MACROPROLACTINEMIA: EXPERIENCIA EN SCREENING Y CONFIRMACIÓN CON CROMATOGRAFIA DE FILTRACIÓN EN GEL

XVI Congreso Uruguayo de Patología Clínica

Montevideo, 08 noviembre 2016

José Gilberto H. Vieira Professor Afiliado, Disciplina de Endocrinologia, EPM/UNIFESP

Médico Assessor, Grupo Fleury

AGENDA DE LA PRESENTACIÓN

• Formas Circulantes de la Prolactina

• Ensayos para la Medida de Prolactina Sérica

• Concepto de Macroprolactinemia

• Influencia de la presencia de Macroprolactina

– Importancia Clínica

• Métodos de Pesquisa y cuantificación de Macroprolactina

• Resumen y Conclusiones

FORMAS CIRCULANTES DE PROLACTINA

• Formas Glicadas – Cromatografia de afinidad

• Formas que varian de acuerdo con el peso molecular: – Monómeros – Dímeros – Macroprolactina

• Identificación – precipitación selectiva – Presencia de IgG – Definición por Cromatografia

de gel filtración

0 10 20 30 400

10

20

30

40

V0

tubo (mL)P

rl n

g/m

L

HIPERPROLACTINEMIA INDUCIDA POR EL USO DE MEDICACIÓN

• Causa comun de hiperprolactinemia

• Drogas relacionadas: – Antipsicotrópicos (neurolépticos, bloqueadores del

receptor de Dopamina): fenotiazidas

– Antidepresivos: tricíclicos, tetracíclicos, inhibidores de la recaptura de serotonina

– Opiáceos y cocaína

– Bloqueadores del canal de cálcio (Verapamil)

– Metoclopramida, Domperidone

– Estrógenos

ESTRES E HIPERPROLACTINEMIA ESTUDIO DE LA RESPOSTA DE 157 INDIVÍDUOS SELECCIONADOS CON PRL >40 g/L

SUBMETIDOS A REPOSO DE 30 MIN ANTES DE LA COLECTA DE NUEVA MUESTRA Y RE-DOSEA MIENTO DE PROLACTINA

Sin Reposo Con Reposo 0

25

50

75

100

"no respondedores"

"respondedores"

Pro

lact

ina

g

/L

74,5%

25,5%

Vieira JG, et al. Arq Bras Endocrinol Metab 50 ;569-70, 2006

QUE ÉS MACROPROLACTINA?

• Predominancia en circulación de formas de Prolactina de alto peso molecular

• Prolactina ligada a una proteína cargadora o un receptor solúble? Agregados?

• Prolactina ligada a la IgG – Anticuerpo anti-prolactina? – Ligación no-específica?

• Por que la concentración total de prolactina es, en general, elevada en pacientes con macroprolactinemia? – Media-vida prolongada – Formas monoméricas “libres” en cantidad normal

CONCEPTO DE ENSAYO INMUNOMÉTRICO (NO COMPETITIVO) ACTUALMENTE EMPLEADO EN RUTINA

DIAGNÓSTICA PARA LA MEDIDA DE PROLACTINA

Anticuerpo de Captura

Fase Sólida

Anticuerpo Señalizador

Prolactina

PRINCÍPIOS DE LA GEL FILTRACION

MÉTODO CROMATOGRÁFICO DE CONFIRMACIÓN

• Columna 0,9x30 cm

• Gel: Superdex 200

• Muestra: 0,5 mL soro

• Velocidad de eluición: 1 mL/min

• Colecta 1 mL/tubo

• Dosage de Prolactina em los tubos 5 a 30

0 1 0 2 0 3 0 4 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

V 0

tu b o (m L )

Prl

ng

/mL

MONOMERO DÍMERO

MACRO

VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE PRECIPITACIÓN CON PEG COMO SCREENING PARA MACROPROLACTINEMIA

Vieira JG et al. Clin Chem 44:1758-1759, 1998

250 uL de suero + 250 uL PEG 6000 25% Determinación de Prl em el sobrenadante:

•Recuperación >65%: monomérica •Recuperación entre 65 e 30%: cromatografia •Recuperación <30%: macroprolactina

Período de 12/96 a 08/99: 55.488 dosages 3.581 muestras >25 ng/mL (6,5%) Monoméricas: 52,0% Indeterminado: 13,5% Macroprolactina: 34,5%

POTENCIALES DIFICULTADES TÉCNICAS EM LA DETERMINACIÓN DE TSH SÉRICO

• Presencia de anticuerpos heterofílicos

• Presencia de anticuerpos endógenos anti-TSH (MacroTSH)

– Vieira JG et al. Arq Bras Endocrinol Metab 50:445-449, 2006

• Diferencias significativas entre bio e imunoafinidade

MACROPROLACTINA ES BIOLÓGICAMENTE ACTIVA?

• Trabalho de Glezer A et al, J Clin Endocrinol Metab, 2006; 91:1048-55;

• Estudio de la actividad “in vitro” de las formas de prolactina de alto peso molecular

• En bioensayo con células Nb2 es activa, en BaF/LLP no;

0 10 20 30 400

10

20

30

40

V0

tubo (mL)

Prl

ng

/mL

CORRELACIÓN ENTRE ENCUENTROS DE ESTUDIOS DE IMÁGENES (CT/MRI) Y PESQUISA DE MACROPROLACTINA

Hauache OM, et al. ClinEndocrinol (Oxf)57:327-331, 2002

0

100

200

300

400

500

normal

microadenoma

macroadenoma

Negative Positive

Image Finding

n=46 n=42

Macroprolactin Screening

Pro

lacti

n n

g/m

L

DIFERENCIAS EN EL RECONOCIMIENTO DE MACROPROLACTINA POR LOS DIFERENTES ENSAYOS COMERCIALES

Fahie-Wilson, MN. Clin Chem 46:2022-3, 2000

Basado en el programa de control de cualidad británico (UKNEQAS), muestra con 93% de macroprolactina y monomérica de 7,1 ng/mL

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Prl

ng

/mL

0

1

2

3

4

5

6

% Prl >25 ng/mL

% MacroPrl +

1o Trimestre 20089.979 amostras

IFMA Wallac

1o Trimestre 201012.002 amostrasICMA Beckman

% d

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DIFERENCIA EM EL RECONOCIMENTO DE MACROPROLACTINEMIA POR PRECIPITACIÓN CON PEG EMPLEANDO ENSAYOS COMERCIALES TRADICIONALES

Y CON MENOR “REACTIVIDAD” CONTRA MACROPROLACTINA Vieira JG, Tachibana TT, Ferrer CM, Sá J, Biscolla RP, Hoff AO, Kanashiro I, Hyperprolatinemia: new assay more specific for the monomeric form does not eliminate screening for macroprolactin with

polyethylene glycol precipitation. Arq Bras Endocrinol Metab 54:856-857, 2010

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

2

4

6

8

1 0

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Pr

l n

g/m

L

A m o s t r a 2 3 : P r l 3 1 0 / p p t 1 4 . 5 / r e c 5 %

M a c r o 5 8 %

D im e r o 7 %

M o n o m e r o 3 5 %

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

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l n

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L

A m o s t r a 2 4 : P r l 1 8 4 / p p t 1 4 0 / r e c 7 6 %

M a c r o 5 %

D im e r o 7 %

M o n o m e r o 8 8 %

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA DE GEL-FILTRAÇÃO DE UM CASO POSITIVO Y UN NEGATIVO PARA LA

PESQUISA DE MACROPROLACTINA

ALGUNAS OBSERVACIONES PRÁCTICAS

• Es fundamental la pesquisa de macroprolactinemia en muestras con resultados inesperadamente elevados. – Soarez PC, Souza SC, Vieira JG, Ferraz MB. The effect of identifying macroprolactinemia on health-

care utilization and costs in patients with elevated serum prolactin. Value Health 12:930-934, 2009

• Diferentes métodos de ensayo de prolactina pueden presentar resultados poco comparables

• Ensayos que presentam menor reconocimento de macroprolactina no eliminan completamente el problema

• Pesquisa por precipitación con PEG es el método mas simple y barato, desde que validado para el método utilizado para la medida de prolactina total en uso

• El método cromatográfico deve ser restricto a casos donde la correlación clínica es problemática y la precipitación con PEG también deja dudas

RESUMEN

• La prolactina es una hormona que presenta heterogeneidad quanto a sus formas circulantes

• El reconocimiento de esas diferentes formas circulantes es método-dependiente y es clinicamente relevante pues aparentemente sólo la forma monomérica presenta actividad biológica

• Su reconocimiento inicial y discriminación tiene alto costo-benefício para el paciente, el médico y el sistema de salud

0.1 1 10 100 1000 10000 100000100

1000

10000

100000

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Prolactina g/L

cp

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FENÔMENO DO “GANCHO”

• Condição restrita a ensaios imunométricos

• Excesso de antígeno satura os dois monoclonais e não permite a formação do “sanduiche”

• Resultado falsamente baixo • Alcance da curva e

concentração de prolactina ditam a importância do fenômeno

• Nos ensaios disponíveis comercialmente: valores acima de 100 ng/mL devem ser confirmados com diluição 1:10

HIPERPROLACTINEMIA INDUZIDA PELO USO DE MEDICAÇÃO

• Causa comum de hiperprolactinemia

• Drogas relacionadas: – Antipsicóticos (neurolepticos, bloqueadores do

receptor de Dopamina): fenotiazidas

– Antidepressivos: tricíclicos, tetracíclicos, inibidores da recaptura de serotonina

– Opiácios e cocaína

– Bloqueadores do canal de cálcio (Verapamil)

– Metoclopramida, Domperidone

– Estrógenos