Hilda Montero L. de Guevara - Instituto de...
43
1 Hilda Montero L. de Guevara
Transcript of Hilda Montero L. de Guevara - Instituto de...
1
Hilda Montero L. de Guevara
2
CONTENIDO1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………..……12. TEORIA DE LA SEDIMENTACIÓN………………………………………………………………..…….23. FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA……………………………………………………………..………34. COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN…………………………………………………………..……… 3
COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN ESTÁNDAR…………………………………………...……… 4DEPENDENCIA DE S CON RESPECTO A LA CONCENTRACIÓN………………………..………….4SEDIMENTACIÓN DEPENDIENTE DE LA VELOCIDAD…………………………………………..….6EFECTO DE LA CARGA EN LA SEDIMENTACIÓN………………………………………………..…..7
MEDICIÓN EXACTA DEL COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN………………………………..…...75. CENTRÍFUGAS……………………………………………………………………………………..………8
CENTRÍFUGAS DE BAJA VELOCIDAD………………………………………………………….……...8CENTRÍFUGAS DE ALTA VELOCIDAD…………………………………………………………..……..8ULTRACENTRÍFUGAS……………………………………………………………………………….……8CENTRÍFUGA TUBULAR………………………………………………………………………………..11CENTRÍFUGA DE CAMARA MULTIPLE……………………………………………………………….11CENTRÍFUGAS DECANTADORAS O DE TORNILLOS……………………………………………….12CENTRÍFUGAS DE DISCOS……………………………………………………………………………...12
6. TIPOS DE ROTORES……………………………………………………………………………………...13ROTORES DE COLUMPIO……………………………………………………………………………….13ROTORES DE ÁNGULO FIJO…………………………………………………………………………....14ROTORES VERTICALES………………………………………………………………………………....14ROTORES ZONAL……………………………………………………………………………………..….15FACTOR K Y K’………………………………………………………………………………………..….16
7. TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN…………………………………………………………………………..17CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL O PELLETING………………………………………………...…18CENTRIFUGACIÓN ZONAL……………………………………………………………………………..18 MATERIALES PARA GENERAR UN GRADIENTE DE DENSIDAD…………………………….20 FORMAS DE GRADIENTES………………………………………………………………………...22CENTRIFUGACIÓN AL EQUILIBRIO………………………………………………………………...…23
GRADIENTES DE DENSIDAD AUTOGENERADOS…………………………………………..…24 MATERIALES PARA FORMAR GRADIENTES AUTOGENERADOS…………………………..24 PREPARARACIÓN DE GRADIENTES………………………………………………………..……25 GRADIENTES DISCONTINUOS………………………………………………………...….25 GRADIENTES CONTINUOS…………………………………………………………….….26 GRADIENTES PREFORMADOS…………………………………………………………....26 GRADIENTES AUTOGENERADOS………………………………………………………..27 DETERMINACIÓN DE LA FORMA DE UN GRADIENTE AUTOGENERADO….…….29 GRADIENTES ISOSMÓTICOS……………………………………………………….……..29
8. ANÁLISIS DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA MUESTRA EN EL GRADIENTE…………………..…….29INSPECCIÓN VISUAL………………………………………………………………………………...…..29ANÁLISIS RADIOQUIMICOS DE LA MUESTRA ………………………………………………….…..30
9. APLICACIONES…………………………………………………………………………………………...31CROMATOGRAFÍA DE PRECIPITACIÓN CENTRÍFUGA…………………………………………….31MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN CENTRÍFUGA………………………………………………….32SEPARACIÓN DE DNA, RNA Y PROTEINAS DE NUCLEOS FIBROBLASTOS DE HAMSTER…...33SEPARACIÓN DE DNA EN BASE ALA COMPOSICIÓN GC, CON USO DE BAMD………………..33SEPARACIÓN DE DNA NATIVO Y DESNATURALIZADO CON GRADIENTES DE DENSIDADDE TRICLOROACETATO DE RUBIDIO………………………………………………………………...33FRACCIONAMIENTO DE RNA………………………………………………………………………….34SEPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO, EN ROTORES DE TUBO VERTICAL…………………..…..34FRACCIONAMIENTO CELULAR POR CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL………………………..35
10. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………3611. APÉNDICE …………………………………………………………………………………………….…..37
3
INTRODUCCIÓN
La separación de líquidos y partículas insolubles se ha dado en la naturaleza desde que se formó eluniverso. La aplicación de una fuerza centrífuga ayuda a la separación y este proceso se ha venido aplicandorecientemente. La separación de partículas por medio de la centrifugación tuvo aplicaciones en procesosindustriales hasta hace aproximadamente 100 años. Los primeros usos fueron en la manufactura del azúcar yen separar la crema de la leche. Las primeras separaciones de partículas usando centrifugación fueronprobablemente inventadas en 1877 por el ingeniero sueco Carl Gustaf Patrik DeLaval para separar crema deleche, estas centrífugas funcionaban a velocidades de hasta 3 000 r.p.m.
El desarrollo de la ultracentrífuga se le atribuye a Svedberg quien trabajó entre 1920 y 1930, el fuequien introdujo el termino de ultracentrífuga y debido a que era un químico coloidal, estudiaba la estructurade las proteínas ( en esa época todas las proteínas eran consideradas coloides); su grupo utilizaba laultracentrífuga para determinar el peso molecular y la subunidad estructural de la hemoglobina, sus estudioscambiaron las ideas concernientes a la estructura de las proteínas que se tenían en aquel tiempo. El grupo deSvedberg desarrollo algunas centrífugas y los primeros modelos funcionaban a velocidades de hasta 900 000g y cuyos rotores eran pequeños; otros modelos funcionaban a velocidades de hasta 260 000 g. SPINCOprodujo en 1940 la primera centrífuga comercial, el modelo original es mostrado en la siguiente figura.
Una de las técnicas más comúnmente utilizadas en la actualidad para caracterizar lasmacromoléculas es la sedimentación. Utilizando las variantes adecuadas de esta técnica, se pueden obtenerel peso molecular, la densidad y la forma general de la macromolécula; además, se puede detectar cambiosen estos parámetros y cualquiera de ellos se puede aprovechar como base para la separación de loscomponentes de una mezcla con propósitos preparativos o analíticos. Debido a la facilidad con la que seobtienen los resultados en los modernos instrumentos automáticos, hacen de la ultracentrifugación unatécnica especialmente útil.
En realidad, con una ultracentrífuga solamente se hace una cosa: mover a las partículas por lafuerza centrífuga y medir, una o varias veces a lo largo del tiempo, la distribución de la concentración delas partículas a lo largo del tubo de la centrifugadora. La medición realizada mientras las moléculas se estánmoviendo a lo largo del eje de la fuerza centrífuga, se denomina determinación de la velocidad desedimentación y el resultado es un coeficiente de sedimentación, cifra que proporciona información sobreel peso molecular y la forma de la partícula. Cuando se mide la distribución de concentraciones bajocondiciones en las que la distribución ya no cambia con el tiempo, se dice que las partículas han alcanzadoel equilibrio de sedimentación; este segundo tipo de medida proporciona datos sobre los pesos moleculares,la densidad y la composición de las partículas.
4
Teoría de la Sedimentación
Las partículas en disolución pueden sufrir alteración espacial, es decir, pueden cambiar de posicióncon el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusión (en un gradiente de concentración, laspartículas tienden a ir de la zona de mayor concentración a la de menor concentración) o bien a procesosde sedimentación.
En un proceso de sedimentación la velocidad a la cual sedimentan las partículas en una suspensión,no sólo depende de su naturaleza, depende también de la naturaleza del medio en el cual están suspendidasasí como, de la fuerza aplicada a las partículas. Intuitivamente, uno especularía que las partículas másgrandes sedimentarán más rápido que las más pequeñas. Un factor que afecta la sedimentación de laspartículas es la viscosidad del medio. En 1856 Sir Gabriel Stokes propuso que la fuerza friccional, F, queactúa en una partícula esférica de radio rp es relacionada a la viscosidad, h, por la siguiente ecuación:
F= 6 p h rp dr/dt
Donde dr/dt es la velocidad de la partícula. La fuerza que experimenta una partícula no está sólodeterminada por la fuerza gravitacional, g, sino también, por los efectos de flotación que reflejan lasdiferencias en la densidad del medio dm y de la partícula dp, por lo que tenemos:
(dm - dp) V g = 6 p h rp dr/dt
V= volumen de la partícula
Como se asume que la partícula es esférica, el volumen puede ser expresado en términos del radio:
(dm - dp) ( 4/3 p rp3) g = 6 p h rp dr/dt
en la práctica, la fuerza centrífuga que mueve a la partícula sobre su eje de rotación es mucho mayorque la fuerza de gravedad, se puede expresar la fuerza centrífuga de la siguiente manera:
Fuerza centrífuga = w2r / g
Donde r es la distancia radial de la partícula del eje de rotación y w es la velocidad angular enradianes / segundo, haciendo una sustitución en esta fórmula y simplificando la expresión en términos de lavelocidad de la partícula, tenemos:
dr = 2rp2 (dp - dm) w2 r
dt 9h
Esta expresión es cierta para partículas esféricas. Las partículas no esféricas tienen altos coeficientesde fricción, por lo que, la expresión se puede modificar en base a los coeficientes de fricción de unamolécula dada, f (f= 2phmD), con relación al coeficiente de fricción de una partícula esférica, fo.
dr = 2rp2 (dp - dm) w2 r
dt 9h (f/fo)
5
Por la anterior ecuación, podemos deducir que:1) Una partícula con mayor masa tiende a moverse más de prisa que una de menos masa2) Una partícula más densa se mueve más de prisa que otra menos densa3) Cuanto más densa sea la disolución, más lentamente se moverá la partícula4) A mayor coeficiente de fricción, más lento será el movimiento de la partícula
Fuerza Centrifuga Relativa
La fuerza centrífuga (RCF) es dependiente de la velocidad de rotación (N) en r.p.m. y la distancia dela partícula (r) al centro de rotación. Cuando la distancia es expresada en cm tenemos que:
RCF = 1.18 x r x (r.p.m / 1000)2
ó
RCF = 1.18 x r x (N)2
La fuerza centrifuga es dada en términos de g y N esta dada en miles de r.p.m.. Si la fuerza centrifugaes conocida, entonces la velocidad (N) requerida en r.p.m. para obtener esa fuerza centrífuga a un punto r(cm) de el centro de rotación puede ser calculada con solo despejar la ecuación anterior.
Coeficiente de Sedimentación
Como la velocidad de una molécula es proporcional a la magnitud del campo centrífugo (w2r) escomún discutir las propiedades de sedimentación en términos de la velocidad por unidad de campo, o sea:
s = (dt/dr) / w2 r
Donde s es el coeficiente de sedimentación; el objetivo inmediato de muchos de los experimentos develocidad de sedimentación es la determinación del valor del coeficiente de sedimentación.
Dado que la velocidad de sedimentación es mucho mas pequeña que la velocidad angular, para lamayoría de macromoléculas biológicas la magnitud de s es alrededor de 10-13 seg y es por ello que la unidadde sedimentación Svedberg (S) ha sido definida como 10-13
S = 10-13 seg
Así por ejemplo, tenemos que la constante de sedimentación de los ribosomas de eucarotes es 80S, osea, s = 80 x 10-13 seg.
6
Coeficiente de Sedimentación Estándar
En una centrifugación, el valor del coeficiente de sedimentación no depende sólo de la velocidad otipo de rotor, depende también del tamaño y densidad de la partícula, así como, de la densidad y viscosidaddel medio utilizado para la centrifugación. La dependencia de la viscosidad del medio se puede descartarsiempre que se utilice el mismo medio para la centrifugación. El medio más utilizado es el agua, cuyadensidad y viscosidad son conocidas a 20 0C. El coeficiente de sedimentación de una partícula en agua a estatemperatura se denotará s20,w y como las condiciones de viscosidad y densidad del medio se descartan por sersiempre las mismas, ahora, el coeficiente de sedimentación dependerá sólo de las parámetros de la partícula.Entonces tenemos:
s20,w = k´ [D2 (d - d20,w)] / h20,w
Donde k´ es 1.18 para una partícula esférica y 1.12 para una partícula cilíndrica, D es el diámetro encm, d es la densidad de la partícula (g/cm3) , d20,w y h20,w son la densidad y viscosidad del agua.
Para determinar la constante de sedimentación no es necesario realizar la centrifugación con aguacomo medio, los datos de la centrifugación pueden obtenerse con otro medio cuya densidad y viscosidad seanconocidas. Para transformar el coeficiente de sedimentación de una partícula de un experimento dado a laconstante de sedimentación estándar, s20,w es dividida entre s, así, se obtiene la eliminación de k´ y D2 :
s20,w = s [ (d - d20,w) hm ] / [ (d - dm ) h20,w]
Sustituyendo s en la ecuación, tenemos:
s20,w = v . (d - d20,w) hm
w2r (d - dm ) h20,w
Donde d es la densidad de la partícula (g/cm3), v es la velocidad de sedimentación, r es la distanciade la partícula al eje de rotación (cm) y w es la velocidad angular (rad/seg).
El coeficiente de sedimentación de las macromoléculas depende de toda una serie de factores, puestoque las moléculas tienen una forma que depende de la composición del disolvente, muchas de ellas puedenestar eléctricamente cargadas, son muy grandes comparadas con las moléculas del disolvente y se deforman amedida que se mueven. Estos efectos se manifiestan en la dependencia que s presenta respecto a laconcentración, la velocidad de centrifugación y la fuerza iónica del disolvente.
Dependencia de s conRespecto a la Concentración
Considérese una disolución de macromoléculas de un tamaño tal que chocan frecuentemente unascon otras. Ésta es una característica de las moléculas muy grandes y muy extendidas en disolución (proteínasy ácidos nucleicos), porque a medida que giran sobre sí mismas, ocupan un volumen efectivo de la disoluciónrealmente grande. Cuando se aproximan entre sí, es más fácil para las moléculas del disolvente el moverse endirección opuesta, es decir, la viscosidad del disolvente se incrementa efectivamente en la vecindad de lasmacromoléculas. Esto reduce la velocidad hacia adelante de la partícula en un campo centrífugo dado y por
7
FagoFX 174Proteínas pequeñas
y globulares
T7 DNA
T6 DNA
Concentración mg/mlDependencia de s con respecto a laconcentración expresada como s/so
donde s0 es el valor de s extrapolado aconcentración cero.
s/s0
consiguiente se reduce s. Como la probabilidad de colisión aumenta tanto con el volumen como con el gradode extensión de la molécula, la magnitud de la dependencia respecto a la concentración también aumenta amedida que lo hacen dichos parámetros.
En la siguiente figura se ejemplifica este punto con varias curvas de s en función de la concentraciónde DNA o de proteína.
En la gráfica se puede observar que la dependencia respecto a la concentración aumenta a medidaque aumenta el peso molecular y a medida que la molécula es más extendida. Las proteínas pequeñas sonmás pequeñas que Fago fx 174, este es más pequeño que el DNA del fago T7.
Nota: El valor de so se obtiene experimentalmente midiendo s a varias concentraciones yrepresentando gráficamente 1/s frente a la concentración para determinar 1/s0 por extrapolación aconcentración de cero. Esto se deduce de la siguiente ecuación 1/sc= 1/s0 + k/s0.
Si las moléculas de una disolución tienen diferentes s y la concentración es relativamente alta, surgeun nuevo problema. En este caso, las moléculas no solamente interfieren con la sedimentación de las de sumisma clase, sino también con las de otros tipos. Es más, la molécula con el mayor s y mayor dependenciarespecto a la concentración, tiene que sedimentar a través de la disolución de las moléculas de movimientomás lento . A concentraciones elevadas, las moléculas más veloces resultan tan impedidas en su movimientoque sedimentan a la misma o similar velocidad que las lentas, lo cual puede enmascarar el hecho de que, enrealidad, se trata de una mezcla y dar la información errónea de que el material que se está analizando eshomogéneo. Este fenómeno se conoce como efecto de Jhonston-Ogston. De hecho, con ácidos nucleicos degran tamaño se hace necesario utilizar pequeñísimas concentraciones antes de que los dos tipos de moléculaspuedan diferenciarse e, incluso a estas concentraciones, los datos indican a menudo que hay menos cantidaddel componente rápido de la que realmente hay. Cabe mencionar que este problema queda muy reducido conel uso de la técnica de centrifugación zonal.
8
En la siguiente figura hay un ejemplo que ilustra este punto.
Sedimentación Dependiente de la Velocidad
La sedimentación dependiente de la velocidad se refiere a dos fenómenos independientes: laagregación de las moléculas, dependiente de la velocidad, que se produce a grandes concentraciones, y lareducción real de s a elevadas velocidades. En ninguno de los dos casos se comprende completamente elfenómeno, pero gracias a los trabajos de Bruno Zimm y sus colaboradores, se tiene una idea de cuáles puedenser las causas.
La agregación dependiente de la velocidad se refiere a la pérdida aparente de material de ladisolución, que disminuye la concentración efectiva de la macromolécula (aumentando el s aparente). Laexplicación que normalmente se da de este fenómeno es que, a elevadas velocidades, las moléculas dejanatrás de sí una estela que aumenta la velocidad de la molécula que está justamente detrás de ella. El resultadoes la formación de agregados moleculares que tienen valores de s muy elevados y que forman rápidamente unsedimento en el fondo del tubo de la centrífuga. Este proceso continua hasta que la concentración esdemasiado baja para que se produzcan agregados.
El segundo tipo de dependencia con respecto a la velocidad, se produce con las grandes moléculas abajas concentraciones. En el caso del DNA de T4 (peso molecular = 106 x 106 daltones) el aumento de s esdel 9% al pasar de 65 000 a 10 000 r.p.m.. Con moléculas de DNA de mayor tamaño (con pesos molecularesmayores a 500 x 106 daltones), la dependencia respecto a la velocidad se hace significativa y puede conducira errores de entre tres y ocho veces al estimar el peso molecular. Este fenómeno tiene importancia, puestoque el ADN del cromosoma de bacterias y de los eucariotes poseen pesos moleculares que van de 2 x 109 a10 x 109 daltones.
En la siguiente gráfica podemos ver como por encima de una cierta velocidad se pierde ladependencia de s respecto al peso molecular. Zimm ha propuesto que esto se debe a una alteración de laforma (un agrandamiento) de las moléculas de DNA, debido a que el arrastre creciente provocado por lafricción distiende los extremos de la molécula.
0
10
20
30
40
50
60
0 20 40 60 80 100
Concentración (mcg/ml)
PORC
ENTA
JE
DE
DN
A
9
Efecto de la Carga en la Sedimentación
Cuando la sedimentación se lleva a cabo en disoluciones de baja fuerza iónica (menores 0.01 M) y lamolécula esta eléctricamente cargada, lo que suele ocurrir con la mayoría de las macromoléculas biológicas,se presenta un fenómeno en el disolvente que no implica ningún cambio de conformación. Debido a loselevados valores de s para las macromoléculas, comparándolos con los de los iones neutralizantes, como Na+
y Mg+2, la macromolécula ionizada sedimenta mucho más rápidamente que los iones estabilizadores. Estaseparación de las cargas crea un gradiente de potencial contrario a la dirección de sedimentación, con elresultado de disminuir s. Para evitar esta complicación, se realiza la centrifugación con un exceso de ionesestabilizadores, por ejemplo, utilizando una fuerza iónica mayor a 0.05.
Medición Exacta delCoeficiente de Sedimentación
En primer lugar, habría que mantener la fuerza iónica entre 0.05 y 1.0 para evitar efectos de la cargay el pH debería quedar regulado por una disolución tampón. Debe efectuarse las medidas a variasvelocidades, difiriendo entre ellas en un 50%, para asegurarse que los efectos de la velocidad no esténpresentes. A cada velocidad debe usarse como mínimo cuatro concentraciones distintas, incluyendo lasolución más diluida posible, para asegurarse de que o bien solamente hay un tipo de moléculas o que se estaobservando la proporción real entre las distintas moléculas. Por último, debe calcularse s20,w con lasecuaciones dadas anteriormente.
Peso molecular
10
CENTRÍFUGAS
Los experimentos de centrifugación requieren aparatos que funcionan a velocidades exactamenteconocidas con pequeñas variaciones y sin fluctuaciones de temperatura. Existen varios criterios paraclasificar las centrífugas, uno de ellos es por la máximo velocidad a la que operan, así tenemos:
Centrífugas de Baja Velocidad
Estas centrífugas son capaces de centrifugar hasta 6 litros de muestra a la vez, mantienen la muestrafría por un flujo de aire que pasa a través del fondo de la centrifuga. Estas máquinas son utilizadasrutinariamente para procesos iniciales de muestras biológicas; puede ser utilizadas para separar células, y conmayores velocidades, separar organelos así como núcleo y cloroplastos que también pueden ser separadospor gradientes de densidad.
Centrífugas de Alta Velocidad
Estas centrífugas , usualmente con máximas velocidades de 18 000 – 25 000 r.p.m.,son máquinas quepueden generar cerca de 60 000 g, son muy baratas comparadas con las ultracentrífugas. Estas centrífugastienen sistema de refrigeración y algunos tipos tienen también sistema de vacío, sin embargo, las maquinasque cuentan con sistema de vacío son mas caras pero tienen la ventaja que controlan con mayor exactitud latemperatura.
Al igual que las centrífugas de baja velocidad las centrífugas de alta velocidad son muy utilizadaspara el fraccionamiento subcelular. La ventaja de los rotores verticales ha facilitado el uso de centrífugas dealta velocidad para las separaciones por gradiente.
Ultracentrífugas
La fuerza generada por las ultracentrífugas pueden ser significativamente mayor de los 600,000 g, loscuales son suficientes para separar proteínas pequeñas.
Las ultracentrífugas son subdivididas en dos tipos: analíticas y preparativas. La ultracentrífugaanalítica a menudo es confundida con la ultracentrífuga preparativa. Sin embargo, los experimentos con laanalítica son diferentes en varios aspectos. El más importante es que cuenta con un sistema óptico, por loque, la muestra es visualizada en tiempo real durante la sedimentación, permitiendo la determinación exactade parámetros hidrodinámicos y termodinámicos. Además, el propósito del experimento es para caracterizarlas propiedades claves de la muestra o para purificar la muestra para un uso posterior.
11
En contraste a muchas técnicas biofísicas, las biomoléculas son caracterizadas durante laultracentrifugación analítica en su estado nativo bajo condiciones biológicas importantes. En el siguienteesquema se pueden observar las diferencias entre un rotor de una centrífuga analítica y una centrífugapreparativa.
Las ultracentrífugas analíticas Beckman se componen esencialmente de un motor, de un rotor decentrifugación, que esta en una cámara blindada protectora y de un sistema fotográfico para registrar ladistribución de las concentraciones de la muestra en la celda de centrifugación, o bien, de una computadora.El rotor esta suspendido en el centro del motor mediante un cable. Uno de los agujeros del rotor contiene lacelda de centrifugación; el otro sirve para equilibrar el peso y contiene un agujero de referencia paradeterminar la distancia al centro de rotación. Las paredes de la celda están diseñadas de modo que si seorientan con cuidado al colocar la celda en el rotor, tales paredes serán paralelas a las líneas del campocentrífugo, lo cual impide la acumulación de materiales en las paredes de la celda. La celda consta de unapieza central que contiene la muestra líquida, dos ventanas, un cilindro soporte en el que se introduce la piezacentral y las ventanas; y una compuerta de alimentación. Las ventanas suelen estar hechas de cuarzo, aunquea veces se utiliza zafiro para centrífugas de velocidades muy altas puesto que se deforma menos cuando seopera a fuerzas elevadas. La pieza central suele estar hecha de metal (aluminio) o de plástico, las primerastienen la ventaja de que el equilibrio térmico queda establecido rápidamente, reduciendo al mínimo laconvección producida por los gradientes térmicos. La desventaja del metal es que a veces reacciona con eldisolvente o el soluto por lo que, hay que utilizar el plástico.
Una ultracentrífuga analítica es una ultracentrífuga preparativa complementada con un sistema dedetección óptico que es capaz de medir directamente la concentración de la muestra durante lasedimentación. La introducción de la ultracentrífuga analítica Beckman Coulter XL-A fue en 1992 y encontraste a la versión anterior (modelo E), el modelo XL-A es compacto y fácil de utilizar. Los parámetros decentrifugación (velocidad del rotor, temperatura.) y adquisición de datos son bajo control computarizado yexperimentos largos, de horas o días, se llevan a cabo con la mínima intervención del operador y si se desea,los datos pueden ser vistos o analizados en tiempo real.
El modelo XL-A utiliza un sistema óptico de absorbancia basado en una lámpara de xenón, unrastreador monocromático que permite la medición de la concentración de la muestra en un rango de longitudde onda de 200 a 800 nanómetros. El sistema óptico de interferencia Rayleigh fue adicionado al modelo XLAcreando la ultracentrifuga analítica XL-I que puede obtener datos simultáneamente con ambos tipos desistemas ópticos. El sistema óptico de interferencia Rayleigh mide la concentración de la muestra basado encambios en el índice de refracción.
Analítica Preparativa
12
Cada sistema óptico tiene ciertas ventajas y desventajas. La óptica de absorción es sensible para ladetección de macromoléculas que contienen fuertes grupos cromóforos. Por ejemplo, tomando la ventaja dela intensa absorción del grupo amida en el lejano ultravioleta (230 nm), las proteínas pueden sercaracterizadas con una buena señal a concentraciones de 10 mg/ml. Similarmente, los ácidos nucleicospueden ser estudiados en la misma concentración por su absorbancia a 260 nm. Para muestras que contienendos a más componentes con diferente espectro de absorción (por ejemplo proteínas y ácidos nucleicos) losdatos pueden ser obtenidos a múltiples longitudes de onda para detectar selectivamente las diferentesespecies en solución.
El sistema óptico de interferencia Rayleigh es utilizado para el análisis de macromoléculas quecarecen de cromóforos intensos (ejemplo polisacáridos) y muestras que contienen moléculas que absorbenfuertemente (ejemplo ATP, GTP, DTTOXIDADO). Este sistema óptico es utilizado para la caracterización demuestras muy concentradas.
Existe otro tipo de sistema óptico utilizado en las centrífugas analíticas llamado sistema Schlieren, enel cual la luz que atraviesa las regiones de concentración uniforme prosigue su camino sin desviarse, mientrasque la que atraviesa regiones de concentración cambiante se desvía debido al cambio del índice de refracciónque varía con la concentración. El sistema óptico de las modernas centrífugas convierte estas desviaciones enuna curva que muestra el gradiente de concentración. Se puede ajustar el sistema de modo que las curvassean más o menos agudas; sin embargo, al realizar estos ajustes, el área rodeada por la curva Schlieren y lalínea de base debe permanecer constante y proporcional a la concentración. Midiendo estas áreas y utilizandociertas constantes ópticas del aparato, se puede determinar la concentración. A medida que disminuye la
13
concentración del material en la celda, también disminuye el área englobada por el pico hasta que apenaspuede diferenciarse de la línea de base. En la práctica, el limite inferior del sistema Schlieren es unaconcentración de algunos miligramos por milímetro. El valor del sistema Schlieren reside en su grancapacidad para examinar el perfil del frente de sedimentación y para detectar la presencia deheterogeneidades en s. Se ha utilizado muy ampliamente, sobre todo para la determinación del coeficiente desedimentación de las proteínas.
Otras variantes de centrífugas utilizadas ampliamente, son descritas a continuación.
Centrífuga Tubular
Las centrifugas tubulares (CT) consisten básicamente de un tubo vertical esbelto que gira a altasvelocidades por la acción de un motor eléctrico, o una turbina de aire o vapor. Este tipo de centrífuga es unade los más eficientes y sencillos, capaz de separar partículas hasta de 0.1 mm. Las CT pueden contar con unsistema de enfriamiento por lo que son empleadas en el manejo de caldos con enzimas o proteínas.
Durante la operación de la CT la suspensión es alimentada por la parte inferior y los sólidossedimentan en la pared del tubo. El líquido claro se recolecta por rebosamiento en la parte superior.Conforme se forma la precipitado el área de flujo se reduce y el tiempo de residencia del liquido disminuye.Esto se traduce en un aumento gradual del contenido de sólidos en el sobrenadante que puede serdeterminado por mediciones de turbidez.
Un modelo típico de laboratorio consta de un tubo de 4.5 cm de diámetro por 25 cm de longitud, elcual puede girar a una velocidad de hasta 50 000 r.p.m., desarrollando campos de hasta 62 000 g, con unacapacidad de hasta 100 l/h. En la siguiente imagen se muestra una centrífuga tubular.
Centrifugas de Cámara Múltiple
Las centrífugas de cámara múltiple fueron creadas para incrementar la capacidad de manejo desólidos de las centrífugas tubulares. Estas centrífugas consisten en una serie de tazones concéntricos condeflectores que provocan un flujo en serie de la suspensión. Su operación permite la clasificación de laspartículas conforme pasan de una cámara a otra. El líquido claro se obtiene por rebosamiento en la últimacámara. Este arreglo genera un mayor tiempo de residencia del líquido, en relación al de la centrífugatubular, así como mayor capacidad de manejo de sólidos.
14
El diámetro de los equipos de cámara múltiple varía de 335 a 615 mm, con velocidades de rotaciónentre 5 000 y 8 400 r.p.m., produciendo campos entre 5 000 y 9 000 g, respectivamente. La capacidad demanejo de sólidos varía entre 2.5 y 60 litros dependiendo del material y del número de cámaras. La descargade sólidos y el mantenimiento de estos equipos es más difícil que el de las centrífugas tubulares, ya que lacentrífuga tiene que ser desarmada para sacar los sólidos.
CentrífugasDecantadoras o de Tornillo
Las centrífugas decantadoras se caracterizan por un tazón horizontal con una sección cilíndrica y unasección cónica, con una relación de longitud a diámetro entre 1.5 - 3.5. el tazón contiene un tornillotransportador que gira en la misma dirección, pero a una velocidad ligeramente superior o inferior que eltazón (entre 5 – 100 r.p.m.) de diferencia. Las velocidades de rotación son de 1 600 a 6 000 r.p.m. por lo quelos campos centrífugos son menores que los de los otros equipos.
En las centrífugas decantadoras la suspensión es introducida a través de perforaciones por un tuboaxial concéntrico a la flecha del tornillo, al final de la sección cónica o de compresión de sólidos. Los sólidosque se depositan en la pared son transportados y descargados continuamente por el extremo cónico de lacentrífuga, donde escurren antes de salir. El líquido claro se obtiene por rebosamiento en el extremo opuestoa través de orificios de descarga que fijan el nivel del líquido en la centrifuga.
Existen diversos diseños de centrifugas decantadoras. Los diámetros de los tazones varían de 15 a140 cm. Para los modelos piloto e industriales. La descarga de los sólidos varía de 30 Kg/h hasta 60 Ton/h,con alimentaciones entre 308 y 1890 l/min, respectivamente. En Internet se encuentra un movie delfuncionamiento de este tipo de centrífuga, la dirección es:http://www.diquima.upm.es/docencia/tqg/eq_tqg.html
Centrífuga de Discos
La centrífuga de discos consta de un eje vertical sobre el cual se montan un conjunto de discos enforma de conos truncados, uno sobre otro. El rotor de la centrifuga provoca el giro tanto de los discos comodel tazón de la centrifuga. Los discos constan de bordes internos que permiten mantener pequeñasseparaciones entre ellos, del orden de 0.5 a 2.0 mm. El ángulo que forman los conos con la vertical varíaentre 35 y 500 dependiendo de la aplicación particular. Entre la pila de discos y el tazón existe un espacio quepermite la acumulación de sólidos.
Durante la operación de la centrifuga de discos la suspensión es alimentada continuamente en elfondo del tazón a través de la parte central de la flecha, y fluye hacia arriba entre las placas hacia la salida enla parte central superior del equipo. Debido a la fuerza centrífuga, los sólidos se depositan en la cara internade los discos, resbalando hacia la cámara colectora debido al ángulo de los discos. La siguiente imagenmuestra una centrífuga de discos. En Internet, se encuentra un archivo del funcionamiento de este tipo decentrífugas en la dirección:te://www.diquima.upm.es/docencia/tqg/eq_tqg.html
15
TIPOS DE ROTORES
Los rotores para centrífugas preparativas pueden ser clasificados en cuatro tipos principalmente:rotores de columpio, rotores de ángulo fijo, rotores verticales y rotores zonales.
Rotores de Columpio
En el caso de estos rotores la muestra están en una cubeta individual el cual se mueve de formaperpendicular al eje de rotación del rotor, por lo tanto, en estos rotores, la fuerza centrífuga es ejercida a lolargo del eje del tubo, y a pesar de que la fuerza centrífuga es axial, algunas partículas son sedimentadassobre la pared del tubo; esto se puede evitar con la sedimentación zonal.
Estos rotores llevan de tres a seis tubos fijados a un soporte de metal que esta libremente suspendido,la suspensión libre sirve solo para fijar la posición de inicio del tubo con la muestra, cuando el rotorcomienza a girar, el bucket se pone de forma horizontal. Todos los buckets de un rotor son de igual masa porlo que sólo se necesita balancear los tubos con la muestra. La superficie de los buckets debe de estar seca ylimpia
Los rotores de columpio Beckman tiene un número que designa la máxima velocidad permitida(r.p.m. x 1000) y por Ti si esta hecho de titanio, el digito adicional que sigue a la marca mencionada indica lavariante del rotor con la misma velocidad máxima ( 50 Ti, 50.2 Ti, etc.) seguido de las letras SW.
Estos rotores pueden ser divididos en tres grupos.
1.- Rotores de alta velocidad con tubos de 4.4 y 5 ml. Tipo SW 50.1, SW 55 Ti, SW 60 Ti y SW 65Ti. Estos rotores son convenientes para centrifugación zonal y al equilibrio donde no es necesaria una finaresolución.
2.- Rotores de velocidad moderada para tubos de 13.2 a 17 ml de capacidad, son convenientes parala separación de partículas de masa similar por medio de centrifugación zonal en gradientes de densidad desacarosa. Este grupo incluye rotores del tipo SW 20.1, SW 40 Ti y SW 41 Ti.
3.- Rotores para tubos largos y de baja velocidad de rotación. Incluye rotores del tipo SW 25.1 quecontiene tres tubos de 34 ml, el tipo SW 25.2 (3x 60 ml) y SW 28 con seis tubos de 38.5 ml.
A continuación, la imagen corresponde a un rotor de columpio.
16
Rotores de Ángulo Fijo
Como su nombre lo indica los tubos tienen un ángulo fijo y cuando el rotor gira la solución sereorienta en el tubo. El ángulo del tubo en el rotor puede variar de 140 a 400 . En los modelos comercialesexiste una gran variedad de capacidades, rango de velocidades y ángulos de inclinación. Los rotores con bajoángulo son más eficientes para sedimentación porque el trayecto de las partículas que sedimentan es corto.Los rotores de ángulo fijo están diseñados para soportar altas fuerzas centrífugas, por arriba de 600 000 g .Las siguientes imágenes muestran dos modelos de rotores de ángulo fijo.
Rotores Verticales
Estos rotores se utilizan en la mayoría de centrífugas de alta velocidad y ultracentrífugas. En estosrotores, los tubos están en posición vertical y se podría considerar que es una forma extrema de un rotor deángulo fijo, sin embargo, las características del rotor vertical son lo suficientemente diferentes paraconsiderarse otra categoría. Cuando el rotor gira la solución se reorienta 900, esta reorientación se lleva acabo debajo de las 1000 r.p.m. y si la aceleración es suficientemente lenta la reorientación no rompe elgradiente. La característica importante de los rotores verticales es la corta trayectoria de sedimentación de laspartículas (que equivale al diámetro del tubo). El diseño de los rotores verticales permite muy altas fuerzascentrífugas.
Eje de rotación
rmin
rmax
17
Los rotores verticales no son convenientes para sedimentación pero pueden ser utilizados paracentrifugación isopícnica. La siguiente imagen muestra un rotor vertical.
Rotores Zonal
Los procesos de sedimentación que se llevan a cabo en un rotor zonal son similares a los que ocurrenen los rotores de bucket, sin embargo, en lugar de tubos hay cuatro sectores en el cuerpo del rotor zonalformados por la inserción de una cilindro de cuatro sectores que esta hecha de Noryl, un químico inerte ysuave. El ensamble del aspa asegura la rotación del liquido junto con el rotor y consecuentemente laformación de una fuerza centrífuga. La dirección de la sedimentación es hacia la periferia del rotor.
En el interior del centro de las aspas hay canales que conectan la parte central y la región periféricadel rotor con un dispositivo transicional que se encuentra arriba del rotor. Esto permite que el rotor pueda serllenado y descargado mientras esta girando a baja velocidad (2000 a 3000 r.p.m.), esto es necesario para crearun gradiente de densidad al inicio de la corrida y prevenir la ruptura del mismo después del fraccionamiento.La densidad del gradiente aumenta del centro a la periferia del rotor haciendo que la fuerza centrífuga seamantenida a lo largo de la corrida.
La siguiente imagen ilustra la carga de la muestra: la solución es bombeada o inyectada con unajeringa por un canal central, mientras el exceso de muestra es desalojado del sistema. Para asegurar laeficiencia de separación el volumen no debe de exceder el 10 % de la cavidad del rotor. La inyección de lamuestra debe de ser en forma lenta y uniforme.
El siguiente esquema muestra el paso final de una centrifugación zonal. El rotor es cerrado con unatapa y gira a altas velocidades, las partículas están distribuidas a lo largo del gradiente de acuerdo a susrespectivas constantes de sedimentación.
18
Carga y fraccionamiento de un gradiente: Mientras el rotor está girando lentamente el líquido demayor densidad que será usado en la formación de gradiente se carga a través de una conexión hacia el centrodel rotor, seguida por las demás soluciones de densidad decreciente. El siguiente esquema muestra la salidade las soluciones del gradiente, esta es a través de una línea central donde la salida de la solución menosdensa precede a la más densa. La solución es monitoreada por un densitómetro, fluorímetro o medidor de laradioactividad para que las fracciones puedan ser colectadas individualmente.
Se han desarrollado diferentes diseños de este tipo de rotores a los que se las ha agrupado endiferentes series, de tal manera que hay de la serie A, B, C, D, F, K y J. Cada serie agrupa a rotores quecomparten características en cuanto a su velocidad.
En la siguiente tabla se muestran las aplicaciones de los rotores en los diferentes tipos decentrifugación.
Tipos de rotores y sus aplicaciones.
Tipo de separación
Tipo de rotor sedimentación zonal isopícnica
Ángulo fijo. excelente pobre buena Vertical. Pobre buena excelente De columpio. Ineficiente buena adecuado Zonal. Pobre excelente adecuado
Factor k y k´
Un concepto para la selección o funcionamiento de un rotor es el factor k y el factor k´. Estosfactores pueden ser utilizados para comparar la eficiencia de varios rotores para el material con el que se estatrabajando. El factor k provee una estimación del tiempo t en horas, requerido para separar la partícula deinterés con un coeficiente de sedimentación conocido s (en unidades Svedberg), a la máxima velocidad delrotor, por lo que tenemos:
t= k / S20,w
Si se conoce el coeficiente de sedimentación de la partícula en el medio utilizado y el factor k delrotor, es posible estimar el tiempo de separación de la partícula.
19
El factor k se calcula de la siguiente manera
k= ln (rmax/rmin) x 1013
w2 3600
donde, w es igual a 0.104720x r.p.m., rmax es la máxima distancia radial de el eje centrifugo (en cm) yrmin es la distancia mínima radial de el eje centrífugo (en cm).
A menor valor de k, más eficiente es el rotor, puesto que varia directamente proporcional al tiempoen que tarda la partícula en separarse.
El factor k´ es utilizado para estimar el tiempo requerido para mover una zona de partículas a elfondo del tubo a través de un gradiente lineal de sacarosa a la máxima velocidad del rotor.
K´ = I Z2 – I Z1 x 1013
W2 3600
Donde Z2 es el máximo porcentaje de el gradiente de sacarosa, Z1 es el mínimo porcentaje de elgradiente de sacarosa, I es el valor integral obtenido en unas tablas (ver tabla I del apéndice), después decalcular Z0.
Z0 = Z1 rmax – Z2 rmin rmax – rmin
El tiempo t (en hrs) para que una partícula (que se conoce su coeficiente de sedimentación), alcanceel fondo del tubo en un gradiente lineal de sacarosa se puede calcular por la siguiente ecuación:
t = k´/s20,w.
Frecuentemente el tiempo de corrida que se utiliza es el que se encuentra en la literatura, o bien, esdeterminado arbitrariamente hasta que se completa la separación. El utilizar los factores k y k´ podríaahorrar tiempo en la centrifugación. Estos factores pueden ser utilizados para convertir un tiempo de corridade un tipo de rotor a otro. Por ejemplo si el rotor tipo 40 tiene una máxima velocidad de 40 000 r.p.m. selleva 4 horas en realizar la separación, el tiempo de corrida que se lleva un rotor tipo 60 Ti a 60 000 r.p.m.puede ser determinado por la siguiente relación:
t1 = k1 x t2 / k2
donde t1 es el tiempo de corrida de el rotor tipo 60 Ti, k1 es el factor k del rotor 60 Ti, t2 es el tiempoobservado en el rotor tipo 40 y k2 es el factor k para el rotor tipo 40. Para el ejemplo anterior el tiempo decorrida para el rotor 60 Ti es aproximadamente de dos horas
TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN
El objetivo de la centrifugación es la separación de partículas especificas en una solución. El términopartícula involucra sustancias disueltas y partículas de tamaño microscópico y macroscópico que seencuentran suspendidas en un fluido que usualmente es agua. En biología las partículas suelen ser células,organelos subcelulares o moléculas grandes; en química, usualmente son solutos macromolecularesdisueltos. Existen tres tipos principales de centrifugación: Centrifugación diferencial, centrifugación zonal ycentrifugación al equilibrio.
20
Centrifugación Diferencial o Pelleting
En este método, el tubo de la centrífuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de lasolución de la muestra, a través de la centrifugación se obtiene una separación de dos fracciones: Un pellet(sedimento) que contiene la partícula sedimentada y un sobrenadante con la fracción no sedimentada de lasolución. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el pellet, o podría estardistribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamaño y/o de las condiciones de centrifugación. Elpellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y esta contaminado con cualquier partícula nosedimentada que estuviera en el fondo de el tubo. Las dos fracciones son recuperadas por decantación de lasolución sobrenadante del pellet. El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obteneruna mayor purificación con la formación de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido enun pequeño volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.
Otro método de separación es por gradiente de densidad, un método que es más complicado que lacentrifugación diferencial pero tiene algunas ventajas: el método de gradiente de densidad permite lacompleta separación de algunos o todos los componentes de la mezcla y también permite que se puedanrealizar mediciones analíticas.
Hay dos métodos básicos de centrifugación por gradiente de densidad: La centrifugación zonal y lacentrifugación isopícnica o al equilibrio.
Centrifugación Zonal
Cuando se coloca una pequeña cantidad de la disolución con las moléculas que se quierencaracterizar sobre la superficie de un gradiente de densidad previamente formado a lo largo de un tubo decentrifugación, en la superficie siempre hay una densidad menor que la existente en la parte superior de elgradiente y cuando se centrifuga el tubo las moléculas de la capa superior sedimentan a través de elgradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de sedimentación sedimentarán en una estrecha franja,sin embargo, si hay moléculas con distintos coeficientes de sedimentación, se separaran unas de otras amedida que se produzca la centrifugación y finalmente los diferentes componentes se resolverán en una seriede zonas o bandas, de ahí el nombre de centrifugación zonal. Una vez completada la centrifugación, sefracciona el contenido del tubo generalmente por recolección de las gotas cuando se hace un orificio en elfondo del tubo y el goteo es lo suficientemente lento para no producir turbulencias. Cada gota representa unalamina del tubo y una fracción está representada por una o varias gotas.
21
Se pueden utilizar una gran variedad de técnicas para medir la cantidad de los materiales y, a partirde éstas, determinar la distribución de las concentraciones. En la centrifugación analítica se dependetotalmente de técnicas ópticas para detectar las moléculas. En cambio, las porciones obtenidas de un tubofraccionado por goteo, pueden titularse radiactivamente por reacciones químicas, por actividad enzimática,por absorción, fluorescencia o por una combinación de todas estas técnicas.
La necesidad de un gradiente de concentración para la centrifugación zonal se debe a lo siguiente:considérese las consecuencias de colocar una disolución de baja densidad sobre otra de alta densidad en laque no existe gradiente de concentración. Inicialmente, el sistema es estable, debido a la diferencia dedensidades en la interfase, supóngase que hay pequeñas fluctuaciones de temperatura en la disolución, comola densidad de la mayoría de las disoluciones disminuye al aumentar la temperatura, estas fluctuacionescrearán inversiones locales de la densidad lo que se traducirá en un flujo local de líquido, flujo que recibenombre de convección. Esta convección tendrá un efecto nulo sobre la interfase inicial, ya que la diferenciade densidades en dicha interfase suele ser lo suficientemente grande como para que no se produzcan mezclasa través de ellas, a menos que la diferencia de temperatura sea enorme (10 oC a 20 oC). Por el contrario, trasla sedimentación, las moléculas que se pretenden estudiar se habrán movido hacia el interior de las capasinferiores más densas, donde la convección comentada puede distorsionar cualquier tipo de banda quepudiera formarse.
La introducción de un gradiente de densidad pronunciado asegura que los cambios de temperaturatengan que ser muy grandes para poder crear las diferencias de densidad suficientemente grandes paraprovocar convección en el interior del gradiente. Una segunda función importante del gradiente es el impedirlas mezclas debidas a perturbaciones mecánicas; cualquier perturbación sería contrarrestada por la tendenciaa restablecer el equilibrio en el que la densidad baja esta por encima de la alta. El gradiente tiene una tercerafunción. Considérese un sistema sin gradiente en el que no existieran ni fluctuaciones de temperatura niperturbaciones mecánicas, en el que las moléculas que están sedimentando han entrado en la capa inferior yformado una banda. En esta zona, la propia presencia de las moléculas incrementa la densidad de ladisolución, normalmente un efecto muy pequeño, pero que es muy importante cuando se utilizanconcentraciones elevadas. De modo que la densidad de la banda es superior a la de la capa inmediatamentepor debajo de ella, lo que se traduce en el flujo convectivo de la zona hacia el fondo del tubo.
22
Si, por el contrario, se realiza la sedimentación a través de un gradiente de concentraciónpreviamente formado, las moléculas en sedimentación estarían constantemente entrando en una zona demayor densidad . Su llegada aumentaría la densidad de la región, pero si el gradiente fuera suficientementefuerte, el soporte de las moléculas recién llegadas sería insuficiente para ocasionar una inversión de ladensidad y el sistema permanecería estable. El material más comúnmente utilizado para formar gradientes dedensidad es la sacarosa, debido a su pureza, su bajo costo y su no interferencia con la mayoría de lasmediciones químicas, ópticas o enzimáticas. Si la macromolécula en estudio es una enzima o una proteínainestable se usa frecuentemente el glicerol, puesto que muchas proteínas son más estables y sedesnaturalizan más difícilmente en presencia de glicerol.
La separación zonal es ideal para separar partículas de tamaño definido (ejemplo: proteínas, RNA yribosomas), sin embargo, las partículas del mismo tipo son heterogéneas; en este caso, la separación porcentrifugación zonal no es eficiente y es mas apropiado separar las partículas en base a otro parámetro comola densidad; por lo tanto se recurre a la separación isopícnica.
Materiales para Generar un Gradiente de Densidad
Sacarosa: La sacarosa posee propiedades para ser un ideal medio para la formación de gradiente yes el más utilizado en la centrifugación zonal. Este material tiene aplicación en el fraccionamiento deorganelos celulares y virus. La razón de su gran utilidad es su comportamiento inerte ante la presencia delmaterial biológico, su bajo costo y su naturaleza estable. Debido a su gran uso, se han caracterizado laspropiedades de la sacarosa y de sus soluciones con respecto a sus relaciones de concentración y viscosidad,densidad e índice de refracción en un gran rango de temperaturas, y es posible encontrar las descripciones delos gradientes disponibles y condiciones de centrifugación para la separación de un gran tipo de muestrasbiológicas.
La principal desventaja de la sacarosa son algunas de sus propiedades fisicoquímicas. Las solucionesde sacarosa tienen alta fuerza osmótica y las soluciones por arriba del 9% (p/V) son hipertónicas y solotienen una densidad de 1.03 g/cm3 lo que reduce su uso en la separación de partículas osmóticamentesensibles. Las soluciones concentradas de sacarosa requeridas para separaciones isopícnicas son muyviscosas, por lo que, las partículas pequeñas son incapaces de alcanzar su posición isopícnica en el gradiente.
La sacarosa es muy susceptible a hidrólisis de los enlaces glicosílicos a pH menores a 3. Cuando secalientan, y a menos que se ajuste el pH a 5-6, las soluciones concentradas tienden a caramelizarse por arribade los 100 0C. Esta caramelización provoca cambios en las propiedades de la solución de sacarosa. Comoregla general, es mejor esterilizar por filtración o bien, esterilizar la solución de sacarosa con 0.1% dedietilpirocarbonato; el exceso de dietilpirocarbonato puede ser removido calentando la solución a 60 0C porvarias horas. La ventaja de tratar la solución de sacarosa con dietilpirocarbonato es que inactiva a la mayoríade las enzimas y por ello es utilizado para remover actividad ribonucleasa en las soluciones de sacarosa.
Los gradientes de sacarosa pueden ser preformados para fraccionamiento zonal de macromoléculas ycomplejos macromoleculares, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, ribosomas y polisomas, también seutiliza gradientes de sacarosa para la separación isopícnica de virus, organelos celulares y de células si laviabilidad no es esencial.
23
Glicerol: El glicerol está disponible como reactivo puro y sus gradientes han sido utilizados en lugarde soluciones de sacarosa en centrifugación zonal. Las soluciones de glicerol son menos densas y menosviscosas que las correspondientes soluciones de sacarosa, sin embargo, las soluciones de glicerol de la mismadensidad de una solución de sacarosa es mucho más viscosa que la solución equivalente de sacarosa. Laventaja de utilizar glicerol es que ayuda a conservar la actividad de un gran número de enzimas además deser muy barato.
Polisacáridos: Para evitar el problema que se puede originar en el fraccionamiento de partículasosmóticamente sensibles (células y organelos) en altas fuerzas osmóticas en las soluciones de sacarosa, sehan utilizado un gran número de polisacáridos como medio para la formación de gradientes. Se han utilizadopolisacáridos como glucógeno, dextrán y otros materiales, sin embrago, el más utilizado es el Ficoll. El Ficolles producido por la copolimerización de moléculas de sacarosa con epiclorohidrina para dar un polisacáridocon un peso molecular promedio de 400 KDa.
La soluciones de Ficoll por debajo del 20% (P/V) equivalente a una densidad de 1.07 g/cm3 soninertes osmóticamente pero la desventaja que presentan es que a altas concentraciones, la osmolaridadaumenta abruptamente. El otro problema al trabajar con estas soluciones de Ficoll es su alta viscosidad. Suaplicación ha sido en separaciones zonal e isopícnica. La muestra se puede separar de la solución de ficollpor pelleting de la fracción diluida.
Gradientes de iodinato: la mayoría de los compuestos iodinatos usados como medio para generargradientes tienen una estructura basada en el ácido tri-iodobenzoico, en el que los grupos hidrofílicos estánunidos para aumentar la solubilidad de estos compuestos en agua.
La metrizamida y Nycodenz son solubles en medio acuoso y son estables en un rango de pH 2 a12.5. Las soluciones de metrizoato de sodio y Nycodenz no son termolábiles por lo que pueden seresterilizadas en autoclave, sin embargo, el grupo glucosamida de la metrizamida la hace inestable atemperaturas por arriba de los 55 0C , por lo que, deben ser esterilizadas por filtración.
En comparación con otros medios para generar gradientes, los compuestos iodinatos tienen grandesventajas. Por ejemplo, a todas las densidades, los gradientes de iodinato presentan menor viscosidad yosmolaridad que los de sacarosa. Los gradientes de iodinatos pueden ser preformados y la muestra se cargaen la parte superior del gradiente. Este método es preferible para la preparación de gradientes isopícnicos ypara la separación de partículas grandes (células, organelos et.) los cuales necesitan ser centrifugados porcorto tiempo (2 horas o menos). Alternativamente, para partículas pequeñas es posible realizar gradientesautogenerados durante la centrifugación, en este caso, la muestra es mezclada con la solución del gradientehaciendo posible el uso de un mayor volumen de la muestra.
Suspensiones coloidales de sílica: las suspensiones coloidales de sílica contienen partículas en elrango de 3-15 milimétros de diámetro y son extensamente usadas para varias aplicaciones industriales y paraseparaciones centrífugas. El Percoll tiene algunas ventajas sobre las preparaciones de sílica de las quederiva. Las partículas coloidales están cubiertas con polivinilpirrolidona (PVP) la cual minimiza susinteracciones con material biológico.
Las suspensiones de sílica coloidal son desestabilizadas por condiciones que tienden a neutralizar lascargas de las partículas, por lo tanto, el Percoll precipita a bajo pH y las altas fuerzas iónicas tambiéndesestabilizan la suspensión coloidal. El Percoll interfiere con la mayoría de los tipos de los análisis deproteínas y para algunos tipos de análisis de ácidos nucleicos y polisacáridos. El uso de gradientes de Percolles restringido para separaciones isopícnicas y estos gradientes pueden ser usados para células, organelos yalgunos virus. La sílica coloidal puede ser removida de las fracciones por centrifugación diferencial pararetirar el material fraccionado de la mayoría de las partículas de sílice.
24
Formas de Gradientes
La forma del gradiente se refiere al perfil de concentración, es decir, a la variación de laconcentración en el gradiente a lo largo del tubo.
Hay dos tipos básicos de gradientes que son representados con funciones matemáticas simples y sonfáciles de preparar con equipo de laboratorio, estos son: 1) Continuos que pueden tener forma lineal,convexo, cóncavo y 2) discontinuo. La siguiente imagen muestra ambos gradientes.
Los gradientes continuos pueden ser producidos por adición continua de una solución de altadensidad CD desde un reservorio a un compartimento que contiene una solución de baja densidad CL,mientras al mismo tiempo se desplaza la mezcla al tubo que contiene el gradiente. El gradiente producido eslineal si los dos compartimentos tienen el mismo diámetro. Cuando los compartimentos tienen diferentesdiámetros se pueden producir gradientes convexos o cóncavos como se puede observar en las siguientesfiguras.
a) Gradiente lineal, b) Gradiente convexo y c) Gradientecóncavo
25
La forma del gradiente es importante para lograr la separación deseada, y para determinarpropiedades tales como densidad de flotación y coeficiente de sedimentación. Los gradientes lineales endensidad son los mas utilizados y a menudo dan la mejor resolución de componentes de proteínas, enzimas,hormonas, subunidades ribosomales y algunos virus de plantas. En un gradiente lineal la densidad incrementalinealmente conforme aumenta la distancia del centro de rotación. Cuando se diseña un gradiente lineal en unrotor vertical o de columpio, la densidad en la superficie del gradiente debe “soportar” la muestra, mientrasque la densidad en el fondo del tubo no debe exceder la densidad de las partículas a ser separadas y engeneral, a mayor pendiente del gradiente (más pronunciado), mayor resolución.
Para algunas aplicaciones es necesario generar gradientes cóncavos o convexos. Cuando el gradientenecesita un cambio pronunciado en la superficie para soportar la muestra y no tener un cambio abruptoconforme se acerque al fondo, es necesario utilizar un gradiente de forma convexa. Si es necesario que en laterminación del gradiente haya un cambio abrupto, se puede realizar un gradiente de forma cóncavo. Estetipo de gradiente es preferido cuando se necesita un cambio brusco en la viscosidad cerca del fondo del tubo,el cual puede ser utilizado para disminuir la sedimentación de partículas de un tamaño determinado mientraslas zonas de menor viscosidad siguen separando a las otras partículas. Los gradientes cóncavos son utilizadospara separación de lipoproteínas.
En los gradientes discontinuos, el cambio de concentración de las soluciones en el gradiente no esgradual. Los gradientes discontinuos se utilizan para separar células u organelos subcelulares de plantas uhomogenados de tejidos animales y para la purificación de algunos virus.
Centrifugación al Equilibrio
En la separación isopícnica las partículas son separadas en base a su densidad, el tamaño solo afectala velocidad con la que las partículas alcanzan su posición isopícnica. Estas separaciones se llevan a cabo enun gradiente de densidad en el que las partículas se mueven hasta el punto en el que su densidad es la mismaque el medio.
La técnica de centrifugación al equilibrio fue desarrollada por Matthew Meselson, Franklin Stahl yJerome Vinograd. En esta técnica la densidad del disolvente es casi la misma que la de la molécula que seestá estudiando. Esta técnica requiere un tercer componente (normalmente una sal de cesio), de bajo pesomolecular y elevada densidad. Cuando se centrifuga la disolución, las sal se redistribuye y alcanza unequilibrio, formando, un gradiente de concentración que es menos denso en la parte superior y más denso enel fondo del tubo obteniéndose como resultado un gradiente de densidad. Las macromoléculas tambiénsedimentan, pero el material en la parte superior del tubo se mueve centrífugamente a través del gradiente,mientras que el mismo material en la parte baja del tubo se mueve centrípetamente. Este movimientocontinua hasta que las macromoléculas forman una banda en una posición determinada del gradiente deconcentración, posición en la que la densidad de la macromolécula iguala a la de la disolución. La anchura dela banda está determinada por el equilibrio entre la fuerza centrífuga (que tiende a estrechar la banda), ladifusión (que tiende a ensancharla) y el gradiente de densidad (un gradiente más pronunciado dará una bandamás estrecha).
Como se mencionó anteriormente, la muestra se mezcla con la solución del gradiente y conforme selleva a cabo la centrifugación se genera el gradiente (gradiente autogenerado) a la vez que se separan laspartículas de la muestra. Sin embargo, la muestra puede ser colocada en la superficie de un gradientepreformado de igual forma que en la centrifugación zonal.
26
Gradientes de Densidad Autogenerados
Tal como se indicó anteriormente, si se extiende una capa de la muestra sobre una disolución másdensa sin gradiente de densidad, la convección acabará destruyendo o dilatando el límite de sedimentación.Vinograd se dio cuenta de que si la muestra estaba en una disolución de muy baja densidad, debido a ladifusión del soluto utilizado para incrementar la densidad de la disolución más densa, al cabo de un ciertotiempo la discontinuidad de la densidad generada en la interfase se propagaría lentamente hacia el fondo deltubo de centrifugación, formando un gradiente suave. Por debajo del frente generado por el gradiente que seva propagando, no existe gradiente y puede producirse la convección. Por el contrario, en el gradiente enpropagación y por encima de él, hay una estabilización frente a la convección. Obviamente el material enestudio no sedimenta con mayor velocidad que la de propagación del gradiente, el material se hallará en ungradiente de densidad y la sedimentación será completamente normal, es más, si el soluto de la disoluciónmás densa tiene una densidad muy elevada, como ocurre con el cloruro de cesio, la sal también sedimentaráligeramente formando un gradiente estabilizador adicional. Se ha denominado a esta técnica sedimentaciónen gradientes de densidad autogenerados.
Materiales para formarGradientes Autogenerados
Sales de cesioLos gradientes de sales de cesio fueron primero utilizados para la separación isopícnica de ácidos
nucleícos y se han establecido como los más extensamente utilizados para la formación de gradientesisopícnicos. Todas estas soluciones son altamente iónicas, son no viscosas pero, tienen alta osmolaridad.
Los gradientes de soluciones de sales de cesio se pueden generar in situ por centrifugación. Loabrupto del gradiente formado depende del campo centrífugo aplicado y del soluto utilizado; por ejemplo,para una fuerza centrifuga dada el sulfato de cesio forma gradientes mas abruptos que los que se forman concloruro de cesio.
27
Los gradientes de cloruro de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA de acuerdoa su composición de bases. Las especies de DNA que son enriquecidas en citosina y guanina bandean denso.El grado de separación de diferentes especies puede ser utilizado por la adición de drogas como ladistamicina la cual se une selectivamente a regiones del DNA que son ricas en adenina y timina y disminuyela densidad de este DNA. En suma, en la presencia de bromuro de etidio, es posible separar DNA dediferentes conformaciones (ejemplo, superhelicoidal y lineal) incluso teniendo la misma composición debases.
Los gradientes de sulfato de cesio son utilizados para separar diferentes especies de DNA, sinembargo, la composición de bases tiene un efecto pequeño en la densidad de flotación de DNA y losgradientes deben de ser abruptos. Una ventaja de los gradientes de sulfato de cesio comparado con elgradiente de cloruro de cesio es que ellos pueden ser utilizados para bandear RNA. Algunas especies de altopeso molecular de RNA tienden a agregarse y precipitar en gradientes de sulfato de cesio, sin embargo, estosse pueden minimizar adicionando urea 4 M al gradiente. Cuando se utiliza un gradiente abrupto es posiblebandear proteínas, DNA y RNA en un solo gradiente de sulfato de cesio. Un problema con los gradientes desulfato de cesio es que los iones de sulfato reaccionan y se precipitan con la mayoría de los fluidos decentelleo.
El cloruro de cesio y el sulfato de cesio son las sales de cesio mas utilizadas para la separación deácidos nucleicos, sin embargo, hay otras sales de cesio que pueden ser utilizadas para obtener mejoresseparaciones. Por ejemplo, las sales de tricloroacetato y trifluoroacetato se han utilizado para buenasseparaciones de ácidos nucleícos. En el caso del trifluoroacetao de cesio es posible obtener una buenaseparación de plásmidos superhelicoidal y DNA lineal sin la adición de bromuro de etidio.
Sales de sodio y potasio.El cloruro de sodio y el cloruro de potasio son soluciones poco densas para bandear la mayoría de las
macromoléculas, el bromuro de sodio, el yoduro de sodio, el bromuro de potasio y el yoduro de potasioforman soluciones densas no viscosas y han sido utilizadas para el bandeo de lipoproteínas, proteínas yácidos nucleicos. Una ventaja de los gradientes de yoduro de potasio y de yoduro de sodio es que el RNA nose agrega y precipita como en los gradientes de sulfato de cesio. Sin embargo, las sales de yodo tienen ladesventaja de que son propensas a la oxidación y se pueden adicionar algunos agentes reductores paraprevenir la formación de yodo libre.
Sales de rubidio.Estas sales han sido utilizadas para fraccionamientos isopícnicos, en particular se han utilizado
gradientes de cloruro de rubidio en lugar de gradientes de cloruro de cesio para separaciones isopícnicas deproteínas, sin embargo el uso de esta sal para la formación de gradientes no presenta mas ventajas que las quese obtienen al utilizar gradientes con cloruro de cesio.
PREPARACIÓN DE GRADIENTES
Preparación deGradientes Discontinuos
Los gradientes discontinuos pueden ser hechos simplemente colocando una solución de bajadensidad sobre otra mas densa, sin embargo una mejor interfase puede ser obtenida si la solución mas densaes colocada bajo la solución menos densa utilizando una jeringa con una aguja larga o una pipeta. Elprincipal problema es que algunos solutos (ejemplo: cloruro de cesio) difunde rápidamente así que la
28
interfase desaparece rápidamente. La siguiente imagen muestra las dos formas de hacer un gradientediscontinuo.
A) Cargando por arriba, B) Cargando por abajo
Preparación de Gradientes Continuos
Este tipo de gradientes incluye a los gradientes autoformados y los gradientes preformados. Losgradientes también pueden ser divididos en normales e isoosmóticos. Los últimos son importantes para laseparación de células. Con la excepción de gradientes de Percoll, los gradientes autoformados no pueden serisoosmóticos.
Generación de Gradientes Preformados
Los gradientes continuos pueden ser preparados simplemente adicionando las soluciones dediferentes concentraciones para que puedan difundir. Por ejemplo, para un gradiente de sacarosa de 5-20%,se agregan cantidades iguales de cada solución 5, 10, 15 y 20 %, una tras otra (en orden descendiente deconcentración) y se dejan difundir de 12-18 h si el tubo es vertical y de 1-2 h si el tubo es colocadohorizontalmente. Este método es aplicable para la mayoría de los solutos para realizar gradientes, sinembargo, existen dispositivos para preparar gradientes con diferentes perfiles. En la siguiente imagen sedescribe la formación de un gradiente continuo a partir de un discontinuo.
29
El dispositivo utilizado para la formación de gradientes se esquematiza en la siguiente imagen .
El líquido denso en la cámara A se mezcla continuamente con el líquido menos denso en la cámaraB. El flujo es producido por una bomba peristáltica (P) la cual coloca el líquido cada vez más denso en elfondo del tubo de centrifuga. La llave (T) controla el flujo del liquido de A a B . La mezcla en la cámara B seda con un agitador magnético (SB).
Gradientes Autogenerados
En un gradiente autogenerado, las soluciones son centrifugadas y las moléculas del medio tienden asedimentar formando un gradiente de densidad. En algunos casos, los gradientes como los de Percoll, formanmuy rápidamente un gradiente (20,000 g x 30 min.) sin embargo, hay otras soluciones como el cloruro decesio que toma muchas horas para alcanzar el equilibrio. Existen una serie de ecuaciones que permitenconocer algunos parámetros útiles en una corrida de centrifugación.
En el caso de metales alcalinos (ej. CsCl) es posible predecir el rango del gradiente y el tiempo enque alcanza el equilibrio. Estos cálculos son basados en el valor de b0 (ver valores en el apéndice) que es laconstante de proporcionalidad del gradiente de densidad cuyo valor ha derivado de trabajos experimentales.Utilizando este valor, el rango del gradiente de densidad en el equilibrio puede ser calculado como sigue.
Primero es necesario encontrar el punto de isoconcentración de el gradiente. Este es el punto (rc)donde la concentración del gradiente es constante independientemente de su forma:
rc= [1/3 (rmin2 + r min x rmax + rmax
2)] 1/2
Donde rmin y rmax son la distancia radial (cm) de la parte superior y del fondo del gradienterespectivamente.
30
La densidad (dr) en cualquier punto r de el centro de rotación relativo a la densidad en el punto deisoconcentración puede ser calculada con la siguiente ecuación:
dr = 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 – r2)
2 b0
donde N es la velocidad del rotor en miles de r.p.m.. Por lo tanto, conociendo la densidad inicial de lasolución (di), es posible calcular la densidad máxima (en el fondo del tubo) y la densidad mínima (partesuperior del tubo) del gradiente en el equilibrio utilizando las siguientes ecuaciones:
dmax = di - 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 – rmax
2)2 b0
dmin = di - 1.1 x 10-2 x N2 (rc2 – rmin
2)2 b0
Una vez teniendo los valores de dmax y dmin , por diferencia podemos conocer el valor del rango dedensidad (Dd) que está presente a lo largo del tubo del gradiente, o bien, rearreglando las anterioresecuaciones, tenemos que:
Dd = 0.545 x 104 x N2 (rmax2 – rmin
2) = dmax- dmin
b0
Alternativamente podemos utilizar esta ecuación para conocer la velocidad del rotor siempre que seconozca el valor de Dd. Es muy importante conocer el valor de la dmax de el soluto con el que estamosformando el gradiente, este parámetro nos informa si el soluto cristaliza en el fondo del tubo. Por ejemplo,cuando la densidad del cloruro de cesio en el fondo del tubo es mayor a 1.8 g/cm3 (1.75 g/cm3 a bajastemperaturas), se encuentra formando cristales y puede ocasionar daño en el rotor.
Por otra parte, el tiempo para llegar al equilibrio es muy grande, típicamente 100 hrs. para ungradiente de 12 ml, sin embrago, la velocidad a la que se forma el gradiente es exponencial, y una buenaseparación se puede obtener en una tercera parte del tiempo calculado. El tiempo requerido para que laspartículas alcancen la posición isopícnica puede ser calculado para gradientes no viscosos (CsCl) usando lasiguiente ecuación:
t (h) = 9.83 x 1013 x b0 (dp – 1)Q4 x rp
2 x sp
Donde dp y sp son la densidad y coeficiente de sedimentación de la partícula, y rp es la distancia radialde la banda de partículas en el equilibrio.
31
Determinación de la Formade un Gradiente Autogenerado
Para saber la forma de un gradiente autogenerado, es necesario seguir la siguiente formula para saberel valor de la pendiente (dd/dr):
dd = w2 r = 1.1 x 10-2 N2 r dr b0 b0
Donde w es la velocidad angular (rad/seg), r es la distancia (cm) de el eje de rotación, N es lavelocidad del rotor (r.p.m.). Esta ecuación puede predecir la pendiente del gradiente para la región centralque abarca.
Gradientes Isoosmóticos
La separación de células animales y otras partículas sensibles osmóticamente requieren que elgradiente para la centrifugación sea conveniente osmóticamente, es decir, mantengan constante laosmolaridad a través del gradiente. Las soluciones utilizadas son: suspensiones de sílica coloidal como elPercoll, iodonidatos como el Nycodenz y metrizamida.
Análisis de la Distribuciónde la Muestra en el Gradiente
Inspección visual, análisis flourométricos y espectrofotométricos: En algunos casos, la inspecciónvisual simple podría revelar la posición de la banda de interés, por ejemplo, las bandas mitocondriales tienenun color café que las distingue y el DNA en gradientes de cloruro de cesio y con bromuro de etidio presentaun color rosa. Estas bandas pueden ser removidas utilizando una jeringa o una pipeta para su análisisposterior. En otros casos, las partículas absorben o dispersan la luz, así que, su posición puede serdeterminada por medición de la densidad óptica en un espectrofotómetro. Los ácidos nucleícos y lasproteínas absorben en la región ultravioleta del espectro sin embargo, hay algunos medios (NaI, Nycodenz)que absorben fuertemente en la región ultravioleta y otros medios que dispersan la luz (Percoll) haciendo quesea muy difícil la medida de la absorción de la luz.
A menudo los problemas asociados con la medida directa pueden eliminarse utilizando análisiscolorimétrico o fluorimétrico para diferentes tipos de macromoléculas, sin embargo, en estos ensayos no esfácil remover la fracción del gradiente lo que involucra perdida de materiales, en el peor de los casos puedeser no selectivo y dar un fraccionamiento falso. Es posible utilizar marcadores para fraccionamientosubcelular (ver tabla 5 Apéndice) para poder distinguir su banda después de una centrifugación. Acontinuación se muestra un tubo de centrifuga después de un fraccionamiento por centrifugación zonal, endonde podemos ver claramente las diferentes fracciones.
32
Fotografía de un fraccionamiento de hepatocito derata utilizando centrifugación zonal con rotor vertical.
Análisis Radioquímicos de Muestras
Los análisis radioisotópicos son convenientes para analizar un gran número de partículas biológicas,si los isótopos son 125I o 32P, las muestras pueden ser contadas en un contador de centelleo. Este método tienela ventaja de que las fracciones de interés pueden ser identificadas y recuperadas después de contarse paraprocedimientos analíticos posteriores, sin embargo, el uso de estos isótopos exponen al usuario a la radiación.
Los isótopos mas utilizados son 3H, 14C y 35S y en todos los casos las muestras pueden ser mezcladascon fluidos de centelleo antes de medir su actividad en un contador. Los ensayos radioisotópicos pueden serafectados por extinción en el gradiente y puede variar de una muestra a otra. La mayoría de las sustancias conlas que se hace un gradiente actúan como agentes extinguidores y el sulfato de cesio precipita casi todos lostipos de fluidos de centelleo. La extinción de isótopos de baja energía tiende a ser mucho mayor que la deisótopos de mayor energía, por ejemplo las muestras que están marcadas con 3H se extinguen mas fácilmenteque las muestras que tienen 14C.
33
APLICACIONES
Cromatografía de Precipitación Centrífuga
Un nuevo sistema de cromatografía introduce un gradiente de concentración generado internamentecon sulfato de amonio a través de un conducto de separación bajo un campo de fuerza centrífuga. Lasmuestras de proteínas son expuestas a un incremento gradual de concentración de sulfato de amonio yprecipitado a lo largo del conducto, entonces se inicia la elusión cromatográfica disminuyendogradualmente la concentración de sulfato de amonio en el gradiente que causa que las proteínas sedisuelvan y precipiten a través del canal; consecuentemente, las proteínas salen de acuerdo a su solubilidaden la solución de sulfato de amonio. La columna de separación consiste en un par de discos equipados quetienen dentro una membrana de diálisis de tal manera que se forman dos canales divididos por estamembrana. El disco es ensamblado en una centrífuga de flujo continuo. Cuando una solución concentradade sulfato de amonio es eluída a través de un canal y el agua a través de otro canal en dirección opuesta, seforma un gradiente exponencial de sulfato de amonio.
Este nuevo método elimina varias complicaciones tales como pérdida de la muestra por absorción ydesactivación causada por el soporte sólido y el arrastre de los precipitados finos a través de la columnacromatográfica. En suma el método ofrece varias ventajas incluyendo: la capacidad de concentrar lamuestra dentro del canal, la manipulación mas flexible del gradiente a través del canal y la completaeliminación de impurezas de bajo peso molecular.
En la siguiente figura se muestra la separación de suero humano bajo las siguientes condicionesexperimentales: 0.05 ml en un ml de solución de buffer, gradiente de sulfato de amonio de 95 a 0 % x 1600min, se utiliza una centrífuga de flujo continuo a 2 000 r.p.m., la velocidad de flujo de elusión del gradientede sulfato de amonio de 1 ml x min y la detección fue a 275 nm.
34
Microscopio de Polarización Centrífuga
La razón del desarrollo de este tipo de microscopio centrífugo es que permite utilizar luz polarizaday observar estructuras finas dinámicas en células vivas que están expuestas a aproximadamente 11 500veces la fuerza de gravedad de la tierra. El espécimen se coloca en un rotor conectado a un motor, laimagen es apreciada en un microscopio externo y aunque el objeto esté girando, la imagen es capturada poruna cámara CCD que esta sincronizada al rotor de la centrífuga, la imagen tiene una resolución menor auna micra y es detectada con una sensibilidad de retardo menor que un nanómetro.
En la siguiente figura podemos ver la imagen de un microscopio polarizado centrífugo.
La siguiente figura muestra un huevo de erizo de mar (Arbacia punctulata) observado en unmicroscopio de polarización centrífugo en donde se utilizó un gradiente isopícnico y después de habercentrifugado 15 min a 5 200 r.p.m.
35
Separación de DNA, RNA y Proteínasde Núcleos de Fibroblastos de Hamster.
Los núcleos purificados fueron suspendidos en 6 M de cloruro de guanidino y 10 mM EDTA (pH =7), después de este tratamiento las uniones entre ácidos nucleicos y proteínas son disociadas. La mezcla fuesonicada para reducir la viscosidad. Los carbohidratos fueron extraídos con acetato de etilo y 2.2 ml delisado fue centrifugado en un rotor SW 50.1 con 2.8 ml de 2.2 M de sulfato de cesio que contiene 10 mMde EDTA y 9 % de DMSO. La centrifugación se llevo a cabo a 35 000 r.p.m. a 20 0C por 40 hrs. Tresbandas muy bien separadas fueron colectadas.
Los ácidos nucleicos fueron monitoreados por absorción ultravioleta y las proteínas fuerondetectadas por tinción con fluoresceína.
Separación de DNA en Base a laComposición GC con uso de BAMD
La aplicación de un compuesto órgano mercurial conocido con el nombre de BAMD (3,6 – bis(acetoximercuriometil) dioxano), es más eficiente que los iones de mercurio. El BAMD interactúaprincipalmente con regiones ricas de GC del DNA, la formación del complejo BAMD-DNA ocurre bajovigorosa agitación de las soluciones en 0.1 M de sulfato de sodio que contiene 5 mM de buffer de borato desodio pH 9.2.
La densidad de inicio de la solución de sulfato de cesio debe de ser 1.47 g / cm3. La región rica delDNA satélite del timo de ternero fue purificado con BAMD, la centrifugacion se llevó acabo en un rotorSpinco 65 a 35 000 r.p.m. x 60 h y en rotor Spinco 30 a 25 000 r.p.m. x 110 h. El DNA fue parcialmenteseparado y sólo la región rica en GC formó una banda separada cerca al menisco del tubo. Un tercer pasopara la separación fue por centrifugación isopícnica en gradientes de cloruro de cesio.
Separación de DNA Nativo yDesnaturalizado con Gradientes de
Densidad de Tricloroacetato de Rubidio
La densidad de flotación del DNA desnaturalizado en solución de tricloroacetato de rubidio es1.675 g / cm3 y del DNA nativo es 1.48 g / cm3 entonces, la diferencia entre las densidades del DNA nativoy desnaturalizado es 0.177 g / cm3 , esto es 10 veces la diferencia de densidad que se presenta en cloruro decesio (0.016 g / cm3). La centrifugación fue llevada en un rotor SW Ti x 36 hrs a 45 000 r.p.m. y 250 C. Elgradiente fue preformado con cinco soluciones de diferentes densidades: 1.695 g / cm3, 1.635 g / cm3, 1.575g / cm3, 1.515 g / cm3 y 1.455 g / cm3.
La separación de DNA nativo y desnaturalizado fue tan eficiente que uno puede esperar separarmoléculas con regiones únicas entrelazadas (híbridos de DNA imperfectos) de perfectas moléculas dedoble cadena; también es posible separar moléculas circulares intactas de moléculas con rupturas en una delas cadenas o en base a sus diferentes propiedades de desnaturalización.
36
Fraccionamiento de RNA
Si es necesario separar un rango completo de moléculas de RNA desde s20,w = 4S a s20,w = 28S (1:7)en una corrida de centrifugación se puede utilizar un gradiente abrupto con una diferencia de concentraciónde 25 %, por ejemplo 10 – 35 % de sacarosa a la máxima velocidad del rotor SW 40 Ti.
Se utilizó una centrifugación a 30 000 r.p.m. x 14 hrs a 0 0C. Utilizando nomogramas ( d = 1.5) danuna posición de x / L = 0.45 para RNA 28 S y x / L = 0.06 para RNA 4 S.
Nota: los nomogramas son gráficas que representan unas constantes (a , S ) en el eje de lasordenadas y x/L (longitud del gradiente) en el eje de las absisas. Estas gráficas ayudan a obtener losparámetros para realizar una centrifugación.
Separación de DNAPlasmídico en Rotores de Tubo Vertical
Se utilizaron cultivos de E. coli en donde los ácidos nucleícos fueron separados utilizando unprocedimiento alcalino. Se llevó a cabo una centrifugación a 5 000 r.p.m. a 4 0C en una centrifuga J-6usando un rotor JS-5.2 con varios adaptadores.
El Pellet de ácidos nucleícos (plásmido y fragmentos cromosomales, RNA y algunas proteínas ),fue resuspendido en buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4). El cloruro de cesio fue adicionado auna densidad final de 1.55 g / ml, y bromuro de etidio a una concentración final de 0.06 mg / ml. Secentrifugó 4.2 hrs a 55 000 r.p.m. en un rotor VTi. Después de la centrifugación, la banda del plásmido fuecolectada, el bromuro de etidio fue removido con n – butanol saturado con agua y cloruro de cesio yfinalmente, los ácidos nucleícos fueron precipitados 2 veces con etanol.
37
Fraccionamiento Celular porCentrifugación Diferencial
Condiciones:primera centrifugación: 600 g por 5 minsegunda centrifugación: 3000 g por 20 mintercera centrifugación: 15 000 g por 1 h
La centrifugación es una técnica que no sólo se utiliza en el laboratorio, sino que también se usa anivel industrial. Por ejemplo es utilizada para purificar y recuperar aceites, fluidos hidráulicos y enfriadoresahorrando miles de dólares a la industria. Otra aplicación es en la industria de alimentos en donde lascentrífugas son utilizadas en muchas operaciones. Por ejemplo en la extracción de proteínas comestibles deproductos vegetales y animales; en la industria farmacéutica cada vez tienen más auge en procesos de controlautomatizados. Las impurezas del café, té y jugos de fruta son eliminadas con la ayuda de centrífugas.
Cabe mencionar que cada vez son más las aplicaciones de la centrifugación en micro y macro escala,ésto es debido a los nuevos diseños automatizados que proporcionan mayor eficiencia y nuevas aplicacionesen los procesos de separación de moléculas.
38
BIBLIOGRAFÍA
Ito, Y., (2000) Centrifugal Precipitation Chromatography :Principale, Apparatus, and Optimization of KeyParameters for Protein Fractionation by Ammonium Sulfate Precipitation. Analytical Biochemistry. 277. 143-153.
Inoué, S., Knudson, R.A., Goda, M., Suzuki, K., Nagano, C., Okada, N., Takahashi, H., Ichie, K.,Iida, M., Yamanaka, K., (2000) Centrifuge polarizing microscope. I. Rationale, design and instrumentperformance. Journal of Microscopy. 201. 341-356.
Inoué, S., Knudson, R.A., Goda, M., (2000) Centrifuge polarizing microscope. II. Sample biologicalapplications. Journal of Microscopy. 201. 357-367.
Little, S.E., (1989) Plasmid DNA Separations in High Performance Vertical Tube Rotors. Effect ofSpeed on Run Times. Beckman Instruments, Inc. DS-726.
Griffith, O. M., Techniques of Preparative, Zonal, and Continuous Flow Ultracentrifugation.Beckman Instruments, Inc. 50 pp.
Wen Hsu, H.,(1981) Separations by Centrifugal Phenomena, Techniques of Chemistry Volume XVI.John Wiley & Sons, Inc. 466 pp.
Tejeda, A., Montesinos, R.M., Guzmán, R., (1995) Bioseparaciones. Unison. Capitulo 4Centrifugación.
Rickwood, D., Ford, T.C., Steensgaard, J., (1994) Centrifugation Essential Data. John Wiley & Sons,Inc. 114 pp.
Ford, T.C., Graham, J.G., (1991) An Introduction to Centrifugation, BIOS Scientific Publishers,Oxford. 118 pp.
Rickwood, D., (1984) Centrifugation: a Practical Approach. 2nd edition IRL Press, Oxford.
Cole, J.L., Hansen, J.C., (1999) Analytical Ultracentrifugation as a Contemporary BiomolecularResearch Tool. Journal of Biomolecular Techniques. 10. 163-176.
39
APÉNDICE
En el siguiente apéndice se encuentran algunas tablas con información relevante en el tema de lacentrifugación, cada una tiene un encabezado que permite identificar su uso.
40
41
42
43
