursos

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mailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]


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humanos y materiales que inciden en su propia formacin.

. )&igir en forma intransigente una actitud de honestidad intelectual.

Por la naturaleza de las prácticas y para poder cumplir con sus ob(eti$os esimprescindible una participacin acti$a y personal tanto de alumnos como dedocentes.

#$% Ana &% '% Gutiérrez Román

#$% Carlos #% Santa Cruz Carpio

FCCNM – UNFV

Enero 2010

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$re2araci4+ de e62erime+to) re"i)tro de re)u!tado)

)l registro de los resultados de los e&perimentos es una parte esencial decualquier traba(o cient"fico. 'os e&perimentos de laboratorio son el fundamento de lashiptesis# teor"as# conocimientos cient"fico y tecnolog"a# y son intiles si no se

consigna por escrito la descripcin de lo que se ha hecho y obser$ado en tal formaque permita a cualquiera# con cierto conocimiento del asunto# que repita# compruebeo corri(a el traba(o realizado sin necesidad de gu"a especial.

'as anotaciones deben ser bre$es y muy claras3 se lle$arán en las páginas en blanco de esta gu"a# as" como las gráficas y calibraciones de los e&perimentos que lorequieran. +e harán inmediatamente despu%s de cada e&perimento sin confiar a lamemoria un momento más de lo necesario.

Para que los e&perimentos de laboratorio tengan $alor formati$o# se aprenda ahacer obser$aciones e&actas# se estimule la curiosidad y se desarrolle un sentido

cr"tico basado en los aspectos cuantitati$os de la ciencia es necesario que antes deiniciar el traba(o en el laboratorio-

♦se re$ise en te&tos# los principios fundamentales implicados♦se refle&ione y relacione con otros principios o hechos pre$iamente conocidos♦se estudie y comprenda bien las instrucciones del e&perimento antes de realizarlo

'a gu"a se conser$ará limpia y ordenada# para permitir la lectura fácil de lasanotaciones# que deben ser una descripcin completa y honesta de lo que ha $isto yecho. 4o es aceptable hacer anotaciones en borrador para despu%s pasarlo en limpio yconceder al aspecto est%tico un $alor que no merece.

5unque los e&perimentos que se harán# producen resultados pre$isibles por lasteor"as conocidas que de ellos se deri$an originalmente# cualquier resultadoimpre$isto# raro# o an absurdo debe anotarse y de ningn modo llenar el protocolocon lo 6que debi pasar7 pues ser"a una relacin completamente intil. 'os asientosfalsos o las omisiones no ense*an nada. +" en cambio# el análisis concienzudo de losresultados inesperados o contrarios a lo pre$isto# que pueden ser fuente de muchainformacin til para el desempe*o futuro en el laboratorio.

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Medida) de Se"uridad

8odos los accidentes personales por tri$iales que sean deben comunicarse al profesor encargado de la práctica.

'as sustancias que se utilizan# y las operaciones que se realizan en el laboratorio son potencialmente t&icas y peligrosas. 8raba(e con cuidado# atento a los e$entos que puedancomprometer la seguridad personal o colecti$a.

3. 9sar mandil# para proteger la ropa y el cuerpo

5. 4o fumar en el interior del laboratorio

7. 4o consumir alimentos# ni bebidas en el laboratorio

8. 4o utilizar la llama del mechero sin cerciorarse antes de que no haya cercal"quidos inflamables.

9. /iri(a la boca del tubo o matraz de reaccin# le(os de s" mismo y del $ecino# elcontenido puede proyectarse.

:. Con los l"quidos corrosi$os# ácidos y álcalis concentrados# o $enenosos# se debetener cuidado de no inhalar sus $apores y el contacto con cualquier parte del cuerpo.+i se tiene contacto accidentalmente# lá$ese de inmediato con abundante agua delca*o y a$ise al profesor.


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en(uagar con abundante agua

Acti;idad N3-Coordi+aci4+ *ormaci4+ de "ru2o)

)n esta acti$idad se organizarán los grupos de traba(o de acuerdo al horario y nmeroestablecido por la )PQ y de acuerdo a la asistencia de los alumnos# los integrantes semantendrán en su respecti$o grupo por todo el semestre acad%mico# serán responsables delcumplimiento de lo solicitado para el me(or desarrollo de las acti$idades programadas.

Acti;idad N5-ETRACCIN DE ADN

Introducción

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de quelos iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN,permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula !e empie"apor lisar #romper$ las células mediante un detergente, vaci%ndose sucontenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve elADN &n ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido derestos moleculares' A(N, carbohidratos, proteínas y otras sustancias enmenor proporción

Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado encadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente !ólo queda,por tanto, e"traer el ADN de esa me#cla de tampón y detergente

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración!e basa en la simultánea neutrali#ación de las cargas negati$as y deshidrataciónde la molécula, lo cual posibilita su agregación y precipitación

Objetivo

&l ob)etivo *undamental de esta pr%ctica es utili"ar unas sencillastécnicas para poder extraer el ADN

Materiales

• !olución de %loruro de sodio al & '

• Detergente no ionico al ('

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• Alcohol isopropílico frio

• %olorante a#ul de metileno

• ) $asos descartables plástico o de cristal limpios

Procedimiento

( *eber +sin tragar tres cucharadas de solución salina y remo$erla en la bocadurante un minuto

& De$ol$er la solución salina a un $aso +esto se hace para coger célulasepiteliales de la boca y así poder e"traer el ADN de ellas -.%/-DA-01. .! ADN de tus células y de las bacterias presentes en la boca

) Añadir un ml de la solución detergente a la solución que contiene las

células epiteliales e"traídas de nuestra mucosa bucal -emo$er despaciopara no hacer burbu2as +así rompemos las membranas celulares y podemose"traer el ADN de las mismas 3erter en un tubo unos 4 ml de este lisadocelular

5 .n un tubo por separado, me#clar los (ml de alcohol isopropílico frio contres gotas de a#ul de metileno

4 %on cuidado $erter la me#cla del alcohol y colorante en el tubo quecontiene el lisado celular, inclinando el tubo para que el alcohol genere unacapa sobre el lisado celular

6 .sperar 4 minutos y $er cómo se forman grumos y cadenas blancas

%omo el ADN no es soluble en alcohol, forma un sólido en la interfase de la capade alcohol y agua salada +donde las capas se 2untan La mayor parte de lascélulas epiteliales se $erán disueltas en el agua salada, mientras que las cadenasblancas serán miles de moléculas de ADN unidas unas contra la otra formandogrumos Las moléculas de ADN indi$iduales son demasiado pequeñas para ser $istas a simple $ista

A partir de la longitud enorme de las +bras, también se con+rma que enel ncleo el ADN se encuentra compactado

Nota importante .l producto filamentoso obtenido de esta e"tracción no es ADNpuro ya que, entreme#clado con él, hay fragmentos de A-N 1na e"tracción

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/e igual forma# si losl"quidos e&tracelulares sediluyen# se hacenhipotnicos respecto a lasc%lulas.

)l agua tiende a pasar al protoplasma y las c%lulasse hinchan y se $uel$enturgentes# pudiendoestallar :en el caso dec%lulas $egetales la paredde celulosa lo impedir"a#en el caso de los animales

puede producirse la lisis celular;# por un proceso de turgescencia.

+egn el medio en el que se encuentre la c%lula# la membrana de(ará pasar algunos solutos#modificando as" la turgencia de la c%lula.

Materia!e) Microscopio ptico

• 5gua destilada• 8ubos de ensayo• 5lgodn• ,radillas• Marcador de $idrio• +olucin hipotnica 4aCl B.B= M :B.0;

• +olucin hipertnica 4aCl al 2 y • 5zul de metileno• +olucin isotnica de 4aCl al B.A :suero fisiolgico;

/eberás traer de casa'anceta hematolgica• 0 ,oteros• Planta )lodea• Cebolla• !uscar el coeficiente de e&tincin molar de la hemoglobina

$rocedimie+to

Acti;idad N7- $rueba e+ c/!u!a) ;e"eta!e)

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3. )n cinco laminas numeradas coloque- DB. ml. de solucin hipotnica 4aCl B.BA DB. ml. de solucin hipotnica 4aCl B. DB.ml. de solucin isotnica de 4aCl al B.A :suero fisiolgico;DB. ml. de solucin de hipertnica 4aCl al 2

DB. ml. de solucin de hipertnica 4aCl al 5. Colocar una ho(a de )lodea en cada solucin y esperar 0 a min.7. Colocar una laminilla y obser$ar.

Eepetir con muestras de cebolla

Acti;idad N8- $rueba e+ c/!u!a) a+ima!e)

3 )n cinco tubos de ensayo numerados coloque- D1 ml. de solucin hipotnica 4aCl B.BA

D1 ml. de solucin hipotnica 4aCl B. D1 ml. de solucin isotnica de 4aCl al B.A :suero fisiolgico;D1 ml. de solucin de hipertnica 4aCl al 2

D1 ml. de solucin de hipertnica 4aCl al 5 btener unas gotas de sangre empleando la lanceta hematolgica en un tubo limpio

con heparina7 /e(ar caer 0 a gotas de sangre en cada uno de los tubos con un gotero :o directamente

de la puncin;.8 5gite los tubos y de(ar en reposo durante 2 0 minutos.9 Con un gotero coloque en una lámina portaob(eto una gota de cada uno de los tres

tubos.

: 'uego e&amine en el microscopio su aspecto. bser$ar qu% efecto ha tenido lasdistintas soluciones sobre la morfolog"a del eritrocito y e&plicar por qu%.< )stime la concentracin de hemoglobina al espectrofotmetro

Cue)tio+ario-1. /ibu(ar todo lo obser$ado en la práctica que pueda ser$irle para la discusin de sus

resultados.2. Fndique en que muestras se obser$- a; smosis b; /ifusin c; 8urgencia d;

Plasmlisis0. Mencione y dibu(e las diferencias encontradas en cada uno de los hue$os sometidos a

cada proceso.

. GQu% factores podr"an afectar la $elocidad de difusinH. /efina el mo$imiento !roIniano y como se relaciona con la difusinH=. /iferencie la pared celular de la c%lulas $egetales.

Bib!io"ra*ía-1. ..2. ..

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Acti;idad N9- C1!cu!o) e+ bioe+er"/tica

)n esta acti$idad tiene un carácter de dinámica peque*a de grupo# en ella se desarrollarán problemas para el cálculo de las $ariaciones de energ"a en un determinado proceso

biolgico# cada alumno deberá conseguir 1B problemas de esta temática los cuales seránintercambiados en clase discutidos y resueltos con la ayuda del profesor. 'os problemas podrán ser obtenidos de los te&tos de bioqu"mica que figuran en la bibliograf"a del sillabuso de páginas Iebs de internet.

Acti;idad N:- Meca+i)mo de acci4+ de! AT$ e+ !o)Or"a+i)mo) ;i;o)

)n esta sesin de seminario y discusin los alumnos buscaran art"culos recientes sobre elrol y el mecanismo de accin del 58P en un sistema biolgico# estos art"culos serán presentados y e&puestos por el alumno discutidos y e$aluados.

Acti;idad N


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Teoría

'os hetertrofos obtienen energ"a o&idando mol%culas orgánicas y acoplando lasreacciones de o&idacin a la s"ntesis de 58P. )l 58P es entonces usado para realizar reacciones metablicas necesarias para mantener la integridad f"sica del organismo ysustentar todas sus otras acti$idades.

5lgunos organismos son capaces de e&istir en ausencia de o&"geno molecular y pueden ser per(udicados por la presencia de este elemento. 'a respiracin anaerbica# enausencia de o&"geno es llamada fermentacin. Comienza con una sustancia rica en energ"acomo la glucosa# utiliza las enzimas de la gliclisis y finalmente produce etanol y anh"dridocarbnico o una mezcla de ácidos orgánicos y otros compuestos. Jay una ganancia neta desolamente dos mol%culas de 58P por cada mol%cula de glucosa o&idada en la fermentacin.

'as le$aduras son hongos eucariticos unicelulares comercialmente muyimportantes. )llas son necesarias para la produccin de cer$eza# $ino# pan y productosqu"micos industriales. )n este e&perimento se estudiará la produccin de C2 durante la

fermentacin de $arios carbohidratos por c%lulas de le$adura y el efecto del 2 en lafermentacin.

Cuando microorganismos facultati$os se están culti$ando anaerbicamente y see&ponen al o&"geno# hay una inhibicin de la fermentacin alcohlica y disminucin delconsumo de glucosa# esto es conocido como efecto Pasteur y refle(a el incremento derendimiento energ%tico obtenido por el metabolismo respiratorio de la glucosa comparadocon el obtenido por la fermentacin de la glucosa. Cuando se consume glucosaaerobiamente por cada mol o&idado se producen 0=K0? moles de 58P# por lo que seconsume menos glucosa que cuando se o&ida por la $"a anaerobia en la que solo se obtienen2 moles de 58P por mol de glucosa.

Ligura 41. /estino de la glucosa en condiciones aerobias :respiracin; o anaerobias :fermentacin;.

Materia!e) Reacti;o)-

1. Pipetas Pasteur 2. 8ubos de ensayo0. Pipetas graduadas

2. Parafilm0. 'e$adura. +acarosa 2

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-L./0!A

1#ADP2Pi$ 1A3P

&3AN0L


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. ,alactosa 2=. ,lucosa 2

>. 5lmidn 2

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E62erime+to I-

1. /ebe disponer de una gradilla# una piseta con agua destilada# seis tubos de ensayo# seis pipetas graduadas de 2 ml# seis pipetas Pasteur con bulbo y trozos de parafilm. Marque

los tubos 1# 2# 0# y . 'l%nelos del siguiente modo-8ubo 1 N 1.2 ml de glucosa :2 pK$;O 1.2 ml de suspensin de le$adura.8ubo 2 N 1.2 ml de sacarosa :2 pK$;O 1.2 ml de suspensin de le$adura.8ubo 0 N 1.2 ml de galactosa :2 pK$;O 1.2 ml de suspensin de le$adura.8ubo N 1.2 ml de almidn :2 pK$;O 1.2 ml de suspensin de le$adura.8ubo N 1.2 ml de agua O 1.2 ml de suspensin de le$adura.

2. Mezcle las soluciones. +elle el e&tremo inferior de una pipeta graduada con parafilm.0. 9sando la pipeta Pasteur llene completamente la pipeta graduada con la solucin del tubo

1 por el e&tremo superior.. Coloque sobre el e&tremo sin sellar de la pipeta graduada el tubo 1 in$ertido. Fn$ierta

luego todo el sistema cuidadosamente manteniendo (untos el tubo de ensayo y la pipeta.

Eepita el procedimiento con los demás tubos.. )l gas producido se acumulará en el e&tremo cerrado de la pipeta graduada.=. Eegistre el ni$el del gas en las pipetas cada 2 minutos por alrededor de 2B min.>. 5note los datos en una la tabla.

Minuto

Nivel de -as #ml$

Glucosa

Sacarosa

Galactosa

Almidón

Agua

02

468

101214161820

E62erime+to II-

3. Marque los tubos 1# 2# 0# y . 'l%nelos del siguiente modo-8ubo 1 N 1.2 ml de glucosa :2 pK$;O 1.2 ml de suspensin de le$adura.8ubo 2 N 1.2 ml de agua O 1.2 ml de suspensin de le$adura.8ubo 0 N 1.2 ml de glucosa :2 pK$;O 1.2 ml de agua

5. Mezcle las soluciones y colquelas en matraces de 2 ml. 5gite por 2B minutos.7. Liltre el contenido del tubo 1 :)&perimento F; y de los matraces 1 y 2 :)&perimento FF; y

usando el m%todo enzimático determine la cantidad de glucosa presente.

Absorbancia [Glucosa


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!ubo 1

Matra# 1

Matra# 2

Matra# $

/iscuta sus resultados

Cue)tio+ario

1. G)l tipo de carbohidrato fermentado afecta la tasa formacin de gasH

2. GQu% tipo de carbohidrato sustent la tasa más rápida de fermentacinH GPor qu%H

0. GQu% mol%cula es desdoblada en la reaccin que produce el C2H

. GPor qu% es $enta(oso para un organismo realizar fermentacinH

. Cuando el carbohidrato es fermentado por la le$adura# slo un tercio de los carbonos sonliberados en forma de C2. )l resto del carbono es liberado como mol%culasde.....................

Acti;idad N= $rimer e61me+ de 2ractica

Acti;idad N>- Medida de !a ;e!ocidad i+icia!.


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OBETIVOS-

a, )$aluacin de la acti$idad de la amilasa sali$alb, /efinir las condiciones del sistema enzimático y medir la acti$idad enzimática

:$elocidad inicial;.

TEOR'A-

'a presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparicin del substrato o aparicindel producto de la reaccin. Para ello la enzima es incubada con el substrato ba(o condicionescuidadosamente controladas y se sacan al"cuotas a inter$alos de tiempo para ser analizadas. /ebeconsiderarse además controles para corregir los errores que se presentan debido a reacciones qu"micasespontáneas no espec"ficas ni catalizadas por la enzima.

'a amilasa es la enzima responsable de la hidrlisis del almidn# tanto su acti$idad como la presencia de sus transcriptos está asociada a este polisacarido. uhn# en 1A2 demostr la presenciade dos amilasas- la alfa amilasa )c 0.2.1.1 y la beta amilasa 0.2.1.2. 'a alfa amilasa hidroliza losenlaces alfa 1D pero no puede hidrolizar los enlaces alfa 1D= de las cadenas ramificadas de laamilopectina# por lo que se requiere de la enzima desramificadora para la hidrlisis completa delalmidn.

)l estudio in $itro implica# sin embargo# aislar y purificar aunque sea parcialmente laenzima y posteriormente analizar indi$idualmente las $ariables que influyen en su acti$idad. Paratodo este proceso es indispensable fi(ar inicialmente en forma tentati$a las condicionese&perimentales en que se realizará el ensayo enzimático# tomando en consideracin todos losconocimientos generales que se tienen sobre la naturaleza de las enzimas y aquellos hechos particulares que nos permiten suponer algunas cualidades o requerimientos especiales de la enzima enestudio. /e este modo se debe elegir un pJ# una temperatura y un tiempo de incubacin compatiblecon la naturaleza proteica de la enzima# condiciones que deben ser en lo posible lo más seme(antes alas del medio en el cual la enzima acta in $i$o. 5demás se debe procurar que las concentracionesde la solucin amortiguadora del pJ que se use en el medio de incubacin# garanticen la estabilidaddel pJ elegido durante el lapso de obser$acin y que la concentracin del substrato sea losuficientemente alta para mantener la saturacin de la enzima# mientras dure el e&perimento.

9n m%todo para la determinacin cuantitati$a de la acti$idad de la amilasa es el amiloclasicoiodometrico. )n este m%todo el sustrato# almidn tamponado# se incuba con la muestra produci%ndosela hidrlisis enzimática. )ste se detiene al agregar el reacti$o de yodo. 'a disminucin de color respecto a un sustrato sin muestra permitirá medir la acti$idad enzimática.

'a 9nidad 5milol"tica :95; es la cantidad de enzima contenida en 1BB ml de muestra# que puedehidrolizar 1B mg de almidn en 0B minutos#

MATERIALES REACTIVOS-

1. +olucin de +ustrato almidn BBmgK'# en buffer fosfato B.1 M y 4aClB.1 M :pJ >;

2. Eeacti$o de yodo B.B1 eqK' de Rodoen JCl B.B2M

0. )nzima amilasa. 8ubos de prueba y pipetas. Centr"fuga cl"nica=. )spectrofotmetro o fotocolor"metro>. !a*o de mar"a a 0>SC.

$ROCEDIMIENTO-

La 2re)e+cia de u+a e+0ima )e demue)tra )i"uie+do !a de)a2arici4+ de! )ub)trato o !a

a2arici4+ de! 2roducto de !a reacci4+. Para ello la enzima es incubada con el substrato ba(ocondiciones cuidadosamente controladas y se sacan al"cuotas a inter$alos de tiempo para ser


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analizadas. /ebe considerarse además controles para corregir los errores que se presentandebido a reacciones qu"micas espontáneas no espec"ficas ni catalizadas por la enzima.

Reacti;o) 3 5

5gua /estilada :m'; B.B1 DDD+ubstrato :m'; B. B. Incubar a 37 °C por 5 min

)nzima :m'; DDD B.B1

♦ Fnmediatamente mezcle e incube a 0> SC por >. min♦ 5gregar # de solucin re$eladora♦ 'eer al espectro a =Bnm

)n esta t%cnica se incuban 1B Tl de muestra con B.2 mg de almidn contenidos en B. ml desolucin de sustrato durante > minutos y medio# lo que equi$ale a incubar 1BB ml de muestra

con 1B BBB mg de almidn durante 0B minutos. +i todo el almidn fuera hidrolizado# la acti$idadamilásica de la muestra ser"a de 1BBB 95Kdl. Para obtener las unidades de acti$idad amilásica# lafraccin de almidn digerido se multiplica por 1BBB.

1BBB;1:

;2:;1:K ∗

−=

Tuboa Absorbanci

Tuboa AbsorbanciTuboa Absorbanci! UA Ami!asa

CUESTIONARIO-1. GCuál es la acti$idad de la muestra analizadaH2. 'a acti$idad de la amilasa es directamente proporcional al $olumen empleadoH +i no es

as" que cantidad describe me(or la cantidad de enzima presenteH

0. )n relacin al almidn defina los t%rminos gelatinizacin# licuefaccin# sacarificacin. )n que se diferencian las enzimas amilasas y que or"genes tienenH. Qu% reaccin catalizan las amiloglucosidasas y cuál es su origenH

Acti;idad N3?- Ci+/tica e+0im1tica.

OBETIVO-

a, Conocer como la concentracin de substrato puede modificar la $elocidad de reacciny calcular la constante de Michaelis de una enzima.

TEOR'A.G+i se analiza la influencia de la concentracin del substrato# manteniendo la

concentracin de la enzima constante# y se dibu(a una gráfica con los resultados# se obtieneuna hip%rbola rectangular. )sta cur$a está e&presada matemáticamente por la ecuacin deMichaelis-

Uma& Uma& + $ N DDDDDDDDDDDDDD $ N DDDDDDDDDDDDD

1 O m. K + + O m.donde ; es la $elocidad de la reaccin# Vma6 es la $elocidad má&ima# S es la concentracinmolar de substrato y Hm. es una constante equi$alente a la concentracin de substrato con la

que se obtiene la mitad de $elocidad má&ima. +uele usarse la e&presin de 'ineIea$erD!urV#que es la reciproca de la ecuacin de Michaelis y da una l"nea recta.


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1 m. 1 1 DDD N DDDDDDD . DDDD O DDDD

$ Uma& + U

MATERIALES REACTIVOS-1. +olucin de +ustrato almidn BB

mgK'# en buffer fosfato B.1 M y 4aClB.1 M :pJ >;

2. Eeacti$o de yodo B.B1 eqK' de Rodoen JCl B.B2M

0. )nzima amilasa. 8ubos de prueba y pipetas. Centr"fuga cl"nica=. )spectrofotmetro o fotocolor"metro>. !a*o de mar"a a 0> SC

$ROCEDIMIENTO+e montará el siguiente set de traba(o-

Reacti;o)1:Eeaccin

enzimatica;

2:Eeaccin

enzimatica;

0:Eeaccin

enzimatica;

:Eeaccin

enzimatica;

:Eeaccin

enzimatica;J2d :m'; B. B.0 B.2 B.1 DDD+ubstrato :m'; B.1 B.2 B.0 B. B.)nzima :m'; B.B1 B.B1 B.B1 B.B1 B.B1

♦Para cada tubo de reaccin deberá hacerse un tubo blanco enzimático :sin enzima;♦)l blanco para el espectrofotmetro se realizará mezclando B.m' de agua con .m'

de solucin de lugol.♦ Fnmediatamente mezcle e incube a 0> C por >. min♦ 5gregar # m' de solucin re$eladora♦'eer al espectro a =Bnm

Acti;idad N33- *actore) que a*ecta+ !a ;e!ocidade+0im1tica.

E62erime+to I.G Co+ce+traci4+ de !a E+0ima

OBETIVO-

a, Conocer como la concentracin de la enzima puede modificar la $elocidad de

reaccin.

$ROCEDIMIENTO+e montará el siguiente set de traba(o

Reacti;o)1:Eeaccinenzimatica;

2:Eeaccinenzimatica;


:Eeaccinenzimatica;

:Eeaccinenzimatica;

J2d :m'; B. B.0 B.2 B.1 DDD+ubstrato :m'; B. B. B. B. B.)nzima :m'; B.1 B.2 B.0 B. B.

♦

/eberá hacerse un tubo blanco enzimático :sin enzima;♦)l blanco para el espectrofotmetro se realizará mezclando B.m' de agua con .m'


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OBETIVO-

a, Conocer como la $ariacin de temperatura puede modificar la $elocidad de reaccin.

$ROCEDIMIENTO

+e montará el siguiente set de traba(o

Reacti;o)1:Eeaccinenzimatica;



:Eeaccinenzimatica;

+ubstrato :m'; B. B. B. B.)nzima :m'; B.B1 B.B1 B.B1 B.B18)MP)E589E5 Sobre ie!o Ambie+te 7< C :? C

♦Deber1 acer)e u+ tubo b!a+co e+0im1tico ()i+ e+0ima,♦E! b!a+co 2ara e! e)2ectro*otometro )e rea!i0ar1 me0c!a+do ?.9mL de a"ua co+

8.9mL de )o!uci4+ de !u"o!.♦ I+mediatame+te me0c!e e i+cube a 7< C 2or


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a, 9sar el azul de metileno como indicador del proceso de o&idacin# es decir comoaceptor final de hidrgenos.

b, /eterminar la acti$idad )nzimática de la +ucc"nico /eshidrogenasa# en un e&tracto deh"gado# ri*n o corazn.

c, )studiar algunos factores que afectan el transporte de electrones# siguiendo esta $"a.

Teoría.G

'a +ucc"nico /eshidrogenasa cataliza la o&idacin del ácido +ucc"nico a ácido Lumárico.

JC D CJ2 D CJ2 D CJ XNNNY JC D CJ N CJ D CJ O 2JO

'a +ucc"nico /eshidrogenasa es una fla$oprote"na que no requiere coenzimanicotinamida y que se encuentra en las mitocondrias. 5demás de formar parte del ciclo derebs es capaz de reducir directamente a la coenzima Q de la cadena respiratoria. )saltamente espec"fica para el ácido succ"nico y es inhibida competiti$amente por numerososácidos dicarbo&"licos# en especial# málico y o&aloac%tico. )s una t"pica enzima D+J3

inhibida no competiti$amente por arsenicales tri$alentes# monoyodoacetato# metales pesadosy an por el o&"geno. )stos inhibidores o&idan los grupos sulfihidrilos o forman compuestosco$alentes con ellos :5smercapturos# deri$ados +Dalquilos# sales de metales pesados;.

Fu+dame+to.G )l azul de metileno es un pigmento de color azul que se decolora alreducirse. )l 45/J2 puede reducirlo debido a la presencia en el e&tracto de te(ido de unadiaforasa# que es una fla$oprote"na capaz de catalizar esa reaccin y corresponde al 'ipoato/eshidrogenasa3 el potencial redo& del azul de metileno es O B.B11 $oltios.

'a reaccin deben hacerse en anaerobiosis# pues el azul de metileno reducido esautoo&idable# es decir# puede ser o&idado espontáneamente por medio del o&"geno molecular.

Para conseguir la anaerobiosis se utilizan los tubos de 8humberg# en los cuales se puedehacer fácilmente el $ac"o y reemplazar el aire por un gas inerte :nitrgeno;. 9na anaerobiosisrelati$a se puede conseguir mediante una capa de $aselina l"quida# que a"sla el medio deincubacin del aire.

Materia!e) Reacti;o)-

3. Losfato de sodio B.1 M a pJ >.B5. +uccinato de sodio B.1B M7. Malonato de sodio B.1B M

8. 5zul de metileno B.B2 9. Cianuro de potasio B.B? M:. Cloruro de mercurio B.1B M


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c. Moler hasta obtener una pasta fina y agregar otros m'. de fosfato. /e(ar esta mezclaa la temperatura ambiente por unos 1 minutos# re$ol$iendo de $ez en cuando paradestruir substratos endgenos.

d. Uaciar el contenido a un tubo de centrifuga y centrifugar a ba(a $elocidad duranteunos minutos para sedimentar la arena# ncleos y c%lulas enteras que haya quedado

sin destruir. Conser$ar en hielo el sobrenadante.

5. E+)ao de !a Succí+ico De)idro"e+a)a.G /eterminar la acti$idad de la +ucc"nico/eshidrogenasa# usando los controles adecuados para un sistema completo- +uccinato desodio B.B2B M3 azul de metileno B.BB3 1.B m' de preparacin enzimática para un$olumen final de la mezcla de .B m'. )s recomendable colocar los componentes en elorden indicado. Fnmediatamente despu%s de colocar el sistema# mezclar y agregar apro&imadamente 2.B m' de $aselina l"quida al tubo# no usar pipeta.

'a acti$idad enzimática se reconocer por la decoloracin del azul de metileno. Cada grupode traba(o dise*ará sus propios e&perimentos# que permitan responderlas preguntas que se

han formulado con respecto a los blancos necesarios y a los factores que puedan influir enla reaccin.

Cue)tio+ario

1. )scriba la ecuacin del azul de metileno2. 9se la magnitud de decoloracin del azul de metileno como "ndice de la acti$idad

enzimática. )$ale semi D cuantitati$amente el efecto de los di$ersos factores estudiados.0. GQu% significado energ%tico para la fosforilacin o&idati$a tiene el hecho de que la

/eshidrogenasa +ucc"nico no requiere 45/H. GQu% diferencias e&isten entre acti$idad succ"nico deshidrogenasa y succ"nico o&idasaH. GCuál es el fundamento del m%todo manom%trico de WarburgH GCmo se podr"a medir la

respiracin de un te(ido mediante el m%todo de WarburgH=. Mencione tres enzimas fla$"nicas# indicando las reacciones que catalizan.>. GCuál es la caracter"stica espectrofotom%trica que permite distinguir al 45/ reducido del

o&idadoH?. GQu% efecto tiene el C4 sobre la succ"nico deshidrogenasaH GCmo lo demostrar"aH

$r1ctica N38- Foto)í+te)i)OBETIVO-

a; bser$ar y )$aluar la 8asa Lotosint%tica.

TEOR'A

'a fotos"ntesis es el proceso biolgico mediante el cual las plantas y losmicroorganismos fotosintetizadores obtienen biomasa. !ásicamente está constituida por una

fase de transduccin de energ"a y otra fase de s"ntesis. 'a ecuacin general de la fotos"ntesises- =C2 O =J2 Z C=J12= O=2 .


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'a tasa de fotos"ntesis se puede obtener midiendo la cantidad de o&"geno producido por unidades de tiempo. 'a tasa fotosint%tica por lo tanto se puede entender como la$elocidad de produccin de o&"geno dada por la siguiente ecuacin-

U2N :Uol 2;Kt

donde U2 es la $elocidad o tasa de fotos"ntesis# Uol 2 es el $olumen de o&igeno producido y t es el tiempo.

/ebido a que las burbu(as de 2 son de tama*o y formas regulares y además es proporcional al Uol 2# se puede cuantificar la U2 por medio de la ecuacin#

U2N :4S burbu(as 2;Kt.

'a tasa de fotos"ntesis es dependiente de la intensidad de luz# de la temperatura# de laconcentracin de C2 y de la composicin qu"mica del agua en el caso de una plantaacuática.

MATERIAL REACTIVOS

3. E!oea sp. u otra planta acuática.5. 5gua destilada7. Luente de luz.8. Cronmetro

9. 2 frascos de boca ancha:. 2 embudos de $idrio Watts

$ROCEDIMIENTO

3. Preparar frascos con agua destilada.5. Colocar en estos frascos la elodea o planta acuática ba(o el embudo y sumergir

dentro del frasco.7. 'lena el tubo de ensayo con agua e in$i%rtelo sobre el $ástago del embudo#

procurando que no se derrame.8. Eepite los pasos descritos en el otro frasco obteniendo 2 monta(es similares9. Flumina cada frasco con un foco distinto:. )spera unos 1 minutos y mide con una regla el espacio $ac"o que queda en el

tubo de ensayo. Jasta aqu" obtenemos la cantidad de 2 en $olumen.. Medir la tasa de fotos"ntesis cronometrando el nmero de burbu(as de o&"geno

producidas por cada 1B segundos durante 1BB y 12B segundos.3?. bser$a durante una hora lo que pasa en ambos frascos33. 5nota la cantidad de burbu(as que se desprenden cada minuto y mide nue$amente

el espacio $ac"o en el tubo de ensayo35. /ise*a una tabla de datos que resuma los resultados y colocar en una ho(a decálculos.

CUESTIONARIO3. 5note sus resultados y e&plique.


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Bib!io"ra*ía

Teoría

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Guia Bioquimica-2015

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