GUION practicas BIOFISICA

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GUIÓN DE PRÁCTICAS DE LA ASIGNATURA “ELEMENTOS DE BIOLOGÍA“.

MÁSTER EN BIOFÍSICA

PROGRAMA DE PRÁCTICAS

1.- DISOLUCIONES. SOLUCIONES TAMPÓN .............................................. 3

2.- (I) PRECIPITACIÓN FRACCIONADA DE PROTEÍNAS.................................. 6

3.- (II) CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO ................................... 7

4.- DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS: LOWRY.......................11

5.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS ...........................13

6.- CRECIMIENTO DE BACTERIAS TRANSFORMADAS GENÉTICAMENTE. ............18

7.- AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ..............................................19

8.- DIGESTIÓN DE DNA PLASMÍDICO POR ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.............20

9.- SEPARACIÓN DE DNA POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA. .........22 10.-IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN LA CASEÍNA MEDIANTE

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC). ................................................23

PRÁCTICAS DE “ELEMENTOS DE BIOLOGÍA”, MÁSTER EN BIOFÍSICA de la UAM

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ESQUEMA DE PRÁCTICAS DE ELEMENTOS DE BIOLOGÍA

DÍA PRÁCTICA 1 (número) PRÁCTICA 2 MARTES DISOLUCIONES Y

TAMPONES (1)

MIÉRCOLES

PRECIPITACIÓN CON SULFATO AMÓNICO (2)

Calcular y hacer las diluciones de cada fracción obtenida según tabla de la práctica 4.

JUEVES CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (3)

VIERNES CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: LOWRY (4)

Plaquear bacterias transformadas para aislar colonias.

LUNES PREPARACIÓN DE GELES DE ACRILAMIDA (5)

Preparar y hervir muestras de proteínas según tabla práctica 5.

MARTES DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS(5)-TINCIÓN

Crecimiento de bacterias transformadas genéticamente (6).

MIÉRCOLES

PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (7)

Destinción de geles de acrilamida

JUEVES CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (10, I)

Digestión de un DNA plasmídico (8) Preparación de geles de agarosa (9)

VIERNES CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (10, II)

Electroforesis y visualización de DNA en geles de agarosa (9)

NORMAS DE TRABAJO. Todo el trabajo se llevará a cabo en los Laboratorios del Departamento de Biología Molecular, en el 1er sótano del edifico de Biológicas. Generales: Está prohibido pipetear con la boca, comer, beber o fumar en los laboratorios. Es obligatorio el uso de bata. El material desechable de vidrio se tirará a basuras especiales para residuos cortantes: os pedimos colaboración para no llenar estas basuras con guantes y otros desechos que no sean de cristal. Marcar siempre cualquier tubo o recipiente que contenga algo útil de la forma más segura posible, por ejemplo tanto en la tapa como en el tubo.


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En algunas prácticas se utilizarán reactivos que requieren ser manipulados con mayores medidas de seguridad y que los profesores identificarán como “tóxicos” (p.ej., fenol, bromuro de etidio, sales de cobre, etc). Os pedimos una atención especial a las instrucciones que los profesores os darán a para utilizarlos y para desechar adecuadamente los residuos que se generen. • Seguridad biológica Es obligatorio lavarse las manos después del trabajo de laboratorio, para evitar contaminación del usuario con material biológico, y la potencial dispersión de éste. Todo el material biológico, p. ej. bacterias o material que haya estado en contacto con éstas (tanto sólido como líquido), ha de ser inactivado dejándolo en contacto con hipoclorito (lejía) durante al menos 30 min. antes de desecharlo. El material líquido se puede entonces desechar por la pila dejando correr algo de agua, y el sólido se eliminará tirándolo a las basuras correspondientes. Cualquier material biológico derramado ha de ser descontaminado inmediatamente con hipoclorito, antes de proceder a secar y lavar con jabón la superficie manchada. 1.- DISOLUCIONES. SOLUCIONES TAMPÓN

En esta primera práctica se llevará a cabo la preparación de los reactivos y disoluciones que se van a emplear en el resto de las prácticas. Es muy importante el manejo con soltura de las unidades de medida y concentración, así como la máxima precisión a la hora de medir los pesos y volúmenes para preparar las disoluciones. A continuación se recuerdan las definiciones básicas referentes a concentración y se plantean dos problemas teóricos sencillos que deben resolverse antes de empezar a preparar las disoluciones. Finalmente se enumeran unas cuantas disoluciones que se emplearán en las prácticas y que deberán prepararse. DEFINICIONES DE UNIDADES DE CONCENTRACIÓN

La concentración de una sustancia es una medida de la cantidad en que dicha sustancia (el soluto) está presente en una disolución. La concentración del soluto viene expresada normalmente en unidades de masa, (gramos, miligramos, etc), o más frecuentemente, de cantidad de sustancia (moles o equivalentes), mientras


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que la cantidad de disolución suele venir dada en unidades de volumen (litros o sus submúltiplos). El concepto de equivalente cambia según el tipo de reacción en la que vaya a intervenir el compuesto, sea ésta ácido-base o redox. Así, en una reacción ácido-base, se define como equivalente la cantidad de sustancia capaz de ceder o aceptar un mol de protones, mientras que en un equilibrio redox, un equivalente corresponde a la cantidad de sustancia capaz de ceder o aceptar un mol de electrones. En la práctica, el número de equivalentes es el número de moles multiplicado por un coeficiente que indica el número de protones o electrones que intercambia en la reacción ácido-base o en la reacción redox. Las formas más comunes de expresar la concentración son las siguientes:

• Molaridad. Expresa el número de moles de soluto por litro de disolución. Se abrevia, M.

• Normalidad. Expresa el número de equivalentes de soluto por litro de disolución. Se abrevia, N.

• Tanto por ciento peso / volumen (p/v). Expresa la masa en gramos de soluto en 100 ml de disolución.

• Tanto por ciento peso / peso (p/p). Expresa la masa en gramos de soluto en 100 g. de disolución.

• Tanto por ciento volumen / volumen (v/v). Expresa el volumen en mililitros de soluto en 100 ml de disolución.

A la hora de preparar disoluciones, es imprescindible conocer una serie de propiedades del soluto, como son el peso molecular, la riqueza (con la posible presencia de moléculas de agua de hidratación).

Muchas sales incorporan un número fijo de moléculas de agua en su composición, denominadas de hidratación. Se incluyen estas moléculas de agua en la fórmula y en el peso molecular del compuesto. Hay sales que pueden presentar varios grados de hidratación distintos según la preparación comercial. El valor de la riqueza comercial hace referencia a que muchos compuestos no son, en su presentación comercial, completamente puros. Este valor suele expresarse en tanto por ciento en peso. En estos casos, para medir un volumen, habrá que conocer también la densidad de la disolución.


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Algunas de las disoluciones que se emplearán son disoluciones reguladoras o disoluciones tampón, que tienen la propiedad de ser capaces de neutralizar

pequeñas adiciones de iones H3O+ u OH- dejando prácticamente inalterado el pH.

Para la correcta preparación de tales disoluciones hemos de emplear el pHmetro ya que, como veremos en la práctica número 2, esta propiedad de tamponamiento sólo se mantiene en un rango determinado de pH.

PROBLEMAS TEÓRICOS

PROBLEMA Nº 1

Calcular la cantidad de NaOH necesaria para preparar 200 ml de una solución al 20% (p/v). A partir de ella describir cómo preparar 100 ml de NaOH 200 mM y expresar dicha concentración en porcentaje p/v.

PROBLEMA Nº 2

El ácido clorhídrico concentrado tiene una riqueza del 37,5% (p/p) de HCl y su densidad es de 1,19; el ácido sulfúrico tiene una riqueza del 96% y una densidad de 1,84. Calcular la Molaridad y la Normalidad de dichos ácidos concentrados.

Describir la preparación de 100 ml de HCl 10 mM y 50 ml de H2SO4 0.2M a partir

de las disoluciones anteriores.

LISTA DE DISOLUCIONES QUE PREPARAR: 1-Tris-HCl 1M pH8.5 (50 ml) 2-Tris-HCl 0,1M pH7.5 (50 ml) 3-NaCl 3 M (50 ml) 4-Etanol 70% (7ml)


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PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS DE SUERO

Los anticuerpos pertenecen a un grupo de proteínas llamadas "inmunoglobulinas", que están compuestas por dos cadenas pesadas (de unos 50KDa) y dos cadenas ligeras (de 25KDa) unidas entre sí por puentes disulfuro, y son muy abundantes en la circulación sanguínea. Un cierto número de técnicas ampliamente utilizadas en los laboratorios de Bioquímica requieren la utilización de inmunoglobulinas purificadas. Hay muchos métodos de purificación de inmunoglobulinas, pero en esta práctica vamos a seguir el método más convencional que incluye un fraccionamiento de las proteínas del suero con sulfato amónico y una cromatografía de intercambio iónico. El análisis del resultado de ambos métodos se realizará mediante electroforesis en geles de proteínas en presencia de SDS. Se pretende con ello que el investigador se familiarice con tres técnicas de separación de proteínas que se basan en diferentes principios de separación.

2.- (I) PRECIPITACIÓN FRACCIONADA DE PROTEÍNAS Cuando una sal se añade a una disolución de proteínas, se produce un incremento de la solubilidad de las mismas (solubilización por salado o "salting in"). Este aumento inicial en la solubilidad se debe a la estabilización en solución de la proteína por la disminución de los coeficientes de actividad de los grupos ionizables. A medida que la fuerza iónica se eleva, por aumento en la concentración en la sal, se alcanza un máximo de solubilidad seguido de una disminución hasta que las proteínas precipitan (precipitación salina o "salting out"). Durante la precipitación probablemente existe una competencia por las moléculas de agua de solvatación entre la proteína y la sal, por lo que las interacciones proteína-proteína aumentan, produciéndose su precipitación. El

sulfato amónico, (NH4)2SO4, tiene una gran solubilidad (por encima de 700 g/l)

y es la sal más utilizada para el fraccionamiento de proteínas. Material y reactivos - Suero de ternera (ST). - Disolución saturada de (NH4)2SO4 (100% de saturación).

- PBS (137 mM NaCl; 2.6 mM KCl; 8 mM Na2HPO4; 1.8 mM KH2PO4 pH 7.2).

Método


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1.- Tomar 6 ml de una dilución 1/6 del ST en H2O destilada preparada

por los profesores en un tubo de 10 ml (tapón rojo). La adición de (NH4)2SO4 se va a realizar añadiendo el volumen

suficiente (lentamente, y a 4°C) de disolución saturada hasta alcanzar la concentración que se desea. Para ello se utilizará la siguiente ecuación:

(1) V= V´(S2-S1) / 1 - S2 siendo,

V = Volumen que hay que echar de la disolución saturada. V´= Volumen de muestra que se tiene.

S2 = Tanto por uno de la concentración de saturación a la que se

quiere llevar la muestra.

S1 = Tanto por uno de la concentración inicial de la muestra.

2.- 5 ml de esta dilución se llevan hasta un 30% de saturación. Se mezcla lentamente en frío, se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a 4000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Guardar a 4ºC el otro ml de ST diluido rotulado con el nombre del investigador. 3.- Se pasa el sobrenadante a un tubo graduado y se mide el volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de PBS (con ayuda del vórtex) y se mide el volumen final (fracción 1). 4.- El sobrenadante obtenido en el paso anterior se lleva a un 40% de saturación. Se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a 4000 rpm durante 10 minutos a 4°C. 5.- Se pasa el sobrenadante a un tubo graduado y se mide su volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de PBS y se mide el volumen final (fracción 2). 6.- El sobrenadante obtenido se lleva a un 60% de saturación. Se procesa del mismo modo que en los pasos anteriores. El precipitado se disuelve en 6 ml de PBS y se mide su volumen final (fracción 3). Todas las fracciones se conservarán a 4°C hasta su utilización en el siguiente ensayo.

3.- (II) CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO La cromatografía de intercambio iónico de proteínas tiene su fundamento en las propiedades ácido-base de éstas. Las proteínas tienen una carga neta determinada por su composición amino-acídica y por el pH del medio en el que se encuentran. El carácter y magnitud de esta carga neta les permite interaccionar o no con un grupo cargado determinado. El comportamiento de una proteína en una cromatografía de intercambio iónico puede predecirse a partir de su punto isoeléctrico (pI). Una proteína con un pI de 5.8, tendrá una


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carga neta positiva a pHs inferiores a su pI, y negativa a pHs superiores. Atendiendo al pI de la proteína y a los valores de pH con los que deseemos trabajar, deberemos elegir un intercambiador aniónico o catiónico. El

intercambiador está constituido por una matriz insoluble y, a ser posible, inerte a la que está unida un grupo funcional con una carga positiva (cuando se trate de un intercambiador aniónico) o negativa (en el caso de un intercambiador catiónico). La cromatografía por intercambio iónico consta de cuatro fases: a) Equilibrado, o ajuste de la resina y de la muestra a las condiciones salinas y de pH iniciales requeridas para el experimento; b) Fijación de la muestra, por incubación de la mezcla, en este caso de proteínas, que deseamos resolver, uniendo todas o parte de ellas para luego eluirlas (“despegarlas”) de forma diferencial; c)

lavado de las proteínas que hayan quedado retenidas inespecíficamente; y d) Elución de la muestra, utilizando concentraciones variables de sales y/o tampones con diferente pH. La práctica que se realiza a continuación tiene como objetivo la purificación de inmunoglobulinas de suero de ternera a partir de un extracto parcialmente enriquecido en esta proteína por precipitación con sulfato amónico. Para ello emplearemos un intercambiador aniónico, el DEAE-sephacel, constituido por una matriz a la que está unido como grupo funcional un radical dietil-amino-etilo. El procedimiento empleado será una cromatografía en columna, empleando una solución tampón Tris/HCl a pH 8.5, que nos asegure que la carga neta de la inmunoglobulina sea negativa y, por consiguiente, que la proteína se una de forma efectiva al intercambiador.

RESINA

EPPENDORFF

COLUMNA

FILTRO

1 ml

CELULOSA -CH2-CH2-N+H

CH2-CH3

CH2-CH3


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Material y reactivos

- Extracto correspondiente al corte del 40% de la práctica de

precipitación con (NH4)2SO4 [F2] - Tampón de equilibrado : Tris 10 mM, pH 8.5 - Resina DEAE-Sephacel. - Columna, soporte y pinza de cierre - Soluciones stock para preparar tampones de elución de la columna (del 1

al 4, ver tabla más abajo) Método

1- Equilibrado de resina y muestra

Procederemos al equilibrado y empaquetamiento de la resina añadiendo suavemente sobre la resina 10 ml de Tris 10mM pH 8.5 y dejándolo caer libremente. De esta forma nos aseguramos que la resina se halla al pH y condiciones iónicas que deseamos (se suele pasar un volumen de 10 veces el de la resina de tampón de equilibrado).

Para ir preparando la muestra que pasaremos a continuación, tomar 1 ml (aprox. 5 mg de proteína) de la fracción del precipitado del 40% del

tratamiento con (NH4)2SO4 (Fracción 2) y diluirlos en 5 volúmenes de Tris 10mM pH 8.5. con el fin de disminuir en lo posible la concentración de sales (y que la proteína no tiene que competir con los iones de las sales para quedarse pegada al intercambiador) y cambiar las condiciones de pH de la F2 al adecuado para la unión de las inmunoglobulinas a la resina. 2- Unión de la muestra a la resina Cuando acabe de pasar el tampón de equilibrado, se añade la muestra diluida (6 ml) en movimientos rotatorios intentando no distorsionar la resina con ayuda de una pipeta Pasteur. Descartaremos lo que caiga (“pass through”). Deberemos ir calculando y preparando en tubos de 5ml los tampones de elución (del 1 al 4) partiendo de soluciones concentradas siguiendo la siguiente tabla:

Nº COMPOSICIÓN (preparar 4 ml )

Vol de NaCl 3M

Vol Tris 1M pH 8,5

H2O (hasta 4 ml)

1 Tris 10 mM, pH 8.5; NaCl 50 mM





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3- Lavado de la columna

Cuando termine de salir el “pass through”, añadir 4 volúmenes (4ml) de Tris 10mM pH 8.5. para arrastrar (“lavar”) las proteínas que no se hayan retenido electrostáticamente a la resina. Descartaremos lo que caiga.

4- Elución de la muestra Para separar las imunoglobulinas de la muestra del resto de las proteínas se llevarán a cabo varias eluciones de la columna con concentraciones crecientes de NaCl en tampón Tris/HCl 10mM a pH 8.5. Cada uno de los pasos se llevará a cabo con 4 ml del correspondiente tampón (ver tabla), y se recogerán fracciones de 1 ml que, posteriormente, se analizarán por electroforesis en gel de poliacrilamida.

Recoger las fracciones correspondientes a la salida de los mililitros 3º y 4o de cada tampón de elución . Para ello usar tubos eppendorff rotulados como se explica en la tabla de arriba recogiendo las gotas que eluyan de la columna hasta que se alcance aproximadamente la marca correspondiente a 1ml en cada tubo. El primer y último ml de cada paso se descartarán ya que el primer ml de cada lavado equivale aproximadamente al volumen “muerto” de la columna (el volumen que ha de recorrer el tampón desde el comienzo de la columna hasta su salida). Las fracciones 3ª y 4ª son las que van a contener la mayoría de la proteína eluída, Guardar estas fracciones rotuladas con el número del investigador a 4ºC hasta su utilización.

TAMPON COMPOSICION muestras 1 Tris 10 mM, pH 8.5; NaCl 50 mM 1.3 y 1.4

2 Tris 10 mM, pH 8.5; NaCl 150 mM 2.3 y 2.4




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4.- DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE LOWRY

El objetivo de la práctica es calcular la cantidad total de proteínas contenida en una disolución. El método de Lowry se basa en la reacción de las proteínas con el reactivo de Folin dando un complejo coloreado. Su descripción es el artículo más citado de la historia en nuestro área (JBC de 1951). Este reactivo es una disolución de tungstato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico y ácido clorhídrico. El mecanismo del proceso es el siguiente: el Cu2+, en medio alcalino, forma un complejo con los enlaces peptídicos de las proteínas reduciéndose a Cu+. Este ión, así como los grupos R de los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo inicialmente un producto inestable, que se reduce para formar un compuesto coloreado. La intensidad del color dependerá de la cantidad presente en las proteínas de estos aminoácidos aromáticos y será proporcional a la concentración de proteínas en la disolución. La concentración de una disolución problema puede calcularse interpolando el valor obtenido de absorbancia en una recta de calibrado trazada con valores conocidos de concentración de una proteína y sus respectivas absorbancias. Material y reactivos - Albúmina de suero bovino (BSA) 1 mg/ml en PBS. - NaOH 1 M - Reactivo 1: 10 volúmenes de Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 M.

0.1 volúmenes de tartrato sódico potásico al 2% (C4H4O6KNa).

0.1 volúmenes de CuSO4 al 1%.

- Reactivo 2: 1 volumen de reactivo de Folin. 1 volumen de H20 destilada.

Método A partir de una disolución de albúmina bovina (BSA) de 1 mg/ml, preparar 8 diluciones, con agua, de concentraciones: 0, 20, 40, 80, 160, 240, 320 y 400 !g/ml. A 0.25 ml de cada una de estas diluciones, añadir NaOH 1 M

hasta una concentración final de 0.1 M (25 µl). Añadir a cada tubo 2 ml del reactivo 1, mezclarlo bien e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Añadir ahora 225 !l del reactivo 2 con la p1000, mezclarlo bien e


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incubarlo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Leer la absorbancia a 750 nm, ajustando previamente el 0 del espectrofotómetro con el ensayo en blanco (tubo nº 1). Con las diferentes fracciones obtenidas en el ensayo de precipitación

con (NH4)2SO4, se realizarán, con H2O, las siguientes diluciones:

- ST (diluido): 1/150; 1/300 - Fracción 1: 1/4; 1/8 - Fracción 2: 1/30; 1/60 - Fracción 3: 1/30; 1/60 Procesar 0.25 ml de cada una de estas diluciones igual que las diferentes diluciones de BSA (es conveniente, para ahorrar tiempo, procesar estas fracciones a la vez que las de BSA).

1 2

PROTEINA 3 4 5 6 (10

min) 7 (20

min) 8 9 10

Nº tubo

BSA

!l BSA

H2O

!l

NaOH 1M

Reactivo

1

Reactivo

2

DO 750 nm

Conc !g/ml

Conc final x

f-1

1 BSA 1mg/ml 0 250 27!l 2 ml 225!l 0 -

2 BSA 1mg/ml 5 245 27!l 2 ml 225!l 20 -

3 BSA 1mg/ml 10 240 27!l 2 ml 225!l 40 -

4 BSA 1mg/ml 20 230 27!l 2 ml 225!l 80 -

5 BSA 1mg/ml 40 210 27!l 2 ml 225!l 160 -

6 BSA 1mg/ml 60 190 27!l 2 ml 225!l 240 -

7 BSA 1mg/ml 80 170 27!l 2 ml 225!l 320 -

8 BSA 1mg/ml 100 150 27!l 2 ml 225!l 400 -

MUESTRA !l ¿Conc?

9 ST(dil)1/150 250 - 27!l 2 ml 225!l

10 ST (dil)1/300 250 - 27!l 2 ml 225!l

11 F1 1/4 250 - 27!l 2 ml 225!l

12 F1 1/8 250 - 27!l 2 ml 225!l

13 F2 1/30 250 - 27!l 2 ml 225!l

14 F2 1/60 250 - 27!l 2 ml 225!l

15 F3 1/30 250 - 27!l 2 ml 225!l

16 F3 1/60 250 - 27!l 2 ml 225!l Representar gráficamente las concentraciones patrón frente a la absorbancia y hallar, interpolando, las concentraciones de proteína de las diferentes fracciones teniendo en cuenta las diluciones realizadas y los volúmenes totales de cada fracción.


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5.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA-SDS La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una partícula cargada en un determinado medio cuando se ve sometida a la acción de un campo eléctrico. Esta técnica se utiliza frecuentemente en el laboratorio para la separación de proteínas y de ácidos nucleicos. La técnica electroforética más común en la separación de proteínas es la que se realiza en geles de poliacrilamida en presencia del detergente dodecilsulfato sódico (SDS). El gel se obtiene mediante la polimerización de acrilamida y el entrecruzamiento de las cadenas con bis-acrilamida. De esta manera el gel forma una red o malla a través de cuyos poros circulan las proteínas a separar. El tamaño de los poros depende de la concentración absoluta y de la proporción acrilamida/bis-acrilamida del gel. La polimerización es promovida por el persulfato amónico y estabilizada por el TEMED. Los pesos moleculares de las proteínas se pueden determinar midiendo su movilidad en geles de poliacrilamida en presencia de SDS. Esto es debido a que la cantidad de SDS (cargado negativamente) que se une a una proteína es proporcional al peso molecular del polipéptido y es independiente de su secuencia. A saturación, se une aproximadamente 1.4 g de detergente por gramo de proteína. De esta manera, cuando una mezcla de proteínas de peso molecular conocido se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida en presencia de SDS, la representación gráfica de la distancia recorrida por cada proteína en función del logaritmo de su peso molecular dará una línea recta (ver anexo al fin al del guión). Material y reactivos - Disolución de acrilamida-bisacrilamida al 30%/0.8% en agua destilada. - Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 - Tris-HCl 3 M pH 8.8 - SDS 10% - Persulfato amónico al 10% - Tampón de electroforesis (Tris 25 mM pH 8.3; Glicina 192 mM; SDS 0.1%) - Tampón de ruptura (Tris 313 mM pH 6.8; SDS 10%; Glicerol 25%;

mercaptoetanol 25%; azul de bromofenol 0.02%) - Cubetas de electroforesis, cristales, fuentes de alimentación, separadores,

pinzas. - Marcadores de peso molecular de proteínas - Solución de fijación (ácido acético 10%; etanol 20%) - Solución de tinción (azul de Coomassie 0.1%; etanol 40%; ácido acético 10%) - Solución de revelado (ácido acético 10%)


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Método 1.- Preparación del gel En esta práctica se va a preparar un gel discontinuo constituido por el gel de separación o resolución y el gel de concentración o empaquetamiento. Las cantidades de cada reactivo se muestran en la tabla. Limpiar perfectamente los cristales (uno cuadrado y otro con dos rebordes), peines y espaciadores con agua y jabón, aclararlos con abundante agua y escurrirlos en posición vertical y en un sitio a resguardo de posibles roturas. Montar el gel con los separadores en la carcasa correspondiente siguiendo las instrucciones de los encargados de prácticas. Meter el peine para hacer una marca con rotulador 1-2 cm por debajo del nivel que será ocupado por el peine formador de los pocillos. Rellenar la carcasa con agua para comprobar que no hay pérdidas. Preparar la solución del gel de separación (30 ml por gel) teniendo en cuenta que el persulfato amónico y el TEMED se añaden al final. Verterlo rápida y cuidadosamente entre los cristales hasta la marca de rotulador. Colocar un poco de agua destilada cuidadosamente sobre el gel (gota a gota con una pipeta Pasteur) y dejarlo polimerizar a temperatura ambiente. Dejar polimerizar en el tubo Falcon el resto de la mezcla del gel como control de polimerización y descartarlo después. Una vez polimerizado (unos 30 minutos), retirar el agua y preparar la solución del gel de concentración. Verter esta solución sobre el gel de separación hasta llenar el espacio entre cristales y colocar un peine previamente lavado con agua y etanol, evitando que queden burbujas entre el peine y el gel. Dejarlo polimerizar a temperatura ambiente durante 20-30 minutos (proceder del mismo modo que antes desechando el resto de mezcla polimerizada una vez sólida). Gel de separación

(10%) Gel de concentración

Acrilamida-Bisacrilamida

10 ml 1,25 ml

Agua 15,6 ml 6,1 ml

Tris HCl 3 M pH 8.8 3,8 ml ------

SDS 10% 300 !l 100 !l

Persulfato amónico 10% 300 !l 100 !l

TEMED 30 !l 10 !l

Tris HCl 0.5 M pH 6.8 ------ 2,5 ml


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2.- Preparación de las muestras En esta práctica se van a analizar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS las muestras provenientes de las dos prácticas anteriores. Por un lado, las muestras resultantes de la precipitación con sulfato amónico del suero de ternera y, por otro lado, las muestras eluidas de la columna de DEAE. Se incluirá también un carril con marcadores de peso molecular, que consta de una mezcla de proteínas de peso molecular conocido que nos servirán de referencia. Las muestras a analizar son las siguientes:

Nº tubo

muestra !l para 100!gr

!l de agua (hasta 80)

!l de Tampón 5x

1 SUERO Ternera (1/6 o original) 20

2 F1 (precip. del 30% de (NH4)2SO4) 20



5 1.3 (eluida con NaCl 50 mM) 80!l 0 20








Para preparar las muestras (100!l de cada una), proceder como sigue:

1) En base a los valores de concentración de proteínas obtenidos en el ensayo de Lowry, calcular el volumen que debemos tomar de cada fracción para tener en cada muestra 100!g de proteína total. Tener el cuenta que si el volumen resultante es mayor de 80!l, hay que tomar solamente 80!l aunque no se lleguen a completar los 100!gr (no cabe más en los pocillos).

2) Calcular el volumen de agua a añadir para llegar a 80 !l totales. 3) Preparar esas mezclas en eppendorff numerados. 4) Añadir por último el tampón de ruptura 5x (20!l/eppendorff) CON

GUANTES y cerrar rápidamente los tubos después de pipetearlo. 5) Calentar las muestras en un “termoblock” a 90ºC durante 3-5 minutos

para desnaturalizar las proteínas y permitir su unión al SDS. OJO: calentar con los tubos eppendorff perfectamente cerrados y con un agujero en la tapa hecho con una aguja fina.

6) Se cargarán 40!l (40!gr de proteína) por pocillo.


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3.- Desarrollo de la electroforesis Una vez polimerizado el gel de concentración, retirar el peine con cuidado de no romper los pocillos para las muestras. Montar el gel en la cubeta de electroforesis siguiendo las instrucciones de los encargados de prácticas. Retirar restos de acrilamida con ayuda de una aguja de 0,7 mm. Eliminar las burbujas de aire de la parte inferior del gel (zona de contacto con el tampón de electroforesis) con ayuda de una jeringuilla. Añadir tampón de electroforesis y marcar los pocillos con un rotulador o añadiendo 2-5 !l de tampón de ruptura azul. Cargar las muestras en el orden adecuado apoyando la punta sobre el cristal cuadrado y dejando que resbale con suavidad la mezcla hacia el fondo del pocillo. Una vez cargadas las muestras, se conectan los cables correctamente (el polo positivo, rojo, abajo y el negativo, negro, arriba) y se corre la electroforesis a 150-200 volt (unos 50 mA/gel) hasta que el frente azul esté cerca de la parte inferior del gel (unos 90 min). Cuando el frente esté cerca de la parte inferior del gel, se desconecta la corriente, se separan con mucho cuidado los dos cristales con ayuda de un espaciador de teflón y, con los guantes mojados en agua, se retira el gel y se coloca en un recipiente donde se añade la solución de tinción durante 30-40 minutos con agitación. Se retira esta solución y se añade la solución de revelado, donde se deja hasta que el gel esté completamente desteñido (hasta el día siguiente) encima de la mesa.


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6.- CRECIMIENTO DE BACTERIAS TRANSFORMADAS GENÉTICAMENTE.

La “transformación” es un proceso a través del cual un DNA exógeno se

puede introducir dentro de un microorganismo. En algunas bacterias éste es un fenómeno que se da de manera natural, pero puede ser inducido en el laboratorio mediante tratamientos químicos o físicos que modifican las propiedades de la pared celular bacteriana. En esta práctica vamos a utilizar

una cepa de Escherichia Coli (llamada DH5!) a la que se le ha introducido un DNA circular llamado “plásmido” que se caracteriza por contener las secuencias necesarias para garantizar su auto-replicación. Además suele contener un gen que confiere a aquellas células que lo expresen resistencia frente a la acción de un antibiótico determinado.

Nuestro plásmido codifica para un enzima que hidroliza el anillo "-lactámico de la ampicilina, permitiendo el crecimiento bacteriano incluso en presencia de este antibiótico. Por ello vamos a partir de “placas Petri” en las que se ha introducido un medio sólido rico en nutrientes (LB) junto con concentraciones del antibiótico ampicilina (50!gr/ml) restrictivas para el crecimiento de bacterias. En estas condiciones, las bacterias que hayan adquirido el DNA plasmídico van a poder crecer en forma de “colonias” observables a simple vista. Estas colonias son aglomeraciones de bacterias derivadas de una única célula original, es decir, “clones”. Para poder trabajar con el material biológico procedente de estas colonias bacterianas (en nuestro caso el DNA), necesitamos una cantidad grande de células de partida, para lo cual procederemos a cultivar estas bacterias inoculando una colonia en un medio líquido de LB-ampicilina en el que las bacterias se replicarán de manera muy eficiente durante toda la noche generando millones de células “hija”.

Materiales -tubos de 10 ml de tapón rojo estériles -puntas autoclavadas -medio LB-ampicilina (50!gr/ml) Método 1.- Preparar en condiciones de esterilidad (cerca de la llama y con puntas de 1 ml esterilizadas en el autoclave) un tubo de 10 ml estéril que contenga 2 ml de medio LB con ampicilina 50!gr/ml. 2.- Limpiar con etanol la parte blanca y el disparador de metal de una pipeta Gilson (p200).


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3.-Tomar con ayuda de una punta estéril y cerca de la llama una pequeña porción de una colonia procedente de la placa Petri que proporcionará el profesor. 4.- Inocular el medio introduciendo la punta dentro del tubo con 2 ml de LB-ampicilina y pipeteando arriba y abajo dos veces (teniendo cuidado de no tocar las paredes del tubo y de que el medio no llegue a mojar la punta blanda de la pipeta). 2.- Dejar creciendo el cultivo en un baño de agitación a 37ºC durante toda la noche.

7.- AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

La purificación de ácidos nucleicos se basa en la diferente solubilidad de las macromoléculas biológicas en función de la polaridad del disolvente. Vamos a realizar una extracción de ácidos nucleicos de DNA plasmídico de bacterias. El DNA resultante se someterá una digestión con enzimas específicos y después a electroforesis en un gel de agarosa con bromuro de etidio. Los ácidos nucleicos se visualizan con luz ultravioleta debido a la fluorescencia del bromuro de etidio que se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos. Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena, cerradas covalentemente, con un tamaño variable de 1-20 kilobases. Se encuentran en una gran variedad de especies bacterianas, funcionando como elementos genéticos que se replican, y heredan, de manera independiente del cromosoma bacteriano y que, frecuentemente, contienen genes que confieren a la bacteria resistencia a antibióticos. En esta práctica vamos a purificar DNA plasmídico de una estirpe de la bacteria Escherichia coli. Tras crecer las bacterias toda la noche, el método de purificación comienza con la destrucción de la pared celular. Seguidamente las células son expuestas a la acción de un detergente (dodecil sulfato sódico) y lisadas por tratamiento con sosa. Como consecuencia se produce la desnaturalización del DNA cromosómico y de las proteínas formándose una matriz insoluble. El DNA circular cerrado del DNA plasmídico no se desnaturaliza a no ser que el tratamiento con sosa sea prolongado. La mezcla se neutraliza con acetato potásico y se centrifuga. El DNA del plásmido queda soluble en el sobrenadante y es precipitado con etanol. Tras centrifugar y eliminar el etanol, el DNA precipitado se resuspende en tampón TE.


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Material y reactivos - 1,5 ml de cultivo bacteriano crecido durante una noche.

Todos los reactivos deben esterilizarse por autoclavado o filtración y se deben manejar posteriormente en condiciones estériles.

- solución I: Glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8 - solución II: NaOH 0.2M, SDS al 1% - solución III: (5M de ión potasio, 3M de ión acetato, pH 4.8) - Fenol saturado con tampón Tris-HCl pH 8 - Cloroformo. - Alcohol isoamílico. - Etanol absoluto. - Etanol al 70% - Tampón TE: EDTA 1mM, pH 8; Tris-HCl 10mM, pH8 - Ribonucleasa 10 mg/ml (conservada a -20°C). - Columnas de microcentrífuga para la purificación de plásmidos. - Tampones de lavado y elución de las columnas (comerciales) Método

Transferir 1.5 ml de cultivo de bacteria crecido durante toda la noche a un tubo eppendorf y centrifugar en la microfuga durante 1 min. Decantar el sobrenadante y resuspender bien las células, con ayuda del vórtex, en 100 !l de solución I. Añadir 200 !l de solución II. Mezclar con cuidado, invirtiendo el tubo tres veces (no se debe dejar la preparación más de 2-3 min en esta solución). Añadir 150 !l de solución III. Mezclar con cuidado e incubar en hielo 5 min. Centrifugar en la microfuga durante 10 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y estéril. Añadir 0.5 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (50/49/1). Agitar fuertemente, con el tubo bien cerrado, durante 1 min. y volver a centrifugar 3 min. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo y precipitar el DNA plasmídico añadiendo 1 ml de etanol absoluto dejando el tubo 5 min en hielo. Centrifugar 10 min. Eliminar el etanol y lavar el precipitado añadiendo 1 ml de etanol al 70%. Centrifugar de nuevo 3 min. Eliminar el etanol y secar bien el precipitado en una estufa a 37°C. Resuspender el DNA en 30 !l de tampón TE con RNAsa a una concentración de 50 !g/ml. Incubar a 37°C durante 30 min. Guardar la muestra a 4°C hasta el momento de realizar la electroforesis.


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8.- DIGESTIÓN DE DNA PLASMíDICO POR ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. Las enzimas de “restricción“ o endonucleasas de restricción son proteínas que cortan las moléculas de DNA específicamente en ciertos nucleótidos determinados por la secuencia precisa en la que estos nucleótidos se encuentran. Estos enzimas son producidos por muchas especies bacterianas de las que generalmente se deriva su nombre. El hecho de que el corte sea específico de secuencia, permite la digestión de moléculas de DNA en lugares determinados las cuales son utilizadas con posterioridad para introducir dichos fragmentos de DNA en diferentes tipos de vectores, por ejemplo, tras un promotor que dirija su transcripción a RNA, o tras un gen que codifica para cierta proteína generándose así una “proteína de fusión“, etc. Muchas nucleasas de restricción ya purificadas son hoy en día disponibles comercialmente. En estas prácticas vamos a utilizar la endonucleasa EcoRI (por E. Coli Restriction 1) para digerir el DNA plasmídico que hemos preparado en la práctica anterior con el fin de generar un fragmento de este DNA y separarlo así del resto del DNA perteneciente al vector. Para ello se llevará a cabo la reacción enzimática de corte mezclando la enzima (EcoRI) con el sustrato (DNA) e incubando un tiempo suficiente a una temperatura adecuada. El medio óptimo para la catálisis (condiciones de pH y concentración de sales adecuadas) se consigue añadiendo 1/10 del volumen final de una solución tampón específica para cada enzima que se suministra concentrada 10 veces (10x). Material y reactivos -Enzima de restricción Eco RI (diluida 1/2 del stock a 20 unidades/!l) -Tampón de restricción para EcoRI (10x) Método En un tubo eppendorff estéril (para evitar degradaciones por DNAsas) se mezclarán por este orden: 11 !l de H20 estéril 2 !l de tampón para EcoRI 10x 5 !l del DNA plasmídico 2!l de EcoRI recombinante a 10 unidades/!l*


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* Pipetear evitando introducir la punta en la solución en la que está resuspendida el enzima (tocar sólo levemente la superficie para pipetear). Así se evita llevarse por fuera de la punta restos de esta suspensión que contiene glicerol el cual puede inhibir la reacción a concentraciones altas. Por ello lo se suele establecer un máximo de volumen de enzima correspondiente a 1/10 del volumen final de la digestión. Mezclar bien los componentes con el vórtex y dar un pulso con la microfuga (para concentrarlos en el fondo del tubo). Incubar en la estufa de 37ºC durante al menos 60 min 8 (lo dejaremos toda la noche).

9.- SEPARACIÓN DE DNA POR ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.

La agarosa es un polímero lineal que, al fundirlo y dejarlo solidificar de nuevo, forma una matriz cuyo tamaño de poro depende de la concentración de agarosa. Al aplicar una corriente eléctrica al gel de agarosa, los ácidos nucleicos migran hacia el ánodo y se van a separar por tamaño. El tamaño y la cantidad relativa de los ácidos nucleicos se determina por tinción con bromuro de etidio y examen del gel con luz ultravioleta. Material y reactivos - Agarosa y Bromuro de etidio 10mg/ml - Tampón TAE (se prepara a partir de TAE 50x): EDTA 0.01M pH 8; Tris-acetato 0.04M - Tampón de carga (10x): Azul de bromofenol al 0.25%; Xilencianol al 0.25%; Glicerol al 30% Método ATENCION: Durante la preparación y manejo del gel es necesario SIEMPRE el uso de guantes (el bromuro de etidio es un agente cancerígeno).

Se pesa la cantidad correspondiente de agarosa (utilizaremos un gel de agarosa al 0,8% (p/v)). Se añade a 100 ml de tampón TAE, se calienta la mezcla, agitándola, hasta que se funda completamente la agarosa. Se deja enfriar un poco y se añade bromuro de etidio a una concentración final de 0,5 !g/ml.


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Se mezcla bien y se vierte sobre la placa que va a contener el gel donde hemos colocado el peine con los pocillos. Se deja solidificar al menos durante 30 min. Las muestras que vamos a cargar en el gel son 10 !l de la digestión con EcoRI y 5 !l de la preparación de DNA plasmídico sin digerir (al que añadiremos 5 !l de H2O estéril). Para prepararlas utilizar tubos eppendorff estériles y añadir a cada muestra 2 !l de tampón de carga 6x y mezclando bien. Se introduce la muestra en el pocillo con la pipeta automática junto a una muestra de marcadores de peso molecular. Correr la electroforesis en tampón TAE a 100 voltios durante 30 min. Una vez terminada la electroforesis, el DNA se visualiza con luz ultravioleta y se analiza mediante un escáner digital.

10.- IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN LA CASEÍNA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC).

Las proteínas se caracterizan por su composición y su secuencia de aminoácidos. La composición de aminoácidos de una proteína viene definida por el porcentaje de cada uno de los que componen la cadena. Para determinar la composición de aminoácidos de una cadena será necesario: (1) romper la cadena polipeptídica liberando los aminoácidos constitutivos, (2) separar los aminoácidos resultantes y (3) medir las cantidades de cada aminoácido. La ruptura de los enlaces peptídicos, normalmente, se consigue hirviendo la proteína en HCl 6N, esto provoca la hidrólisis del enlace y libera los aminoácidos, a este proceso se le conoce como hidrólisis ácida de las proteínas. La separación y posterior cuantificación de los aminoácidos resultantes puede hacerse por diferentes técnicas cromatográficas, siendo la más frecuente la de intercambio iónico. La cromatografía en capa fina se utiliza en el Laboratorio para la determinación semicuantitativa de aminoácidos. CROMATOGRAFÍA La cromatografía es una de las técnicas más útiles para separar los

componentes de una mezcla. Se basa en la distribución relativa de un soluto entre una fase móvil, y una fase estacionaria. La cromatografía en capa fina es un caso particular de cromatografía de reparto donde la fase estacionaria (agua) se adsorbe en el soporte sólido, que constituye


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la capa fina, y que podrá ser cualquier material que pueda reducirse a polvo y formar una capa uniforme, p. ej. celulosa. Generalmente, la capa tiene un espesor de 0,25-0,5 mm y se extiende sobre una placa de vidrio, plástico o aluminio. La fase móvil (disolvente orgánico saturado de agua) fluye a través de la fase estacionaria. Los componentes de la mezcla se separarán si sus coeficientes de reparto, K, entre los dos disolventes, son suficientemente distintos. La movilidad de un compuesto respecto a la del disolvente se

denomina Rf. Los valores de Rf dependerán, obviamente, de la naturaleza del

compuesto, del soporte, del disolvente y de la temperatura. Material y reactivos - Cubetas cromatográficas. - Placas de capa fina de celulosa de 20 x 10 cm. - Eluyentes cromatográficos: n-Butanol: acetona: ácido acético: agua (35:35:10:20) -Disoluciones patrón de Lys, Phe, Ala, Leu, Val, Gly, Arg, Glu y Pro a una concentración de 1,6 mg/ml en agua destilada.

- Mezcla problema de 4 aas. - Hidrolizado de caseína a una concentración de 5 mg/ml en agua destilada. - Reactivo de tinción: 200 mg de ninhidrina en 100 ml de etanol al 70% Método 1.- Aplicación de las muestras. Sobre una cromatoplaca de celulosa aplicar 2 !l. de las disoluciones

patrón de aminoácidos, así como del hidrolizado de caseina, haciendo uso de la plantilla de papel proporcionada. Se cargarán 9 aas: Lys, Phe, Ala, Leu, Val, Gly, Arg, Glu y Pro. Dichas muestras deben ser aplicadas a 1 cm. del borde inferior de la cromatoplaca, y distantes entre sí aproximadamente 1 cm. Rotular la cromatoplaca con el número de cada investigador en la esquina superior derecha con un lápiz de grafito. Se deja secar la placa a temperatura ambiente antes de proceder al desarrollo cromatográfico.


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2.- Desarrollo cromatográfico. Se introduce la placa en el eluyente que constituye la fase móvil (n-

butanol: acetona: acético: agua) y se deja correr de forma ascendente hasta que el frente llegue al borde superior de la placa (aproximadamente setenta y cinco minutos). Se deja secar la placa y se repite el proceso para una mejor separación de los aminoácidos.

Para obtener Rf reproducibles es imprescindible tener la atmósfera del

tanque saturada con disolvente ya que en caso contrario, puede evaporarse disolvente de la capa fina, aumentando los valores de Rf.

Terminado el desarrollo se seca la placa con aire frío hasta la eliminación total de los disolventes. Se tiñe por inmersión de la placa en el líquido de tinción durante 1 minuto y se seca en una estufa a 120°C hasta la aparición de las manchas (aproximadamente 5 minutos). Resultados Una vez visualizadas las manchas se calcularán los Rf, y por comparación

con los de los patrones, se procederá a la identificación de los aminoácidos mayoritarios en la caseína de la leche y de las muestras problema de las que se calcularán también sus Rf.


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