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Universidad Nacional de Rosario- Facultad de Ciencias

Bioquímicas y Farmacéuticas

Guía de ejercicios

Química Biológica

2013

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METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO

ESTRUCTURA Y CUANTIFICACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO

1. Se obtienen soluciones de cada uno de los siguientes azúcares en las concentraciones detalladas en cada caso: glucosa 1,8 mg/ml; maltosa 1,71 mg/ml y trealosa 1,71 mg/ml. Si 0,2 ml de un testigo 1 mM de glucosa dio una absorbancia de 0,180 al hacer la reacción de Somogyi-Nelson, calcule la absorbancia que se obtendría al hacer la determinación con 0,1 ml de las soluciones indicadas antes y después de la hidrólisis. 2. Una muestra que ha dado negativa la reacción de Fehling se ensaya en una alícuota de 0,1 ml para la reacción de Roe, obteniéndose un valor de absorbancia de 0,11 descontado el blanco. Después de sometida a un tratamiento con HCl concentrado una alícuota idéntica a la anterior presentó una absorbancia de 0,24 para el método de Somogyi-Nelson. Un testigo de fructosa 1 mM ensayado en alícuotas de 0,2 ml dio una absorbancia de 0,21 para el método de Somogyi-Nelson y 0,19 para el método de Roe. a) Indique qué tipo de sustancias presenta la muestra. Fundamente su respuesta. b) Exprese su concentración en mM. 3. Ud. dispone de tres tubos (A, B y C) conteniendo sacarosa, fructosa y glucosa (no necesariamente en este orden). Usando un testigo de fructosa 1 mM, decide hacer determinaciones por las técnicas de Somogyi-Nelson y Roe sobre los distintos tubos, obteniéndose los valores de absorbancia que se muestran en el cuadro. Las alícuotas utilizadas en las determinaciones fueron de 0,1 ml para el testigo y 0,3 ml para todas las muestras.

Técnica Testigo A B C Roe 0,25 0,11 0,33 0 Somogyi-Nelson 0,37 0,16 0 0,30 HCl + Somogyi-Nelson 0,37 0,16 0,96 0,30

a) Indique en qué tubo está cada sustancia. b) Calcule la concentración de sacarosa en el tubo correspondiente. 4. Una muestra de un oligosacárido que ha dado negativa la reacción de Fehling, se ensaya para la reacción de Roe y presenta un valor de absorbancia de 0,60 para una alícuota de160 µl. Luego se lo somete a una hidrólisis ácida y una alícuota de 50 µl registró una absorbancia de 0,95 para el método de Somogy-Nelson. Además, un testigo de fructosa 1,5 mM presentó las siguientes características:

Alícuota Método Absorbancia 0,2 ml Roe 0,30 0,1 ml S. N. 0,25

a) Indique una probable estructura del compuesto. Fundamente su respuesta. b) Exprese la concentración en mM. c) Si las alícuotas usadas para los dosajes por ambos métodos provienen de una solución 7 mg/ml del oligosacárido, calcule la pureza del mismo.

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5. En una muestra desconocida que ha dado positiva la reacción de Fehling, se ensayan las reacciones de Somogyi-Nelson y Roe en una alícuota de 0,3 ml dando los siguientes valores de absorbancia (descontado el blanco): Somogyi-Nelson = 0,31 y Roe = 0. Después de sometida a un tratamiento con HCl concentrado, la reacción de Somogyi-Nelson dio una absorbancia de 0,6 ensayada en la misma alícuota. Un testigo de fructosa 1 mM (0,4 ml) dio una absorbancia de 0,42 para el método de Somogyi-Nelson. a) ¿Qué tipo(s) de sustancia(s) contiene la muestra? Fundamente su respuesta. b) Exprese la concentración de la muestra en molar. 6. Por hidrólisis ácida de un trisacárido se obtiene D-glucosa y D-galactosa en relación 2:1. La metilación exhaustiva seguida de hidrólisis produce 2,3,4,6-tetra-O-metilgalactosa, 2,3,4,6-tetra-O-metilglucosa y 2,3,4-tri-O-metilglucosa. a) Designe el trisacárido. b) Indique cuales son los productos de la metilación exhaustiva seguida de hidrólisis de lactosa y sacarosa? 7. Se metilaron exactamente 81 mg de glucógeno y posteriormente se hidrolizaron en medio ácido. Los productos metilados se separaron e identificaron por cromatografía en capa fina. Se obtuvieron exactamente 62,5 µmoles de 2,3-di-O-metilglucosa. a) ¿Qué porcentaje del total de residuos de glucosa son puntos de ramificación? b) ¿Cuáles fueron los demás productos de metilación e hidrólisis y cuánto se formó de cada uno? c) Si el glucógeno descripto tiene un PM de 3.106, ¿cuántos residuos de glucosa contiene una molécula de este glucógeno? d) ¿Cuántos de estos residuos están en los puntos de ramificación? e) ¿Cuántos de estos residuos están en los extremos no reductores? 8. El reactivo de Tollens consiste en una solución de plata amoniacal que reacciona frente a grupos aldehídos libres oxidándolos hasta formar los ácidos carboxílicos correspondientes. El tratamiento de 6 g de una muestra de glucógeno con el reactivo de Tollens seguido por metilación exhaustiva y posterior hidrólisis produce 3,1 mmoles de 2,3-di-O-metilglucosa y 0,0031 mmoles de ácido 2,3,6-tri-O-metilglucónico además de otros productos. a) ¿Qué fracción de los residuos de glucosa forman parte de los puntos de ramificación y cuál es el número promedio de residuos de glucosa por ramificación? b) ¿Cuáles son los otros productos luego del tratamiento y en qué cantidad se forman? c) ¿Cuál es la masa molecular promedio de la molécula de glucógeno? 9. Con el objetivo de identificar el polisacárido predominante en una muestra de origen vegetal, se realizaron determinaciones con diferentes tratamientos hidrolíticos: I. La hidrólisis completa con HCl generó únicamente restos de glucosa. II. No se observó hidrólisis con celulasa. III. El tratamiento con alfa-amilasa produjo la liberación de unidades de glucosa, maltosa y de un núcleo grande y ramificado (dextrina). IV. El tratamiento con beta-amilasa produjo sólo maltosa y dextrina. Indique la posible identidad de la muestra, fundamentando su respuesta en base al modo de acción de las enzimas utilizadas. 10. Por tratamiento con periodato, una muestra de 100 mg de celulosa produjo 1,5 µmoles de ácido fórmico. ¿Cuál es la longitud aproximada de la cadena? 11. El almidón contiene generalmente alrededor de un 20% de una fracción insoluble en agua llamada amilosa y un 80% de una soluble llamada amilopectina. Se tratan 100 mg de gránulos de almidón con 50 ml de agua tibia para que difunda la fracción soluble. a) Dicha fracción rinde 0,049 mmoles de 2,3-di-O-metilglucosa por metilación e hidrólisis. ¿Qué porcentaje de los restos de glucosa se hallan en los puntos de ramificación? ¿Qué otros productos se han formado y en qué porcentaje? b) Considerando despreciable los producidos por los extremos reductores, ¿cuántos moles de ácido fórmico se formarán luego de tratar con periodato de sodio la fracción soluble?

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12. a) Calcule la concentración de un compuesto puro, que se encuentra disuelto en 2 ml de un solución que se somete a los siguientes ensayos: i) Roe: 0,1 ml de muestra presentaron una absorbancia de 0,2; mientras que un testigo de fructosa 5 mM presentó una absorbancia de 0,15 cuando se ensayó una alícuota de 0,15 ml. ii) Somogyi-Nelson: 0,4 ml de muestra dieron un valor de absorbancia de 0. iii) Somogyi-Nelson luego de hidrólisis ácida completa: 0,05ml de alícuota dieron una absorbancia de 0,60. Un testigo de fructosa 5 mM presentó una absorbancia de 0,40 cuando se ensayó una alícuota de 0,2 ml. b) Escriba la fórmula estructural del compuesto si los productos de su metilación exhaustiva e hidrólisis fueron los que se detallan aquí: 13. En cuatro tubos rotulados como A, B, C y D se encuentran 4 sacáridos puros por Ud. conocidos. Nombre el carbohidrato presente en cada uno y exprese su concentración en mM a partir de los siguientes datos: i) Después de la metilación exhaustiva seguida de hidrólisis ácida se obtuvo glucosa tetrametilada en los tubos B, C y D en concentración de 0,5; 1 y 0,5 mM, respectivamente; mientras que se obtuvo glucosa trimetilada en los tubos A y D presentando en ambos una concentración de 0,5 mM. ii) Utilizando 200 l para la prueba de Roe, sólo el tubo B presentó absorbancia siendo ésta de 0,194. iii) La prueba de Somogyi-Nelson sólo la dieron positiva los tubos A y D: 200l de los mismos presentaron una absorbancia de 0,206 y 0,207, respectivamente. iv) Para Somogyi-Nelson post-hidrólisis (150 l) se obtuvieron los siguientes valores de absorbancia: A: 0,308; B: 0,310; C: 0,309 y D: 0,308. v) Un testigo de fructosa 1,5 mM rindió una absorbancia de 0,310 para S-N con 100 l y 0,580 para Roe con 200l.

INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO Y PRINCIPIOS DE BIOENERGÉTICA

1. El cambio de energía libre estándard para la hidrólisis de glucosa-6-P a pH 7 y 25°C se ha medido como -3300 calorías/mol. Sabiendo que el cambio de energía libre estándard para la hidrólisis de glucosa-1-P en las mismas condiciones es de -5000 calorías/mol, calcule el G’ para la siguiente reacción a pH 7 y 25°C.

Glucosa-1-P <------> Glucosa-6-P

2. El G’ para la hidrólisis de un azúcar-P (a pH 7 y 25°C) es de -6,2 kcal/mol en una celda homogénea e hipotética en la cual las concentraciones del estado estacionario del azúcar-P, el azúcar libre y el Pi son 10-3 M; 0,2 mM y 5.10-2 M, respectivamente. ¿Cuál es el G’ para la reacción? El estado estacionario se refiere a una situación de no equilibrio que prevalece debido a un balance entre las reacciones que proveen y eliminan estas sustancias.

Azúcar-P + H2O <------> Azúcar + Pi

3. ¿Cuáles de las reacciones dadas abajo serán candidatas probables para acoplarse a la formación de ATP a partir de ADP y Pi? (considere que las condiciones de reacción son pH 7 y 25°C). El G’ de hidrólisis del ATP a ADP y Pi es -7300 cal/mol. G’ (cal/mol) Keq a) Fosfoenolpiruvato + H2O Piruvato + Pi 2,5.1010

CH2OCH3

OCH3

OCH3

OH

O

H3CO

CH2OH

OCH3

OCH3

OH

O

H3CO

O

OCH3

OH

CH2OCH3

H3COH2C

H3CO

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b) 3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato 1,8.10-1 c) Fructosa-6-P + H2O Fructosa + Pi -3200 d) Succinil-CoA + H2O Succinato + HSCoA -11000 4. La hexoquinasa cataliza la reacción:

ATP + Glucosa <----> Glucosa-6-P + ADP Keq = 2,21.103

Calcular la concentración mínima de glucosa-6-P necesaria para forzar a la reacción de la hexoquinasa a transcurrir en sentido contrario (en el sentido de la formación de la glucosa y ATP) en presencia de glucosa 10-5 M, ATP 10-3 M y ADP 10-4 M. 5. La combustión completa de la glucosa a CO2 + H2O tiene lugar con un G’ total de -686 kcal/mol. Cuando este proceso sucede en una célula típica, se producen 30-32 moles de ATP en forma concomitante a partir de ADP + Pi. a) Suponiendo que el G’ de hidrólisis del ATP a ADP + Pi es de -10 kcal/mol y que el G’ es aproximadamente igual al G’ para la oxidación de la glucosa bajo condiciones intracelulares, ¿qué fracción de la energía potencial de la glucosa se conserva en forma de ATP? b) ¿Qué le ocurre a la energía que no se conserva en forma de ATP?

GLUCÓLISIS. FERMENTACIÓN

1. a) Escriba las ecuaciones balanceadas del catabolismo de la glucosa en dos moléculas de gliceraldehído-3-P, indicando las reacciones que son irreversibles bajo condiciones intracelulares típicas. Luego escriba la ecuación final de la primera fase de la glucólisis. b) El gliceraldehído-3-P es convertido a piruvato durante la segunda fase de la glucólisis. Escriba las ecuaciones balanceadas de este proceso y la ecuación neta.

2. Se incuba glucosa marcada en el 14C1 con las enzimas glucolíticas y los cofactores y sustratos

necesarios. ¿Cuál es la distribución de 14C en el piruvato? Realice el mismo seguimiento con glucosa marcada en C2, C3, C4, C5 y C6.

3. La hexoquinasa muscular y la glucoquinasa hepática son isoenzimas ya que ambas catalizan la fosforilación de la glucosa en el primer paso de la glucólisis. La enzima de músculo tiene una Km de 0,1 mM y la de hígado una Km de 10 mM. Teniendo en cuenta que la concentración de glucosa normal en sangre es cercana a 5 mM, ¿cuál es la importancia fisiológica de esta diferencia? 4. La gliceraldehído-3-P deshidrogenasa puede reemplazar al fosfato por arseniato como sustrato. El producto resultante es el 1-arseno-3-fosfoglicerato, un compuesto inestable que se hidroliza a arseniato y 3-fosfoglicerato. Escriba una ecuación balanceada para la glucólisis en presencia de arseniato reemplazando al fosfato. Analice el rendimiento de ATP del proceso en estas condiciones. 5. Se incubaron en condiciones estrictamente anaeróbicas 0,5 ml de extracto de levaduras (conteniendo 4,8 mg/ml de proteína) en 50 mM MES pH 5,5, NaPi en exceso y con glucosa como única fuente de carbono en un volumen final de 2 ml. A los 20 minutos se tomaron dos alícuotas determinándose 30 moles de etanol en 0,1 ml y 80 moles de glucosa en 0,2 ml. a) Calcule la concentración de glucosa inicial en mM, considerando que la única vía de la degradación de la

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glucosa es la fermentativa. b) Determine los moles de 14CO2 producidos a los 30 minutos si la glucosa estaba marcada con 14C1.y, alternativamente, en C3. c) Explique cómo se afectaría la velocidad de consumo de glucosa si las levaduras son incubadas en condiciones aeróbicas. 6. La fructosa se encuentra en el semen de humanos y bovinos en concentraciones superiores a 12 mM. Los espermatozoides usan la fructosa anaeróbicamente para producir el ATP necesario para el movimiento flagelar. La ruta catabólica más importante de fructosa a lactato en estas células cortocircuita la reacción de la fosfofructoquinasa de la glucólisis mediante el uso de una enzima que rompe la fructosa-1-P en dos compuestos de tres átomos de carbono. Escriba las ecuaciones para la secuencia de transformaciones químicas involucradas. Escriba la ecuación neta para el catabolismo anaeróbico de la fructosa a lactato en los espermatozoides. 7. En dos tubos diferentes se incubaron extractos celulares de músculo de conejo (tubo A) y de

levaduras (tubo B) con fosfato y glucosa marcada isotópicamente (14C) en forma uniforme en un medio anaeróbico (con NaN3) a pH 5 y 30°C. Las medidas de radiactividad, en alícuotas iguales de

medio, a tiempo cero (antes de agregar las células) y luego de 1 hr. de incubación se muestran en la siguiente tabla:

% de RADIOACTIVIDAD Tiempo (min) Tubo A Tubo B

0 100 100 60 98 65

a) ¿Qué explicación encuentra para estos resultados? b) Construya una tabla con los valores teóricos de % de radioactividad que esperaría encontrar si

el experimento se realizara en idénticas condiciones pero con (14C1) glucosa.

c) Igual que en b) pero con (14C3) glucosa.

8. Se prepararon varios tubos de ensayo que contenían 1 ml de levaduras (2.107 células/ml), 1 ml de una solución reguladora y 3 ml de una solución de glucosa 5 mM. A tiempo 0 se les hicieron los agregados (volúmenes despreciables) que se detallan en la columna A de la tabla y se tomó una alícuota de cada mezcla (volumen despreciable), la cual se hizo reaccionar por el método de la glucosa oxidasa obteniéndose los valores que se indican en la columna B. Luego de 30 minutos se repitió la operación (los datos obtenidos figuran en la columna C). Todos los valores de absorbancia han sido obtenidos en idénticas condiciones de ensayo. a) Una con flechas los datos de la columna C a los de las columnas A y B según lo esperado para el consumo de azúcar en cada condición. Determine la velocidad de consumo de glucosa en

µmol/min.106 células para cada caso. Compare los resultados obtenidos. b) Teniendo en cuenta que el consumo de glucosa es lineal en función del tiempo, ¿cuándo será consumida totalmente la glucosa en los casos anteriores?

A B C AGUA 0,80 0,20

Pi 50 Mm 0,79 0,78 Pi + NaN3 0,82 0,78 Pi + NaF 0,80 0,47

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9. Se desea estudiar el efecto de tres compuestos (A, B y C) sobre la vía glucolítica. Para ello, se utiliza una suspensión de levaduras aplicando el protocolo que se muestra en la tabla (todos los volúmenes están expresados en ml). Después de incubar 30 minutos a 30°C, se midió la absorbancia obtenida por el método de la glucosa oxidasa en alícuotas de 0,4 ml (volumen final de lectura de 3 ml).

Tubo Glucosa 50 mM

A B C Buffer Cél. (x106) A - Abco.

1 1 - - - 1,5 1,5 0,50 2 1 0,2 - 1 0,3 1,5 0,50 3 1 - 0,7 - 0,8 1,5 0,18 4 1 - - 1 0,5 1,5 0,32

Se realizó una curva de calibración a partir de una solución de glucosa 50 mM utilizándose el mismo método de dosaje (volumen final de lectura de 3 ml).

Tubo 1 2 3 4 Glucosa (50 mM) 0,2 ml 0,15 ml 0,10 ml 0,05 ml

A - Abco. 0,99 0,74 0,50 0,26 a) Calcule la velocidad de consumo de glucosa en cada tubo expresada en µmol por minuto. b) Proponga que compuestos podrían ser A, B y C. c) Determine el sitio y modo de acción de estos compuestos. 10. Un investigador desea estudiar el metabolismo de hidratos de carbono en Brassica nigra, una variedad de mostaza. Para ello prepara suspensiones celulares partiendo de hojas, separa la preparación en dos fracciones de 250 ml y las coloca en agitación. Una de las muestras es la control, con un medio de cultivo adecuado para que las células realicen sus funciones normales; y la otra es sometida a un tratamiento de privación de fosfato (Pi). Cuando luego de unos días realiza mediciones de actividades enzimáticas en la muestra tratada encuentra que se han inducido las enzimas indicadas en la tabla:

Enzima Reacción que cataliza PFP Fru-6-P + PPi Fru-1,6-bP + Pi

G3PdH no fosforilante Oxidación de Gliceraldehído-3-P sin incorporación de Pi utilizando NADP+ como aceptor de electrones

PEP fosfatasa Hidrólisis del enlace fosfato del PEP En base a estas observaciones: a) Escriba la ecuación neta balanceada de la glucólisis desde glucosa-6-P hasta piruvato en ambas muestras. ¿Qué diferencia encuentra? ¿Qué ventajas confiere a estas plantas la inducción de las mencionadas actividades enzimáticas teniendo en cuenta el estrés al que están sometidas? b) Partiendo de una [glucosa inicial] en el medio de 20 mM, se determina la concentración de glucosa a los 25’ por el método de la Glucosa Oxidasa utilizando una dilución 1/50 de las muestras. Se obtiene una A= 0,259 para el control y una A= 0,478 para la muestra tratada. Un testigo 0,5 mM dio una lectura de 0,724. Considere en todos los casos una A blanco= 0,005. ¿Cuál fue el consumo de glucosa en cada caso si el contenido de proteínas es de 1,1 y 0,88 mg/ml en la muestra

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control y en la muestra tratada, respectivamente? Exprese el resultado en moles/min.mg de proteína.

CICLO DE KREBS

1. El ciclo del ácido cítrico utiliza 8 enzimas para catabolizar el acetil-CoA. a) Escriba la ecuación balanceada para la reacción catalizada por cada enzima. b) ¿Qué cofactores se requieren en cada reacción enzimática? c) Para cada enzima indique el tipo de reacción que cataliza: condensación (formación de un enlace C-C), deshidratación, hidratación, descarboxilación, oxidorreducción, fosforilación a nivel de sustrato, isomerización. d) Escriba la ecuación neta balanceada para el catabolismo del acetil-CoA a CO2.

2. Un cultivo bacteriano respirando activamente es incubado con glucosa 14C1 y, posteriormente,

se aislan los intermediarios de la glucólisis y del ciclo del ácido cítrico. ¿Dónde estará el 14C en cada una de las siguientes sustancias? Considerar sólo la incorporación inicial de 14C en tales compuestos: a) Fructosa-1,6-bisP; b) Gliceraldehído-3-P; c) Fosfoenolpiruvato; d) Acetil-CoA; e) Citrato; f) -Cetoglutarato; y g) Oxaloacetato. ¿Cuántas vueltas del ciclo son necesarias para que todo el 14C se desprenda como CO2? 3. Se incuba piruvato marcado en el 14C2 con una suspensión de mitocondrias. Determine: a) el número de carbono en que aparecerá inicialmente marcado el fumarato. b) cuántas moléculas de CO2 se generan en la secuencia de reacciones desde piruvato a fumarato. c) en esa misma secuencia, cuántas moléculas de alta energía (ATP y GTP) se generan, considerando la oxidación de NADH y FADH2 en la cadena de transporte de electrones. d) Explique qué efecto tendría sobre el funcionamiento del ciclo de Krebs si se somete a condiciones anaeróbicas esta suspensión mitocondrial. e) De un ejemplo de una reacción (indicar nombre, sustratos y productos) que sirva para re-abastecer el ciclo de Krebs de intermediarios que se utilizan para reacciones biosintéticas. 4. La respiración celular puede ser estudiada usando preparaciones de mitocondrias aisladas y midiendo su consumo de O2 bajo diferentes condiciones. Si se agrega 10mM de malonato de sodio a

mitocondrias que se encuentran respirando activamente usando piruvato como fuente combustible, la respiración se detiene rápidamente. Explique por qué sucede ésto, indicando el efecto del malonato sobre la glucólisis, el ciclo de Krebs y el consumo de O2.

5. El transporte de malato y -cetoglutarato a través de la membrana mitocondrial interna es bidireccional e inhibido por n-butilmalonato. a) De acuerdo a sus conocimientos sobre metabolismo, explique en qué proceso(s) está involucrado este sistema de transporte; b) Considerando que la lanzadera Malato/Asp es la única presente en hígado, determine el rendimiento de ATP en una suspensión aeróbica de células hepáticas que oxidan completamente la fructosa en los siguientes casos: CASO 1: 1mol de fructosa; CASO 2: 1mol de fructosa + n- Butilmalonato; c) Prediga el efecto del n-butilmalonato sobre la glucólisis.

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GLUCONEOGÉNESIS. CICLO DEL GLIOXILATO

1. ¿Es posible obtener síntesis neta de oxaloacetato agregando acetil-CoA en un homogenado mitocondrial que contiene las enzimas y cofactores del ciclo del ácido cítrico? Fundamente su respuesta mediante ecuaciones balanceadas. 2. Un procedimiento usado para determinar la efectividad de compuestos no glucosídicos como precursores de glucosa es ayunar al animal hasta que sus reservas de glucógeno hepático se agoten y luego administrar el sustrato a estudiar. Un sustrato que conduce a un incremento neto en el glucógeno hepático es denominado glucogénico, éste debe primeramente ser convertido en glucosa-6-P. a) Demostrar por medio de reacciones enzimáticas conocidas cuál o cuáles de los siguientes sustratos son glucogénicos.

a) Piruvato b) Lactato c) Glicerol d) Succinato e) Aspartato

b) Si la relación NADH/NAD+ en el citosol fuera muy alta, ¿a partir de cuál de estos compuestos (a-d) se bloquearía la gluconeogénesis? 3. Si en un extracto de hígado de rata que lleva a cabo gluconeogénesis a partir de piruvato se adiciona HCO3- marcado (14C), ¿cuál o cuáles carbonos de la glucosa resultarán marcados? Si en el experimento anterior se suprime el HCO3- marcado y se adiciona piruvato marcado uniformemente con 14C, ¿cuál o cuáles átomos de la glucosa resultarán marcados? 4. La avidina es un potente inhibidor de las reacciones que requieren biotina.¿Qué reacciones involucradas en la gluconeogénesis serán inhibidas en un extracto de hígado de rata al adicionar avidina? 5. Un homogenado de hígado fue incubado en un medio que contenía lactato 10 mM como única fuente de carbono y ATP 50 mM (volumen final de 3 ml). Al cabo de 30 minutos la concentración de lactato fue 0,13 mM. a) Calcule la velocidad de consumo de lactato expresándola en μmoles/min. En base a este dato y suponiendo que todo el lactato se convierte en glucosa, ¿qué velocidad de producción de glucosa esperaría encontrar? b) Luego de 25 minutos de incubación mediante el método de glucosa oxidasa se obtuvo un valor de absorbancia 0,150 utilizando una alícuota de 0,2 ml de la muestra, mientras que una alícuota de 0,1 ml de un testigo de glucosa 2 mM dio una absorbancia de 0,100. Calcule la velocidad de producción de glucosa expresándola en μmoles/min. c) En base a los datos obtenidos en los items a) y b), ¿qué destinos metabólicos tuvo el resto del lactato consumido? 6. Ciertas cepas mutantes de levaduras pueden crecer en un medio mínimo utilizando como única fuente de carbono el etanol. Esto lo logran invirtiendo la dirección de la reacción de la última enzima de la fermentación alcohólica (E1). El producto de esta reacción es oxidado por una deshidrogenasa (E2) a un ácido carboxílico de dos carbonos que finalmente se condensa con la coenzima-A por E3. a) Esquematice la ruta de reacciones desde etanol hasta el producto condensado con CoA, nombrando las enzimas (E1, E2 y E3) y sus productos. b) El producto de E3 es utilizado por la levadura para generar intermediarios de cuatro carbonos para la biosíntesis de aminoácidos y glucosa. ¿Qué ruta anaplerótica le permite a la levadura crecer en etanol?. Esquematice la ruta hasta la generación de succinato e indique la ecuación global balanceada. c) Si la levadura crece con etanol marcado con 14C en el C2. ¿Dónde aparecerá la marca en el succinato?

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7. Bacterias como Escherichia coli pueden vivir en medios conteniendo acetato como única fuente de carbono y energía. Parte del acetil-CoA generado (reacción de la enzima acetil-CoA sintetasa) es utilizado para generar ATP y NADH y parte para sintetizar glucosa. a) ¿Cuál es la cantidad mínima de acetato que necesitan estas bacterias para sintetizar 1 mmol de glucosa, considerando que la energía y el poder reductor requeridos provienen de la oxidación completa del acetato a CO2?. Justifique. b) ¿Cuál es la importancia del ciclo del glioxilato en semillas en germinación? 8. Se incubó acetil-CoA marcado con 14C en el grupo metilo en un tubo A con un extracto hepático de una rata sometida a un ayuno prolongado y en un tubo B con un extracto de E. coli.¿Podría aislar glucosa marcada radiactivamente en el tubo A y en el tubo B? Explique su respuesta indicando la ruta que seguiría el acetil-CoA en cada tubo. 9. En un experimento, se incuba durante 1 hora un extracto hepático con las organelas intactas con un pulso de los siguientes compuestos marcados: I) oxaloacetato marcado con 14C en C4 y II) acetil-CoA marcado con 14C en el grupo metilo. a) Indique si en algún tubo obtendrá glucosa marcada. En caso afirmativo, indique las enzimas involucradas en la síntesis de glucosa marcada. En caso negativo, justifique mediante ecuaciones la pérdida de la marca radiactiva. b) ¿En qué caso obtendrá la síntesis de glucosa de manera neta? Justifique. c) Indique si la síntesis neta de glucosa del caso b es inhibida por: i) avidina; ii) un inhibidor de la malato deshidrogenasa; iii) Fructosa2,6-biP; iv) inhibidor del transporte de glucosa6P del retículo endoplasmático. Justifique en cada caso.

VÍA DE LAS PENTOSAS FOSFATO

1. Se realiza el siguiente experimento con isótopos para determinar qué fracción del catabolismo de la glucosa procede vía glucólisis vs vía de las pentosas: Células hepáticas se dividen en dos fracciones; una de ellas se incuba con glucosa 14C1, y la otra con glucosa 14C3. Se comparan las velocidades iniciales por las cuales la marca aparece como CO2. a) Explique las bases químicas del diseño experimental. b) ¿Con qué extracto se obtendrá mayor cantidad de 14CO2, al incubarlo con glucosa 14C1? Extracto de miocitos de músculo esquelético que se encontraba realizando una contracción vigorosa. Extracto de hepatocitos que se encontraban sintetizando ácidos grasos. 2. ¿Cuál es la estequiometría de la síntesis de NADPH desde glucosa-6-P, sin la formación neta de pentosa? 3. Se incuba 2.9 ml de una solución de glucosa 5 mM con 100 μl de un extracto de tejido adiposo (5.106 células/ml) cuyas células requieren grandes cantidades de NADPH para poder realizar biosíntesis reductoras. Es por eso que el 80% de la glucosa es metabolizada completamente a CO2 por la vía oxidativa del shunt de las pentosas en 1392 segundos. a) Calcule la velocidad de consumo de glucosa y velocidad de producción de NADPH y CO2 por dicha vía (μmol/min.106 células). b) Se observó que se producen 2 μmol/min.106 células de CO2 marcado por la vía oxidativa del shunt ¿en cuántos carbonos estaba marcada la glucosa?

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4. ¿Cuál es la estequiometría de la síntesis de ribosa-5-P desde glucosa-6-P, sin la generación de NADPH? 5. Se agregan 75 nmoles de ribosa-5Pi marcada con 14C1 a una solución que contiene las siguientes enzimas: transcetolasa, transaldolasa, fosfopentosa epimerasa y fosfopentosa isomerasa. a) ¿Cuál es la distribución de la marca radiactiva en el gliceraldehído-3-Pi y en la fructosa-6-Pi que se forman en el medio de reacción? b) Escriba una ecuación de la reacción global, suponiendo que a los 30 minutos las reacciones son completas. c) Si la cantidad de fructosa-6-Pi producido en el item a se incubara en una cubeta de 1 ml con NADP+ 0,04mM y las enzimas hexosaisomerasa y glucosa-6-Pi deshidrogenasa por un tiempo suficiente para completar las reacciones, ¿cuál sería la variación de la absorbancia que se registraría en la cubeta? 340 NADPH = 6,2mM -1 .cm-1. 6. Se incubaron a 37°C 0,5 ml de un extracto de levaduras libre de mitocondrias (conteniendo 1mg/ml de proteína), con 2 ml de una solución de glucosa 0,5M en un volumen final de 3 ml. A los 30 minutos se sacaron 2 alícuotas de 0,1 ml cada una, determinándose en una de ellas 13,3 μmoles de glucosa, y en la otra 30 μmoles de etanol. a) Determine la velocidad de consumo de glucosa y la de producción de etanol, expresándolas en μmoles/min.mg prot. b) Suponiendo que la velocidad de consumo se mantiene constante en función del tiempo, determine cuándo se consume toda la glucosa agregada. c) Nombre la/s vía/s involucradas en la utilización de la glucosa, y diga qué porcentaje de glucosa es degradada por cada una ellas. d) Si se agrega glucosa marcada radiactivamente en C1, ¿qué cantidad de 14CO2 se desprende en 10 minutos? 7. Se incubó glucosa-14C6 con una suspensión de eritrocitos en presencia de un potente inhibidor de la fosfoglucoisomerasa. Al cabo de un tiempo se detectó la presencia de piruvato marcado con 14C. ¿Mediante qué vía metabólica se llegó a la producción del piruvato marcado? Detalle la vía e indique qué % de la población de piruvato espera encontrar marcado y en qué carbono. 8. Leuconostoc mesenteroides es una bacteria que carece de la enzima aldolasa, por lo cual la vía de las pentosas fosfato es fundamental. Además, posee ciertas enzimas extra que le permite generar etanol y lactato. Una de estas enzimas es la fosfocetolasa que cataliza la siguiente reacción: Ribulosa 5P + Pi Acetil-P + Gliceraldehído 3P. El Acetil-P por una serie de enzimas da lugar a la producción de etanol, mientras que el Gliceraldehído 3P formará lactato por la vía glucolítica. Se realiza un extracto de estas bacterias y 40 μl del mismo se utilizan para determinar la concentración de proteínas por el método de Lowry (volumen final 5 ml), obteniéndose una absorbancia de 0,6. Un testigo de albúmina (20 μl) de una concentración 2 mg/ml dio una absorbancia de 0,6 por el mismo método. 0,5 ml del extracto de bacterias se incuba, en condiciones anaeróbicas, con 10 μl de una solución de glucosa 1 M en un volumen final de 3 ml. Al cabo de 20 min se extrae una alícuota de 300 μl y se determina una absorbancia de 0,40 por el método de la glucosa oxidasa. Una alícuota de 0,5 ml de un testigo de glucosa 1 mM dio, por el mismo método, una absorbancia de 0,50. Calcule la velocidad de consumo de glucosa y las velocidades de producción de CO2, lactato y etanol. Exprese los resultados en μmol/min.mg de proteína.

METABOLISMO DEL GLUCÓGENO. DISTURBIOS METABÓLICOS

1. ¿Cuántos enlaces fosfato de alto contenido energético se consumen durante la síntesis de glucógeno a partir de: a) 1 mol de glucosa-1-fosfato, b) 1 mol de fructosa 1,6 bisfosfato, c) 1 mol de glucosa, d) 1 mol de oxaloacetato.

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2. Determine el balance energético del proceso por el cual un residuo de glucosa almacenado como glucógeno en el músculo es convertido anaeróbicamente a lactato, el cual es transportado luego por vía sanguínea hasta el hígado donde sirve como sustrato para la gluconeogénesis, con incorporación del azúcar formado al glucógeno hepático. Exprese el resultado como enlaces fosfato de alta energía producidos o consumidos. 3. Considerando una molécula de glucógeno de masa molecular 105 (PM residuo glucosa: 162) y en la cual el 10% de los residuos son puntos de ramificación, indique: a) la cantidad de ATP total que se formaría al degradarla hasta piruvato; b) ¿cuánto ATP sería necesario para sintetizar dicha molécula de glucógeno a partir de piruvato?. c) Analice el balance neto de ATP entre las dos vías. 4. Un homogenado de hígado (Vf = 3mL) es incubado con glicerol marcado en el carbono 2. Luego de 20 minutos se determinó la formación de 0,8 μmoles de glucógeno en una alícuota de 1ml. a) ¿Cuántos enlaces de alta energía fueron necesarios para la síntesis de dicha cantidad de glucógeno (masa molecular promedio de glucógeno: 105). b) ¿En qué carbonos se encuentran marcados los residuos de glucosa presentes en el glucógeno. c) Esquematice la vía indicando los residuos marcados, nombre las enzimas y sus cofactores. 5. Existe una enfermedad genética fatal en la cual la actividad fosforilasa del hígado es deficiente, pero la actividad de la glucógeno sintasa es normal. ¿Qué síntomas manifestaría un paciente con esta enfermedad? 1) Baja glucosa en sangre. 2) Alta glucosa en sangre. 3) Bajos niveles de glucógeno hepático. 4) Altos niveles de glucógeno hepático. 6. a) Calcule cuántos enlaces de alta energía son necesarios para sintetizar una molécula de glucógeno de PM 57348 a partir de malato. Justifique indicando las reacciones involucradas y la reacción global balanceada. b) Describa un ejemplo de regulación covalente y uno de regulación alostérica de enzimas implicadas en el metabolismo del glucógeno, especificando la relevancia fisiólogica de dichas regulaciones. 7. Una muestra de tejido hepático fue obtenida post-mortem del cuerpo de un paciente, probablemente con deficiencias genéticas en una de las enzimas del metabolismo de carbohidratos. El homogenado de la muestra de hígado tiene las siguientes características: i. Degrada glucógeno a glucosa-6-P. ii. Fue incapaz de sintetizar glucógeno a partir de cualquier azúcar o utilizar galactosa como fuente de energía. iii. Sintetizó glucosa-6-P a partir de lactato. Indique a cuál de las siguientes enzimas podría atribuirse la deficiencia de este tejido: a. Glucógeno fosforilasa. b. Fructosa bisfosfatasa. c. UDP-glucosa pirofosforilasa. Explique el motivo de su elección. 8. En un experimento, se suministra a un voluntario en reposo una pequeña cantidad de lactosa uniformemente marcada con 14C. Un estudio efectuado 24 horas después demuestra que la marca radiactiva se encuentra distribuida en 2 fracciones bien definidas: 40 % en gran parte de la masa corporal, mientras que el 60 % restante se ubica en el hígado. Una muestra de sangre obtenida en ese

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momento no presenta radiactividad. Luego de transcurridas 72 horas se somete al individuo a actividad física intensa pero de corta duración. Una muestra de sangre obtenida en este momento presenta radiactividad, no así el aire espirado por el sujeto. a) Explique la distribución inicial de la radiactividad. b) Indique qué compuesto(s) podría(n) ser responsables de la radiactividad en la sangre. 9. Un niño de dos años, de muy bajo desarrollo para su edad, es internado con convulsiones en el servicio de terapia intensiva pediátrica de un hospital. El nivel de glucosa en su sangre al ingreso es de 24 mg/dl (valor normal: 70-110 mg/dl). El médico comprueba, además, que el niño presenta un hígado aumentado de tamaño. El paciente es tratado con una dieta hipertónica para aumentar su glucosa sanguínea, pero el valor de la misma se mantiene siempre muy por debajo del valor normal (hipoglicemia). Ante la sospecha de una deficiencia enzimática, se decide inyectar al niño por vía endovenosa glucosa marcada uniformemente con 14C. Al cabo de unas horas se practica biopsia hepática y muscular, encontrándose en ambos tejidos glucógeno marcado radiactivamente y de estructura normal. En hígado se encuentra, además, la acumulación de un azúcar-P marcado radiactivamente. Indique a qué deficiencia enzimática podría correlacionar este caso: a) glucógeno fosforilasa; b) -1,6 glucosidasa; c) glucosa-6-fosfatasa; d) UDP-glucosa pirofosforilasa. Explique el por qué de su elección y por qué descarta las otras tres posibilidades. Indique la reacción catalizada por la enzima elegida y su localización subcelular.

CADENA RESPIRATORIA. FOSFORILACION OXIDATIVA

1. Los grupos prostéticos hemo de los citocromos mitocondriales son esencialmente idénticos en su estructura. ¿Puede explicar en términos generales, cómo es posible que sus potenciales de media celda difieran en más de 0,2 V? 2. Cuatro transportadores: a, b, c y d, cuyas formas reducidas y oxidadas pueden ser distinguidas espectrofotométricamente, se requieren para la respiración en un sistema de transporte de electrones bacteriano. En presencia de sustrato y oxígeno, tres inhibidores diferentes bloquean la respiración, obteniéndose los patrones de los estados de oxidación que aparecen en la Tabla. ¿Cuál es el orden de los transportadores en la cadena desde los sustratos hasta el oxígeno?

Tabla: Efecto de los inhibidores sobre los niveles de oxidación de los transportadores en una vía hipotética de transporte de electrones (+ y - indican las formas totalmente oxidadas y reducidas, respectivamente).

INHIBIDOR a b c d 1 + + - + 2 - - - + 3 + - - +

3. Un laboratorio farmacéutico le envió a usted muestras de dos nuevos compuestos metabólicos para caracterizarlos como posibles antibióticos. Utilizando una preparación aislada de mitocondrias de hígado e incubada con piruvato, O2, ADP, y Pi, usted observa que la adición del compuesto "A" bloquea tanto el transporte de electrones como la fosforilación oxidativa. Cuando agrega el compuesto "B" además del "A", observa con sorpresa que se restablece el transporte de electrones pero no la fosforilación oxidativa. a) ¿Cómo clasificaría estos compuestos teniendo en cuenta su

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modo de acción en el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa? b) Nombre un par de sustancias conocidas que podrían dar el mismo resultado. 4. Si la rotenona se agrega a la cadena transportadora de electrones mitocondrial, determinar si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas: el índice P/O del NADH se reduce de 2,5 a 1,5 la velocidad de oxidación del NADH disminuye a 2/3 de su valor inicial. la oxidación del succinato permanece normal. el flujo de electrones está inhibido en el sitio 2. 5. Una suspensión de mitocondrias consume 24 µmol O2/min en presencia de malato y glutamato. Al agregar 2,3 mmoles de ADP y Pi en exceso el consumo se acelera a 178 µmol O2/min durante 3 min para luego retornar a la velocidad inicial. a) Explique a qué se debe la aceleración transitoria del consumo de oxígeno. b) calcule el control respiratorio e índice P/O. c) Explique cómo afectaría un inhibidor de la transferencia de energía (inhibidor ATPasa) a la velocidad de consumo de oxígeno y el índice P/O. 6. Se agregaron 0,1 ml de una suspensión conteniendo partículas submitocondriales (con una concentración de proteína de 5 mg/ml) a 2,9 ml de una solución amortiguadora (pH: 7,2) en una cubeta termostatizada de un oxígrafo. Las medidas de consumo de oxígeno obtenidas ante el agregado de diferentes compuestos se muestran en el gráfico adjunto. En base a estos datos: a) Calcule la velocidad de consumo de O2 en cada caso, expresándola en µmol/min.mg de proteína. b) Calcule el índice P/O. c) Caracterice lo mejor posible a los compuestos X, Y, Z y A. d) ¿Qué velocidad de consumo de O2 esperaría medir si a los 3,9 minutos (flecha en línea de puntos) se agregara nuevamente ADP y Pi (iguales cantidades que anteriormente)? ¿Durante cuánto tiempo?

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7. El gráfico muestra el trazado obtenido en un oxígrafo al incubar partículas submitocondriales a 30 °C, en un medio a pH: 7,5. Caracterice cada uno de los compuestos agregados (A, B, C, etc.). Justifique brevemente el efecto de cada compuesto sobre la velocidad de consumo de O2.

Tiempo (min)

[O2] (

mM

)

AB

C D

G

E

F

H

I

B

E

8. La inyección de dinitrofenol a una rata produce un aumento inmediato en su temperatura corporal. ¿Puede explicar por qué? 9. Relacione los siguientes compuestos con sus respectivos comportamientos:

a) rotenona 1) inhibe la fosforilación oxidativa cuando el sustrato es piruvato pero no cuando el sustrato es succinato.

b) dinitrofenol 2) inhibe la fosforilación oxidativa cuando el sustrato es piruvato y/o succinato.

c) antimicina A 3) permite que el piruvato sea oxidado por la mitocondria aún en ausencia de ADP.

10. El consumo de O2 obtenido de una suspensión de partículas submitocondriales usando succinato como sustrato fue: Estado 4 = 40 µmoles O2/min Estado 3 = 80 µmoles O2/min Estado desacoplado = 200 µmoles O2/min Se agrega luego 50 µl de una sustancia X y se vuelve a medir la velocidad de consumo de O2 en los 3 estados anteriores. Indique qué velocidad de consumo de O2 obtendría en cada estado si: a) X = malonato b) X = oligomicina c) X = rotenona 11. Indique si las afirmaciones hechas a continuación son verdaderas o falsas. a. El dispositivo molecular para la respiración se encuentra sólo en las células eucariotas. b. Las proteínas transportadoras de electrones que tienen FAD como grupo prostético se denominan citocromos. c. La relación P:O es igual a 2,5 para el FADH2 en la mitocondria. d. El amital bloquea la formación del ATP de la oxidación del isocitrato, pero no de la del succinato.

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e. En presencia de un desacoplante la energía obtenida del transporte de electrones se disipa como calor. f. Si la concentración de ADP intracelular es baja, la adición de un desacoplante retarda el transporte de electrones. 12. La oligomicina y el cianuro inhiben la fosforilación oxidativa cuando el sustrato es piruvato o succinato. El dinitrofenol puede se usado para distinguir entre estos dos inhibidores. Explique. 13. Se prepararon mitocondrias y se determinó el consumo de O2 en 0,2 ml de la preparación en estado 4, en estado 3 y desacoplado, en presencia y en ausencia de una sustancia M (ver tabla). Indique que tipo de inhibidor es M y justifique su respuesta.

CONDICIÓN SUSTANCIA M (nM)

CONSUMO DE 02 (µmol O/min)

ESTADO 4 0 11ESTADO 4 0,5 4ESTADO 3 0 70ESTADO 3 0,5 7

DESACOPLADO 0 205DESACOPLADO 0,5 9

14. a. Se determinó (en presencia de distintas concentraciones de las sustancias "A" y "B") la velocidad de consumo de oxígeno en mitocondrias intactas en las siguientes condiciones: estado "3", estado "4" y en presencia de un desacoplante. El sustrato empleado fue malato-glutamato. Los resultados se grafican abajo. Indique si la sustancia "A" y “B” son inhibidores de la síntesis de ATP, de la cadena respiratoria o un desacoplante. Justifique brevemente.

b. Se estudió el efecto de distintas concentraciones de las sustancias "C" y "D" (inhibidores del

transporte de electrones) sobre el consumo de oxígeno en partículas submitocondriales utilizando como sustrato: NADH, succinato y ascorbato + TMPD. Precise lo mejor posible el lugar de acción de la sustancia "C" y "D" en la cadena respiratoria. Justifique brevemente.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50 60 70

consumo de O2

[A]

desacoplado

estado 3

estado 4

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6 7 8

consumo de O2

[B]

16

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60 70

[C]

co

ns

um

o d

e O

2

Succinato

NADH

ASC + TMPD

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60 70

[D]

con

sum

o d

e O

2

15. Se incubaron 10 µl de una suspensión conteniendo partículas submitocondriales (concentración de proteína de la suspensión: 10 mg/ml) con una solución amortiguadora de pH y una concentración de NADH inicial de 20 µM, en un volumen final de 1 ml. Al cabo de 20 minutos se determinó la concentración de NADH espectrofotométricamente y se obtuvo un valor de 16 µM. A partir de este momento se agregaron al medio 50 µl de una solución de ADP de concentración 0,40 mM y fosfato en exceso. El ADP agregado se consumió totalmente en 20 min. Se midió nuevamente la concentración de NADH, obteniéndose un valor de 4 µM. a) Calcule la velocidad de consumo de O2

expresándola en µmol/min.mg de proteína antes y después del agregado de ADP y fosfato. b) Calcule el índice P/O. c) Si en este momento agregamos rotenona, succinato, fosfato en exceso y 50 µl de ADP (concentración 1,5 mM) y se observa que éste se agota totalmente al cabo de 100

minutos, calcule la velocidad de consumo de O2 en µmol/min.mg proteína usando el índice P/O teórico correspondiente.

16. Se incuba una suspensión de partículas submitocondriales en buffer pH 7,2 a 37ºC (1 ml volumen total), se realizan agregados de distintos compuestos y se analiza la concentración de oxígeno en el medio mediante un oxígrafo. En base a los resultados observados: a) Determine qué compuestos podrían ser A, B, C y D. Justifique brevemente la elección. b) Determine cómo evolucionaría el consumo de oxígeno si E fuese Ascorbato + TMPD. c) Calcule el índice P/O del sistema (conc. final de ADP agregado: 200 nM, fosfato agregado en exceso). d) Determine en cada etapa del gráfico si existe gradiente de protones transmembrana o no. e) Calcule la cantidad total de ATP sintetizado y la cantidad de NADH consumido (en nmoles) entre los minutos 0 y 11.

020406080

100120140160180200220240

0 5 10 15tiempo(min)

conc

O2

(nM

) BAC

D E

ADP+PiNADH