HERRAMIENTAS MOLECULARES HERRAMIENTAS MOLECULARES HERRAMIENTAS MOLECULARES HERRAMIENTAS MOLECULARES APLICADAS A LA INVESTIGACIAPLICADAS A LA INVESTIGACIAPLICADAS A LA INVESTIGACIAPLICADAS A LA INVESTIGACIÓÓÓÓN DE N DE N DE N DE

PHYTOPHTHORA INFESTANSPHYTOPHTHORA INFESTANSPHYTOPHTHORA INFESTANSPHYTOPHTHORA INFESTANSEN LA ESTACIEN LA ESTACIEN LA ESTACIEN LA ESTACIÓÓÓÓN CIPN CIPN CIPN CIP----QUITOQUITOQUITOQUITO

• El tizEl tizEl tizEl tizóóóón tardn tardn tardn tardíííío de la papa causado por el o de la papa causado por el o de la papa causado por el o de la papa causado por el hongo hongo hongo hongo PhytophthoraPhytophthoraPhytophthoraPhytophthora infestansinfestansinfestansinfestans continua continua continua continua siendo uno de los msiendo uno de los msiendo uno de los msiendo uno de los máááás serios problemas en s serios problemas en s serios problemas en s serios problemas en el cultivo de la papa en los pael cultivo de la papa en los pael cultivo de la papa en los pael cultivo de la papa en los paííííses en ses en ses en ses en desarrollo.desarrollo.desarrollo.desarrollo.

• CIP ha puesto en marcha desde hace CIP ha puesto en marcha desde hace CIP ha puesto en marcha desde hace CIP ha puesto en marcha desde hace algunos aalgunos aalgunos aalgunos añññños atros atros atros atráááás programas con s programas con s programas con s programas con herramientas biotecnolherramientas biotecnolherramientas biotecnolherramientas biotecnolóóóógicas, las mismas gicas, las mismas gicas, las mismas gicas, las mismas que estque estque estque estáááán ayudando cada vez mas en n ayudando cada vez mas en n ayudando cada vez mas en n ayudando cada vez mas en entender el comportamiento, evolucientender el comportamiento, evolucientender el comportamiento, evolucientender el comportamiento, evolucióóóón, n, n, n, cambios y dincambios y dincambios y dincambios y dináááámica poblacional de este mica poblacional de este mica poblacional de este mica poblacional de este patpatpatpatóóóógeno en nuestro pageno en nuestro pageno en nuestro pageno en nuestro paíííís.s.s.s.

De las herramientas biotecnológicas desarrolladas para este tipo de estudios en Phytophthorainfestans los marcadores a nivel molecular son los mas utilizados incluso mundialmente para la caracterización y mapeo de muchos organismos en general.

De estos marcadores, los mas utilizados regularmente en la Estación CIP-Quito son de dos tipos:

•ADN o Acidos nucleicos•Proteínicos

• Usualmente un marcador genético es un fragmento de ADN –que puede ser un gen-, cuyo forma de expresión o fenotipo es fácilmente distinguible, y que debido a esta característica éste será usado para identificar o distinguir a un individuo u organismo que lo porta

QUE ES UN MARCADOR GENQUE ES UN MARCADOR GENQUE ES UN MARCADOR GENQUE ES UN MARCADOR GENÉÉÉÉTICO ?TICO ?TICO ?TICO ?

CaracterCaracterCaracterCaracteríííísticas mas deseables que un buen sticas mas deseables que un buen sticas mas deseables que un buen sticas mas deseables que un buen marcador molecular debermarcador molecular debermarcador molecular debermarcador molecular deberíííía tener:a tener:a tener:a tener:

ALTO COMPORTAMIENTO POLIMÓRFICO

HERENCIA CODOMINANTE

SER FRECUENTE EN EL GENOMA

UNIFORMEMENTE DISTRIBUÍDO EN EL GENOMA

COMPORTAMIENTO NEUTRAL

FÁCIL Y RÁPIDA ACCESIBILIDAD

ALTA REPRODUCIBILIDAD

FÁCIL INTERCAMBIO DE DATOS ENTRE LABORATORIOS

MARCADORES PROTEÍNICOS

Los marcadores a base de proteínas fueron los marcadores mas usados para los estudios de genética, herencia, variabilidad, filogenia, etc.

La información de dos formas protéicas en general nos permitirá diferenciar a un organismo.

IsoenzimasFormas protéicasfuncionalmente similares

AloenzimasProteínas con variantes estructurales que representan a las diferentes alternativas alélicasen igual locus genético

Categorías de las proteínas por su estructura (número de cadenas de polipeptidos)

Monoméricas

Diméricas

Triméricas

Tetraméricas

GPI (GLUCO FOSFO ISOMERASA )

PEP (PEPTIDASA)

HOMOCIGOTO HETEROCIGOTO HOMOCIGOTO

CON LA SEPARACION DE LAS PROTEINAS PODEMOS REVELAR LOS PATRONES DE LINAGES EN Phytophthora infestans

ACETATO DE

CELULOSA

ALMIDON DE PAPA

MARCADORES MARCADORES MARCADORES MARCADORES MOLECULARES DE MOLECULARES DE MOLECULARES DE MOLECULARES DE

ADNADNADNADN

• El enfoque esencial de los marcadores de ADN se centra en el estudio del polimorfismo en la secuencia de material genético de los organismos.

• Dado que dicha secuencia de ADN es única para cada organismo, su información puede ser explotada para cualquier estudios de diversidad genética y la relaciones intra e inter-específicas, genética de poblaciones, etc.

En el estudio de Phytophthotora infestans en CIP-Quito nos ayudan esencialmente a discriminar la diversidad de linajes que se encuentran en los distintos hospederos y los nuevas variantes que pueden estarse generando.

•Los marcadores regular se estan usando:

ADN mitocondrial (mt DNA).ADN microsatélites .RFLP`S (Fragmentos polimorficos de restricción).ISSR (secuencias inter-microsatélites).

ADN mitocondrial (mt DNA).

ADN microsatélites (SSR).

RFLP`S(Fragmentos polimórficos de restricción).

ISSR(secuencias inter-microsatélites).

MATERIA PRIMA HERRAMIENTA NATURALEZA

ADN de mitocondria

PCR + RESTRICCION CODOMINANTE

Secuencias de ADN repetitivas PCR CODOMINANTE

ADN genómico RESTRICCION CODOMINANTE

Secuencias de ADN

intermicrosatélites PCR DOMINANTE

GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR ADN MITOCONDRIAL ADN MITOCONDRIAL ADN MITOCONDRIAL ADN MITOCONDRIAL

((((mtDNAmtDNAmtDNAmtDNA))))

EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA TOTALTOTALTOTALTOTAL

AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE SECUENCIAS ESPECIFICAS SECUENCIAS ESPECIFICAS SECUENCIAS ESPECIFICAS SECUENCIAS ESPECIFICAS

POR PCRPOR PCRPOR PCRPOR PCR

GENERACION DE GENERACION DE GENERACION DE GENERACION DE FRAGMENTOS DE FRAGMENTOS DE FRAGMENTOS DE FRAGMENTOS DE

RESTRICCION USANDO RESTRICCION USANDO RESTRICCION USANDO RESTRICCION USANDO ENZIMAS (ENZIMAS (ENZIMAS (ENZIMAS (EcoR1EcoR1EcoR1EcoR1))))

SEPARACION DE SEPARACION DE SEPARACION DE SEPARACION DE PRODUCTOS POR PRODUCTOS POR PRODUCTOS POR PRODUCTOS POR

ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)

HAPLOTIPOS DE HAPLOTIPOS DE HAPLOTIPOS DE HAPLOTIPOS DE P.infestansP.infestansP.infestansP.infestans

IcGrupo brevifolium

IIaEc1 S.tuberosum

IaTomate árbol

IbTomate riñón

GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR ADN MICROSATELITE (SSR)ADN MICROSATELITE (SSR)ADN MICROSATELITE (SSR)ADN MICROSATELITE (SSR)

EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA TOTALTOTALTOTALTOTAL

AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE SECUENCIAS SECUENCIAS SECUENCIAS SECUENCIAS

MICROSATELITES POR PCRMICROSATELITES POR PCRMICROSATELITES POR PCRMICROSATELITES POR PCR

SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR ELECTROFORESIS (EGA, EGP)ELECTROFORESIS (EGA, EGP)ELECTROFORESIS (EGA, EGP)ELECTROFORESIS (EGA, EGP)

Lycopersicumsculentum

Solanum

phureja

Solanum

tuberosum

Solanum

andreanum

Solanum

paucijugum

GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR RFLP`SRFLP`SRFLP`SRFLP`S

EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA TOTALTOTALTOTALTOTAL

DIGESTION DE ADN TOTAL DIGESTION DE ADN TOTAL DIGESTION DE ADN TOTAL DIGESTION DE ADN TOTAL CON ENZIMAS DE CON ENZIMAS DE CON ENZIMAS DE CON ENZIMAS DE

RESTRICCIONRESTRICCIONRESTRICCIONRESTRICCION

SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)

TRANSFERENCIA DE ADN A TRANSFERENCIA DE ADN A TRANSFERENCIA DE ADN A TRANSFERENCIA DE ADN A MEMBRANA POR SHOUTERN BLOTMEMBRANA POR SHOUTERN BLOTMEMBRANA POR SHOUTERN BLOTMEMBRANA POR SHOUTERN BLOT

HIBRIDACION Y MARCACION DE HIBRIDACION Y MARCACION DE HIBRIDACION Y MARCACION DE HIBRIDACION Y MARCACION DE SONDA EN MEMBRANASONDA EN MEMBRANASONDA EN MEMBRANASONDA EN MEMBRANA

DETECCION Y REVELADODETECCION Y REVELADODETECCION Y REVELADODETECCION Y REVELADO

GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR GENERACION DE MARCADOR ISSR (secuencias inter-microsatélites).

EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA EXTRACCION DE DNA TOTALTOTALTOTALTOTAL

AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE AMPLIFICACION DE FRAGMENTOS MEDIANTE FRAGMENTOS MEDIANTE FRAGMENTOS MEDIANTE FRAGMENTOS MEDIANTE

PCRPCRPCRPCR

SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR SEPARACION DE PRODUCTOS POR ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)ELECTROFORESIS (EGA)

PERU

PAPABOLIV

PAPA

ARGT

PAPA

KENYA

PAPA

UGAN

PAPA

ECUA

PAPA

ECUA

TOMAT

KENYA

TOMAT

UGAN

TOMAT

R(A.G)CTC.TCT.CTC.TCT.CTC.TRC844

• Todas estas herramientas biotecnológicas, enmarcadas dentro de un programa de manejo integral del tizón tardío pretenden ampliar el conocimiento sobre e patógeno proporcionando soluciones prácticas al problema del tizón tardío en el Ecuador como puede ser el diseño de estrategias eficaces de control, la disminución en el uso de los funguicidas, transferencia de tecnologías y saber como combatir el tizón tardío con efectividad en nuestros campos.

COMENTARIO FINAL