Guia de M.A.

7/21/2019 Guia de M.A.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAOFACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y DE RECURSOS NATURALES

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y DE RECURSOS

NATURALES

GUÍA DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

CARLOS ODORICO TOME RAMOS

Biólogo con mención en Microiolog!" # $"r"%i&olog!"

C"ll"o'()*+'Per,

Blgo. Carlos Tome Ramos2

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INTRODUCCI-N

En el curso de Microbiología General el alumno aprende a realizar los trabajo básicos en un

laboratorio de Microbiología; para el curso de Microbiología Ambiental debe aprender

algunos análisis microbiológicos, sobre todo los análisis que le permita determinar

contaminación de una muestra determinada; para ello con la finalidad de facilitar ste

aprendizaje es que se presenta sta guía de prácticas, donde se !a considerado los diferentes

mtodos de laboratorio para el análisis microbiológicos, tales como el recuento de aerobios en

placa "A#$% & el de coliformes sea con los mtodos con'encionales como los mtodos

rápidos, &a que son los parámetros frecuentemente requeridos para determinar la

contaminación de una muestras del ambiente(

Esperando cumplir con el objeti'o trazado, dejamos a disposición de los interesados sta obra(

Blgo. Carlos Tome Ramos)

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PRACTICA N. *

COMPOSTA/E

I0' In&ro12cción3

El com$o%&, com$o%&"4e, com$o%& o "ono org5nico es el producto que se obtiene decompuestos que forman o formaron parte de seres 'i'os en un conjunto de productos de origen

animal & 'egetal; constitu&e un *grado medio+ de descomposición de la materia orgánica que

&a es en sí un magnífico abono orgánico para la tierra, logrando reducir enormemente la

basura( e denomina !umus al *grado superior+ de descomposición de la materia orgánica( El

!umus supera al compost en cuanto abono, siendo ambos orgánicos(

El compostaje se forma de desec!os orgánicos como- restos de comida, frutas & 'erduras,

aserrín, cáscaras de !ue'o, restos de caf, trozos de madera, poda de jardín "ramas, csped,

!ojas, raíces, ptalos, etc(%( .a materia orgánica se descompone por 'ía aeróbica o por

'ía anaeróbica( .lamamos *compostaje+ al ciclo aeróbico "con alta presencia de o/ígeno% dedescomposición de la materia orgánica( .lamamos *metanización+ al ciclo anaeróbico "con

nula o mu& poca presencia de o/ígeno% de descomposición de la materia orgánica(

El compost es obtenido de manera natural por descomposición aeróbica "con o/ígeno% de

residuos orgánicos como restos 'egetales, animales, e/crementos & purines "parte líquida

altamente contaminante que rezuma de todo tipo de estircoles animales%, por medio de la

reproducción masi'a de bacterias aeróbicas termófilas que están presentes en forma natural en

cualquier lugar "posteriormente, la fermentación la contin0an otras especies de

bacterias, !ongos & actinomicetos%( 1ormalmente, se trata de e'itar "en lo posible% la

putrefacción de los residuos orgánicos "por e/ceso de agua, que impide la aireación

o/igenación & crea condiciones biológicas anaeróbicas malolientes%, aunque ciertos procesos

industriales de compostaje usan la putrefacción por bacterias anaerobias(

Agen&e% 1e l" 1e%com$o%ición- .a construcción de pilas o silos para el compostaje tiene

como objeti'o la generación de un entorno apropiado para el ecosistema de descomposición(

El entorno no solo mantiene a los agentes de la descomposición, sino tambin a otros que se

alimentan de ellos( .os residuos de todos ellos pasan a formar parte del compost(

Microscópicos- .os agentes más efecti'os de la descomposición son las bacterias &

otros microorganismos( .os microorganismos eficientes son un conjunto de bacterias "caldomicrobiano% que unidas producen a temperaturas fa'orables un apro'ec!amiento de los

componentes de la materia a compostar para optimizar el proceso de compostaje( 3ambin

desempe4an un importante papel los !ongos, protozoos & actinobacterias "o actinomicetos,

aquellas que se obser'an en forma de filamentos blancos en la materia en descomposición%(


https://es.wikipedia.org/wiki/Humus

https://es.wikipedia.org/wiki/Desecho_org%C3%A1nico


https://es.wikipedia.org/wiki/Organismo_aerobio


https://es.wikipedia.org/wiki/Digesti%C3%B3n_anaer%C3%B3bica

https://es.wikipedia.org/wiki/Materia_org%C3%A1nica


https://es.wikipedia.org/wiki/Metano

https://es.wikipedia.org/wiki/Vegetal

https://es.wikipedia.org/wiki/Purines


https://es.wikipedia.org/wiki/Esti%C3%A9rcol

https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria


https://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n


https://es.wikipedia.org/wiki/Fungi


https://es.wikipedia.org/wiki/Silo

https://es.wikipedia.org/wiki/Ecosistema

https://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo


https://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismos_efectivos







https://es.wikipedia.org/wiki/Protozoo

https://es.wikipedia.org/wiki/Actinobacteria




https://es.wikipedia.org/wiki/Filamento_(bot%C3%A1nica)






https://es.wikipedia.org/wiki/Metano

https://es.wikipedia.org/wiki/Vegetal


https://es.wikipedia.org/wiki/Esti%C3%A9rcol





https://es.wikipedia.org/wiki/Silo

https://es.wikipedia.org/wiki/Ecosistema




https://es.wikipedia.org/wiki/Protozoo



https://es.wikipedia.org/wiki/Filamento_(bot%C3%A1nica)

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Macroscópicos- 6a a ni'el macroscópico se encuentran las lombrices de

tierra, !ormigas, caracoles, babosas, milpis, coc!inillas, etc(, que consumen & degradan la

materia orgánica(

II0' Me&o1olog!"3

E/isten 'ariadas tcnicas de compostaje, las que se ajustan a diferentes necesidades; la

elección de una tcnica u otra depende, entre otras cosas, de la cantidad & tipo de material a

procesar, in'ersión disponible & disponibilidad de terreno, complejidad operacional & del

producto final que se quiere obtener( .os distintos sistemas están determinados por los

mecanismos de aireación que se utilizan en el proceso, generalmente los podemos agrupar en-

aireación pasi'a, aireación forzada, & aireación por 'olteos del material(

• Com$o%&"4e en $il"% e%&5&ic"%- se forman pilas, en un bote o caja metálica grande

"mínimo 7 m), má/imo 7(8 m)% con tapa, colocando una capa gruesa "apro/imadamente 9

cm% de aserrín o tierra & se deja sin mo'imiento, se 'ierte a!í todos los desec!os orgánicos& se cubren con otra capa de tierra, para que se mantenga la !umedad se rocía con un poco

de agua que resulta indispensable & se espol'orea con cal para e'itar malos olores(

3ermina 'entilándose naturalmente por un proceso de con'ección trmica natural( En este

procedimiento no se tiene temperatura, los procesos son los naturales a temperatura

ambiente(

• Com$o%&"4e en $il"% e%&5&ic"% "ire"1"%- consiste en airear de manera forzada la

materia que se está compostando( .a pila se constru&e sobre una red de tuberías, donde se

suministra o e/trae aire frecuentemente para proporcionar un medio aeróbico( Esta tcnica

es conocida tambin como tcnica acti'a o caliente- se controla la temperatura para permitir el desarrollo de las bacterias más acti'as, matar la ma&oría de patógenos &

grmenes, & así producir compost 0til de forma rápida(• Com$o%&"4e en $il"% 1e 6ol&eo- este sistema de compostaje es el más utilizado, & se

realiza mediante un 'olteo manual o mecánico( En este mtodo se amontona el material, se

mezcla & 'oltea periódicamente, e'itando así la compactación & entregando o/ígeno al

sistema(

.a ma&oría de plantas industriales & comerciales de compostaje utilizan procesos acti'os,

porque garantizan productos de mejor calidad en un plazo menor( El ma&or grado de control &, por tanto, la ma&or calidad, suele conseguirse compostando en un recipiente cerrado con un

control & ajuste continuo de temperatura, flujo de aire & !umedad, entre otros parámetros(

El compostaje casero es más 'ariado, fluctuando entre tcnicas e/tremadamente pasi'as !asta

tcnicas acti'as propias de una industria( #ara ello se escoge un lugar al aire libre &a sea

$"&io o 4"r1!n de preferencia lejos de la casa o la cocina, le debe dar el sol & la sombra


https://es.wikipedia.org/wiki/Lumbricidae


https://es.wikipedia.org/wiki/Formicidae

https://es.wikipedia.org/wiki/Caracol

https://es.wikipedia.org/wiki/Babosa

https://es.wikipedia.org/wiki/Diplopoda

https://es.wikipedia.org/wiki/Coccoidea

https://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno



https://es.wikipedia.org/wiki/Formicidae

https://es.wikipedia.org/wiki/Caracol

https://es.wikipedia.org/wiki/Babosa

https://es.wikipedia.org/wiki/Diplopoda

https://es.wikipedia.org/wiki/Coccoidea


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durante el día( $ada 'ez que se integren nue'os desec!os orgánicos a la composta o una 'ez a

la semana se re'uel'e todo con una 'arilla, este paso es mu& importante para 'entilar los

materiales( En tres o cuatro semanas se obser'ará que es difícil distinguir lo que se fue

depositando a e/cepción de los desperdicios más recientes( e pueden utilizar

productos desodorantes, aunque una pila bien mantenida raramente produce malos olores(:espus de cuatro meses se con'ertirá en !umus "nombre 'egetal de la 3ierra que se forma

por la descomposición de la materia orgánica% & esto resulta en un "ono estupendo con 'ida,

con una gran densidad & 'ariedad de microorganismos que

sintetizan enzimas, 'itaminas, !ormonas, etc( & que repercuten fa'orablemente en el equilibrio

biótico del suelo(

III0' E&"$"% iológic"% 1el com$o%&"4e

En una pila de compostaje !a& ) grupos principales de organismos-

• $onsumidores primarios• $onsumidores secundarios

• $onsumidores terciarios

En un gramo de compost !a& más de 7 millones de consumidores primarios o micro

organismos, la ma&or parte son bacterias, que generan calor como producto de su trabajo & se

clasifican de acuerdo al rango de temperatura en el que operan-

#sicrofílicas- Entre 7<=$ & 7<= $( " & 95 =>%

Mesofílicas- Entre 8= $ & 5)=$ "57 & 7?= >%3ermofílicas- Entre 5 & ?)= $ "75 & 2 =>%

.o deseable es alcanzar en la pila condiciones 3ermofílicas "arriba de los 5= $%, porque esas

bacterias son las que trabajan más rápido & !a& otros microorganismos que solo trabajan a esas

temperaturas, además se destru&en microbios patógenos & malezas( Entre los consumidores

primarios tambin están los actinomicetos que son los que dan al compost un agradable olor a

tierra, los !ongos & los gusanos que agregan material 'alioso al compost & la porosidad creada

contribu&e a la aireación del mismo( $uando !a& poco aire & muc!a !umedad se genera otro

tipo de bacterias, las anaeróbicas, que son las causantes de los malos olores(

.os consumidores secundarios consumen a otros organismos, manteniendo bajo control a

dic!as poblaciones, los nematodos por ejemplo se alimentan de bacterias, protozoarios,

esporas de !ongos & entre sí(

.os consumidores terciarios se alimentan principalmente de consumidores secundarios, por

ejemplo unas ara4as que solo se dedican a comer artrópodos sin tejer telara4as, los ciempis


https://es.wikipedia.org/wiki/Desodorante





https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima

https://es.wikipedia.org/wiki/Vitamina

https://es.wikipedia.org/wiki/Hormona




https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima

https://es.wikipedia.org/wiki/Vitamina

https://es.wikipedia.org/wiki/Hormona

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que comen in'ertebrados a0n más grandes que ellos & escarabajos que se alimentan de

semillas & otro material 'egetal(

IV0' P"r5me&ro% 1el $roce%o 1e com$o%&"4e

72me1"1( @na pila de compost efecti'a debe tener una !umedad entre el 5 & el 9( Ese

grado de !umedad es suficiente para que e/ista 'ida en la pila de compost & las bacterias

puedan realizar su función( .as bacterias & otros microorganismos se clasifican en grupos en

función de cuál es su temperatura ideal & cuánto calor generan en su metabolismo( .as

bacterias mesofílicas requieren temperaturas moderadas, entre 2 & 5 B$( $onforme

descomponen la materia orgánica generan calor( .ógicamente, es la zona interna de la pila la

que más se calienta( .as pilas de compost deben tener, al menos, 7 m de anc!o por 7 m de alto

& la longitud que sea posible( Así se consigue que el propio material aísle el calor generado(

Ca& sistemas que permiten pilas muc!o más anc!as & más altas( Así se puede !acer compost

de una tonelada de residuos en un metro cuadrado( .a aireación pasi'a se ejecuta por medio de

un piso falso( 3ampoco necesita el re'oloteo del material en degradación(

Tem$er"&2r"( .a temperatura ideal está alrededor de los 9 B$( Así la ma&oría de patógenos

& semillas indeseadas mueren a la par que se genera un ambiente ideal para las bacterias

termofílicas, que son los agentes más rápidos de la descomposición( :e !ec!o, el centro de la

pila debería estar caliente "tanto como para llegar a quemar al tocarlo con la mano%( i esto no

sucede, puede estar pasando alguna de las siguientes cosas-

• Ca& demasiada !umedad en la pila por lo que se reduce la cantidad

de o/ígeno disponible para las bacterias(

• .a pila está mu& seca & las bacterias no disponen de la !umedad necesaria para 'i'ir &

reproducirse(

• 1o !a& suficientes proteínas "material rico en nitrógeno%(

.a solución suele pasar por la adición de material o el 'olteo de la pila para que se airee(

:ependiendo del ritmo de producción de compost deseado, la pila puede ser 'olteada más

'eces para lle'ar a la zona interna el material de las capas e/ternas & 'ice'ersa, a la 'ez que se

airea la mezcla( .a adición de agua puede !acerse en ese mismo momento, contribu&endo a

mantener un ni'el correcto de !umedad( @n indicador de que !a llegado el momento del'olteo es el descenso de la temperatura debido a que las bacterias del centro de la pila "las más

acti'as% !an consumido toda su fuente de alimentación( .lega un momento en que la

temperatura deja de subir incluso inmediatamente despus de que la pila !a&a sido remo'ida(

Eso indica que &a no es necesario 'oltearla más( >inalmente todo el material será !omogneo,

de un color oscuro & sin ning0n parecido con el producto inicial( Entonces está listo para ser

Blgo. Carlos Tome RamosD

https://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo

https://es.wikipedia.org/wiki/Tonelada

https://es.wikipedia.org/wiki/Metro_cuadrado


https://es.wikipedia.org/wiki/Semilla




https://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna


https://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno

https://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo

https://es.wikipedia.org/wiki/Tonelada


https://es.wikipedia.org/wiki/Semilla



https://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno

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usado( Ca& quien prefiere alargar la maduración durante incluso un a4o más, &a que, aunque

no está demostrado, puede que los beneficios del compost así producido sean más duraderos(

N2&rien&e%- #ara el crecimiento microbiano en la pila de compost, es necesario que !a&a un

balance entre carbono & nitrógeno que son los macronutrientes más importantes, los materiales

ricos en carbono son color caf & seco & los ricos en nitrógeno son 'erdes & !0medos( .osmicronutrientes son el manganeso, cobre, magnesio & cobalto & !a& una categoría intermedia

entre micro & macro nutrientes donde están el fósforo, potasio & calcio( .os microbios usan el

carbono para su o/idación metabólica, parte lo con'ierten en bió/ido de carbono & parte lo

combinan con nitrógeno para sus clulas, cuando el carbono está en lignina o celulosa cuesta

biodegradarlo & !a& que reciclarlo 'arias 'eces( $uando el carbono se quema es cuando se

ele'a la temperatura de la pila & a eso se debe que se reduzca el 'olumen de la pila durante el

compostaje( El nitrógeno es necesario para el crecimiento de las clulas, cuando !a& e/ceso

del mismo se libera como amoniaco & cuando !a& escasez se retarda el compostaje( .a

relación óptima es de *8 " 9) $"r&e% 1e c"rono $or 2n" 1e ni&rógeno, cuando esta relaciónes ma&or se retarda el compostaje & se genera un olor desagradable, pero si la relación es

menor, los microorganismos se terminan el carbono & dejan ir el nitrógeno como amoniaco(

Garantizar esta relación puede ser difícil en la práctica( .as relaciones de carbono nitrógeno

para algunos desec!os son las siguientes-

EF:@ E.A$FH1 $I1

Aserrín 28

$aballo "e/cremento% 28Gallinaza 78

Grama 7278

rina (<

#aja 72<78

#apas "cáscaras% 28

angre )

Jacas "e/cremento% 7<

Jegetales "sin leguminosas% 7772

El resto de nutrientes suele estar presente en las concentraciones adecuadas(

Blgo. Carlos Tome Ramos<

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Fórmula para calcular el balance de carbono de la Carga:

$KL"A(A($ANO(O($O%I 7

$KL $arbono en la carga total "Pg(%

AL #eso del estircol o aserrín

AL en peso de sólidos totales del estircol o aserrín

$AL de carbono en peso seco del estircol o aserrín

OL #eso del residuo de gras

OL en peso de sólidos totales del gras

$OL de carbono en peso seco del gras

Fórmula para calcular el balance de nitrógeno de la carga:

1KL "A(A(1ANO(O(1O%I7 1KL 1itrógeno de la carga total "Pg(%

1AL de nitrógeno en peso seco del estircol o aserrín

1OL de nitrógeno del gras

Blgo. Carlos Tome Ramos?

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PRACTICA N. (

TOMA Y 7OMOGENEI:ACI-N DE LA MUESTRA PARA AN;LISIS

MICROBIOL-GICO

I< In&ro12cción3

.a toma de muestra & su procesamiento adecuado, para realizar un análisis microbiológico

en el laboratorio, es de 'ital importancia para asegurar un resultado 'álido & confiable, de

tal manera que nos permita tomar decisiones( En esta primera práctica de laboratorio del

curso de microbiología ambiental, el alumno debe tener en cuenta las consideraciones

necesarias para asegurar una buena toma de muestra para su respecti'o análisis

microbiológico(

II< Me&o1olog!"3

#ara realizar una buena toma de muestra para análisis microbiológico se debe tener en

cuenta los siguientes lineamientos-

7(.a toma de muestra debe ser en forma asptica(

2( .a muestra debe ser estadísticamente representati'a(

)( .os en'ases de muestreo deben presentar las siguientes características-

• .impios & secos• A prueba de fugas

• Ooca anc!a

• 3ama4o adecuado para la muestra

• $ierre !ermtico

• Estriles

5( iempre que sea posible debe e'itarse el uso de en'ases de 'idrio

8( :ebe tenerse estricto cuidado de no sobresaturar las bolsas(

9( 3odos los instrumentos de muestreo deben estar estriles(

D( iempre que sea posible obtener por lo menos 7 gr( de cada unidad muestreada

<( Fdentificar cada unidad de muestra con una tira de cinta ad!esi'a

?( El transporte de la muestra, en lo posible, debe ser en sus en'ases originales(


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7( .as muestras deben ser entregadas al laboratorio inmediatamente, junto con las

condiciones de almacenamiento original(

E$E#$FH1 :E .A M@E3A- Kuien recepciona la muestra debe tener en cuenta lo

siguiente-

• $ondiciones físicas generales del en'ase

• Etiquetado & registro(

• Almacenamiento- Muestras congeladas a Q2 B$, muestras perecibles- entre a

5B$ , pero no más de )9 !oras(

#$EAMFE13 :E .A M@E3A-

• Emplear la tcnica asptica para manipular el producto(

• Mezcla- @sar 8gr( de muestra & despus a4adir 58 ml( de agua para dilución

"7-7%, !omogeneizar & preparar las diluciones siguientes "7-7, 7-7, etc(% para

los análisis microbiológicos correspondientes(


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P R A C T I C A N. 9

RECUENTO EN PLACA DE AEROBIOS =APC<

INTRODUCCI-N3

El recuento en placas de aerobios es uno de los mtodos que nos permite determinar la

calidad !iginica de una muestra, &a que está destinado a indicar el ni'el de

microorganismos en un producto( El rango óptimo para realizar el recuento de colonias es

de 28 a 28(

MATERIALES Y M>TODOS-

• Agar para recuento en placa(

• Oa4o maría

• Ootellas para dilución estriles(

• $ontador de colonias en registrador de recuento(

• :ilu&ente

• Fncubadora(

• #ipetas de 7,8 & 7 ml( estriles(

• #lacas Estriles

• efrigeradora

• 3ermómetro & #! metro(

METODOLOGÍA-

7% ealizar la primera dilución 7 Q 7 agregando 7 ml de muestra a ? ml de dilu&ente(

.as diluciones siguientes "7 2, 7 8, etc(% se efectuará transfiriendo 7 ml( de la

dilución anterior a un tubo con ? ml( de dilu&ente(

2% embrar 7 ml de cada dilución, por duplicado, por el mtodo de difusión("Fncorporación de medio%

)% Mezclar las diluciones de la muestra con el medio de agar en forma completa &

uniforme, mediante una rotación & mo'iendo las placas de atrás !acia delante de modo

alternado, sobre una superficie plana(

5% :ejar que el agar se solidifique e incubar a )8=$ / 5< !oras( "Jer fig( 7%


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Fig2r" *0' @n recuento en placa es una medida directa & proporciona un recuento de 'iables( En primer lugar, lamuestra se dilu&e seriadamente, transfiriendo 7 ml de la muestra a ? ml de medio estril & se mezclanadecuadamente( Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 7-7 "7 8%(#osteriormente se a4ade ,7 ml a una placa de agar nutriti'o, bien e/tendindolo en la superficie de la misma"mtodo de e/tensión en placa% o mezclándolo con el medio "mtodo de 'ertido en placa%( .as placas se incuban

& se recuentan las colonias que se desarrollan( :ebido a razones estadísticas, las placas deben contener entre ) &) colonias( En este ejemplo, la placa tiene 228 colonias(

Blgo. Carlos Tome Ramos7)

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LINEAMIENTO PARA EL C;LCULO =Seg,n l" FDA<(

7( #lacas 1ormales "28 Q 28%

$alcular el A#$ de la siguiente manera- 1 L R $ ( (

S"7 / ni% N "(7 / n2%T / "d%

:onde-

1 L 10mero de colonia por ml o gramo del producto(

R $ L uma de todas las colonias en todas las placas contadas(

ni L 10mero de placas en la primera dilución contada(

n2 L 10mero de placas en la segunda dilución contada(

d L :ilución de la cual se obtu'o los primeros recuentos(

Ejemplo-

7- 7 7- 7

2)2, 255 )), 2<

1 L "2)2 N 255 N )) N 2<% L 8)D L 25,5? ≅ 25,

S"7 / 2% N "(7 / 2%T / 72 (22 egistrar en 2 dígitos

2( 3odas las placas con menos de 28 u(f(c( "unidades formadoras de colonias%

egistrar como- U 28 / 7Id; :onde d es la primera dilución

Ejemplo- 7- 7 7- 7

7< 2


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28 / 7I 72 ≤ 28 u(f(c( I ml

U 28 ufc I ml "gr%

)( 3odas las placas con mas de 28 u(f(c "peso U 7I cm2%

Ejemplo- 7- 7 7- 7

:1$ 95 95( EA#$ I ml "gr%

5( 3odas las placas con un promedio ma&or a 7 u(f(c( Icm2

eportar- 7 / 7Id / área de la placa;

:onde- d es la disolución más alta

Ejemplos- #romedio de 77 colonias Icm2 $on área de la placa 98 cm2

eportar- 7 / 7I 7) / 98 V 98 / 78 EA#$


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P R A C T I C A N. +

M?TODO SIMPLATE PARA DOSIS M@LTIPLES DE RP7

INTRODUCCI-N3

El mtodo im#late para #C se usa para la cuantificación de recuentos de plaquetas

!eterotróficas "#C% en agua( e basa en la tecnología de enzimas m0ltiples de F:E

"Multiple Enz&me 3ec!nolog&W% patentado, que detecta bacterias 'iables en el agua

comprobando la presencia de enzimas cla'e que se sabe e/isten en esos organismos( e 'ale

de sustratos de enzimas m0ltiples que producen una fluorescencia azul al ser metabolizados

por la bacteria que se encuentra en el agua( .a muestra & el medio se a4aden a una placa

im#late, se incuban & luego se e/aminan para determinar la presencia de pocillos

fluorescentes( El n0mero de pocillos fluorescentes de la placa corresponde al 10mero Más

#robable "1M#% de bacteria total en la muestra original( .os 'alores 1M# generados por el

mtodo im#late para #C se correlacionan con el mtodo #our #late utilizando Agar de

recuento de plaquetas totales incubadas a )8B$ durante 5< !oras como se describe en Standard

Methods for the Examination of Water and Wastewater , 7?t! edition " Métodos Estándar para

el Análisis de Agua y Agua de Desecho%(

MATERIAL Y M>TODO37( Cidrate el medio llenando el en'ase para medio !asta la marca de 7 m. con dilu&ente

esterilizado "p( ej( agua declorinada, agua desionizada, tampón de fosfato o ,7 peptona%,

coloque la tapa & agite para disol'er( Jea la imagen 1= 7(

2( #ipetee 7 m. de muestra & luego ? m. de medio re !idratado en el centro de la base de la

placa im#late( Jea la imagen 1 2(

)( $ubra la placa con la tapa & agite sua'emente para distribuir la muestra en todos los

pocillos( Jea la imagen 1 )(

NOA! las burbujas de aire en los pocillos no interfieren con la muestra

5( $oloque la placa en un ángulo de ?B a 72B para 'erter el e/ceso en el pa4o absorbente(

Jea la imagen 1 5(

8( Fn'ierta la placa e incube durante 5< !oras a )8 X ,8B$( Jea la imagen 1 8(


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9( $uente el n0mero de pocillos que tienen fluorescencia- sujete una bombilla de 9 Yats,

)98nm, de luz @J a una distancia de 72(8 cm por encima de la placa( Apunte la bombilla !acia

la muestra( Alternati'amente, usted puede leer los pozos fluorescentes a tra's de la parte

posterior de la base in'ertida del im#late(

D( $onsulte la tabla de 1M# "M#1% proporcionada para determinar el n0mero más probable

de bacteria de recuento de plaqueta !eterotrófica en la muestra original( .a tabla tiene en

cuenta la muestraImedio eliminado en el paso 5(

*

( 9

+

Fig0 N.* Proce1imen&o 1e $r2e"

Blgo. Carlos Tome Ramos7D

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PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD

El siguiente procedimiento se recomienda para cada lote de placas im#late para #C o con

ma&or frecuencia seg0n lo establezcan los reglamentos-

7( iga el *#rocedimiento de prueba+, arriba citada, usando 7 m. de medio re!idratado & sin

muestra(

2( 1ing0n pozo debe mostrar fluorescencia despus de la incubación(

RECOMENDACIONES

7( #roceda con tcnica asptica(

2( .as muestras clorinadas se deben tratar con tiosulfato de sodio antes de !acer la prueba(

)( .os resultados se pueden leer desde 58 !asta D2 !oras despus de iniciada la incubación(

5( efrigere el medio no utilizado & descarte si no lo usa al cabo de 8 días(8( Elimine la muestra & el medio siguiendo buenas prácticas de laboratorio(

9( e pueden utilizar muestras más peque4as siempre que el 'olumen final "muestra más

medio !idratado% sea 7 X ,2 m.( Ajuste el 1M# para reflejar las diluciones( #or ejemplo, si

se ponen a prueba 7 m. de muestra & ? m. de dilu&ente estril "dilución de 7-7%, multiplique

el n0mero de la tabla de 1M# por 7 para encontrar el 1M#Im. correcto(

Blgo. Carlos Tome Ramos7<

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PRACTICA N.

M>TODO CONVENCIONAL PARA LA DETERMINACI-N DE COLIFORMES Y

E0 Coli I3

PRUEBA PRESUNTIVA Y PRUEBA CONFIRMATIVA DE COLIFORMES TOTALES

INTRODUCCI-N

:eterminar la calidad !iginica sanitaria, &Io el grado de contaminación microbiana de

una muestra en particular, es de suma importancia para la pre'encion de enfermedades

transmisibles( #ara ello, se utilizan organismos indicadores de la contaminación bacteriana &

de la calidad !iginica a tra's de dos grupos bacterianos- $oliformes

Enterococos

Estos indicadores, seg0n Outtiau/ & Mossel, deben poseer las siguientes propiedades-

7( Cábitat específico del medio intestinal(

2( #resentes en gran cantidad en las !eces, para ser detectados en altas concentraciones(

)( esistentes a las condiciones ambientales e/traintestinales(

5( :etectables de forma fácil & completa(

E( coli & los coliformes son bacterias Gram negati'as "coliformes%, fermentadores de la lactosa

con producción de gas a )8=$ 5< !rs & a 55(8=$ "coliformes fecales & E( coli%(

MATERIALES Y M>TODOS3

Oa4o maría

Fncubadora

Oalanza

#ipetas estriles de

7 ml

>rascos de

muestreo estril

>rascos de

diluciones

$aldo 3riptosa

.auril ".3%

$aldo de Oilis

.actosa Jerde

Orillante "OG.O%

Blgo. Carlos Tome Ramos7?

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$aldo E$

Agar EMO

$aldo 3riptano

$aldo M( @#

$aldo de $itrato

Agar #eptanado al

(7

eacti'o de Po'ac

eacti' de Joges

#ros Pouer

eacti'o para

3inción Gram

METODOLOGÍA

I0' PRUEBA PRESUNTIVA PARA DETECCI-N DE BACTERIAS COLIFORMES

TOTALES

7( A4adir 7 ml e muestra de agua a un frasco de dilución con ? ml de agua peptona al

(7, !omogeneizar(2( #reparar las siguientes diluciones a4adiendo 7 ml de la dilución 7-7 a un tubo con ?

ml de agua peptonada "72% & así sucesi'amente "7), 75, etc(%(

)( 3ransferir 7 ml de cada dilución a un juego de 8 tubos con 7 ml( del $aldo 3riptosa

.auril ulfato ".3%(

5( Fncubar a )8=$ por 25 a 5< !rs(

eportar como resultados positi'os la turbidez & presencia de gas en el 'ial de fermentación

"tubos :ur!am%( En caso de agua potable, leer como positi'o la presencia de turbidez(

II0' PRUEBA CONFIRMATIVA PARA DETECCI-N DE COLIFORMES TOTALES

7( :e los tubos positi'os del $aldo 3riptosa .auril ulfato ".3%, transferir un inóculo a

los tubos con 7 ml( de $aldo Oilis .actosa Jerde Orillante "OG.O%(

2( Fncubar a )8=$ por 25 a 5< !rs & proceder a reportar sus resultados(

)( $alcular el n0mero más probable "1M#% con la tabla(


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Fig2r" *0' El mtodo del n0mero más probable "1M#% proporciona un recuento de 'iables( Al aumentar el factor

de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo un organismo & los otros, ninguno( A

partir del n0mero, determinado por los tubos que presentan turbidez en tres diluciones sucesi'as "en este caso 8,

), 7%, puede determinarse el n0mero más probable de clulas estadísticamente "77,% en la primera de las tres

diluciones, mediante una tabla de n0meros más probables "3abla <(9%( Este 'alor, multiplicado por el factor de

dilución nos proporciona el n0mero de clulas 'iables de la muestra(

III0' DETERMINASCION DE COLIFORMES FECALES Y CONFIRMACI-N DE E0

Coli

II0' MATERIALES Y M>TODOS

7( Agitar sua'emente cada tubo de .3 que produce gas $2, puede usarse tambin

tubos de OG.O gas positi'o% & transferir una asada al tubo de caldo E$ e incubar a 55(8


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o 58(8=$ por 25 a 5< !rs( & proceder a realizar su lectura con la a&uda de la tabla del

1M#(

2( embrar por el mtodo del estriado a partir de cada tubo que produce gas sobre el agar

.EMO e incubar por 7< a 25 !rs a )8=$(

)( 3ransferir colonias sospec!osas de cada placa EMO "'er fig(% a caldos de culti'os para

realizar los estudios morfológicos & bioquímicas( Fncubar por 7< a 25 !rs a )8=$(

5( ealizar la tinción de Gram( E/aminar todos los culti'os que aparezcan como bacilos

cortos o cocos Gram negati'os para las siguientes pruebas bioquímicas(

Pro12cción 1e In1ol-

• Fnocular un tubo de $aldo 3riptona e incubar por 25 ± 2 !rs a )8=$(

• :etectar la presencia de Fndol a4adiendo (2 Q () ml de eacti'o de Po'ac(

• .a aparición de un color rojo en la capa superior, significa que el resultado de

prueba es positi'o(

Voge% Pro%"2er =VP<-

• #roducción del A$E3F. ME3F. $AOF1.(

• Fnocular un tubo de caldo M Q J# e incubar por 5< ± 2 !rs a )8=$(

• 3ransferir 7 ml a un tubo de 7) / 7 mm(


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• A4adir (9 ml de solución alfanaftal & (2 ml 5 de PC & agitar(

• A4adir unos cuantos cristales de creatina(

• Agitar & dejar reposar por 2 !rs(

• .a prueba es positi'a si se desarrolla un color rosado de eosina Ro4o 1e Me&ilo =RM<-

• Fncubar el tubo de M Q J# por 5< ± 2 !rs, adicionales a una temperatura de )8=$

despus de la prueba J#(

• A4adir 8 gotas de la solución ojo de Metilo a cada tubo(

• El color rojo indica que la prueba es positi'a; el amarillo que la reacción es

negati'a(

Ci&r"&o-• Fnocular a un tubo de $aldo de $itrato(

• Fncubar a ?9 ± 9 !rs a )8=$(

• El desarrollo de una turbidez distinta significa que la reacción es positi'a(

INTERPRETACI-N

FMJi$- ' ' ó ' ' ' ∴ E( $oli

"Oiotipo 7% "Oiotipo 2%

N N Enterobacter aerógenes

Blgo. Carlos Tome Ramos2)

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PRACTICA N.

DETERMINACI-N DEL NMERO M;S PROBABLE

INTRODUCCI-N

E/isten tres mtodos que se usan con ma&or frecuencia para calcular el n0mero de bacterias en

una muestra determinada-

7( ecuento :irecto al Microscopio

2( ecuento en #laca

)( 10mero más #robable

El n0mero más probable es una estimación de la densidad de los microorganismos 'iables enuna muestra, que se obtiene, aplicando a los resultados obtenidos, la teoría de la probabilidad(

.os resultados más fidedignos se obtienen cuando todos los tubos de la dilución más baja son

positi'os "es decir presentan multiplicación microbiana% & todo los tubos de la dilución más

alta son negati'os "o sea no presentan multiplicación microbiana%( .as diluciones de diez

'eces son los más sencillos de efectuar, & el inóculo frecuentemente de uso en series de 1M#

de ), 8, ó 7 tubos( .os límites de confianza del 1M# se estrec!an a medida que aumenta el

n0mero de tubos inoculados para cada dilución(

TABLAS DE NMP Y LÍMITES DE CONFIAN:A DEL 8 =TABLA * ( DE MAN<

.as combinaciones que no figuran en las tablas tienen mu& pocas probabilidades de

presentarse( i los resultados no corresponden con los de la tabla !a& que repetir la prueba con

la muestra original, & si esto no es posible, el 1M# puede obtenerse con la tabla 2( 3ambin

puede utilizarse una ecuación matemática para obtener una apro/imación de combinaciones

del 1M#(

$uando se preparan más de tres diluciones de una muestra, el 1M# debe determinarse

a partir 0nicamente de tres diluciones consecuti'os(


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eleccionar la dilución más alta "que tiene el menor 'olumen de la muestra% con tubos

positi'os & luego utilice las dos diluciones más altas que le siguen(

$uando ninguna de las diluciones sometidas a prueba da todos los tubos positi'os,

seleccionar "si es posible% las tres primeras diluciones consecuti'as cu&a dilución de un

medio !a&a dado positi'o(

$uando todos los tubos sean positi'os, e/presar el 1M# como ma&or del resultado de

la combinación ) Q ) Q 2 ó 8 Q 8 Q 5(

#ara obtener una apro/imación de combinación del 1M#, puede aplicarse la fórmula

de 3!omas-

# L Es el n0mero de tubos positi'os

1 L $antidad total de la muestra a todos

los

tubos negati'os

3 L $antidad total de la muestra en

todos los tubos(

A menudo es necesario calcular el 1M# a partir de 'ol0menes de la muestra inicialdistintos de los enumerados en los cuadros 7 & 2( i el ma&or 'olumen de muestra

usado para la referencia de la tabla es (7 gr( Multiplique por 7 el 1M# que aparece

en la tabla( :e modo análogo, si la porción ma&or usada para la referencia de la tabla

es 7 gr( En 'ez de (7 gr( :i'ídase por 7 el 1M# obtenido de la tabla(


# 1M# I g "ml% L

13

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PRACTICA N. H

DETERMINACI-N DE COLIFORMES POR M>TODOS R;PIDOS

INTRODUCCI-N3

.a utilización de mtodos rápidos de análisis para $oliformes & E(coli, que nos permitan

cuantificar sin necesidad de confirmaciones bioquímicas, resulta sumamente 'entajosa para la

industria de los alimentos especialmente los alimentos frescos, así como tambin para

muestras de agua & suelos, &a que nos permite liberar rápidamente los productos para el

consumo sabiendo que se cumple con la legislación 'igente, a la 'ez se disminu&en los costos

de almacenamiento & se ganan días del producto en la góndola( .os mtodos tradicionales para

el análisis de $oliformes totales & E( coli comprenden tres pasos sucesi'os de complejidad

creciente & el tiempo del análisis es de 5 a 9 días, dependiendo de los resultados( E/isten

diferentes propuestas de mtodos rápidos en el mercado para el recuento de E( coli &

$oliformes totales, que nos permiten obtener resultados en 25 !s(; tales como el caldo m

$oliOlue 25, $olilert, $M#A$3 :6 E$ etc(

I0' COLIFORMES EN EL MEDIO SOLIDO AGAR BILIS RO/O VIOLETA =VRBA<

MATERIAL Y M>TODO3

ealizar las diluciones seriados de la muestra en agua peptonada "(7%

3ransferir 2 alícuotas de 7 ml de cada dilución a placas de petri(

embrar en placas de la siguiente manera-a% #ara el mtodo con'encional, 'aciar 7 ml de JOA temperado a 5<=$ en las

placas & !omogeneizar( #ara predecir el crecimiento de la superficie & la

propagación de las colonias, cubrir con 8 ml JOA & dejar solidificar(

b% i se necesita la resucitación, 'erter una capa basal de < Q 7 ml de Agar de o&a

3riptica temperada a 5<=$ !omogeneizar e incubar a temperatura ambiente por 2

± (8 !rs( .uego cubrir con < Q 7 ml de JOA temperada & dejar que solidifique(

Fncuba por 7< Q 25 !rs( a )8=$( #ara productos lácteos a )2=$( $ontar colonias rojo p0rpura de (8 mm de diámetro & rodeados por zonas de ácidos

biliares precipitados(

#ara confirmación transferir cada colonia a un tubo con caldo .actosado Jerde

Orillante Oilis( Fncubar a )8=$ / 25 Q 5< !rs(


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eportar como u(f(c( I ml "gr(% de coliformes(

II0' COLIFORMES TOTALES Y E0 coli POR EL M>TODO DE FILTRACI-N POR

MEMBRANA(

MATERIAL Y M>TODO

>iltrar un 'olumen de 2 Q 7 ml muestra de agua en asepsia "'er fig(%(

Enjuagar por 2 ó ) 'eces con 'ol0menes de 2 ml de agua de dilución(

3ransferir la membrana a la superficie de una placa con el medio- Agar Endo les,

Agar m>c o Agar m Q >c Q D! o almo!adillas con el caldo m Q coli blue 25, e'itando

que se formen burbujas entre el medio & la membrana(

Fncubar- )8=$ / 25 !rs( las placas con- Agar Endo les $3 ufc I ml

m coli Olue 25 $3 ufcIml( "colonias rojas &

azules% o E( coli ufc I ml "solo las colonias azules%

55(8=$ / 25 !rs las placas con- Agar m >c

Jerificar 8 colonias del medio Endo les, transfiriendo con la a&uda del asa de siembra a

un tubo con caldo lactosado Jerde Orillante Oilis e incubar a )8=$ / 25 a 5< !rs(

#ara la lectura puede utilizar el microscopio e identificar mejor las colonias( eportar

sus resultados como u(f(c( I 7 ml

Blgo. Carlos Tome Ramos2D

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ANEOS

TABLA N. *0' Selección 1el NMP # e%&im"cione% 1e lo% l!mi&e% 1e conJi"nK" 1el 8 $"r"$r2e"% 1e &2o% 1e Jermen&"ción con &2o% 1e $ro$orcione% 1e )* ))* # )))* g0=ml0<

10mero de tubos positi'os,7 ,7 ,7

1M#Ig("ml%

2 7 2 7 27 27 7 57 7 57 2 92 52 7 D2 7 D2 7 7 ?2 2 ?2 2 ?) <) 7 77) 7 77) 7 7 75) 2 75

) 2 7 7D) ) 7D5 7)5 7 7D5 7 7D5 7 7 275 2 225 2 7 295 ) 2D5 ) 7 ))5 5 )5

8 2)8 7 )78 7 ))8 7 7 598 7 2 9)8 2 5?8 2 7 D8 2 2 ?

8 ) D?8 ) 7 778 ) 2 758 5 7)8 5 7 7D8 5 2 228 5 ) 2<8 5 5 )88 8 258 8 7 )88 8 2 858 8 ) ?28 8 5 79

Blgo. Carlos Tome Ramos2<

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TABLA N. (0' N,mero m5% $ro"le $or *)) ml0 1e m2e%&r" $l"n&e"n1o $orcione% en&re% 1il2cione% en %erie geom&ric"

10mero detubos positi'os7 7 ,7

1M#

7 7,< 2 ),9 ) 8,5 5 D,2 8 ? 7 7,< 7 7 ),9

7 2 8,8 7 ) D,) 7 5 ?,7 7 8 77 2 ),D 2 7 8,8 2 2 D,5 ) ) ?,2 2 5 77 2 8 7) ) 8,9

) 7 D,5 ) 2 ?,) ) ) 77 ) 5 7)


1M#

) 8 78 5 D,8 5 7 ?,5 5 2 77 5 ) 7) 5 5 78 5 8 7D 8 ?,5

8 7 77 8 2 7) 8 ) 78 8 5 7D 8 8 7?7 27 7 57 2 97 ) <7 5 77 8 72

7 7 57 7 7 9,77 7 2 <,77 7 ) 77 7 5 72


1M#

7 7 8 75

7 2 9,77 2 7 <,27 2 2 77 2 ) 727 2 5 787 2 8 7D7 ) <,)7 ) 7 77 ) 2 7)7 ) ) 787 ) 5 7D7 ) 8 7?7 5 777 5 7 7)7 5 2 787 5 ) 7D7 5 5 7?7 5 8 22

7 8 7)7 8 7 787 8 2 7D7 8 ) 7?7 8 5 227 8 8 25 10mero detubos positi'os7 7 ,7 1M#2 5,82 7 9,<

2 2 ?,72 ) 722 5 752 8 792 7 9,<2 7 7 ?,22 7 2 722 7 ) 752 7 5 7D2 7 8 7?2 2 ?,)

2 2 7 722 2 2 752 2 ) 7D2 2 5 7?2 2 8 222 ) 722 ) 7 752 ) 2 7D2 ) ) 7?2 ) 5 222 ) 8 282 5 782 5 7 7D2 5 2 2

10mero detubos positi'os

1M#

Blgo. Carlos Tome Ramos2?

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7 7 ,72 5 ) 2)2 5 5 282 5 8 2<2 8 7D

2 8 7 22 8 2 2)2 8 ) 292 8 5 2?2 8 8 )2) D,<) 7 77) 2 7)) ) 79) 5 2) 8 2)

) 7 77) 7 7 75) 7 2 7D) 7 ) 2) 7 5 2)) 7 8 2D) 2 75) 2 7 7D) 2 2 2) 2 ) 25) 2 5 2D) 2 8 )7


1M#

) ) 7D) ) 7 27) ) 2 25) ) ) 2<

) ) 5 )7) ) 8 )8) 5 27) 5 7 25) 5 2 2<) 5 ) )2) 5 5 )9) 5 8 5

Blgo. Carlos Tome Ramos)

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Blgo. Carlos Tome Ramos)7

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) 8 28) 8 7 2?) 8 2 )2) 8 ) )D) 8 5 57

) 8 8 585 7)5 7 7D5 2 275 ) 285 5 )5 8 )95 7 7D5 7 7 275 7 2 295 7 ) )7

10mero detubos positi'os7 7 ,7 1M#5 7 5 )95 7 8 525 2 225 2 7 295 2 2 )75 2 ) )<5 2 5 555 2 8 85 ) 2D5 ) 7 ))5 ) 2 )?5 ) ) 585 ) 5 825 ) 8 8?5 5 )55 5 7 55 5 2 5D5 5 ) 85

5 5 5 925 5 8 9?


1M#

7 7 ,75 8 575 8 7 5<5 8 2 895 8 ) 95

5 8 5 D25 8 8 <78 2)8 7 )78 2 5)8 ) 8<8 5 D98 8 ?88 7 ))8 7 7 598 7 2 95

8 7 ) <58 7 5 778 7 8 7)8 2 5?8 2 7 D


7 7 ,7

1M#

8 2 2 ?88 2 ) 728 2 5 788 2 8 7<8 ) D?8 ) 7 778 ) 2 758 ) ) 7<8 ) 5 27

8 ) 8 288 5 7)8 5 7 7D8 5 2 228 5 ) 2<8 5 5 )88 5 8 5)8 8 25

8 8 7 )88 8 2 858 8 ) ?28 8 5 798 8 8


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Blgo. Carlos Tome Ramos))

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