INGENIERÍA GENÉTICA 2010

CURSO PRÁCTICO

PROFESORES

Sergio Lobos Camus

Daniela Seelenfreund Hirsch

AYUDANTES:

Camila Valenzuela Montenegro

Catalina Salinas Luypaert

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

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PRESENTACIÓN

Este curso práctico se desarrollará durante una semana en forma intensiva y comprenderá los experimentos y estrategias más directas con el propósito del clonamiento de un gen eucariótico en una bacteria. Los organismos eucariótico modelos de este práctico son las plantas Broussonetia papyrifera y Morus alba. Los experimentos se desarrollarán en un orden lógico utilizando técnicas de biología molecular que se aplican en cualquier laboratorio de investigación moderno.

El objetivo de este curso práctico consiste en familiarizar a los alumnos con la tecnología básica necesaria para manipular ácidos nucleicos, incluyendo tanto el fundamento como las aplicaciones de las técnicas químicas, bioquímicas y genéticas empleadas en ingeniería genética. Diariamente, al inicio del trabajo práctico, se discutirá respecto a los procedimientos experimentales y se integrarán y analizarán los resultados. En este manual se han incluido solamente los protocolos pertinentes al trabajo que se realizará.

Se trabajará en grupos de dos estudiantes y todos los grupos realizarán un serie de experimentos en un orden lógico destinados al clonamiento de un gen eucariótico en la cepa Escherichia coli DH5α. Cada grupo recibirá una muestra de hoja molida de B. papyrifera o M. alba y posteriormente dos parejas de partidores para PCR. Se distribuirán en forma aleatoria la especie de planta a trabajar entre los grupos participantes del curso.

Al término del curso cada grupo deberá confeccionar un Informe a la manera de un manuscrito científico o “paper”, el cual se evaluará con una nota equivalente al 30% de la nota final del curso de Ingeniería Genética.

Fechas y horario: El curso práctico se desarrollará en la sala de trabajos prácticos (VM) desde el Lunes 29 de Noviembre al Viernes 3 de Diciembre del presente año. El curso comenzará diariamente a las 9:30 Hrs y concluirá a la hora en que los diferentes grupos logren cumplir con los experimentos planificados.

Grupo: ……………………….

Integrantes: ………………………………………………………………….

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EXPERIMENTO Nº1

Extracción de DNA de hojas de Broussonetia papyrifera o Morus alba. Unidad de Biotecnología INIA-CRI La Platina

Protocolo de Microextracción de DNA de Vides (Adaptado de Lodhi et al., 1994)

El protocolo consta de las siguientes etapas: 1.- Pesar 0,1 g de tejido vegetal. Utilizar una hoja pequeña, bien formada pero no madura. 2.- Moler en mortero con hielo seco, evitar que se descongele el material vegetal. Moler con pequeños golpecitos, evitando “desgarrar” el tejido 3.- Agregar 0,7 ml de buffer de extracción (con β-mercaptoetanol), 10 mg de PVP (40K) y homogeneizar. Usar tubos de centrífuga de 1,5 ml.. 4.- Incubar a 60°C por 25 minutos y enfriar a temperatura ambiente. 5.- Agregar 0,6 ml de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y mezclar suavemente por inversión. 6.- Centrifugar a 6.000 rpm por 15 minutos. 7.- Transferir el sobrenadante a otro tubo, midiendo el volumen (0,45 ml). 8.- Agregar ½ volumen de NaCl 5M (0,225 ml) y mezclar. 9.- Agregar 2 volúmenes de etanol absoluto a –20 °C (0,9 ml) y mezclar. 10.- Dejar en reposo por 30 min. o más a 4°C; Si se forman hebras de ADN, dejar a temperatura ambiente y centrifugar. 11.- Centrifugar a 3.000 rpm por 3 min. y luego a 6.000 rpm por otros 3 min. a temperatura ambiente. 12.- Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 76% a 4°C, 0,5 ml a cada tubo. 13.- Secar el pellet. 14.- Resuspender el pellet en 100 microlitros de buffer TE o agua destilada conteniendo RNAsa, e incubar a 37°C por 15 minutos. Alternativa: Incubar 30 min. a 37°C más 15 min. a 42°C. El pellet se resuspende solo en la incubación, así disminuye manipulación del DNA. 15.- Revisar el DNA obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%.

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Soluciones 1.- Buffer de Extracción Reactivo Concentración Ej. 500 ml Solución Además EDTA 20 mM 3,7224 g Tris-HCl 100 mM 6,055 g Llevar a pH 8,0 NaCl 1,4 M 40,908 g CTAB 2,0 % 10 g Disolver aparte,después

agregar a la solución β-mercaptoetanol 1 % Sólo antes de usar

200μl en 100 ml solución 40μl en 20 ml solución 30μl en 15 ml solución 60μl en 30 ml solución

pH final 8,0 2.- Cloroformo-alcohol isoamílico 24:1 3.- Buffer TE Reactivo Concentración Además Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM Ajustar a pH 8,0 4.- TE o agua/ RNAsa A Usar 1 μl de RNAsa (solución stock a 10mg/μl) por cada 100 μl de solución de resuspensión. Concentración final de la RNAsa: 0,1 mg/μl. 5.- NaCl 5M Para solución de 200 ml, pesar 58, 44 g. 6.- Etanol 76% Para solución de 40 ml, usar 30,4 ml de etanol absoluto.

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EXPERIMENTO Nº 2

Electroforesis de DNA en Gel de Agarosa.

1) Diluya el amortiguador concentrado TBE 5X a TBE 0,5X con agua destilada, para preparar su amortiguador de electroforesis.

2) Agregue la cantidad apropiada de agarosa al TBE 0,5X en un matraz Pyrex. (Por ejemplo, use 0,8 g de agarosa en 100 mL de TBE 0,5X para un gel al 0,8% de agarosa).

3) Disuelva la agarosa por ebullición a baño maría o durante algunos minutos en un horno a microondas. No sobrecaliente. Utilice guantes protectores para tomar el matraz y agite de vez en cuando verificando la completa disolución de la agarosa. NO CIERRRE TOTALMENTE LA TAPA DEL MATRAZ. SI SE CALIENTA EL MATRAZ CERRADO HERMÉTICAMENTE ESTE PUEDE ESTALLAR PROVOCANDO QUEMADURAS GRAVES.

4) Permita que la agarosa se enfríe a una temperatura de alrededor de 55ºC antes de hacer el gel (Se puede mantener contacto con la mano). Tape los lados del portagel con huincha adhesiva e inserte la peineta. Suavemente vierta la cantidad adecuada de agarosa en el portagel. Asegúrese de que no queden burbujas.

5) Deje que la agarosa solidifique (generalmente 20-30 min). 6) Remueva la huincha adhesiva del portagel y deposite el gel en la cámara de electroforesis. Agregue

suficiente TBE 0,5X para sumergir el gel 2 mm. Remueva la peineta. 7) Cuidadosamente cargue las muestras en los bolsillos utilizando una pipeta automática. Siempre

incluya un estándar de tamaño adecuado, como por ejemplo DNA de bacteriófago Lambda digerido con Hind III (λ/Hind III).

8) Conecte los polos de la cámara de electroforesis a la fuente de poder con las muestras cargadas al lado del polo negativo (negro). Someta el gel a 50 Volts constante, a menos que se le indique otra cosa. El DNA migrará hacia el polo positivo.

9) Cuando el DNA haya migrado una distancia suficiente, apague la fuente de poder y desconecte los cables. Cuidadosamente remueva el gel y póngalo en un contenedor apropiado.

10) Tiña el gel con una solución de bromuro de etidio (aproximadamente 1 µg/mL) durante 5 a 10 min. NO OLVIDE UTILIZAR GUANTES DE VINILO PARA TODAS LAS MANIPULACIONES DEL GEL. EL BROMURO DE ETIDIO ES UN MUTÁGENO (ver procedimientos básicos).

11) Destiña brevemente el gel en agua antes de fotografiar. Un buen truco consiste en volver a someter el gel a electroforesis durante un período corto (al mismo voltaje, 10 min aproximadamente) después de teñido, sin volver a teñir.

12) Fotografíe el gel teñido sobre un transiluminador UV. Recuerde usar anteojos protectores de luz UV. Ver procedimientos básicos.

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EXPERIMENTO Nº 3

LECTURA ESPECTROFOTOMETRICA DE DNA y RNA. Cálculo de la concentración de DNA y RNA

Todas las bases purínicas y pirimidínicas de los ácidos nucleicos absorben fuertemente la luz

ultravioleta en la región de 250 a 280 nm. Esta propiedad es muy útil para el reconocimiento y determinación cuantitativa, no solamente de las bases libres, sino también de los nucleósidos y nucleótidos.

1. Seleccione la longitud de onda de 260 nm en el espectrofotómetro.

2. En una cubeta de cuarzo pipetee 0,5-1 mL de H2Odd, ponga la cubeta en el portacubetas adecuado y

pulse la tecla 100%T ó 0 Abs. La pantalla debe registrar 0.00.

3. Agregue 2-5 µL de la muestra de DNA (o RNA) a 0,5-1 mL de agua y mezcle bien. Transfiera la dilución preparada a una cubeta y mida la Abs a 260 nm y anote el valor. Saque la cubeta y lávela con agua.

4. Repita el procedimiento, pero esta vez leyendo a 280 nm. La fórmula para convertir la Abs260 a mg es la siguiente:

µg/mL DNA = (Abs260 medida) x (50 µg/mL) x (factor de dilución). µg/mL RNA = (Abs260 medida) x (40 µg/mL) x (factor de dilución).

En otras palabras, una solución de DNA cuya concentración es 50 µg/mL tiene una Abs260=1,0. Este

valor varía levemente con la razón G/C a A/T, pero el error por lo general es tan pequeño que puede ser ignorado.

Se puede determinar la pureza de una solución de DNA (o RNA) obteniendo la razón de Absorbancias

260nm/280nm. Para una solución pura de DNA de doble hebra esta razón debe estar entre 1,7 y 1,9. Valores mayores indican una probable contaminación del DNA con RNA y valores menores se deben a contaminación con proteínas o fenol. Si la solución de DNA no está pura, la Abs260 no reflejará la concentración real del DNA.

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EXPERIMENTO Nº 4

AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDIAL (Minipreparación/Maxipreparación)

1. Prepare un cultivo bacteriano que contenga el plasmidio incubándolo durante 12 a 16 hrs o toda la

noche a 37ºC, con agitación, en 3 mL de caldo Luria en presencia de 75 µg/mL de ampicilina.

2. Centrifugue 1,5 mL del cultivo celular durante 1 min en una microcentrífuga utilizando tubos Eppendorf. Bote el sobrenadante y repita la centrifugación de otros 1,5 mL del cultivo en el mismo tubo.

3. Resuspenda perfectamente el sedimento bacteriano en 200 µL de amortiguador de lisis. Deje a

temperatura ambiente durante 5 min.

4. Agregue 400 µL de solución SDS/NaOH y mezcle invirtiendo los tubos 10 veces. Deje en hielo 5 min. (La solución debe llegar a ser clara y viscosa).

5. Agregue 300 µL de una solución de acetato de amonio 8,0 M y mezcle suavemente por inversión unos

10 segundos. Deje a -20ºC durante 10 min o simplemente en hielo.

6. Centrifugue durante 10 min en una microcentrífuga a 13,000 rpm (al máximo).

7. Extraiga el sobrenadante y póngalo en un tubo nuevo de microcentrífuga previamente rotulado.

8. Agregue 250 µL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico(25:24:1). Agite cada tubo mediante vórtex durante 10 segundos y centrifugue 5 min en una microcentrífuga.

9. Extraiga la fase acuosa y póngala en un tubo de microcentrífuga limpio. Agregue 250 µL de

cloroformo:isoamílico, agite mediante vórtex y centrifugue como en 6.

10. Extraiga la fase superior o fase acuosa que contiene el DNA y deposítela en un tubo de microcentrífuga nuevo. Agregue 0,6 volúmenes de isopropanol (aproximadamente 500 µL), homogeneíce y deje a -20ºC durante 10 min para precipitar el DNA.

11. Centrifugue en una microfuga a 13.000 rpm durante 30 min a 4ºC.

12. Remueva el sobrenadante mediante aspiración al vacío, usando una punta de micropipeta. En este

punto, se podría lavar el precipitado de DNA (si es suficiente) suspendiéndolo en etanol frío 70% (200 mL) y posteriormente centrifugando durante 5 min a 13.000 rpm.

13. Remueva el sobrenadante por aspiración al vacío y deje los tubos invertidos sobre papel limpio

durante 15 min a temperatura ambiente para secar cualquier resto de alcohol. Alternativamente, los tubos podrían ser colocados en un desecador al vacío durante un tiempo breve ("SpeedVac").

14. Disuelva el DNA en 50 µL de TE. Agregue 5 µL de RNasa (1 mg/mL) previamente hervida.

NOTA: Se puede aumentar de escala este procedimiento para grandes volúmenes de cultivo bacteriano con el objeto de obtener mayores cantidades de DNA (Maxipreparación). El procedimiento funciona en forma excelente si se incrementan los volúmenes y se usan mayores tiempos de centrifugación. Por ejemplo: para 50 mL de cultivo bacteriano cultivado toda la noche utilice 10 veces más volumen de cada una de las soluciones de este protocolo. Si éste fuera el caso, después del tratamiento con RNasa en el paso Nº 14, extraiga nuevamente con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y una vez con cloroformo:isoamílico solo, y precipite con 2 volúmenes de etanol 95% en presencia de NaOAc 0,3 M ó acetato de amonio 2 M (concentraciones finales) y deje incubando a -20ºC durante 30 min o toda la noche, antes de centrifugar durante 20 min a 13.000 rpm a 4ºC. Resuspenda el sedimento en un volumen apropiado de amortiguador TE o H2Odd estéril (aprox. 250 µL) y mida la concentración del DNA a 260 nm.

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De esta manera, el procedimiento anterior podría emplearse para purificar el vector Bluescript KS II, que Ud. utilizará más adelante.

SOLUCIONES Y REACTIVOS

SOLUCION DE LISIS: Glucosa 50 mM, Tris HCl 25 mM pH 8,0, EDTA 10 mM. 9,0 mL de H2O destilada 0,25 mL de Tris HCl 1M, pH 8,0 0,20 mL de EDTA 0,5M 0,50 mL de glucosa 20% SOLUCION SDS/NaOH: Debe estar recién preparada. 8,8 mL de H2O destilada 1,0 mL de SDS 10% 0,2 mL de NaOH 10M SOLUCION DE ACETATO DE AMONIO 7,5 M: Disuelva 57 g de acetato de amonio en 60 mL de agua destilada. Lleve a 100 mL con agua destilada. Esterilice por filtración usando una membrana de 0,2 µm. Almacene a temperatura ambiente.

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EXPERIMENTO Nº 5

Digestiones con Enzimas de Restricción Cuando utilice endonucleasas de restricción recuerde lo siguiente:

A. Muchas enzimas de restricción pierden actividad si se deja que se entibien durante mucho tiempo

(incluso sobre hielo). Por lo tanto, prepare todos los reactivos para su mezcla de reacción excepto la enzima de restricción. Luego saque la enzima de restricción del congelador (-20ºC) e inmediatamente póngala sobre hielo. Agregue la enzima y devuélvala tan rápido como pueda.

B. Siempre use guantes y una punta nueva estéril de pipeta automática cada vez que Ud. use una enzima de restricción. (No es el momento de ahorrar).

C. El volumen de la enzima de restricción agregado al ensayo debe ser menos de 1/10 del volumen final

de la mezcla de reacción.

D. A menudo la cantidad de enzima se puede reducir si se aumentan los tiempos de digestión. Se pueden tomar pequeñas alícuotas de la muestra durante el curso de la reacción y analizarse por electroforesis en un minigel de agarosa para monitorear el progreso de la digestión. A veces una muestra de DNA no se digiere, independientemente del tiempo de incubación. Esto se debe a contaminantes presentes en su DNA. Tales contaminantes inhibitorios usualmente pueden ser eliminados mediante otra precipitación en etanol o a través de diálisis.

E. Una buena manera de comenzar un análisis o mapa de restricción consiste en usar enzimas baratas,

de corte infrecuente y que cortan el DNA plasmidial 1 ó 2 veces. Algunas buenas enzimas para los intentos iniciales son por ejemplo: Bam HI, Eco RI, Hind III, Kpn I, Pst I y Sal I. Use los tampones 10X para las enzimas de restricción que son proporcionados por la compañía que manufacturó la enzima.

1.- Para digerir su DNA plasmidial o genómico, anote el siguiente protocolo:

MUESTRA: H2O destilada estéril ... µL

DNA ... µL Tampón 10X de Reacción 2 µL Enzima de Restricción 1 µL Volumen Total 20 µL

Al hacer una digestión por primera vez siempre es conveniente preparar un DNA o plasmidio control

exactamente como arriba, pero sin agregar la enzima de restricción, con el fin de detectar la presencia de nucleasas inespecíficas.

2.- Mezcle los componentes de la reacción utilizando la misma punta de pipeta estéril con que agregó la

enzima de restricción. Incube a 37ºC durante 1 a 2 hrs. Siempre que trabaje con volúmenes tan pequeños asegúrese de que el volumen total permanezca en la base del tubo Eppendorf. Todas las gotas pequeñas pueden ser arrastradas de las paredes hacia el fondo mediante una centrifugación de algunos segundos en la microcentrífuga.

3.- Para monitorear el progreso de la reacción extraiga 5 µL de la mezcla, agregue 5 µL de TE y 2 µL de

la mezcla de cese de la reacción (stop mix) y analice la muestra en un gel de agarosa de concentración adecuada para el tamaño de los fragmentos de DNA de interés. Consulte algún manual acerca de la concentración de agarosa óptima para separar por electroforesis determinados tamaños de DNA. Incluya estándares de tamaño de DNA como λ/Hind III o ladder.

4.- Tiña el gel con bromuro de etidio. (Precaución: el bromuro de etidio es un mutágeno, véase

Procedimientos Básicos).

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5.- Tome una fotografía del gel. Use anteojos protectores de la luz UV. 6.- Determine los tamaños aproximados de los fragmentos de DNA de su plasmidio liberados por la

enzima de restrición. Para un plasmidio cualquiera el tamaño total dado por la suma de los fragmentos de las diferentes digestiones debe ser el mismo.

Si el tamaño total de una digestión es mayor que el de otras digestiones, lo más probable es que se trate de una digestión parcial de su DNA.

Si cualquiera de las bandas de menor tamaño tiene mayor intensidad que las de mayor tamaño Ud. probablemente sólo logró una digestión parcial.

Si el tamaño total de los fragmentos de DNA es menor en una digestión, examine cuidadosamente el gel porque las bandas muy intensas pueden corresponder a dupletes.

También hay que tomar en cuenta que los fragmentos de DNA muy pequeños pueden escapar del gel, lo cual podría ocurrir si éstos migran más rápido que el colorante Azul de Bromofenol.

7.- Después de determinar cuáles enzimas cortan el DNA, digiera con una segunda enzima. Si ambas

enzimas requieren el mismo tampón, digiera con ambas enzimas simultáneamente. Si las dos enzimas requieren diferentes tampones, la primera enzima debe ser inactivada antes de cambiar el tampón y agregar la segunda enzima. Algunas enzimas de restricción pueden ser inactivadas por calentamientoa 65ºC durante 10 a 20 min. Si la primera enzima es inactivada por calentamiento, caliente la mezcla de reacción, ajuste la concentración de sal del tampón, y agregue la segunda enzima.

8.- Si la primera enzima no es inactivada por calentamiento, extraiga la mezcla de la primera digestión

con fenol:cloroformo:isoamílico (25:24:1), precipite con etanol y resuspenda en el tampón adecuado antes de realizar la segunda digestión. Nota: Averigüe las condiciones de reacción y estabilidad térmica de las enzimas usadas. Consulte los manuales de sistemas de clonamiento y productos de biología molecular de diversas compañías (Gibco BRL, Promega, NE BioLabs, etc).

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ELECTRO-TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli DE ALTA EFICIENCIA

La electroporación es un método de transformación de E. coli que presenta la mayor eficiencia

disponible. Al someter las mezclas de las células y el DNA de forma exponencial a campos eléctricos de amplitud inicial muy alta, habitualmente se obtienen 109-1010 transformantes/μg de DNA con distintas cepas y plásmidos varios. La supervivencia y la transformación de las células se relacionan con la intensidad del campo (intensidad de campo = a la tensión y la distancia entre los electrodos) y la longitud del pulso (constante de tiempo RC).

Se ha deteminado varias combinaciones de intensidad de campo y duración del pulso que producen muy alta eficiencia de transformación. Por ejemplo, con pulsos de 20 mseg vemos un fuerte aumento de la transformación a medida que aumenta el campo de 1 a 7 kV/cm, y luego un agudo descenso. Con mayor intensidad de campo se produce un decaimiento de la supervivencia celular. La transformación se eleva a un máximo con pulsos de 5 ms a una intensidad de campo de alrededor de 11 kV/cm.

En cada caso, la eficiencia de transformación se encuentra en el rango de 109 a 1010 transformantes/μg de DNA, dependiendo de la cepa escogida y el plásmido vector, y se alcanza cuando sobreviven el 30 y el 40% de las células. Por lo tanto, podemos compensar los pulsos más cortos por el aumento de la amplitud del campo. El rango de esta compensación es limitado.

Procedimiento de electro-la transformación de E. coli de alta eficiencia.

A. Preparación de las células electrocompetentes

1. Inocular 1 litro de Luria-Broth (LB) con 1/100 del volumen de una cultivo overnight.

2. Cultivar las células a 37°C con agitación vigorosa a un Abs a 600nm de 0,5 a 1,0 (los mejores resultados se obtienen con las células que están creciendo rápidamente (fase log) a la densidad celular adecuada.

3. Para cosechar, enfriar el matraz en hielo durante 15 a 30 minutos y centrifugar en frío a 4000 x g

durante 15 minutos (usar centrífuga con refrigeración). 4. Separe la mayor cantidad de sobrenadante (medio) como sea posible. Volver a suspender las pastillas

de células sedimentadas en un total de 1 litro de H2Odd fría. Centrifugar como en el paso 3. 5. Volver a suspender en un litro de H2Odd fría 0.5. Volver a centrifugar como en el paso 3. 6. Resuspenda en aproximadamente 20 ml de glicerol frío al 10%. Centrifugar como en el paso 3. 7. Volver a resuspender las células en un volumen final de 2 a 3 ml de glicerol frío al 10%. La

concentración de células debe ser de 1-3 x 1010 células/ml. 8. Esta suspensión puede ser congelada en alícuotas en hielo seco, y se almacenan las alícuotas a -70 °

C. Las células se mantendrán electrocompetentes por lo menos durante 6 meses en estas condiciones.

B. Electro-transformación

1. Descongelar las células suavemente a temperatura ambiente y colocarlas en hielo.

2. En un tubo de polipropileno de 1,5 ml frío, mezclar 40 µl de la suspensión celular con 1 a 2 μl de DNA (el DNA debe estar en un tampón de baja fuerza iónica). Mezcle bien y deje reposar en hielo durante 1 min.

3. Ajuste el aparato Gene Pulser a 25 μF y 1,8 kV (para cubetas de electroporación de 0,1 cm).

Establezca el controlador de pulso a 200 Ω.

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4. Transfiera la mezcla de las células y el DNA a una cubeta de electroporación fría de 0,2 cm y agite suavemente la suspensión hasta que se deposite en el fondo de la cubeta. Vuelva a colocar la cubeta en hielo. PREPÁRESE.

5. Coloque la cubeta limpia entre los contactos de la base del GenePulser. Pulse una vez a la

configuración indicada apretando decididamente ambos botones de color rojo (Pulse buttons) y mantenga hasta que el pulso sea entregado y suene la señal. Esto debería producir un pulso con un tiempo constante de 4 a 5 mseg. (La fuerza del campo será de 12.5 kV/cm). Si la concentración de sales en su solución de DNA es mayor a 10 mM puede producirse un arco eléctrico con una pequeña explosión, en cuyo caso las células morirán.

6. Retire la cubeta de la cámara e inmediatamente añada 1 ml de medio de cultivo SOCC o LB (sin

antibiótico y a temperatura ambiente) a la cubeta y rápidamente vuelva a suspender las células con una pipeta. (Esta adición rápida de medio de cultivo después del pulso es muy importante en la maximización de la recuperación de los transformantes.)

7. Transfiera la suspensión celular a un tubo de polipropileno estéril de 15 ml e incube a 37°C durante 90

min con agitación en un Shaker. (La agitación de los tubos a 225 RPM durante la incubación puede mejorar la recuperación de transformantes).

9. Plaquée en medio selectivo (placas de agar LB con X-Gal, IPTG y ampicilina). Condiciones para la electro-transformación de Escherichia coli. Para las cepas de Escherichia coli LE392, DH5α, MC1061, WM1100 y muchas otras. Referencias 1) Dower, W. J. Mol. Biol. Rep., 1, 5 (1987) 2) Dower, WJ, Miller, JF y Ragsdale, CW, Nucl. Ac. Res. 16, 6127 (1988). Medio 10% de glicerol Concentración de la células > 1010/ml Volumen de muestra 40 μl Temperatura 0-4°C Distancia entre electrodos 0,1 cm Configuración Gene Pulser Tensión 1,8 kV (2,5 kV para cubetas de 0,2 cm) Condensador 25 μF Ajuste del controlador de Pulso 200 ohmios Condiciones eléctricas reales Intensidad de campo 12.5 kV/cm Constante de tiempo 4,5 a 5 ms

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SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

PROCEDIMIENTOS BASICOS

Bacterias. Algunos de los experimentos utilizan la cepa Escherichia coli DH5aF´. Esta cepa no es patógena aunque en grandes dosis podría eventualmente causar una infección. Sin embargo, se debe tomar en cuenta que la cepa en cuestión será transformada con un plasmidio que codifica para una resistencia a ampicilina. Por lo tanto se debe mantener la bacteria con resistencia a antibiótico fuera del ambiente (y de Ud.), para lo cual todos los cultivos y material de vidrio que ha estado en contacto con cultivos deben ser esterilizados después de su uso. Las técnicas microbiológicas siempre deben ser usadas en forma cuidadosa cuando se manipulen cultivos bacterianos.

Hongos. El hongo utilizado en este práctico es el basidiomicete Ceriporiopsis subvermispora cepa F-105757, un hongo filamentoso muy selectivo en el ataque a la lignina en la madera, heterocarionte dinucleado, no esporulado y no patógeno para el ser humano.

Reactivos Químicos. Varios reactivos químicos utilizados en este laboratorio son peligrosos. Cuando se utilicen estos reactivos se deben tomar las precauciones que son aconsejadas en este manual. Los siguientes reactivos químicos son particularmente peligrosos:

Fenol: Puede causar quemaduras muy severas.

Bromuro de etidio (BrEt): Potente carcinógeno.

Sin embargo, estos reactivos químicos no serán dañinos si se usan apropiadamente: siempre utilice guantes cuando manipule estos reactivos químicos potencialmente peligrosos y nunca los pipetee utilizando la boca. Si Ud. accidentalmente toma contacto a través de su piel con uno de estos reactivos químicos inmediatamente lave el área con abundante agua y avise a su instructor. Descarte los desechos de estos productos en contenedores apropiados que se le proveerán. Cuando tenga alguna duda, la toxicidad de muchos reactivos químicos puede ser consultada en el Index Merck.

Luz Ultravioleta. La exposición a la luz ultravioleta (UV) puede causar una aguda irritación de los ojos. Debido a que la retina no puede detectar la luz UV, Ud. puede tener un daño serio a los ojos que no advertirá hasta 30 min a 24 horas después de la exposición. (Si hay daño a sus ojos, lo más probable es que lo advierta por la noche al sentir como si sus ojos estuvieran llenos de arena. En dicha situación solamente puede mitigar el dolor con compresas frías sobre sus ojos y protegiéndolos de toda luz con anteojos oscuros. Acuda al facultativo por gotas oftalmológicas). Por lo tanto, siempre use protección adecuada para sus ojos en el momento en que este usando lámparas UV. Cuando se trabaja frente a la luz UV por más de unos pocos segundos (por ejemplo, al cortar una banda de DNA de un gel) se debe proteger también la piel utilizando un protector solar para la cara y las manos o una máscara.

Electricidad. Los voltajes utilizados para las electroforesis son suficientes para causar electrocutación. Mantenga tapadas las cámaras que contengan los tampones o amortiguadores de corrida durante la electroforesis y avise con la señal ...ALTO VOLTAJE... en el frente del sistema de electroforesis mientras está corriendo. Siempre apague la fuente de poder y luego desconecte los cables de alimentación antes de tomar un gel.

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Apéndice Nº1. Soluciones.

Acetato de amonio 7,5 M. Disuelva 57 g de acetato de amonio en aprox. 80 mL de H2Odd. Lleve a 100 mL con H2Odd. Esterilice por filtración a través de membrana de 0,2 mm. Almacene a temperatura ambiente.

Amortiguador de carga Use una dilución 1:10 como amortiguador de carga para electroforesis de DNA. El glicerol aumenta la densidad de la muestra permitiendo que sea cargada en los bolsillos sumergidos del gel. El xilén-cianol y azul de bromofenol son colorantes marcadores muy útiles que permiten seguir el curso de la electroforesis y dependiendo de la concentración del gel, estimar aproximadamente la ubicación de los fragmentos de DNA. El azul de bromofenol migra más rápido que el xilén-cianol (verdoso).

glicerol 100% 25 mL EDTA 0,5 M 5 mL H2Odd 20 mL Xilén-cianol 50 mg Azul de bromofenol 75 mg H2Od

La pureza del agua puede tener un efecto importante sobre muchos experimentos. Todos los medios de cultivo para microorganismos y muchas soluciones se pueden preparar con agua desionizada o destilada (H2Od). Sin embargo, en algunos experimentos es de vital importancia el uso de H2Odd (agua destilada y desionizada) o agua altamente purificada y de preferencia esterilizada mediante autoclave.

EDTA 0,5 M. El ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) es un quelante de cationes divalentes. Agregue 18,6 g de Na2EDTA*2H2O a aprox. 70 mL de H 2Odd y mezcle usando el agitador magnético. Lentamente ajuste el pH a 8,0 con NaOH (aprox. 5 mL de NaOH 10 N). El EDTA no se disolverá hasta que el pH esté cercano a 8,0. Posteriormente lleve a 100 mL con H2O dd. Autoclave.

Medio LB (Luria-Bertani) o caldo Luria ("Luria Broth"). El medio LB es un medio rico para el cultivo de microorganismos bacterianos. 10 g de Triptona 5 g de extracto de levadura ("Yeast extract") 5 g de NaCl Disuelva en 1 litro de H2Od y autoclave. Para hacer placas LB agregue 15 g de agar por cada litro antes de autoclavar.

Bromuro de etidio (10 mg/mL). El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante entre las bases del DNA o RNA. Cuando es excitado por la luz UV entre 254 nm (onda corta) y 336 nm (onda larga) emite una luz fluorescente a 590 nm. Cuando está intercalado, disminuye la rotación del complejo DNA-BrEt produciendo cerca de 50 veces más fluorescencia que el BrEt libre. El BrEt se puede usar para detectar tanto ácidos nucleicos de doble hebra como también de hebra simple, pero la sensibilidad es mucho mayor para DNA de doble hebra. Para fotografiar los geles teñidos con BrEt sobre un transiluminador UV se requiere un filtro UV que elimina de la pantalla el trasfondo UV del transiluminador. El BrEt es un potente carcinógeno. Use guantes de vinilo y mascarilla para pesar BrEt Pese 0,2 g de BrEt. Disuelva en 20 mL de H2Odd en un agitador magnético Almacene en la oscuridad en una botella forrada en papel aluminio y de preferencia a 4ºC.

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Alternativa a Bromuro de Etidio Actualmente existe un nuevo reactivo para visualizar DNA denominado GelRed. Este compuesto tiene una sensibilidad similar al bromuro de etidio y no es tóxico. Las desventajas son que las soluciones tienen una duración relativamente baja y también es más caro.

Mantención de células bacterianas. 1. El dimetilsulfóxido (DMSO) se emplea para disminuir el daño que se produce en las células debido a la formación de cristales de hielo durante el congelamiento y descongelamiento. Cuando se almacenan las células en DMSO a -70ºC, muchas bacterias permanecen viables por muchos años. Use guantes al trabajar con DMSO, ya que se absorbe rápidamente a través de la piel.

Agregue 0,2 mL de DMSO a cada tubo Eppendorf. Tape y autoclave durante 15 min. Almacene a temperatura ambiente. Para usar los tubos, llénelos con 1,5 mL de un cultivo bacteriano fresco. Mezcle por inversión, etiquetée y guarde a -70ºC.

Para revivir un cultivo congelado, simplemente extraiga un pequeño pedazo de hielo desde el tubo

usando un asa de platino estéril y siembre por aislamiento (estrías) en una placa de agar LB. NO PERMITA QUE EL CULTIVO SE DESCONGELE. 2. El glicerol también se puede usar para preservar bacterias: Se prepara una solución al 50% para almacenar a -20ºC y al 15% para guardar a -70ºC (concentraciones finales de glicerol estéril).

Glucosa 20%. Caliente (no hierva) 250 mL de H2O dd y ponga sobre un agitador magnético. Agregue 50 g de D-glucosa Disuelva y lleve a 500 mL con H2Od. Autoclave en botellas.

Solución de lisis para purificación de plasmidios.

H2Odd 9,0 mL Tris-HCl 1 M, pH 8,0 0,25 mL EDTA 0,5 M 0,25 mL glucosa 20% 0,50 mL

RNasa (libre de DNasa) 10 mg/mL.

Ribonucleasa A 10 mg Tris-HCl 1 M, pH 7,4 10 L NaCl 5 M 3 L H2Odd 987 L

Coloque la mezcla en tubos Eppendorff y caliente a ebullición suave durante 15 min a baño maría. Saque del baño y permita que se enfríe lentamente hasta temperatura ambiente. Guarde a -20ºC en alícuotas.

SDS-NaOH (Prepare en el momento de usar. No enfríe, el SDS precipita bajo 15ºC).

H2Odd 8,8 mL NaOH 10 N 0,2 mL SDS 10% 1,0 mL

SDS 10% (Dodecilsulfato de sodio). El SDS es un detergente aniónico y existen varias calidades en el mercado. Siempre use grado Biología Molecular. Las soluciones se deben almacenar a temperatura ambiente (22ºC-23ºC), ya que bajo 18ºC el SDS comienza a precipitar. Si ésto sucede entibie las soluciones antes de usar. Disuelva 10 g de SDS en 90 mL de H2Odd.(Podría necesitar entibiar para disolver). Ajuste a pH 7,2 con gotas de HCl 6 N y luego lleve a 100 mL con H2Odd .

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NaOH 10 N (hidróxido de sodio). Disuelva lentamente 40 g de NaOH en lentejuelas en aprox. 60 mL de H2Odd en un agitador magnético. Coloque su vaso de precipitados en un recipiente con hielo o agua con hielo. CUIDADO: Esta reacción es exotérmica y la solución se calienta mucho. Lleve a 100 mL con H2Odd. NaCl 5 M Disuelva 29,2 g de NaCl en 60 mL de H2Odd y luego lleve a 100 mL (Puede ser necesario calentar la solución para disolver). Filtre a través de membrana de 0,4 μm y autoclave. Almacene a temperatura ambiente.

TBE 5X (Tris -borato-EDTA). TBE es un buen amortiguador para electroforesis de DNA. La solución madre se debe diluir a 0,5X o 1X antes de usar. Tris Base (Trizma) 54,0 g ácido bórico 27,5 g EDTA 4,65 g ó 20 mL de una solución 0,5 M EDTA Disuelva en 600 mL de H2Odd en un agitador magnético. Lleve a 1 litro con H2Odd. Filtre a través de papel filtro Whatman Nº1. No es necesario ajustar pH, puesto que quedará entre pH 8,3 y 8,5 si usó el Tris Base. Almacene a temperatura ambiente.

Tampón TE (Tris-HCl, 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM)

Tris-HCl 1M, pH 8,0 estéril 1,0 mL 0,5 M EDTA, pH 8,0 estéril 0,2 mL H2Odd estéril 99,0 mL

X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indoil-β-D-galactosido). El X-gal es un indicador específico para actividadde β-galactosidasa: Las células Lac+forman colonias azules y las células Lac- forman colonias blancas. • Xgal 20 mg • N, N-dimetilformamida 1 mL Disuelva usando vórtex. Agregue 1 mL por litro de medio antes de autoclavar o si solamente necesita pocas placas plaquee 50 mL en cada placa.

AMPICILINA Disuelva el contenido del frasco (en el frasco) en suficiente cantidad de H2Od para obtener una concentración final de 100 mg/mL. Esterilice utilizando filtros de 0,2mm. Alicuotée de a 1 mL en tubos eppendorf estériles y guarde a -20ºC

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APÉNDICE Nº2

A. Extracción fenólica B. Precipitación ácidos nucleicos

A.Extracción fenólica.

La extracción fenólica se usa para extraer proteínas contaminantes del DNA en soluciones acuosas. La extracción con mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) es aún mejor para remover proteínas que el fenol solo. El fenol y el cloroformo desnaturan las proteínas. Las proteínas desnaturadas pasan a la fase orgánica (fase inferior) o permanecen en la interfase, pero el DNA permanece en la fase acuosa (fase superior) después de la extracción. El alcohol isoamílico mejora la separación de las fases orgánica y acuosa.

La oxidación del fenol forma primeramente quinonas que pueden ser oxidadas finalmente a di-ácidos y

radicales fenoxi coloreados amarillo o rosado. Estos productos de oxidación interaccionan con aminas primarias, causando hidrólisis o entrecruzamiento del DNA. Por lo tanto, cuando prepare soluciones de fenol siempre chequee el color y no lo use si aprecia una tonalidad amarilla o rosada. Los productos de oxidación pueden ser removidos mediante destilación y recristalización, pero ésto puede ser costoso y peligroso.

Muchas compañías venden fenol "Ultrapuro", destilado y recristalizado, que puede ser usado con toda

confianza. El fenol puro se funde a 43ºC. Cuando el fenol está saturado con agua, la fase acuosa a menudo tiene un pH muy bajo debido a pequeñas cantidades de di-ácidos contaminantes. Por lo tanto, el fenol se debe someter a una extracción con un tampón antes de usarlo. A menudo se agrega el antioxidante 8-hidroxiquinoleína al fenol saturado en tampón como protección adicional, y al mismo tiempo, como se trata de un reactivo de color amarillo, ayuda bastante a identificar la fase fenólica. Esto podría dificultar ver la aparición de productos de oxidación, pero si inicialmente se parte con un fenol de buena calidad no hay problema. El fenol saturado en tampón debe ser almacenado a 4ºC y no presenta problema durante varios meses. Si se prefiere, se puede almacenar en forma estable a -20ºC.

Si el fenol no está saturado con una solución acuosa, la fase acuosa que contiene el DNA puede

mezclarse completamente con la fase orgánica. Si le sucediera esto, puede adicionar una pequeña cantidad de TE o mezcla cloroformo : alcohol isoamílico (24:1) para separar las fases. NOTA: En la preparación de RNA total el fenol "Ultrapuro" debe ser saturado en H2Odd/DEPC estéril antes de usar. Esto asegura que después de la extracción, la fase acuosa contendrá solamente RNA y que el DNA genómico será degradado y pasará a la fase orgánica. OJO: Confundir un fenol saturado en H2Odd (RNA) con el fenol tamponado a pH 8,0 (DNA) puede ser fatal para sus objetivos.

Procedimiento de Extracción fenólica Precaución: el fenol puede causar quemaduras muy graves. Use guantes. 1. Agregue un volumen igual de fenol saturado o fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) sobre un volumen de muestra de DNA. 2. Mezcle perfectamente usando el vórtex (si se trata de plasmidios pequeños, 10 seg) o por inversión (si se trata de DNA cromosomal o plasmidios muy grandes) formando una emulsión. 3. Centrifugue durante 3-5 min en microcentrífuga (tubos Eppendorf) para separar las fases. 4. Mantenga los tubos sin agitar y cuidadosamente extraiga la fase acuosa superior, usando una pipeta automática, evitando tocar la interfase o la fase fenólica. Descarte la fase fenólica en alguna botella de vidrio. Como regla general, se debe repetida la extracción toda vez que usted vea demasiado material en la interfase. 5. Evite dejar residuos de fenol en la fase acuosa, porque éstos podrían inhibir cualquier actividad enzimática y afectar severamente los pasos posteriores. Una última extracción con un volumen de cloroformo : isoamílico o cloroformo permite retirar cualquier traza de fenol.

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Reactivos.

• Cloroformo : alcohol isoamílico (24 : 1) Agregue 120 mL de cloroformo y 5 mL de alcohol isoamílico a una botella ámbar. Mezcle y almacene a temperatura ambiente.

• Fenol (saturado en Tris o TE, pH 8,0). USE ANTEOJOS DE SEGURIDAD Y GUANTES DE VINILO. NUNCA PIPETEE USANDO LA BOCA. Si su piel toma contacto con fenol, lave inmediatamente con abundante agua y avise a su instructor. No lave con alcohol. 1.-Saque el fenol ultrapuro del congelador -20ºC y deje a temperatura ambiente durante un tiempo. Funda el fenol a 50ºC en un baño con agua. El fenol debe ser incoloro, no lo use si se ve coloreado. 2.-Agregue 8-hidroxiquinoleína hasta una concentración final de 0,1% (tomará un color amarillo). 3.-Agregue un volumen igual de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 para saturar el fenol. 4.-Mezcle bien y luego deje separar las fases sin mover la solución. Extraiga la fase acuosa y mida el pH. Si es necesario continúe extrayendo hasta que el pH de la fase acuosa esté cercano a 8,0. Tenga paciencia. 5.-Finalmente deje que una pequeña cantidad de fase acuosa permanezca sobre el fenol. 6.-Guarde en botella ámbar y a 4ºC. Si no usa fenol saturado habitualmente, puede guardar el fenol saturado a -20ºC hasta su uso.

B.Precipitación de ácidos nucleicos.

1. Precipitación con etanol.

El DNA y RNA precipitan en una solución acuosa con 0,1-0,5 M en cationes monovalentes y 70% etanol (concentraciones finales). Las sales más usadas como contraiones para la precipitación en etanol son acetato de amonio, acetato de sodio y NaCl. Las sales generalmente se agregan a las concentraciones que se indican en la tabla.

Solución Salina Concentración Vol

Acetato de amonio 7,5 M 1/2

Acetato de sodio 3,0 M 1/10

NaCl 5,0 M 1/50

Nota: Estas soluciones deben esterilizarse ya sea por autoclave o filtración (0,2 mm) antes de su uso.

Muchos protocolos para precipitar con etanol requieren enfriar la solución a -20ºC ó -70ºC. Sin embargo, algunos estudios muestran que aún a bajas concentraciones de DNA, éste precipita también eficientemente a 4ºC ó sobre hielo. Otros estudios indican que la centrifugación del DNA precipitado a temperatura ambiente puede ser más eficiente que a 4ºC. Sin embargo, además de ácidos nucleicos, las sales también son atrapadas en el precipitado y éstas pueden interferir en reacciones posteriores.

El lavado del precipitado de ácidos nucleicos con etanol frío al 70% ayuda a remover estas sales del

precipitado. El acetato de amonio es muy soluble en etanol y es removido eficientemente con el lavado en etanol 70%. Por el contrario, el acetato de sodio y NaCl son menos solubles en etanol por lo que son lavados con menor eficiencia con etanol 70%. Además, el DNA precipitado en acetato de amonio parece tener menos contaminantes que inhiben a las enzimas de restricción. Por lo tanto, generalmente el acetato de amonio es la mejor sal para la precipitación del DNA. El problema radica en el fuerte aumento en el volumen que implica su uso (ver tabla), lo que a veces es preferible evitar.

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2. Precipitación con Isopropanol.

Los ácidos nucleicos también se pueden precipitar con 0,6-1,0 volumen de isopropanol (alcohol isopropílico ó 2-propanol). Sin embargo, el isopropanol causa una mayor precipitación de sales que el etanol, especialmente si la solución está fría. Además, el isopropanol es menos volátil que el etanol, por lo que es más dificil remover sus residuos después de la precipitación. Por lo tanto, el isopropanol solamente se usa cuando se desea aumentar al mínimo el volumen de la solución a precipitar. Procedimiento. 1. Agregue 1/2 volumen de acetato de amonio 7,5 M 2. Agregue 2-2,5 volúmenes totales de etanol 95%. 3. Mezcle perfectamente por inversión e incube durante 15-30 min en hielo (o a -20ºC). Si la concentración de DNA es muy baja la precipitación durante toda la noche aumenta el rendimiento. 4. Centrifugue durante 15-30 min a 13.000 rpm a temperatura ambiente. 5. Descarte el sobrenadante. 6. Agregue 1 mL de etanol 75%. Agite en vórtex y centrifugue durante 5 min. a 13.000 rpm. 7. Bote el sobrenadante. Descarte el etanol residual invirtiendo los tubos sobre una toalla de papel limpio. Alternativamente, si se dispone de un desecador al vacío o Speed Vac se puede secar durante unos 3-5 min. 8. Resuspenda el precipitado de DNA en un volumen apropiado (pequeño) de TE o H2Odd estéril.