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BIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULAR

BIO035BIO035BIO035BIO035

GUAGUAGUAGUA DE TRABAJODE TRABAJODE TRABAJODE TRABAJO PRCTICOPRCTICOPRCTICOPRCTICO N 1N 1N 1N 1

INSTRUMENTACIN Y PREPARACININSTRUMENTACIN Y PREPARACININSTRUMENTACIN Y PREPARACININSTRUMENTACIN Y PREPARACIN

DE SOLUCIONESDE SOLUCIONESDE SOLUCIONESDE SOLUCIONES

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ITRODUCCI

El laboratorio no es un lugar peligroso, siempre y cuando se acte en l de maneraresponsable y cuidadosa. Para esto, es importante tener en cuenta ciertas medidas de orden que seaplican en todos los laboratorios y por sobre todo un buen uso del sentido comn. De esta forma, es

necesario recordar algunos principios bsicos generales:

1. El mesn de trabajo debe estar siempre libre de efectos personales tales como abrigos,carteras, libros, etc. que entorpezcan el trabajo y que adems puedan daarse por el contacto conreactivos qumicos, agua o calor.

2. Los reactivos qumicos a utilizar deben ser manipulados con precaucin, de acuerdo a suscaractersticas. Esta estrictamente prohibido pipetear directamente con la boca soluciones altamentealcalinas, cidos concentrados o material biolgico de riesgo. Si la va de desecho de estassoluciones es el desage del laboratorio (previa indicacin del profesor responsable del trabajoprctico), hacer correr abundante agua de manera simultanea para reducir el dao que estassoluciones fuertes pudieran ocasionar a las tuberas. Tener en cuenta que hay soluciones tales como

el H2SO4 que reaccionan violentamente con el agua, por lo tanto se debe proceder con sumocuidado.

3. Si Ud. esta manipulando sustancias inflamables, asegrese antes de destapar el frasco queno existan llamas abiertas ni material incandescente en las proximidades de su lugar de trabajo.

4. Si Ud. calienta una sustancia en un tubo de ensayo, no apunte la boca del tubo en direccinde alguna persona. Una ebullicin violenta de la solucin podra quemar a dicha persona.

5. Cuando trabaje con sustancias txicas voltiles debe hacerlo bajo una campana deextraccin. Recuerde que un gas o vapor nocivo no siempre es perceptible por el olor.

6. Los materiales de desecho no solubles (papel filtro usado, fsforos, corchos deteriorados,etc.) deben tirarse al basurero o recipiente destinado para esta funcin, jams dentro del desage dellaboratorio.

7. Al trmino de cada sesin experimental, el mesn de trabajo y sus alrededores deben quedarlimpios y secos. Todos los reactivos e implementos utilizados deben ser guardados en sus sitiosrespectivos. Asegrese siempre que las llaves de gas y agua estn correctamente cerradas.

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MATERIALES DE LABORATORIO

Material Volumtrico.

Durante el trabajo de laboratorio, en muchas oportunidades es necesario medir conexactitud volmenes de lquidos para la correcta ejecucin del paso experimental. Para ello, existen

diversos tipos de materiales volumtricos. Por lo tanto, es necesario conocer los diferentes tipos demateriales y tener claro cual utilizar en cada ocasin.

Cabe sealar que la precisin de la medida con estos materiales puede verse alterada.Considerando que la mayora de los materiales volumtricos que se usan en el laboratorio estnhechos en vidrio, y teniendo en cuenta que este material puede dilatarse o contraerse segn latemperatura a la que esta expuesto, se ha establecido un estndar convencional de 20C paramaterial de laboratorio destinado a medir volmenes. La graduacin de los utensilios considera dostipos de posibilidades:

- Aforo para contener- Aforo para entregar volmenes determinadosEl nivel de los lquidos se estima por el aforo, que se define como la tangente horizontal al

menisco inferior del lquido. Para realizar la medida, el nivel del lquido debe encontrarse frente al

ojo del observador en posicin vertical. Mientras ms estrecho sea el dimetro donde se realiza elaforo este ser ms exacto.

Fig. 1: posicin del ojo para aforar de manera correcta una solucin

A continuacin se describen los elementos ms usados en la medicin de volmenes en ellaboratorio:

1. PROBETAS

Son cilindros verticales graduados, provistos de una base hexagonal. Sus capacidades normalmenteson de 25, 50, 100, 250, 1000 y 2000 ml. El aforo esta previsto para entregar

volmenes. Debido a que su dimetro interior es amplio, las probetas sirven slo paramediciones aproximadas de volmenes. La graduacin de una probeta est enrelacin a su capacidad, as la ms grande tiene una graduacin de 5 a 10 ml por cadadivisin, en cambio las ms pequeas pueden tener hasta 1/10 de ml.

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2. MATRACES AFORADOS

Son botellas redondas de fondo plano, con cuello largo y estrecho y estn confeccionados en vidriono apto para resistir cambios de temperatura. Los matraces aforados estn previstos

para contener volmenes con bastante exactitud, por lo que son usados parapreparar soluciones en que es importante conocer la concentracin exacta de ellas.Estas soluciones pueden ser preparadas por dilucin de una cantidad conocida omedida de lquido, agregando agua (u otro solvente) hasta completar el volumen.Tambin los matraces aforados se emplean para preparar soluciones de unaconcentracin muy exacta por disolucin de una cantidad precisa de sustanciapreviamente pesada, completando finalmente el volumen hasta el aforo con agua uotro solvente segn sea el caso. Hay matraces aforados con capacidad para contenera 20C y con bastante exactitud 25, 50, 100, 250, 300, 1000 y 2000 ml de lquido osolucin.

3. PIPETAS

Se emplean para medir y entregar con precisin volmenes menores de lquidos y soluciones. Dadoque las pipetas son tubos de seccin estrecha se logra una buena exactitud en laentrega de volmenes por este tipo de material. La abertura del tubo en el extremosuperior (bucal) de la pipeta, es de borde muy parejo, ya que habitualmente se hacesuccin con la boca y se obstruye hermticamente la salida del lquido con ayuda de layema del dedo ndice. El lquido succionado se mantiene dentro de la pipeta, en tantono se permite la entrada de aire. Quitando parcialmenteo totalmente el dedo de la abertura superior, se consigue el vaciado paulatino o rpido

del contenido de la pipeta. La succin de lquidos corrosivos, txicos o de riesgobiolgico debe siempre realizarse con la ayuda de peras de goma o jeringas adaptables

a la boca de la pipeta (llamadas propipetas) para evitar la posibilidad que estosmateriales lleguen a la boca del usuario. El extremo aguzado permite la entrega dellquido gota a gota. Sin embargo, el orificio estrecho del extremo inferior est pensadode manera que no entre aire con facilidad mientras se transporta el lquido de unrecipiente a otro.

Existen pipetas de diferentes capacidades: 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 25 ml. Ygeneralmente estn diferenciadas por un color en la graduacin. Ellas son capaces de entregarvolmenes totales o parciales.

4. PIPETAS VOLUMETRICAS

Se reconocen por presentar su parte central ms dilatada. Estas pipetas estn diseadas para entregarun volumen bien determinado, el cual est indicado en el cuerpo de ella. Este volumenpuede estar delimitado por uno o dos aforos. Si son dos las marcas, el volumen indicadoescurre cuando el menisco del lquido se mueve desde la marca superior a la marcainferior. Si es una sola marca (en el tubo superior), el volumen queda comprendidoaquella marca y el extremo inferior de la pipeta. Al trmino del vaciamiento debenesperarse 15 segundos para que escurra todo el lquido que queda mojando las paredesde la pipeta.

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5. BURETA

Puede ser definida como una pipeta graduada y dotada de un mecanismo regulable para vaciarla. Enel extremo inferior lleva intercalada una llave de vidrio o plstico inerte (tefln). Las

graduaciones ms comunes de una bureta son 25 y 50 ml., existiendo tambinmicroburetas de 1.5 y 10 ml.

6. MATRACES ERLENMEYER

Son usados comnmente para efectuar titulaciones, reacciones y para calentar soluciones, ya que suforma cnica evita en gran parte la evaporacin. Tambin posee graduaciones, perolas medidas que se realizan con ellas son slo aproximadas. Existen matracesErlenmeyer de 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000 ml.

7. VASO DE PRECIPITADO

Se usa comnmente para preparar soluciones o efectuar reacciones. Estos vasos poseengraduaciones de 5, 10, 50,125, 250,.2000 ml., sin embargo hay que teneren cuenta que esta graduacin es slo aproximada y permite estimarvolmenes, por lo tanto no son aptos para preparar soluciones en las cualesse desee un cierto grado de exactitud.

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EQUIPAMIETO BSICO DE LABORATORIO.

En la actualidad el equipamiento de los laboratorios se ha ampliado de manera considerable con lainvencin de nuevas tecnologas. No obstante, a continuacin se describirn instrumentos de uso

general y bsico de un laboratorio comn.

1. BALANZA DE LABORATORIO

La unidad internacionalmente reconocida como patrn de peso es el kilogramo (kg). Sinembargo, comnmente en el laboratorio la unidad de peso ms usada es el gramo (g), as como elmiligramo (mg) y el microgramo (g) que son submltiplos del gramo. La balanza es uninstrumento que sirve para medir la masa de los cuerpos por el peso, es decir para determinar lasveces que ellos contienen la unidad de masa llamada gramo.

a) Balanza de precisin:

Se caracteriza por un sistema oscilante de una barra o cruz apoyada sobre una columna.Actualmente a este tipo de balanza se le ha adicionado unsistema electrnico que registra la pesada. La capacidad de cargade las balanzas de precisin es generalmente hasta 500g y mscomnmente hasta 200g, con una exactitud de pesada alcentsimo de gramo.

b) Balanza analtica:

Es un instrumento de alta precisin empleada en la pesada de reactivos livianos (del orden de losmiligramos).A pesar de que las balanzas analticas pueden presentar un variadotipo de diseos y aspectos exteriores, todas ellas se construyenbasadas en los mismos principios. La base es de gran solidez yconfiere estabilidad al instrumento evitando al mximo la posibilidadde vibraciones. La columna es un tubo por el cual se conduce elmando de arresto o bloqueo del sistema oscilante. La cruz esta hechade una aleacin especial de aluminio u otro metal estable que no

permita deformaciones por el peso variable que debe soportar.

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APLICACIN DE CALOR

Un recurso habitualmente usado en el laboratorio es la aplicacin de calor sobre muestras en ordena acelerar reacciones qumicas, esterilizar, secar, calcinar, etc. Con este fin seemplean materiales resistentes al calor tales como tubos de ensayo, matraces

erlenmeyer, crisoles, vasos de precipitado, balones matraces de fondo redondo. Amenudo, la principal fuente de calor utilizada en el laboratorio es el mecheroBunsen.

No obstante tambin se pueden utilizar baos termorregulados paracuando la temperatura de calentamiento que se desea aplicar no sobrepase los90C. Estos en general funcionan con agua pero existen otros que empleansustancias oleosas para alcanzar temperaturas superiores al punto de ebullicindel agua.

El uso de resistencias elctricas en la generacin de calor es otro de losprocedimientos comnmente usados en el laboratorio. Estos estn presentes eninstrumentos tales como hornos, autoclaves, mantas, baos secos, etc.

La principal ventaja que presentan los baos termorregulados y aquellos

instrumentos que utilizan como fuente de calor resistencias elctricas es que soncmodos de trabajar, poseen exactitud en la regulacin trmica y son seguros en su manejo.

APLICACIN DE FRO

En ciertas ocasiones durante el trabajo de laboratorio es necesario la aplicacin de fro sobreciertas muestras. Ello ayuda por ejemplo en la caracterizacin de sustancias puras por su punto defusin, en la regulacin de reacciones qumicas y procesos enzimticos, solubilizacin oliquefaccin de gases, condensacin o retencin de vapores, cristalizacin y precipitacin,estabilizacin de material biolgico, liofilizacin, etc.Probablemente en algunas secciones de este curso prctico Ud. trabajar con material biolgico

(tejidos, estructuras celulares, etc.), los cuales debern ser mantenidos en hielo. Esto tiene comoobjetivo la preservacin funcional de dichos materiales biolgicos. Hay que tener en cuenta que atemperaturas ms elevadas (temperatura ambiente o mayor) una gran variedad de funcionesbiolgicas se deterioran irreversiblemente.

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PREPARACI DE SOLUCIOES - CLCULO DE COCETRACIOES

SOLUCIOES ACUOSAS

En una solucin acuosa se pueden distinguir 2 componentes: el soluto y el solvente.Solvente es el componente que se encuentra en mayor proporcin y el soluto en menor proporcin.Para identificar una solucin no basta con indicar sus componentes, sino tambin es fundamentalconocer la proporcin de stos en la solucin.

SOLUTO + SOLVENTE = SOLUCION

EXPRESIOES DE COCETRACIO

Concentraciones basadas en el volumen y, en la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumenson las ms ampliamente utilizadas en el trabajo de laboratorio. Las expresiones ms usadas son:

MOLARIDAD (M):Se define como el nmero de moles de soluto por litro de solucin. Para calcular M (molaridad) senecesita conocer el peso del soluto y su peso molecular (PM):

Una solucin 1M: contiene 1 mol de soluto por litro de solucin; contiene el nmero de Avogadrode molculas de soluto por litro de solucin.

*Nmero de Avogadro: nmero de molculas por gramo-mol; nmero de tomos por gramo/tomo;nmero de iones por gramo-in; su valor numrico es 6,023 x 1023.

Una vez preparada una solucin, esta se puede mantener como solucin stock concentrada y a partirde ella se pueden prepara diluciones necesarias, debido a que el nmero de moles no se altera aldiluir una muestra, por lo tanto se establece que:

Ci x Vi = Cf x Vf

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Donde la concentracin inicial (Ci) debe tener la misma unidad que la concentracin final (Cf) y elvolumen inicial (Vi) debe tener la misma unidad que el volumen final (Vf).

Soluciones ms diluidas en general se expresan en trminos de milimolaridad (mM),micromolaridad (M), u otras, donde:

1 mmol = 10-3moles1 mol = 10-6moles1 nmol = 0,001 mol = 10-9moles1 pmol = 0,001 nmol = 10-12moles

De esta manera:

1 mM = 10-3M =1 mmol/litro =1 mol/ml1M =10-6M =1mol/litro =1nmol/ml1nM =10-9M =1nmol/litro =1pmol/ml

Tabla 1: conversin de unidades de masa

ORMALIDAD ()Se define como el nmero de equivalente de soluto por litro de solucin. Para calcular N se

necesita conocer el peso del soluto disuelto y su peso equivalente (PE).

(N) equivalentes = n de equivalentes de solutolitros disolucin

n equivalentes = masa de soluto (g)Peso equivalente

Peso equivalente = Peso molecularn*

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Donde n es:n*: nmero de H+o OH-reemplazables por molcula para cidos o bases respectivamente on*: nmero de electrones perdidos o ganados por molcula para agentes oxidantes y reductores.

Si Ud. reemplaza la ecuacin de PE en la ecuacin de n eq, y seguidamente reemplaza lo obtenidoanteriormente en la ecuacin de normalidad puede deducir que:

N = M x n*

PESO/VOLUME (%p/v)Se refiere al peso en gramos de un soluto en 100 ml de solucin. Depende slo del peso de lasustancia y del volumen en que esta disuelta.

Para soluciones diluidas se puede expresar como:

% p/v = peso del soluto en miligramos por 100 ml de solucin.

o tambin como una frmula numrica:

PESO/PESO (%p/p)Se refiere al peso en gramos de un soluto por 100 gramos de solucin. La concentracin de la

mayora de los cidos comerciales vienen dadas en %p/p. Con el fin de transformar esta expresinde concentracin en M (o N) se debe conocer la densidad () de la solucin.

MOLALIDAD (m)Se define como el nmero de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. Por lo tanto:

M = n moleskg disolv.

Esta expresin de concentracin es usada en ciertos clculos fsico-qumicos Laconcentracin expresada de esta manera se hace independiente de la temperatura. Dado que latemperatura afecta el volumen de una solucin, la concentracin de sta se ver afectada cuando laexpresin de concentracin usada est basada en el volumen. Para soluciones diluidas, la situacines similar a lo descrito anteriormente en el caso de la expresin de molaridad.

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Problemas

1) Para 500 mL de una solucin 0,2 M de cido sulfrico, calcule:a) los gramos de cido sulfrico que contieneb) el nmero de molcula de cido sulfrico que contienec) la concentracin N de dicha solucin

2) Cuntos gramos de hidrxido de sodio slido se requieren para preparar 500 ml de unasolucin 0.04 M.

3) Exprese las concentraciones de la soluciones anteriores en:a) Nb) g/lc) % p/v

4) Para el hidroxido de bario, calcule:a) los gramos contenidos en 1 molb) las molculas contenidas en 1 gc) los gramos necesarios para preparar una solucin 0,1 Md) los gramos necesarios para preparar una solucin 0,5 Ne) los gramos necesarios para preparar una solucin 5% p/v

5) Calcule cuntos mL de cido sulfurico 5M se requieren para preparar:a) 1500 mL de una solucin 0,002 Mb) 1 L de una solucin 2 Mc) 0,05 L de una solucin 1Md) 20 mL de una solucin 1 Ne) 0,2 mL de una solucin 0,1 % p/v

6) Para las sig. soluciones 2 M: Cuarzo (SiO2), azcar de mesa (C12H22O11), calcita (CaCO3)determine:a) PM de cada molculab) Los gramos contenidos en 1 molc) Molculas contenidas en 1 g

7) Calcule cada una de las siguientes cantidades:a) la masa de 2,6 x 1020molculas de cido clorhdricob) la masa de 0,5 mol de cido fosfricoc) el nmero de moles en 60 g de cloruro de sodio

8) Si Ud. dispone de varias soluciones concentradas: cloruro de sodio 3 M, cloruro de potasio1 M, cloruro de magnesio 1 M. A partir de estas, indique cuantos mL de cada una de ellasson necesarios para preparar 0,5 L de soluciones a las siguientes concentraciones:

a) cloruro de sodio 2 Nb) cloruro de potasio 2% p/vc) cloruro de magnesio 0,02 mM

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9) Calcule la cantidad de soluto necesario para preparar las soluciones que se indicana) 1000 mL de hidroxido de sodio 2Mb) 500 mL de cloruro de litio 0,5 Mc) 10 mL de cloruro de calcio 5 % p/vd) 100 mL de cloruro de sodio 1 N

10)Qu cantidad de moles de glucosa existen en los siguientes volmenes de solucin 0.012 Ma) 150 mLb) 1 Lc) 104mLd) 0,2 mLe) 300 L

11)Calcule la molaridad y % p/v si Ud. disuelve 170 mg de sacarosa en los siguientesvolmenes:

a) 700 lb) 80 mLc) 105Ld) 3x105mLe) 1x103L

12)Calcule la normalidad si ud. disuelve 2 mg de cido fosfrico en los siguientes volmenes:a) 200 mLb) 0,2 mLc) 2000 Ld) 3 Le) 20 L

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Actividad Prctica

Actividad N1: Reconocimiento del material de trabajo

a) Ud. dispondr de una cierta cantidad de material de vidrio, el que usar durante su trabajoprctico. Cudelo y evite un tratamiento drstico o golpearlo. Su instructor le mostrar los distintos

materiales de laboratorio y sus caractersticas. Adems Ud. recibir instrucciones de cmo trabajarcon dicho material: pipetas, tubos de ensayo, matraces, etc.

Actividad N2: Preparacin de soluciones

a) Preparacin de una solucin NaCl 3,5 M. Pese la cantidad necesaria y transfirala a un vaso deprecipitado. Adicione 2/3 del volumen final de agua destilada. Con la ayuda de una bagueta (barrade vidrio) acelere la disolucin de la sacarosa en el agua. Tambin puede recurrir a la aplicacin decalor. En este caso deber esperar hasta que la solucin llegue a temperatura ambiente (20C) antesde llevar la solucin a su volumen final. Enrase la solucin a su volumen final en un matrazaforado.

b) A partir de la solucin antes preparada Ud. deber confeccionar tres diluciones de tal manera quequeden a 15%, 1% y 0.15 M respectivamente. Vace la solucin concentrada en un vaso pp. limpioy seco. Tome las alcuotas respectivas con una pipeta volumtrica y vace en matraces aforados.Complete el volumen con agua hasta el aforo.

Actividad N3: Informe n1 en clases.

Ud. recibir una Informe n1 el cual debe ser completado en clase y entregado al final de la misma.Asi mismo, TODOS los clculos de las actividades anteriores deben ser anotadas en esta gua, demanera clara y ordenada.

MATERIALES LABORATORIO

4 Matraces de aforo 100 ml.1 esptula metlica.1 embudo.1 matraz Erlenmeyer 250 ml.2 vasos de precipitado de 100 ml.1 vaso de precipitado de 50 ml.1 pizeta.1 pipeta graduada de 1, 5 y 10 ml.1 pipeta aforada d2 2 ml.1 probeta de 100 ml.1 pprpipeta de 2ml y 10 ml.

1 marcador.1 baqueta de vidrio.Material para el grupo curso.2 balanzas.NaCl.

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Tabla 1: conversiones de medida universal

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FACULTAD DE CIECIAS BIOLGICASDEPARTAMETO DE CIECIAS BIOLGICAS

BIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULAR

BIO035BIO035BIO035BIO035

GUA DE TRABAJO PRCTICO N 2GUA DE TRABAJO PRCTICO N 2GUA DE TRABAJO PRCTICO N 2GUA DE TRABAJO PRCTICO N 2

MTODO CIENTFICOMTODO CIENTFICOMTODO CIENTFICOMTODO CIENTFICO

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ITRODUCCI

El objetivo de toda ciencia radica en brindar explicaciones para los fenmenosobservados y establecer principios generales que permitan predecir las relaciones entre stos

y otros fenmenos. Estas explicaciones y generalizaciones se logran por un sentido comnorganizado al que se le denomina mtodo cientfico. La base radical del mtodo cientficoes la observacin cuidadosa, libre de variables que le puedan afectar, los testigos adecuados ylo ms cuantitativamente posible.

Objetivo General del laboratorio:El objetivo de este trabajo prctico es que el estudiante se familiarice y reconozca cada una delas etapas del mtodo cientfico y su aplicacin en diferentes contextos investigativos.

1. Mtodos y Planes

El concepto de mtodo:Es el camino para llegar a un fin.En consecuencia, los mtodos deinvestigacin sern los procedimientos que se apliquen para lograr los objetivos que losinvestigadores se proponen.

Los mtodos de investigacin son ms generales que las tcnicas, las cuales se utilizan comomedios de apoyo. Las tcnicas son especficas y tienen un carcter instrumental. Por ejemplo:tcnicas de muestreo, de cuestionarios, de entrevistas, de observacin, etc. Una investigacinelige un mtodo y puede aplicar diversas tcnicas.

2.Pasos en el plan de la investigacin

1 PLANTEAMIENTODEL PROBLEMA

Delimitacin

Fuentes documentales

Formulacin de hiptesis

Definicin de variables

2 OBTENCIN DELOS DATOS

3 PROCESAMIENTODE LA INFORMA-CIN

Seleccin de tcnicas

Elaboracin y validacin

de instrumentos.Eleccin de la muestraTrabajo de campo

Planillas de registro

Clculos estadsticos

Tablas y grficos

4 ANLISIS DELO DATOS

Interpretacin de

resultados.

Conclusiones

Redaccin de informe

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Etapa1 :Planteamiento del Problema.

Lo primero que tiene que hacer el investigador es clarificar y delimitar bien su problema deinvestigacin. Esto ha sido precisado en el Mdulo N2, junto con las Hiptesis y Variables.Ahora, nos referiremos a las fuentes documentales relacionadas con el problema. Hay tresrazones fundamentales para que los investigadores busquen informacin pertinente desde unprincipio:

Justificar la originalidad del problema. Se indaga en revistas especializadas, tesis,centros de documentacin, etc. si existen investigaciones relacionadas con nuestroproblema.

Recopilar antecedentes tericos para conformar un marco terico actualizado que sirvade base para proponer una Hiptesis coherente con cierta lgica cientfica.

Rastrear metodologas y tcnicas aplicadas por otros investigadores del sector que nospreocupa, que pueden servir de modelos para seguir o modificar.

Etapa 2 :Obtencin de los datos.

La seleccin de las tcnicas que se requieren depende de la naturaleza del problema y lametodologa de trabajo. Cuando la muestra, es pequea y accesible, lo ms recomendable esobservar a todos los componentes de la investigacin. Cuando la muestra es muy grande y aveces de un tamao indeterminado, en este caso se procede a la eleccin de una porcinrepresentativa.

Etapa 3 :Procesamiento de la informacin.

Cada sujeto integrante de la muestra genera cierta cantidad de informacin, que es convenienteacumularlos en planillas de datos o planillas electrnicas.Para mayor facilidad del manejo de

los datos acumulados, estos se codifican con nmeros, signos o letras. Por ejemplo: los datospersonales (edad, el sexo, curso, etc.) y las preguntas formuladas generan otras tantascolumnas en la planilla. Las respuestas u observaciones registradas para cada sujeto, sedistribuyen en tantas filas como sujetos tenga la muestra.

Un aspecto importante en la confeccin de los instrumentos de investigacin es pensar enforma anticipada de qu manera esta informacin se organizar en una planilla de datos.Cuando finalmente, los datos estn ordenados en la planilla, se proceder a realizar losclculos y pruebas estadsticas necesarias, de acuerdo con los objetivos que se persiguen.El siguiente paso ser resumir la informacin y presentarla en tablas y grficos, quemuestren con claridad las relaciones de las variables que interesaban descubrir.

Etapa 4 :Anlisis de los datos y pruebas.

La interpretacin de los resultadosse debe desprender con claridad del anlisis de cada tablao grfico que se haya previsto. Las conclusiones se apoyan en los resultados presentados. Elprincipal resultado ser demostrar si la hiptesis es aceptada o fue falseada (recuerde elparadigma de la verdad). Recuerde que un trabajo de investigacin slo termina cuando se

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ha elaborado el informe de investigacin.

3.Los Diseos Experimentales

En estos diseos, el elemento eje es el planteamiento de una Hiptesis causal, que establezcarelaciones de CAUSA/EFECTO en el desarrollo de ciertos acontecimientos. El experimentoviene a tener el carcter de medio de prueba, que se planea en forma deductiva para reunirevidencias que permitan inferir el valor de la hiptesis, de acuerdo al modelo clsico delMtodo Cientfico.

Simbologa usada en los diseos experimentales

Variable independiente: X Variable dependiente :Y Experimentador : O Sujeto :SPretest : T1 Postest :T2

Media : M Muestra aleatoria : RGrupo experimental : E Grupo control : CPuntaje medio x

Requisitos necesarios para inferir relaciones causales en un diseo experimental.Cuando a una variable (X) se le atribuye la causa de otra (Y), se debe presentar tres clases deante- cedentes.

Que X anteceda a Y en el tiempo Que Y no est siendo afectado por otras variables Que se demuestre una relacin estadstica significativa entre X e Y

4. El control de variables

Para poder establecer relaciones causales de una variable independiente (X) sobre otradependiente (Y), el investigador deber manipular deliberadamente la primera variable paraobservar el efecto que estos cambios producen sobre la variable dependiente.

Para que los resultados tengan validez, es indispensable realizar un control estricto de lascondiciones de experimentacin a fin de evitar la contaminacin del experimento porvariables intervinientes que interfieran sobre los resultados.

Factores que afectan la validez interna de los datos:

Historia contempornea.Corresponde a cualquier tipo de acontecimientos que afecte a los Sy pueda afectar a la variable Y, por ejemplo una epidemia de gripe puede disminuir elrendimiento esperado en un grupo de estudiantes.

Maduracin. Cuando el experimento se prolonga durante meses o ms tiempo, los participantesS estn desarrollando transformaciones biolgicas y sicolgicas que afectan su rendimiento

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intelectual y fsico y pueden afectar las mediciones finales.

Administracin de test.La administracin de T1 puede servir de experiencia de aprendizaje,y los S aumentarn sus respuestas en T2, aunque no intervenga X.

Instrumentacin.Cambios que se realicen en los instrumentos en las nuevas mediciones o enlos observadores, que pueden producir variaciones en los registros de los nuevos datos.

Regresin estadstica.Opera cuando se escoge a los S por sus puntajes extremos, sean muyaltos o muy bajos. Al escoger a muy buenos alumnos para un programa o especial o los de bajorendimiento para un plan de recuperacin pedaggica. La media x de cualquiera de esosgrupos diferenciales se desplazar hacia la x media de la poblacin original, est o nopresente la variable X.

Sesgos. Al escoger en forma arbitraria o casual grupos o cursos sin aplicar procedimientosaleatorios, se corre el riesgo que los grupos de comparacin tengan habilidades o capacidadesdiferentes en relacin a X antes de iniciar el tratamiento. Por ejemplo, elegir voluntarios o losestudiantes que siempre asisten a clases.

Mortalidad experimental.Es la prdida o retiro de integrantes de E o C una vez que se hainiciado el experimento. Prdidas mayores a un 5% se consideran graves.

Interaccin entre seleccin y maduracin y otras condiciones. Corresponde a la suma dediferentes factores.

La validez externa: Corresponde a la representatividad de los resultados de unexperimento o su poder de generalizacin. Normalmente el experimento se lleva a cabo conuna muestra de cierta poblacin. Cabe preguntarse A qu sujetos, grupos o poblacin puedenaplicarse estos resultados? Bajo qu condiciones o ambientes y variables de aplicacin y demedicin?

El significado del grupo de control : Aqu reside el mayor grado de similitud con loscriterios de comparabilidad exigidos por las ciencias naturales. Para este efecto, al grupoexperimentalse le administra el tratamiento X. El grupo de controlno es sometido a X,permitiendo al O verificar por comparacin, que la variable independiente es el nicoelemento que afectan los cambios registrados en la variable dependiente.

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ACTIVIDADES PRCTICAS

A) Un problema para ser analizado mediante la observacin cientfica:

Qu factores hacen que una sustancia difunda en otra con diferente rapidez?

Ponga 5mL de agua destilada en 5 tubos de ensayo, enumerados del 1 al 5. Calintelos abao de Mara, de modo que los respectivos tubos alcancen una temperatura de 20, 25, 40,55 y 70 C. Una vez alcanzadas las temperaturas para cada tubo, agregue a stos 1,2, 3, 4 y 5 gotas, respectivamente, de azul de metileno. Mida el intervalo de tiempotranscurrido (tiempo de difusin) entre el tiempo cero (momento en que se agrega elcolorante) y el tiempo final (momento en que la distribucin del colorante en el tubo esuniforme).

Resultados

1. Cules son las variables de este experimento y cmo deben situarse en los ejesde las coordenadas de un grfico?. Responda y realice el grfico en el envs de esta hoja.

2. Qu efecto tiene la concentracin sobre la velocidad de difusin?

3. Qu efecto tiene la temperatura sobre la velocidad de difusin?

4. Con estos datos elabore una hiptesis respecto al (los) factor (es) que afecta (n) lavelocidad de difusin del orgnico utilizado.

B) Una hiptesis para ser analizada mediante experimentacin:

Confirmacin o rechazo?

Para verificar las posibles explicaciones, es indispensable ponerlas a prueba a fin deencontrar la verdadera. Por cuanto es preciso que disee un experimento, el que a travs delos resultados que proporciona, podr confirmar o rechazar las inferencias hechas; esto lepermitir determinar cul o cules de las hiptesis son correctas.

TUBOS Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

Volumen de agua (mL)Temperatura (C)Concentracin (gotas)Tiempo (seg)

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Modelo experimental (diseo).

Resultados

TUBOS Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5Volumen de agua (mL)Temperatura (C)Concentracin (gotas)Tiempo (seg)

TUBOS Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5Volumen de agua (mL)Temperatura (C)

Concentracin (gotas)Tiempo (seg)

1. Cules son las conclusiones?

2. Con los datos obtenidos del modelo experimental, es posible determinar la hiptesiscorrecta respecto al o los factores que afectan la velocidad de difusin del azul demetileno? Si es as, formlelo.

3. Cree usted que la hiptesis es vlida para otro tipo de sustancias?

4. Qu deber hacer para generalizar la hiptesis?

BIBLIOGRAFA

Labarca A. C. Los Mtodos de Investigacin Aplicados a las Ciencias de la Conducta.Facultad de Filosofa y Educacin Departamento de Formacin Pedaggica. U.M.C.E.www.umce.cl/publicaciones/mie/mie_modulo4.pdf

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Materiales de laboratorio. Mtodo Cientfico

Materiales por grupo (3 alumnos por grupo)2 pipetas de 5ml2 gradillas

15 tubos de ensayo2 picetas con agua destilada1 termmetro de lquidos1 vaso pp de 500ml1 vaso pp de 250 ml1 pinza de madera para tubos de ensayo1 cronmetro1 rejilla1 trpode1 gotario1 matraz con 20 ml de azul de metileno al 50%.

1 lpiz rotulador

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BIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULAR

BIO035BIO035BIO035BIO035

GUA DE TRABAJO PRCTICO NGUA DE TRABAJO PRCTICO NGUA DE TRABAJO PRCTICO NGUA DE TRABAJO PRCTICO N 3333

MICROSCOPAMICROSCOPAMICROSCOPAMICROSCOPA

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Introduccin

El trmino clula fue usado por primera vez cuando Robert Hooke observ un trozo de corchoen un microscopio de luz en 1665. Luego, Antony van Leeuwenhoek observ en 1670 varios tipos declulas y finalmente, fue en 1838 cuando Matthias Scleiden y Theodro Schwan propusieron a partir desus observaciones microscpicas de diversos tejidos la teora celular Todos los organismos estn

compuestos de clulas y, todas las clulas provienen de la divisin de otras clulas preexistentes.Estos descubrimientos dieron as origen al nacimiento de la biologa celular contempornea.

Las clulas son muy pequeas y adems son traslcidas lo que hace imposible su observacinpor ojo humano desnudo. Es por eso que el microscopio ha sido y, es una de las herramientas msutilizadas en biologa. El progreso en la construccin de nuevos microscopios, as como el desarrollo yuso de nuevos mtodos de fijacin, corte y tincin han permitido una serie de descubrimientos en loscampos de la histologa, citologa y bacteriologa, permitindonos entender cada vez con ms claridadla estructura de la clula y su organizacin, lo que es una importante ayuda para la comprensin de sufuncionamiento.

FIGURA 1: Relacin entre el tamao de diferentes clulas y sus componentes.

Objetivo del trabajo Prctico

El objetivo principal de este laboratorio consiste en que el estudiante comprenda el funcionamiento deun instrumento ptico como el microscopio y observe diferentes tipos celulares realizandocomparaciones entre ellas.

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El microscopio ptico y sus partes

En trminos generales, el microscopio es un sistema de lentes montados en un tubo. Ladistancia desde el tubo al objeto que se quiere observar puede regularse por medio de dos botones deajuste y, todo el conjunto est dispuesto sobre un robusto soporte en el que tambin se apoya la platinasobre la cual se coloca la preparacin a observar y, una fuentes de luz que se dirige a travs del objeto

en estudio. Las diferentes partes de un microscopio pueden agruparse en 3 sistemas fundamentales:

FIGURA 2. Esquema de un microscopio ptico en el cual se indican sus partes

El sistema mecnicose compone del pie en el cual se sustenta el instrumento y, la columna,que se encuentra fijada al pie y sostiene las otras partes del microscopio; el tubo que sostiene losoculares, el revolver portaobjetivos, la platina y el sistema de enfoque, tanto macromtrico

(aproximado) como micromtrico (preciso).El sistema ptico se compone de 2 sistemas diferentes de lentes. Los oculares son 2 lentesseparados por un diafragma fijo, tienen la funcin de aumentar la imagen proyectada por los objetivos.Los objetivos son 3 4 lentes ubicados en el revlver, son los que aumentan la imagen y pueden sersecos (entre ellos y la muestra hay una capa de aire) o de inmersin (entre ellos y la muestra se colocauna sustancia especial que permite lograr un aumento mayor).

Finalmente, el sistema de iluminacin se compone de una fuente luminosa, que esgeneralmente una lmpara ubicada en el pie o en la base de la columna del microscopio. Si la fuenteluminosa es independiente del microscopio, adems se necesita de un espejo que refleje la luz y ladesve hacia el condensador y de un condensador, que a travs de un sistema de lentes concentra la luzque llega al condensador se regula por medio de un diafragma ubicado en su parte inferior.Adicionalmente se puede colocar un filtro, generalmente azul, para obtener una luz homognea y

parecida a la luz natural.

Formacin de la Imagen

La luz posee una naturaleza dual y, puede ser entendida al mismo tiempo como una partcula ycomo una onda. La comprensin de este comportamiento, as como de algunas caractersticas de la luz,es importante para entender el proceso de formacin de la imagen en un microscopio y, cmomanejando ciertos parmetros fsicos podemos obtener imgenes ms ntidas y de mayores aumentos.

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La luz posee una determinada longitud de onda y viaja en el espacio con una determinadavelocidad. Cuando la luz llega a una superficie que separa dos medios transparentes una parte de ella serefleja volviendo por el mismo medio en que se propagaba y, otra parte en cambio es refractada,penetra en el segundo medio y cambia su direccin y velocidad. Esto ocurre cuando la luz llega porejemplo a una lente. Si sta es convergente, los rayos se juntan en un punto, el que corresponde al foco,la distancia entre ese punto y el centro de la lente es la llamada distancia focal.

Como ya vimos, la velocidad de la luz es diferente en el vaco que en otros medios. Estadiferencia de velocidad puede compararse mediante el ndice de refraccin, que corresponde alcuociente entre la velocidad de la luz en el vaco y la velocidad de la luz en un medio determinado enel que sta incide.

Mientras ms se acerca un objeto al ojo, ms detalles de l pueden ser distinguidos, pero hayuna distancia lmite a la que se pueden acercar los objetos y, sobre esa distancia y,a no se distinguenlos objetos con claridad y, se hace necesario el uso de lentes o lupas para aumentar el objeto en estudio.El aumento de una lente est dado por el lmite de cercana a la que pueden llevar los objetos en el ojohumano y por su distancia focal. Si se quiere aumentar an ms una imagen, se pueden colocar doslentes en serie (objetivo y ocular en el caso del microscopio compuesto) y, el aumento final logrado

ser entonces el producto del aumento de cada uno de ellos.

Si tiene en un microscopio un objeto a observar, los rayos de luz reflejados o emitidos por elobjeto que se sita fuera de la distancia focal de un lente (objetivo) al pasar por el objeto sonrefractados y enfocados en un plano que se ubica ms all de la cara opuesta de la lente obtenindoseuna imagen real que es invertida y de tamao distinto (mayor) al del objeto original. A medida que elobjeto se acerca al foco la imagen obtenida es ms grande.

FIGURA 3. Esquema de la formacin de una imagen con un lente simple

La segunda lente (ocular) aumenta la primera imagen obtenida. La imagen final es una imagen virtualy aumentada.

FIGURA 4. Esquema de la formacin de una imagen en un sistema de lentes

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El poder de resolucin de un microscopio depende tambin de la apertura numrica, capacidadde una lente para aprovechar la mayor cantidad de rayos para formar la imagen. Esta puedeaumentarse al usar entre el objetivo y el objeto a observar una sustancia con ndice de refraccin mayordel aire. Para esto se usan los llamados aceites de inmersin. As, al aumentar la apertura numrica seobtienen mayores aumentos. Este tipo de aceites se usan solamente con objetivos especiales que se

llaman lentes de inmersin.

Poderes del Microscopio

El microscopio posee varias caractersticas o poderes que determinan en forma importante suutilidad como herramienta de estudio. Estos son:

* Poder de aumento: Es la razn entre el tamao de la imagen que produce el microscopio y eltamao original del objeto en observacin. Este aumento se logra a travs del ocular y de los objetivosy, ya que cada uno es capaz de amplificar la imagen, el aumento total logrado se obtiene al multiplicarestos dos valores de aumento.

* Poder de definicin: Es la capacidad del microscopio para formar imgenes ntidas y de bordesdefinidos.

* Poder de penetracin:Es la capacidad para visualizar los diferentes planos de una preparacin yest dado por el ajuste de precisin que se logra con el tornillo micromtrico.

* Poder de resolucin:Permite distinguir como objetos separados dos puntos que se encuentran muycercanos entre s.

Uso del Microscopio

Para un buen uso del microscopio sea cuidadoso y siga atentamente las siguientes instrucciones:

1. Asegrese de que el microscopio se encuentre en una posicin cmoda para usted, tomndolosiempre de la columna.2. Encienda la lamparilla.3. Coloque el objetivo de menor aumento.4. Coloque su preparacin en la platina asegurndose de que sta se encuentre con el cubreobjeto haciaarriba.5. Abra totalmente el diafragma iris y suba el condensador casi hasta el tope.6. Si su microscopio tiene espejo, cntrelo para que la preparacin reciba el mximo posible la luz.7. Enfoque la preparacin bajando el tubo o subiendo la platina. Existe un tope que impide que los

objetivos de menor aumento topen la preparacin.8. Mire a travs del ocular y usando el tornillo macromtrico aleje lentamente el objetivo de lapreparacin, hasta lograr una imagen ms o menos ntida. Termine de enfocar usando el tornillomicromtrico.9. Una vez enfocada su preparacin, regule la cantidad de luz que recibe su muestra cerrando para elloel diafragma.10. Si despus de realizar todos los pasos anteriores no logra observar su preparacin en forma ntida,verifique que la preparacin est ubicada dentro del campo visual y que el cubreobjetos se encuentremirando hacia arriba. Revise tambin la limpieza de la preparacin, oculares, objetivos, condensador,

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espejo y, por ltimo, verifique que la iluminacin sea la adecuada y que el objetivo se encuentre en suposicin correcta.11. Para cambiar de objetivo, gire el revolver hasta el objetivo del aumento que desea utilizar y, vuelvaa enfocar su preparacin utilizando para ello el tornillo micromtrico, y si fuera necesario, elmacromtrico.12. Para usar el objetivo de inmersin coloque sobre su preparacin una gota de aceite de inmersin y,

luego enfoque su preparacin con el objetivo inmerso en el aceite. Una vez finalizada la observacin,limpie cuidadosamente el objetivo eliminando el aceite de inmersin. Para ello utilice Xilol y una hojade papel para lentes, especialmente dispuesto para ello, pues las pelusas del papel comn permanecenen el objetivo y pueden interferir en observaciones posteriores.13. Al terminar su trabajo limpie el resto del microscopio con un pao suave, apague la lamparilla,situ el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, baje la platina y, cubra el microscopio.

Preparacin del Material a ser Observado en un Microscopio

Existen dos tipos de preparaciones microscpicas, stas corresponden a las preparacionespermanentes y a las preparaciones temporales. Ambas deben ser lo ms delgadas posible para dejar

pasar la luz a travs de l y as lograr una buena observacin.

Las preparaciones permanentes son aquellas que se han sometido a un proceso largo depreparacin, el que permite que se mantengan en buenas condiciones para su observacin por periodosprolongados de tiempo. La preparacin de estas muestras incluye etapas de fijacin del material,deshidratacin, inclusin en parafina, corte de la muestra en capas muy finas con un micrtomo,colocacin de estas capas que contienen la muestra en un portaobjetos, disolucin de la parafina,tincin de la muestra para contrastar las diferentes estructuras celulares y colocacin de un cubreobjetos para proteger la preparacin.

Las preparaciones temporales corresponden a cortes frescos del material a observar, los que serealizan en el momento y tienen una corta duracin. Una vez realizados los cortes, se coloca una gotade agua en un portaobjetos y, en ella se ubica un trozo del material a observar, el que debe quedar

completamente cubierto por el agua. Sobre esta preparacin se coloca cuidadosamente un cubreobjeto,evitando la formacin de burbujas que interfieren en la observacin microscpica. Finalmente, seelimina exceso de agua y, la preparacin puede teirse para ser observada.

Existen numerosas tinciones que se utilizan en microscopa y permiten una mejor observacinde las estructuras celulares al contrastar en forma selectiva molculas determinadas. Generalmente seusan diferentes colorantes, algunos ejemplos de ellos son el lugol que tie los granos de almidn decolor azul-morado, la floroglucina que tie de rojo violeta las paredes celulares lignificadas, el azul demetileno que tie el protoplasma y las paredes celulares celulsicas, etc.

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Otros tipos de Microscopios

El avance tecnolgico ha permitido en los ltimos aos el desarrollo de una serie demicroscopios que con pequeas modificaciones de los principios bsicos del microscopio de luzpermiten un mejor estudio de la clula. Algunos ejemplos son los siguientes:

FIGURA 5: dibujos de diferentes tipos de microscopios

Microscopio de contraste de fases:El mayor problema de la observacin microscpica de muestras

biolgicas es el poco contraste que stas poseen. Las partes invisibles de una preparacin sonatravesadas por la luz, sin que cambie su amplitud, pero produciendo un cambio en su fase. En estetipo de microscopio los cambios de fase de la luz se traducen en cambios de amplitud, este microscopiopermite examinar objetos vivos, as como el seguimiento en ellos de procesos celulares como lamitosis.

Microscopio de fluorescencia:Algunas molculas emiten parte de la luz que absorben a longitudes deonda mayores a las que reciben. Este proceso es llamo fluorescencia y se presenta en forma natural, porejemplo, en las clorofilas. Existen numerosos fluorocromos (molculas capaces de emitirfluorescencia), los cuales pueden utilizarse para teir muestras biolgicas, cuyas estructuras se vendespus por la fluorescencia de las molculas unidas a ellas. En este tipo de microscopios la luzutilizada es de longitud de onda corta y, se logra por el uso de lmparas de mercurio. Esta luz incide en

la muestra y, lo que se observa es la fluorescencia que proviene de ella. Si la unin de estoscompuestos fluorescentes se hace especfica se pueden observar estructuras celulares definidas, comopor ejemplo, protenas marcadoras de diferentes organelos.

Microscopio electrnico:La luz se reemplaza por un haz de electrones que se obtienen al calentar unfilamento en un tubo al vaco. Estos electrones son desviados en un campo electromagntico quecumple la funcin de condensador. Al pasar a travs del objeto, los electrones son parcialmentedeflectados; el grado de defleccin de ellos depende de la densidad electrnica de la muestra. Debido ala baja densidad electrnica de las muestras biolgicas, para aumentar el contraste de las muestras se

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usan metales pesados que aumentan la interaccin de sta con los electrones incidentes. Despus depasar por la muestra, los electrones se colectan en un objetivo donde se forma la imagen, sta se vefinalmente sobre una pantalla fluorescente, o en una placa fotogrfica. Las imgenes logradas en estetipo de microscopio son siempre en blanco y negro y, las zonas ms oscuras corresponden a zonas demayor densidad electrnica en la muestra. Su poder de resolucin es del orden de 4 A y, permitelograr aumentos de hasta 1.000.000 de veces. Sin embargo, una desventaja es que se necesitan cortes

extremadamente finos y las muestras deben someterse a procesos de preparacin (deshidratacin) antesde ser colocadas al vaco para ser observadas.

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Actividad Prctica

OBJETIVOS:

Describir y analizar los principios bsicos de la microscopa. Aprender el manejo de algunas tcnicas bsicas de microscopa, como el montaje de

preparaciones en portaobjeto y tincin de muestras. Aprender a realizar observaciones microscpicas con el objeto de esquematizar, describir e

interpretar adecuadamente lo observado.

ACTIVIDAD 1: Clculo del aumento y lmite de resolucin del microscopio.

OBJETIVOS:

Conocer los componentes principales de un microscopio. Comprender la funcin de los lentes oculares y objetivos. Calcular el aumento final de los objetos observados y el lmite de resolucin del microscopio.La funcin principal del microscopio es aumentar la resolucin, la cual nos permite observar

detalles de los objetos que no es posible ver con el ojo humano. Al aumentar la magnificacin, eltamao observado del objeto, tambin debe aumentar la resolucin; de otro modo, veramos slo unaimagen de gran tamao pero sin nitidez.

El poder de resolucin de un microscopio se define como la capacidad que permite hacerperceptible por separado, dos puntos situados muy prximos entre s en el objeto. Esta capacidad estdeterminada por la apertura numrica (NA) de la lente, siendo directamente proporcional a sta, einversamente proporcional a la longitud de onda de la luz utilizada ().

Poder de resolucin = NA0,61 x

El recproco del poder de resolucin corresponde al lmite de resolucin, la distancia mnimaque debe existir entre dos puntos para poder distinguirlos por separado.

Lmite de resolucin = 0,61 x NA

Teniendo claros estos conceptos, podemos comenzar el estudio de los componentes delmicroscopio, para llegar a calcular el aumento de las imgenes y la distancia mnima que podemosllegar a distinguir al realizar una observacin en un microscopio compuesto.

IMPORTATE: Recuerde que el microscopio es un instrumento ptico de gran precisin, por loque debe ser manejado siempre en forma cuidadosa. Cualquier maltrato o golpe puededesajustar el instrumento y daarlo gravemente. Trate de no tocar las piezas cuya funcin noconoce. Ante cualquier duda o problema, solicite siempre la ayuda de sus profesores ayudantes.

Observe cuidadosamente los distintos componentes del microscopio que le ha sido asignado.Comprelos con el esquema que fue entregado en la gua y, asegrese de comprender lafuncin precisa de cada uno de ellos antes de comenzar cualquier observacin microscpica.

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Anote en la siguiente tabla el poder de aumento y apertura numrica de los lentes objetivos.Estos valores se encuentran en la parte cilndrica o can de los lentes.

AUMENTO APERTURA NUMERICA

Anote el aumento y la apertura numrica de l o los lentes oculares.

AUMENTO APERTURA NUMERICA

Anote ahora la apertura numrica del condensador:

APERTURA NUMERICA (NA)

La resolucin mxima de su microscopio depende de la apertura numrica efectiva mximaque posea. Este valor mximo corresponde normalmente al lente 100x o lente de inmersin.Observe ahora los siguientes valores:

Apertura del lente 100x ___________________________

Apertura numrica del condensador ___________________________

Apertura numrica de la interfase de aire 1,0

Apertura numrica de la interfase de aceite 1,3 - 1,5La apertura numrica efectiva mxima es el valor ms bajo de los anteriores. Utilizando este

valor menor de apertura numrica de trabajo, calcule el lmite de resolucin y la resolucin de sumicroscopio asumiendo un = 400 nm, correspondiente a la luz visible.

Lmite de resolucin: ____________________

Resolucin: ____________________

Qu conclusin puede obtener de estos resultados?

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ACTIVIDAD 2. Manejo del Microscopio observacion de preparacion de letra e impresa

OBJETIVOS:

Aprender a utilizar correctamente un microscopio, relacionando cada uno de sus componentescon su funcin especfica. Entender el principio de formacin de la imagen, comparando el tamao y la posicin de losobjetivos observados a travs de las lentes.

1) Utilizando el lente objetivo 10x observe la preparacin con una letra e impresa con tinta sobrepapel que le ser entregada. Tenga presentes las instrucciones para el manejo correcto del microscopioque se encuentran en la Introduccin de la presente gua.2) Compare la orientacin de la letra een su portaobjetos (preparacin) y en su campo visual (lo queobserva a travs del ocular del microscopio). A qu se debe la diferencia observada?3) Rote el revlver portaobjetivo hasta llegar al lente 40x y colquelo en posicin. Centre y enfoque lapreparacin con la letra e. Hay algn cambio en la orientacin de la letra e?4) Dibuje a lpiz mina la imagen observada de la letra econ el objetivo 10x:

ACTIVIDAD 3: Determinacin del dimetro del campo visual.

Procedimientos y observaciones

Tomar un cm2de papel milimetrado, colocarlo en un portaobjeto, mojarlo con agua destiladay ponerle el cubreobjeto.

Con el lente lupa (4X) enfocar y lograr observar. Calcule el dimetro del campo visualcontando mayor cantidad de cuadros observados. Recuerde que 1 cuadro corresponde a 1cm2.

Transforme la medida obtenida a unidades micromtricas. Calcule el dimetro del campo visual del resto de los lentes objetivos (10x, 40x, 100x),

empleando la siguiente frmula:

DCV obj.x = DCV obj.4X * aumento obj.4Xaumento obj. X

Siendo DCV = dimetro del campo visual del lente objetivo del que se est averiguando, aumento obj.X del lente con el que se est trabajando.

Agrupe sus clculos en una tabla, de manera clara y ordenada.

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ACTIVIDAD 3: Observacin de preparaciones biolgicas permanentes.

OBJETIVO:

Conocer aspectos generales de las tcnicas de fijacin Realizar observaciones microscpicas de preparaciones biolgicas con el objeto de aprender a

esquematizar, descubrir e interpretar adecuadamente lo observado.

La fijacines un mtodo que se utiliza para preservar la morfologa y la composicin qumica delas clulas que componen una preparacin microscpica. Consiste en agregar agentes fijadores a lamuestra como acetona, formaldehdo o glutaraldehdo, los cuales mantienen las interacciones entre lasmolculas (protenas, cidos nucleicos, etc.) y permiten que las preparaciones duren en buen estadodurante meses o aos.

Uno de los mtodos ms utilizados para realizar preparaciones permanentes consiste en fijar elmaterial de inters en una solucin FAA (formaldehdo-alcohol-cido actico), concentracin (entre 50y 100%) y finalmente embeberlo en parafina para obtener bloques que puedan ser cortados ensecciones muy finas utilizando un micrmetro.

Estas secciones que contienen material fijado y desecado se colocan cuidadosamente en unportaobjetos y, se disuelve la parafina con un solvente orgnico como xilol. Una vez hecho esto, lamuestra se tie para contrarrestar las distintas estructuras celulares y se protege con un cubreobjetomontado sobre una sustancia sellante.

1) Tome las preparaciones biolgicas asignadas por su profesor y que se encuentran en su bandeja detrabajo

2) Observe al microscopio cada una de las preparaciones escogidas y realice un dibujo de las clulasobservadas en el espacio asignado para tal fin en su informe.

3) Al hacer su dibujo tenga presentes las siguientes recomendaciones: Los dibujos deben realizarse siempre a lpiz mina, evitando borrones y colores oscuros. La

utilizacin de lpices de colores es opcional, pero el colorear su dibujo le puede ayudar adiferenciar con mayor claridad las estructuras observadas.

Realice un dibujo simple o esquemtico, pero lo suficientemente grande como para mostrartodos los detalles importantes.

Trate de mantener una escala apropiada al tamao de las estructuras observadas. Acompae su dibujo de notas explicativas, escritas en forma ordenada, clara y breve. Si lo

desea, anote los nombres de las estructuras identificadas en su observacin. Indique siempre el aumento con que est observando su preparacin. Ej: [40x].

ACTIVIDAD 4. Observacin de una preparacin fresca (muestra real).

OBJETIVO:

Realizar la preparacin y observacin microscpica de una muestra real lquida.1) Coloque una gota de la muestra real lquida en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando unapipeta Pasteur con gotario.2) Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colquelo en unngulo de 45 sobre el portaobjetos. Deslcelo hasta ponerlo en contacto con la gota de agua y djelo

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caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formacin de burbujas de aire pues interferirncon su observacin.3) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre elcubreobjeto.4) Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo 10x y prosiga aumentandogradualmente el aumento.

5) Realice un dibujo de los organismos que observe. Descrbalos en forma clara y breve.

ACTIVIDAD 5: Determinacin del tamao celular (TC).Una vez calculado el DCV de cada uno de los lentes objetivos, se puede estimar el tamao celular (TC)utilizando la siguiente formula:

TC = (DCV obj. X) / n de clulas

Donde:

DCV obj. X: corresponde al DCV del lente objetivo que estoy ocupando en mirar las clulas; nde clulas: el nmero de clulas que se observan (contabilizan) a travs del dimetro de dichocampo visual.

Determine este el valor de TC de la preparacin de frotis anteriormente dibujada

ACTIVIDAD 6 : Observacin de muestras frescas

Aprender a realizar preparaciones de tejidos temporalesObservacin de Elodea sp.

Sobre un portaobjetos deposite unas hojas de Elodea sp, cubra con un cubreobjeto y observeal microscopio.

Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo10x y prosigaaumentando gradualmente el aumento.

Qu estructura logra distinguir?. Esquematice.Observacin de Protozoos. Coloque una gota de la muestra real lquida en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando

una pipeta Pasteur con gotario.

Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colquelo enun ngulo de 45 sobre el portaobjetos. Deslcelo hasta ponerlo en contacto con la gota de agua

y djelo caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formacin de burbujas de airepues interferirn con su observacin.

Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobreel cubreobjeto.

Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo 10x y prosigaaumentando gradualmente el aumento.

Realice un dibujo de los organismos que observe. Descrbalos en forma clara y breve.

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ACTIVIDAD 7: Observacin de tejidos vegetales frescos sin y con tincin (Catfilo decebolla).

OBJETIVO:

Aprender a realizar preparaciones de tejidos temporales con tincin.

La mayora de los colorantes de clulas o tincionesson de naturaleza orgnica y aromtica.Existen dos tipos generales de colorantes: bsicos y cidos. En los bsicos, el grupo cromforo (que dael color) es bsico o catinico, por ejemplo el grupo azo (N=N). Los colorantes cidos poseengeneralmente grupos nitrilo (NO2) o aromticos. Ejemplos de colorantes cidos son eosina y azul deanilina. De colorantes bsicos, azul de metileno, cristal violeta y azul de toluidina.

El mecanismo de accin de la mayora de los colorantes se basa en la propiedad de protenas,ciertos polisacridos y cidos nucleicos de ionizarse como cidos o como bsicos, lo que les permitereaccionar con los grupos cromforos de las tinciones.

La carga neta de las molculas es la que determina con que tipo de colorante reacciona y, es loque permite realizar tinciones especficas para distintos tipos de molculas y estructuras celulares.

1) Tome el trozo de cebolla que le ha sido entregado y, con una hoja de gillete limpia realice unpequeo corte en forma transversal al tejido. Levante cuidadosamente el epitelio de la cebolla y tire del hasta obtener un trozo adecuado de tejido que le permita realizar una buena observacinmicroscpica. Si el trozo que usted cort es demasiado grande, crtelo para darle un tamao adecuado.2) Coloque una gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio, utilizando una pipeta Pasteur congotario o una pizeta.3) Sobre la gota ubique un trozo de catfilo de cebolla de tamao adecuado para que pueda ser cubiertoposteriormente por el cubreobjetos. Su muestra debe quedar completamente cubierta por el agua.4) Ponga una gota de la tincin a utilizar a un lado de su muestra e incline el portaobjetos de tal modo

que el colorante baje por capilaridad hasta atravesar el tejido. Limpie el exceso de colorante con unpapel absorbente.5) Tome cuidadosamente un cubreobjeto (sin dejar marcas de huellas dactilares) y colquelo en unngulo de 45 sobre el portaobjetos. Deslcelo hasta ponerlo en contacto con la muestra de catfilo decebolla y djelo caer gradual y lentamente sobre ella. Trate de evitar la formacin de burbujas de airepues interferirn con su observacin.6) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre elcubreobjeto.7) Limpie el exceso de agua con un trozo de papel absorbente, cuidando de no dejar pelusas sobre elcubreobjeto.8) Comience la observacin microscpica de su preparacin en el objetivo10x y prosiga aumentandogradualmente el aumento.

9) Realice en su informe un dibujo esquemtico del tejido de la cebolla antes y despus de la tincin,describiendo brevemente lo observado.

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Bibliografa

* Biologa Celular y Molecular, De Robertis y de Robertis, 11ed

., 2da

impresin, 1998, Ed. El Ateneo,Bs. Aires.

* Molecular Biology of the Cell, Alberts, Bray, Lewis, Raff Roberts & Watson, 3ed

, 1994, Garland

Publishing Inc., new York & London.

Microscopyhttp://ostracon .biologie.uni-kl.de/b online/e03/03.htm

Fluorescence Microscopywww.cimc.cornell.edu/Pages/Fluor.htm

Cell & Molecular Biology Onlinehttp://www.cellbio.com/cuorses.htm

Materiales de laboratorio. Microscopa

Materiales por grupo (3 alumnos por grupo) Microscopio por alumno. Porta objetos. Cubreobjetos. Letra impresa fijada en portaobjeto. Preparaciones histolgicas; Corte intestino delgado de rata, Tejido heptico y Frotis sanguneo. Porta objeto con papel milimetrado (1cm2) 1 Cebolla. Hojas de Elodea (frescas) Muestra de agua con Protozoos

Alcohol. Bisturis. Picetas. Gotarios. Lugol.

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BIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULAR

BIO035BIO035BIO035BIO035

GUA DE TRABAJO PRCTICO NGUA DE TRABAJO PRCTICO NGUA DE TRABAJO PRCTICO NGUA DE TRABAJO PRCTICO N 4444

COMPONENTES QUMICOS DE LACOMPONENTES QUMICOS DE LACOMPONENTES QUMICOS DE LACOMPONENTES QUMICOS DE LA

CLULACLULACLULACLULA

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Introduccin

Las clulas son estructuras increblemente complejas y diversas, capaces de autorreplicarse yde realizar una amplia variedad de funciones especializadas en los organismos multicelulares.

En trminos generales, las clulas se componen de agua, iones inorgnicos y molculasorgnicas que contienen carbono. Tanto el agua como los iones inorgnicos son muy importantes en el

funcionamiento celular, sin embargo, son los compuestos orgnicos de la clula los que le dancaractersticas nicas.

Hidratos de carbono, protenas, lpidos y cidos nucleicos son los cuatro tipos principales demolculas orgnicas que se encuentran en la clulay, cumplen en ella tanto roles estructurales comofuncionales. Las clulas obedecen a las mismas leyes fsicas y qumicas que determinan elcomportamiento de los sistemas no vivosy, su qumica bsica puede ser entendida en trminos de lasestructuras y funciones de estas cuatro clases principales de molculas orgnicas.

Los HIDRATOS DE CARBOO, como su nombre lo indica, se componen de carbono,hidrgeno y oxgeno. Los hidratos de carbono ms simples son los monosacridos. Todos elloscontienen grupos hidroxilo, as como aldehdo o ceto. Estos azcares simples se polimerizan a travs

de reacciones de deshidratacin para formar oligosacridos (2-6

molculas de monosacrido) o polisacridos (cientos o miles demolculas de monosacridos). El enlace formado en esta reaccinse conoce como enlaceglicosdico.

Los polisacridos juegan papeles importantes comomolculas de almacenamiento de energa, as como tambin soncomponentes estructurales de la superficie celular. Los oligosacridosse unen comnmente a protenas o lpidos dando origen a lasglicoprotenas y glicolpidos. Estos son parte importante de lasmembranas y, participan as en los procesos de reconocimiento celular einteraccin entre clulas.

Los monosacridos y algunos disacridos, en medio alcalino yen caliente, presentan una capacidad reductora que permite su reconocimiento en distintos tipos demuestras, entre ellas los lquidos biolgicos como la orina y la leche.

La reaccin de Somogyi permite el anlisis rpido de azcares basada en la capacidad de losmonosacridos para reducir algunas molculas, entre ellas los hidrxidos metlicos. Los componentesprincipales del reactivo de Somogyi son sulfato de cobre (CuSO4), hidrxido de sodio (NaOH), quereaccionan para formar hidrxido de cobre (Cu(OH)2). La precipitacin de este hidrxido se evitaagregando a la solucin tartrato doble de sodio y potasio (C4H4KNaO64H2O), obtenindose unasolucin de color azul intenso.

Calentando el reactivo de Somogyi en presencia de un hidrato de carbono reductor como laglucosa, aparece un precipitado rojo ladrillo correspondiente a xido cuproso (Cu2O).A su vez, el reactivo Lugol est formado por una mezcla de yoduro de potasio (KI) con una solucin de

yodo (I2) y, posee una coloracin marrn-rojiza muy caracterstica. La prueba del Lugol permite laidentificacin de polisacridos como el almidn en muestras de distinto origen: soluciones, slidos ymuestras de origen vegetal como semillas y tubrculos.

Al interactuar el I2con el almidn se produce una coloracin azul-violeta caracterstica que seexplica por que el yodo queda atrapado entre los dos tipos distintos de cadenas que conforman laestructura qumica del almidn: las cadenas de amilosa, sin ramificaciones, que producen el color azulintenso y las cadenas ramificadas de amilopectina, que al unirse al yodo produce la coloracin violeta.Los productos de hidrlisis del almidn producen una coloracin marrn-rojiza y, si son de muy bajopeso molecular no forman productos coloreados.

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Los LIPIDOSson molculas insolubles o escasamente solubles en agua, debido a que una gran partede ellos es hidrofbica. Esta parte hidrofbicaslo contiene carbono e hidrgeno. Los lpidosproveen una importante forma dealmacenamiento de energa, son los principales

constituyentes de las membranas y, sonimportantes en los procesos de sealizacin

celular, tanto como hormonas esteroidales como molculas mensajeras.

Las PROTEASestn formadas por monmeros llamados aminocidos, que se unen entre sipor medio del enlace peptdico. Este enlace covalente a travs del cual los aminocidos polimerizan se

forma entre el grupo carboxilo (COO) de un aminocido y el grupo amino (NH3+

) del siguiente por laeliminacin de una molcula de agua. Las interacciones hidrofbicas y covalentes, como los puentes deazufre (S-S), que se establecen entre los aminocidos que forman una protena determinan en elladiferentes niveles de estructura, los cuales contribuyen a su plegamiento y a que adopten suconformacin final caracterstica. As la prdida de esta conformacin puede llevar a la prdida de lafuncin que una protena realiza.

En la clula, las protenas tienen una serie de importantes funciones; catalizan una grancantidad de reacciones qumicas, proveen rigidez estructural, controlan la permeabilidad de lasmembranas, regulan las concentraciones de los metabolitos, reconocen y se unen a otras biomolculasen forma covalente, participan en el movimiento celular y, controlan el funcionamiento de la expresingnica.

Las protenas son macromolculas formadas por polmeros de aminocidos unidos medianteenlaces peptdicos. Esta caracterstica estructural permite su identificacin en solucin mediantedistintos mtodos, entre los que destaca la utilizacin del reactivo de Biuret. Este se utiliza para realizaranlisis cuantitativo mediante mediciones de espectrofometra.

El reactivo de Biuret esta formado por sulfato de cobre (CuSO 4) ytartrato doble de sodio y potasio (C4H4KNaO64H2O) en medio

alcalino. El Cu+2

reacciona con los grupos amino (>NH) del enlacepeptdico de las protenas, formando un enlace coordinado con 4tomos de nitrgeno. Este enlace coordinado es responsable de lacoloracin azul intensa caracterstica del mtodo al reaccionar lasprotenas con el reactivo.

Las protenas pueden ser precipitadas con facilidadmodificando su solubilidad. Esto se logra agregando a la solucin

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sustancias con cargas opuestas a las que poseen las protenas, se produce la neutralizacin de las cargasde su superficie y una disminucin brusca de la solubilidad en solventes acuosos.

Otra estrategia utilizada para la precipitacin de las protenas en solucin es la adicin de salesneutras como sulfato de amonio ((NH4)2SO4), las que por su gran solubilidad compiten con lasprotenas por el agua que constituyen su capa de solvatacin.

Los CIDOS NUCLEICOS poseen dos tipos principales de macromolculas, el cido ribonucleico oRNA (por el nombre en ingls Ribonucleic Acid) y el cido desoxirribonucleico o DNA

(Deoxyribonucleic acid). Ambos tipos estn formados por polmeros denucletidos (ribonucletidos en el caso de RNA y 3desoxirribonucletidos en DNA) unidos por enlaces fosfodiester (veranexo). Ambos tipos se diferencian en el azcar que contienen en susnucletidos (ribosa en el RNA y 3`desoxirribosa en el DNA) y, en queel RNA se presenta como una molcula de una sola hebra mientras queel DNA es de doble hebra. La funcin general de los cidos nucleicos es

permitir el flujo de la informacin gentica contenida por una clula a otra clula hija y utilizar estainformacin para la expresin gnica. La molcula de DNA se conoce como la molcula de la herenciay almacena la informacin gentica en los genes que codificaran para protenas y RNA. El RNA

participa principalmente en transformar la informacin contenida en el DNA a molculas funcionalescomo lo son las protenas. El RNA se presenta principalmente entres formas que cumplen distintas funciones: El RNA mensajeroque transporta la informacin contenida en un gen hasta elcitoplasma; el RNA ribosomal que forma parte estructural ycataltica de los ribosomas en los cuales se produce la traduccinde la informacin contenida en los RNA mensajeros a protenas; elRNA de transferencia participa como molcula adaptadora paratransformar la informacin desde el RNA mensajero a protena.

Las SALES MINERALES son molculas inorgnicas que se encuentran formando parte de los seresvivos y, aunque se encuentran en pequeas cantidades en comparacin a las biomolculas, tienen

funciones muy importantes en las reacciones metablicas, en la regulacin de stas o comoconstituyentes celulares. Las sales ms abundantes en los seres vivos son los cloruros, los fosfatos y loscarbonatos de calcio, sodio, potasio y magnesio. La funcin que las sales minerales desempean en elorganismo depende del estado fsico en que se encuentren, ya sea como sales precipitadas, dondeforman parte de endoesqueletos de vertebrados (fosfatos y carbonatos), de conchas de moluscos ydientes (carbonatos) y de estructuras de sostn en plantas como las gramneas (slice); o como salesdisueltas, formando parte de todos los plasmas intra e intercelulares disociadas en forma de iones comolos cloruros (Cl-), fosfatos (PO-33), etc. Las sales disueltas tienen numerosas funciones, pero la msimportante es la funcin homeosttica o el mantenimiento constante del medio celular interno.Tambin participan en la regulacin de la presin osmtica determinando la concentracin de ladisolucin.

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ACTIVIDAD PRCTICA

ACTIVIDAD 1: HIDRATOS DE CARBOO

OBJETIVOS

Describir a mono y polisacridos mediante caractersticas qumicas generales. Relacionar estructura de mono y polisacridos con algunas de sus propiedades qumicas.

A) Identificacin de monosacridos mediante la reaccin de Somogyi:

Para comparar la capacidad reductora de distintas muestras conteniendo mono y polisacridos,se realizar la reaccin de Somogyi en distintas soluciones. Esto permitir identificar la presencia y eltipo de hidrato de carbono que se encuentra en las distintas soluciones que se entregarn en ellaboratorio.

Segn las siguientes instrucciones realice un esquema de trabajo que le permita seguirclaramente las acciones a realizar. Repita este proceso en cada uno de los experimentos

siguientes.

Prepare 6 tubos de ensayo colocndolos en una gradilla. Rotule cada uno de los tubos de talmodo que pueda recordar claramente con cual muestra est trabajando.

Agregue a cada uno de los tubos 5 mL del reactivo de Somogyi ya preparado y 8-10 gotas decada una de las siguientes soluciones segn el siguiente esquema:

N Tubo Muestra1 Agua destilada2 Solucin glucosa 1%3 Solucin almidn 1%

4 Solucin almidn 1% tratada con cido en caliente5 Solucin NaCl 1%6 A entregar en el prctico

Agitar bien cada uno de los tubos y, colocarlos en un vaso de precipitado a bao Marahirviendo durante 3 minutos.

Deje enfriar y observe si aparece algn precipitado en la solucin, anote cul es el color y lacantidad relativa del precipitado en cada uno de los tubos.

Interprete cada uno de los resultados obtenidos.B) Identificacin de polisacridos mediante la prueba del Lugol:

De manera similar al experimento anterior, organice los tubos y compararemos la capacidad dedistintas muestras representativas de mono y polisacridos para reaccionar con el Lugol.

Prepare 6 tubos de ensayo con cada una de las muestras segn el mismo esquema delexperimento anterior.

Agregue a cada uno de los tubos 2 gotas de solucin de Lugol diluida y agite. Observe el color producido en cada uno de los tubos. Interprete los resultados obtenidos segn

su conocimiento de la estructura de mono y polisacridos.

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ACTIVIDAD 2: PROTEAS

OBJETIVOS

Reconocer la presencia de protenas en solucin mediante reacciones qumicas generales. Relacionar la estructura qumica de las protenas con su solubilidad en distintos medios.

A) Reaccin de Biuret para la identificacin de protenas:

Rotular 5 tubos de ensayo y colocar en cada uno de ellos 2 ml de cada una de las siguientesmuestras:

Tubo Muestra1 Agua destilada2 Solucin glicina 1%3 Clara de huevo (Ovoalbmina)

4 A entregar en el prctico5 Solucin NaCl 1%

Agregar a cada tubo 1 ml de reactivo de Biuret y agitar. Observar la variacin de color en los tubos. Cmo explica la diferencia de intensidades en los

tubos que presentaron una reaccin positiva?

ACTIVIDAD 3: RECOOCIMIETO DE LPIDOS

A) Reconocimiento de muestras ricas en lpidos mediante su solubilidad:Las grasas son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se forman pequesimas

gotas formando una emulsin de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, porreagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sita sobre la capa deagua. Por el contrario, las grasas son solubles en los llamados disolventes orgnicos, como el ter,benceno, xilol, cloroformo, etc.

Procedimientos y Observaciones Tomar dos tubos de ensayo y poner en uno de ellos 3 ml de agua y en el otro tubo 3ml de ter. Aadir a cada tubo 1ml de aceite y agitar fuertemente. Observar la formacin de gotitas o micelas ydejar en reposo en la gradilla. Observe la reaccin.

Tubo Muestra1 Agua destilada + aceite2 Agua destilada + ter3 Aceite + ter

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ACTIVIDAD 4: RECOOCIMIETO DE SALES MIERALES

Procedimientos y Observaciones Preparar una gradilla con dos tubos de ensayo. En cada tubo agregar 3 ml de suero de leche., numerarlos tubos.

A) Identificacin de cloruros Al tubo 1 aadir 1 ml de solucin de nitrato de plata. Observar un precipitado blanco de aspecto lechoso.

Tubo Muestra1 Agua destilada + AgNO32 Leche + AgNO3

B) Identificacin de calcio Al tubo 2 aadir 10 gotas de solucin de oxalato de amonio al 1%. Observar un precipitado blanco cristalino

Tubo Muestra1 Agua destilada + C2H8N2O

-42 Leche + C2H8N2O

-4

ACTIVIDAD 5: RECOOCIMIETO DE EZIMAS

Determinacin de la presencia de Catalasa, una enzima muy importante

Cal es la funcin de la catalasa en el organismo humano?Cul es la ubicacin elular de la Catalsa?

La reaccin de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente:

2H2O2 2H2O + O2

Procedimientos y Observaciones:

A) Activacin de la enzima Colocar en un tubo de ensayo unos trozos de hgado. Aadir 5ml de Agua Oxigenada. Observar y registrar resultados.

B) Inactivacin de la enzima Colocar un en tubo de ensayo dos trozos de hgado. Aadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos. Despus de este tiempo retirar el agua sobrenadante. Aadir Agua Oxigenada. Observar y registrar resultados.

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BIBLIOGRAFIA

Molecular Cell Biology, James Darbell, Harvy Lodisch, David Baltimore, 1986, Cientific AmericanBooks, New York, U.S.A. Parte 1, The molecules in Cells.

The Cell: a molecular approach, Geoffrey M., Cooper, 1997, ASM Press., Washington, U.S.A. Parte 1,The chemistry of Cells.

MATERIALES DE LABORATORIO

Reactivos y Material BiolgicoSomogyi = 10 mlLugol = 15 ml (para todo el curso, con gotario)Glucosa 1% = 10 ml

Almidn 1% = 30 mlNaCl 1% = 15 mlNaOH 20% = 15 mlCuSO4 1% = 5 mlGlicina 1% = 5 mlNitrato de Plata 1% = 10 ml (para todo el curso, con gotario)Oxalato de Amonio 1% = 10 ml (para todo el curso, con gotario)Eter = 5 mlAcido Actico = 20 ml (para todo el curso, con gotario)Agua Oxigenada = 15 mlAlcohol 96 a 0C = 50 mlAgua destilada = 50 ml

NaCl 2M = 50 mlSDS (detergente lquido) = 15 ml (para todo el curso)Aceite Vegetal = 3 mlClara de Huevo = 5 mlLeche = 1 litro (para todo el curso)Hgado de Pollo fresco y trozado = 3 (para todo el curso)Arena = 10 gr

Material de Vidrio por grupo30 tubos de ensayo.2 gradillas1 mortero de cermica

1 trozo de gaza para filtrar3 vasos pp de 100 ml1 vaso pp 500 ml1 embudo1 probeta 100 ml1 varilla de vidrio3 gotarios3 pipetas graduadas 1 ml2 pipetas graduadas de 5 ml

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3 pipeta graduada de 10 ml1 matraz Erlenmeyer 500 ml1 matraz Erlenmeyer 250 ml1 piceta con agua destilada1 mechero (trpode y rejilla)1 pinza madera para tubo

1 lpiz rotulador.1 cooler con hielo por mesn de trabajoNota: Las pipetas deben reciclarse, por tanto, deben ser lavadas con abundante agua destilada antes devolver a utilizar.

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BIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULARBIOLOGA CELULAR

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GUA DE TRABAJO PRCTICO N 4GUA DE TRABAJO PRCTICO N 4GUA DE TRABAJO PRCTICO N 4GUA DE TRABAJO PRCTICO N 4

ORGANIZACIN SUBCELULARORGANIZACIN SUBCELULARORGANIZACIN SUBCELULARORGANIZACIN SUBCELULAR

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Introduccin

Las clulas aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de aos, probablemente debido a laagregacin espontnea de molculas. Las primeras clulas eran relativamente simples y pequeas,similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes. Luego aparecieron lasclulas eucariontes, ms grandes y de organizacin ms compleja, que hoy forman parte de animales y

plantas.

Por definicin y, a diferencia de las clulasprocariontes, las clulas eucariontes poseen un ncleo quecontiene la mayora del DNA envuelto en una membrana.Esto deja al material gentico en un compartimientoseparado del resto de los contenidos de la clula ocitoplasma, donde ocurren las reacciones metablicas.En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos:cloroplastos, mitocondrias, retculo endoplsmico, aparatode Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas,citoesqueleto, los cuales cumplen funciones especficas

dentro de la clula.El Ncleo es el organelo ms grande de la clula y

est separado del citoplasma por una envoltura queconsiste en dos capas de lpidos, la cul posee una serie deporos los cuales mantienen en constante comunicacin elncleo con el citoplasma celular y sus organelos. Contienetodo el DNA cromosomal, el que se encuentra empacadoen las fibras de cromatina por su asociacin con protenasdenominadas histonas.

Fig.1 : esquemas los dos tipos de clula eucariota: animal y vegetal

La Membrana Plasmtica es la envoltura externa de la clula.Corresponde a un bicapa continua de fosfolpidos de 4-5 nm deespesor, en la cual se encuentran embebidas varias protenas.Algunas de estas protenas sirven como bombas y canales para eltransporte de molculas especficas hacia el interior de la clula y,desde la clula al medio externo. La membrana celular es unaestructura dinmica, en la cul todos los elementos embebidostienen movimiento.

Fig 2: esquema de la bicapa lipidica con protenas en rojo

Las Mitocondrias son muy similares a las bacterias tanto en tamao como en forma. Contienensu propio DNA, sintetizan protenas y pueden reproducirse al dividirse en dos, por lo que se cree queprovienen de la simbiosis de una clula eucarionte primitiva con un organismo procarionte, quecorrespondera a una mitocondria primitiva. Estos organelos son responsables de los procesos derespiracin celular y produccin de energa.

Los Cloroplastos, al igual que las mitocondrias, tambin tendran un origen simbitico. Seencuentran slo en los organismos capaces de realizar la fotosntesis, como las algas verde-azules y lasplantas. Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila y, estn rodeados de una

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membrana doble. Adems, contienen un elaborado sistema de membranas en su interior en el cual seencuentra el aparato fotosinttico propiamente tal.

Fig 3: representacin grfica de un cloroplasto (A) y una mitocondria (B), donde se pueden observar susdiferencias, principalmente en la conformacin interna de ambos, en donde se pueden apreciar el apilamiento detilacoides en el casao del cloroplasto y la formacin de las crestas mitocondriales en el caso de las mitocondrias.

El Retculo Endoplsmico (R.E.) corresponde asacos, tubos y capas de membranas que seextienden a travs del citoplasma y que ocupan unamplio sector de la clula. La membrana delRetculo endoplsmico es una continuacin de lamembrana nuclear. Se especializa en la sntesis delpidos y protenas de membrana, as comotambin de materiales que estn destinados a serexportados de la clula. El Retculoendoplsmico rugoso est asociado a losribosomas, que se unen en su parte externa y seencargan de la sntesis de protenas. El Retculoendoplsmico liso no contienen ribosomas y seencarga del metabolismo de lpidos.

Fig 4 : Dibujo de los retculos endoplasmticos liso y rugoso

El Aparato de Golgi o tamin llamados Dictiosomas(que es el conjunto de sacos que apilados forman esteorganelo) tambin corresponde a un sistema de sacosmembranosos. Se encarga de la modifica-cin, destinacin

y, empaquetamiento otros organelos. Alrededor de l seencuentran numerosas vesculas pequeas que transportansustancias entre el mismo organelo y los diferentescompartimentos de la clula.

Fig 5: esquema representativo de los dictiosomas apiladospara formar el aparato de Golgi, donde se puede apreciar el trafico

vesicular que realiza.

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Los Lisosomas son vesculasmembranosas que contienen enzimashidrolticas requeridas para la digestin demolculas al interior de la clula. De estemodo, estas enzimas se mantienen aisladas del

resto de los componentes celulares evitando ladegradacin de molculas como protenas ycidos nucleicos. Por otras parte losPeroxisomas tambin corresponden a vesculas.En ellas se produce perxido de hidrgeno(H2O2) durante la oxidacin por el oxgeno devarios tipos de molculas. Esta sustancia espeligrosa y gracias a la existencia de losperoxisomas se mantiene aislada al resto de loscomponentes de la clula.

Fig 6: organizacin de los lisosomas y vacuolas, funcin y va intracelular

Los Ribosomas son grandes complejos de RNA y protenas. Se componen de una subunidadgrande y una subunidad pequea que se ensamblan para formar un complejo que se encarga de llevar acabo el proceso de traduccin en la sntesis de protenas. Los ribosomas procariontes y eucariontes sonmuy similares y, pueden encontrarse tanto libres en el citoplasma como unidos a membranas formandoparte del retculo endoplsmico rugoso.

El Citoesqueleto corresponde a filamentos de protenas que forman un enrejado en elcitoplasma. Esta red de filamentos est formada por los microtbulos, filamentos de actina y filamentosintermedios. El citoesqueleto le da a la clula su forma y provee la base de sus movimientos.Generalmente se organiza desde una regin cercana al ncleo donde se encuentran los centrolos y

desde ah se extiende al resto de la clula.Aunque tcnicas avanzadas como la Microscopa Electrnica permiten una visualizacin

detallada de la estructura de la clula, esto no es suficiente para definir la funcin de sus componentes.Para esto, ha sido necesario aislar los organelos del resto de la clula para realizar estudios bioqumicosque permitan determinar la funcin exacta de cada uno de ellos.

Fraccionamiento Subcelular

As como un tejido puede ser separado en las clulas que lo constituyen, con las tcnicasadecuadas la clula puede separarse en los diferentes organelos y macromolculas que la componen.Una de las tcnicas ms utilizadas para tal propsito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite

obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta tcnicafue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duve entre 1940 1950 y, consiste en laseparacin de los componentes de la clula en base a su tamao y densidad.

El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenizacin de lamuestra. Esto se logra a travs de diferentes procedimientos como sonicacin (exposicin a sonidos dealta frecuencia), schok osmtico o simplemente moliendo las clulas en homogenizadores mecnicos.

En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la clula, incluyendo la membranaplasmtica y el retculo endoplsmico, las que quedan formando pequeos fragmentos o vesculas quedan origen a la fraccin microsomal. El resto del