1 . I N T R O D U C C I Ó N

La Histología es la ciencia microscópica que estudia lo relacionado a las estructuras celulares en forma de tejido, desde un punto de vista muy preciso. La histología es una ciencia aplicada que vio luz desde la invención del microscopio, esta herramienta, que también trajo consigo numerosas herramientas para determinar características a un nivel atómico de los tejidos, representó el comienzo de un complejo campo de estudio, en el que se descubrirían interesantes vestigios de la naturaleza del ser vivo y posteriormente se daría paso a la creación de una ciencia moderna ambientada en el estudio celular de los tejidos. La histología, también denominada “Anatomía microscópica” debe tal referencia al hecho de que la ciencia dio un salto inesperado cuando con el estudio de tejidos se descubrió el comportamiento de las células, se determinó que estas pertenecen a un circulo de reproducción, en él, una célula proviene de otra célula, la regeneración de estas se produce en específicos ambientes de la naturaleza y la relación de un tejido con otro puede depender del uso que se le dé a este. Con los estudios histológicos, la medicina ha encontrado curas y vacunas a una diversidad de enfermedades entre las que se destacan aquellas producidas por cepas de virus nacidas en animales y plantas.

La histología en la actualidad, cuenta con campos de investigación muy efectivos y exactos, tal es el caso de la citología, estos estudios, han contribuido de manera significativa en la búsqueda de la cura de enfermedades de transmisión sexual, también en la respuesta del enigma del cáncer.

E.n la actualidad, se da paso a una clasificación muy simple de la histología, por una parte, se le conoce como histología animal, a la investigación en tejidos de animales incluyendo a los seres humanos y la histología vegetal, con una visión botánica, se concentra en la búsqueda de relaciones con los tejidos de plantas y frutos obtenidos de la tierra.

Vamos a describir los procesos experimentales necesarios para obtener secciones teñidas y listas para observar al microscopio partiendo de tejidos vivos extraídos de un animal o de una planta. Por ejemplo: obtención, fijación, inclusión, corte y tinción de los tejidos.

La mayoría de las técnicas histológicas van encaminadas a preparar el tejido para su observación con el microscopio, bien sea éste óptico o electrónico. Ello es debido a que la estructura de los tejidos está basada en la organización de los tipos de células que los

componen y, salvo contadas ocasiones, las características morfológicas de las células sólo se pueden observar con estos aparatos.

Existen procedimientos rápidos y simples para la observación de tejidos y células vivas que reciben el nombre de vitales. Por ejemplo, la observación del flujo sanguíneo en capilares del sistema circulatorio. Otra forma de observar células o tejidos vivos es mediante las técnicas histológicas supravitales, en los que las células y los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera del organismo, como es el caso de los cultivos de células y de tejidos.

Las técnicas histológicas postvitales son aquellas en las que las células mueren durante el proceso, pero las características morfológicas y moleculares que poseían en estado vivo se conservan mejor o peor dependiendo del tipo de técnica.

P R O C E S O H I S T O L Ó G I C O

Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y técnicas utilizados para poder estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir, series de técnicas que se utilizarán dependiendo de qué característica deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los métodos y técnicas comúnmente empleados para el procesamiento de los tejidos para su observación con los microscopios óptico o electrónico. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a estos "caminos" y su elección dependerá del resultado final que queramos obtener.

Esquema del proceso histológico. 

El proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto de estudio. En el caso de los tejidos vegetales directamente se toman muestras de los distintos órganos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porción del tejido u órgano y

procesarla o procesar primero el animal completo y luego extraer la muestra que nos interese. En cualquier caso las muestras son habitualmente fijadas con unos soluciones líquidas denominadas fijadores, las cuales se usan para mantener las estructuras celulares y moleculares inalterables durante el procesamiento posterior y con una organización lo más parecida posible a como se encontraban en la muestra viva. También podemos fijar las moléculas de los tejidos por congelación rápida. Fijar un tejido es como hacer una fotografía de dicho tejido, su estructura se mantendrá hasta su observación. La fijación por congelación se emplea cuando la fijación química o los procesos histológicos posteriores alteran las características de la muestra que queremos estudiar, por ejemplo una molécula sensible a dichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para posteriormente obtener secciones. Cuanto más delgada queramos que sea nuestra sección más tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias líquidas que posteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán consistentes (ceras). También se puede conseguir el mismo efecto mediante congelación rápida. Cortes más gruesos de 40 µm se pueden cortar sin necesidad de inclusión usando el vibratomo. Los medios de inclusión no son normalmente hidrosolubles por lo que tendremos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgánicos liposolubles y posteriormente sustituirlos por el medio de inclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede a cortar los tejidos, es decir, obtener secciones. Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del orden de nanometros), semifinas (de 0.5 a 2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm) y gruesos (mayores a 10 µm). Habitualmente las secciones se procesan para poder observarlas y estudiarlas, aunque ciertos tipos de microscopía, por ejemplo con contraste de fase, permiten observar secciones de tejidos sin procesar. Normalmente las secciones se tiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el medio de inclusión para que los colorantes pueden unirse al tejido. Las secciones ultrafinas (observadas con el microscopio electrónico) o semifinas (observadas con el microscopio óptico) se pueden contrastar con metales pesados o con colorantes, respectivamente, sin necesidad de eliminar el medio de inclusión.

Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos básicos de microscopios: óptico y electrónico. Los primeros ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los tejidos: campo claro, fluorescencia, contraste de fase, polarización o

contraste de interferencia diferencial, mientras que los segundos permiten un gran poder de resolución, pudiéndose observar características ultraestructurales.

Existen múltiples variaciones sobre este esquema general de procesamiento histológico. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el microscopio electrónico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero sólo observaremos superficies

2 . F I J A C I Ó N .

Todos los tejidos, bien cuando se extraen de un organismo o bien cuando el organismo en el que están muere, sufren dos tipos de procesos degradativos: autolisis por acción de enzimas intracelulares, es decir, autodigestión, y putrefacción por acción bacteriana. Además, el procesamiento histológico posterior del tejido para poner de manifiesto y observar determinadas estructuras supone una metodología que puede degradar las estructuras tisulares. Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía en su estado vivo. Es como hacer una fotografía del tejido vivo y poder observarla, tras cierto tratamiento, con el microscopio. Así, los fijadores deben evitar la autolisis, proteger frente a ataques bacterianos, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar distorsiones y retracciones tisulares, penetrar y preparar el tejido para poder llevar a cabo tinciones específicas posteriores, si es necesario, etcétera.

No existe un fijador universal, ni un método de fijación único. Incluso podemos usar varios fijadores secuencialmente según nuestras necesidades. La elección depende de las características fijadoras que necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades enzimáticas debemos usar un fijador que no nos altere el centro activo de las enzimas en las que estamos interesados, y quizá para ello tengamos que sacrificar en cierta medida la morfología tisular. Si queremos estudiar la ultraestructura celular debemos usar fijadores que la preserven y que protejan a las membranas celulares durante el procesamiento de inclusión en resinas, y quizá esto altere su apetencia por los colorantes generales. Si queremos teñir un determinado componente celular difícilmente teñible quizá debamos usar un fijador que lo modifique para que sea reconocido más fácilmente por los colorantes.

En cualquier caso hay características de los fijadores que tenemos que tener en cuenta antes de su uso:

Velocidad de penetración. El proceso de fijación ha de ser rápido y la velocidad de difusión de la sustancia fijadora en los tejidos es un factor determinante. Este parámetro condiciona el tamaño de la pieza que queramos fijar, más pequeña cuanto menor sea la velocidad de difusión del fijador empleado, y también determina el tiempo de fijación, mayor cuanto menor tiempo de difusión.

Velocidad de fijación. Esta característica no dependen de la velocidad de difusión sino de las propiedades químicas del fijador y condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en contacto con el fijador.

Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del tipo de fijador y del tiempo que el tejido haya estado expuesto a él.

Ósmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la células producidos por una osmolaridad del fijador diferente a la del tejido. Por tanto, hay que equilibrar la osmolaridad de las soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es necesario añadir sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con añadir 0.9 % de cloruro sódico. Son sales que no afectan a la capacidad del fijador. Normalmente se suelen usar soluciones tamponadoras a un pH semejante al del tejido e isoosmóticas con dicho tejido.

Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difíciles de teñir puesto que tienen poca apetencia por los colorantes. Esta apetencia puede ser incrementada con un tratamiento previo. Algunos fijadores, además de fijar, modifican químicamente a ciertas estructuras celulares para que posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de modificación química se le denomina efecto mordiente.

Artefactos. Los procesos de fijación pueden acarrear alteraciones tisulares como variaciones morfológicas, cristalización de compuestos, desplazamiento de sustancias, etcétera. Estos cambios pueden producirse por las características del fijador o por un mal uso de éste. En cualquier caso deben tenerse en cuenta para no describir como características tisulares lo que es un artefacto introducido durante la fijación.

2 . M É T O D O S d e F I J A C I Ó N

Existen diferentes formas de fijar los tejidos dependiendo del tipo de fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos observar. Los métodos de fijación se pueden clasificar en dos tipos: físicos y químicos.

Los fijadores físicos se basan o bien en una congelación muy rápida del tejido o bien en la aplicación de calor elevado. Se utilizan cuando cuando los fijadores químicos alteran las estructuras que queremos observar, cuando necesitamos una fijación muy rápida, o cuando el tipo de tejido y la ténica que usaremos lo requiera. La congelación rápida es un buen método de preservación de las caraterísticas moleculares y es conveniente que sea rápida puesto que así se impide la formación de grandes cristales de hielo que nos destrozarían la estructura del tejido. Existen variantes de esta técnica como son la criodesecación o liofilización y la criosustitución. La criodesecación parte de tejido previamente congelado al que posteriormente se le sublima el hielo, es decir, el agua pasa de estado sólido a gaseoso sin pasar por estado líquido. Al eliminar el agua se impide que se den reacciones químicas, por lo que, además de la fijación, este método preserva el tejido en el tiempo. La criosustitución también parte de tejido congelado pero en este caso se produce una sustitución lenta del hielo por una solución fijadora. Con ello se posibilita una fijación química sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto que está congelado. Los métodos de fijación por calor no son frecuentemente usados, excepto para el estudio microorganismos.

Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas fijadoras que establecen puentes entre las moléculas del tejido, manteniéndolas en sus lugares originales e impidiendo su degradación. Hay dos métodos básicos de fijación con fijadores líquidos: inmersión y perfusión. En cualquier caso el fijador debe llegar a todas las partes el tejido lo más rápidamente posible.

Inmersión. En el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en la solución fijadora. Hay que tener en cuenta algunas precauciones.

1) Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que ésta comience a deteriorarse. Esto depende de la velocidad de penetración del fijador y de las características del tejido. Por ejemplo, si tiene cavidades por donde penetre la solución fijadora el volumen podría ser mayor.

Fijación por inmersión.

2) El volumen recomendado de fijador es 20 veces superior al volumen de la pieza.

3) La osmolaridad del tejido y de la solución fijadora deben estar equilibradas.

4) El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.

5) El tiempo de fijación depende de cada tipo de fijador. Una agitación suave durante la fijación ayuda a la penetración del fijador y disminuye el tiempo.

Fijación por perfusión de un órgano. Mediante perfusión se consigue que la solución fijadora llegue a todas las células del órgano a través del sistema sanguíneo. Mediante una bomba peristáltica se introduce la solución fijadora a través de la arteria que irriga el órgano. Se obturan todos aquellos vasos arteriales que no conducen al órgano.

Perfusión. Por este procedimiento la solución fijadora se introduce a través del sistema circulatorio por el cual accede a todas las células del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este método se puede fijar un animal completo introduciendo la solución fijadora a través del ventrículo izquierdo del corazón. El fijador llegará a todas las células irriegadas por la sangre bombeada por dicho ventrículo (circuito corporal). Si se quieren fijar los pulmones habría que introducir el fijador por el ventrículo derecho. También podemos fijar un único órgano en el caso de que podamos introducir la solución fijadora en la arteria principal que irriga dicho órgano. La perfusión no siempre es posible en algunos casos como en muchas biopsias o en los tejidos vegetale.

El método de fijación por perfusión es mucho más efectivo que el de inmersión ya que la solución fijadora llega rápidamente a escasa distancia de todas las células de la estructura perfundida. Por tanto, la velocidad de penetración del fijador no es una condición limitante.

Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos sanguíneos hay que eliminar previamente la sangre con una solución de lavado oxigenada, de otra manera su interacción con el fijador produce trombos que impedirían la fijación de determinadas zonas del animal o del órgano. Respecto a las precauciones mencionadas anteriormente en el método de inmersión debemos cuidar aquí también la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijación.

 Fijación por perfusión de un organismo completo. Mediante este tipo de perfusión se introduce la solución fijadora en el sistema sanguíneo. La bomba peristáltica aporta la presión suficiente para permitir al fijador entrar a través del ventrículo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar la solución fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido en la aurícula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la solución fijadora, una vez realizada su función, salga del circuito. Ai: aurícula izquierda; Vd: ventrículo derecho.

Este método de fijación por perfusión requiere conocer la presión a la que se va a introducir la solución fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presión sanguínea normal en estado vivo. La presión que ejercerá la solución fijadora se puede regular mediante bombas peristálticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la cual se coloca la solución fijadora respecto a la del animal. Esto es importante porque una presión muy baja prodría impedir que la solución fijadora alcanzara todas las partes de la estructura y un presión muy alta podría provocar roturas de los vasos sanguíneos y de la propia estructura tisular.

2 . F I J A D O R E S

Existen multitud de fijadores en los manuales de técnicas histológicas. Aquí sólo trataremos aquellos que consideramos de uso más común para la observación de tejidos al microscopio, es decir, aquellos que mejor preserven la estructura celular. Los fijadores químicos son los más frecuentemente empleados, bien compuestos por un solo tipo de sustancia fijadora o con mezclas de varias de ellas.

Los fijadores se pueden clasificar en dos grandes grupos según su acción sobre el tejido: los desnaturalizantes y los que establecen enlaces cruzados. Los primeros, al extraer agua de los tejidos producen desnaturalización de las proteínas produciendo coagulación proteica, mientras que los segundos establecen enlaces químicos entre moléculas del tejido. Los fijadores que tienen como base al alcohol son desnaturalizantes, tales como el Bouin o el Carnoy, mientras que el formaldehído o el glutaraldehído establecen enlaces.

¡Atención! La mayoría de las sustancias fijadoras son tóxicas por inhalación o por contacto, algunas de ellas cancerígenas. Hay que seguir las indicaciones de seguridad para su manejo y utilización.

Fijadores simples

 Etanol: CH3-CH2-OH 

Alcohol etílico. Fija por deshidratación y se usa entre el 70 y 90 %. Es un buen fijador para preservar proteínas, como enzimas, glucógeno, pigmentos y es útil para fijar las extensiones citológicas. Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar también como un conservante de las muestras. Tiene algunos inconvenientes como producir endurecimiento y la retracción de los tejidos. Carece de efecto mordiente.

 Ácido acético: CH3COOH 

Ácido acético. Su proceso de fijación consiste en cambiar el estado coloidal de las proteínas. Se utiliza a una concentración que varía entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para ácidos nucleicos y nucleoproteínas. Como inconvenientes cabe destacar la destrucción de las mitocondrias y mala fijación de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinación con otros fijadores. Ejemplos: BOUIN☆, FFA ☆

 Ácido pícrico: C6H2OH(NO2)3 

Ácido pícrico. La fijación la produce porque las sales del tipo picrato coagulan las proteínas de los tejidos. Se suele usar del 2 al 15 % de una solución saturada de ácido pícrico. Preserva bien la estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijación es óptimo, preserva bien glucógeno y lípidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto que tiene efecto mordiente y favorece la unión de los colorantes. Hay que eliminarlo completamente antes de proceder a la inclusión en ceras como la parafina puesto que dificulta la penetración de la parafina. Se suele usar combinado con otros fijadores. Ejemplos: BOUIN☆

 Formaldehído: CH2=O. 

Formaldehído. Actúa mediante la formación de puentes entre las moléculas tisulares. Se utiliza a concentraciones próximas al 4 %. Es un fijador ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa como conservante, produce poca retracción tisular, es un buen fijador para lípidos, es compatible con la mayoría de las tinciones histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de ácidos ribonucleicos. Normalmente se usa en solución tamponada e isotónica. Actualmente se prepara a partir de paraformaldehído, sustancia sólida. Ejemplos: BOUIN☆, FFA ☆, PLP ☆,

 Glutaraldehído.

Glutaraldehído. Forma puentes entre las moléculas de los tejidos. Se usa a una proporción de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular, por lo que es el fijador de referencia para observación de ultraestructuras celulares con el microscopio electrónico. Pero hay que tener cuidado con su baja penetración tisular y puede producir retracciones. Se usa en soluciones tamponadas isotónicas.

 Tetróxido de osmio. OsO4.

Tetróxido de osmio. Forma puentes entre moléculas. Se emplea al 1 % en soluciones tamponadas. Es buen fijador de la ultraestructura de la célula por lo que se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electrónico. Es un buen fijador para grasas y membranas celulares. Por su fuerte carácter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para las impregnaciones argénticas como el método de Golgi.

Mezclas fijadoras

La mayor parte de los procesos de fijación usan varias sustancias fijadoras, bien mezcladas en la solución acuosa inicial o utilizadas sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de formas de usar los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de éstos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qué tipo de tejido queremos fijar y qué queremos ver de dicho tejido. A continuación vamos a mencionar algunas combinaciones usadas frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijación que las hace apropiadas para las observación de una gran variedad de tejidos y para el uso diversas de técnicas de tinción.

Líquido de Bouin☆. Está formado por ácido pícrico, formaldehído y ácido acético glacial. Es una solución muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirán en parafina (ver capítulo de inclusión) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy útil para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el núcleo y el glucógeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijación, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersión. Tras la fijación las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de 70°. No está recomendado para el riñón ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusión en parafina es conveniente eliminar el ácido pícrico mediante lavados en alcohol de

70° porque impedir una buena inclusión o que las tinciones no sean adecuadas.

Carnoy☆. Es un buen fijador para el glucógeno, para los hidratos de carbono simples y para las proteínas fibrosas. Es bueno para visualizar los ácidos nucleicos, aunque no la morfología nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Está formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %.

Mezclas con formaldehído. El formaldehído es quizá el fijador más usado hoy en día, tanto para técnicas histológicas rutinarias como para otras como la inmunocitoquímica o la hibridación de ácidos nucleicos. Lo más frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores. Se suele disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopía electrónica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehído y glutaraldehído. La función del formaldehído es iniciar una fijación rápida, por su mayo capacidad de penetración, mientras que el glutaraldehído realizará una fijación más poderosa, pero más lenta que no afectará a la estructura tisular puesto que el formaldehído ya ha realizado una fijación previa.

Glutaraldehído-tetróxido de osmio. Los fijadores en combinación no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscopía electrónica sean inicialmente fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y paraformaldehído (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en tetróxido de osmio al 1 % en solución tamponada. Este último es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperación con los aldheídos. Esto es importante porque el proceso para microscopía electrónica supone incubar el tejido en solventes orgánicos y polimerización de resinas a 60 °C, durante las cuales el tejido debe ser preservado.

T é c n i c a s h i s t o l ó g i c a s  

3 . I N C L U S I Ó N Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observación con el microscopio. Ello implica hacer secciones para teñirlas primero y posteriormente observarlas. Como regla general se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones ya que lo normal es que cuanto más delgada queramos una sección más consistente debe ser la muestra de la que se obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la

fijación, pero esta dureza no es muy alta e impide la obtención de cortes generalmente más delgados que 20 o 30 µm. Sólo en el caso de que queramos trabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y 200 µm) se puede aprovechar el endurecimiento provocado por el fijador y obtener dichas secciones con el vibratomo☆. Este tipo de aparato se utiliza en ciertas técnicas donde es necesaria una buena preservación molecular. Sin embargo, en muchos casos necesitamos endurecer más el tejido para obtener secciones más finas, lo cual se puede hacer de dos formas: por congelación o por inclusión.

La congelación de los tejidos previamente fijados permite la obtención de secciones que pueden ir desde unas 50 µm hasta nm de grosor, para lo que se utilizan diferentes aparatos: microtomo de congelación☆ para secciones de decenas de µm, criostato para secciones de entre 5 y 20 µm y ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm. Para evitar los daños que se producen durante los procesos de congelación, como la formación de cristales de hielo que nos agujerean los tejidos, se pueden usar: a) Anticongelantes que impidan la formación de cristales. El crioprotector más usado es la sacarosa al 30 %, aunque también se usa el dimetil sulfóxido, el glicerol, etilén glicol y otros. La elección de uno u otro depende del tipo de muestra y de la técnica que se vaya a usar. b) Una congelación lo más rápida posible, por ejemplo, con nitrógeno líquido. Cuanto más rápida es la congelación menores son las dimensiones de los cristales de agua formados.

Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes métodos. Secciones más finas se obtienen endureciendo más el tejido. Esto se puede conseguir mediante la congelación o embebiendo el tejido en sustancias que solidifican como la parafina o ciertas resinas. Téngase en cuenta que las dimensiones de los cortes y objetos que se muestran en este dibujo no están a escala. Una rejilla es mucho más pequeña que un portaobjetos. Las dimensiones en µm y nm se refieren al espesor de las secciones.

La inclusión es el método más común de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias líquidas que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las características del tejido. Con ello se consigue obtener cortes del orden de µm a nm, según el medio de inclusión, sin que el tejido se rompa o se deteriore. Además, son un buen método para preservar las muestras durante largos periodos de tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de inclusión dependiendo del grosor del corte y de la técnica que necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observación con el microscopio óptico los medios de inclusión más frecuentemente usados son la parafina☆ o la celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrónico☆ la inclusión se realiza con resinas☆, principalmente de tipo acríclicas o epoxy. La mayoría de estas

sustancias no son hidrosolubles, es decir, no son miscibles con el agua, luego si queremos que la sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por un líquido miscible con dicha sustancia. Si una muestra no está completamente embebida en el medio de inclusión se deteriorará y la obtención de secciones homogéneas será imposible.

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3 . I N C L U S I Ó N e n P A R A F I N A

Para la inclusión de muestras que han de observarse con el microscopio óptico se utiliza sobre todo la parafina, y en menor medida la celoidina, como medio de inclusión. Vamos a describir los pasos para la inclusión en parafina de muestras de tejido previamente fijadas ☆.

La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que está formada por mezclas de hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es sólida y su punto de fusión puede variar entre 40 °C y 70 °C según la composición de la mezcla de hidrocarburos. Así, parafinas más duras a temperatura ambiente tienen un punto de fusión mayor, mientras que las más blandas uno menor. Es recomendable una dureza mayor para incluir muestras más duras. Las parafinas más usadas tienen un punto de fusión en torno a los 60 °C. Podemos también modificar las características de las parafinas añadiendo sustancias para variar su dureza, viscosidad, fragilidad, etcétera.

La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos están formados principalmente por agua. Además, la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica que para que la parafina líquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente orgánico. Esto se consigue mediante la deshidratación del tejido en alcoholes, normalmente etanol, de gradación creciente hasta alcohol de 100°. Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que es miscible tanto con el alcohol de 100° como con la parafina, denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno, tolueno o el óxido de propileno, entre otros. Estas sustancias son normalmente aclarantes por lo que comprobando la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetración de la sustancia intermediaria en el tejido. El tiempo de incubación de la pieza en algunos de estos líquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y crean problemas al hacer las secciones.

Por último se pasa el tejido a parafina previamente licuada en una estufa regulada a la temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina líquida para favorecer una completa sustitución del líquido intermediario por la parafina. El tiempo que dura dichos pasos depende de lo volátil que sea el líquido intermediario y lo grande que sea nuestra pieza. Será mayor cuanto menos volátil es el líquido intermediario o mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo excesivo en parafina puede endurecer el tejido. Tras el embebimiento completo de la muestra se vierte parafina líquida en un molde, se intruduce la muestra y se coloca según la orientación deseada de corte y se deja solidificar a temperatura ambiente.

Un protocolo común de inclusión en parafina es el siguiente:

Esquema de la inclusión en parafina de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño de la muestra, tipo de tejido o, por ejemplo, el líquido intermediario. Sin embargo, los pasos son comunes a cualquier inclusión en parafina.

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3 . I N C L U S I Ó N e n R E S I N A

Para la observación de la ultraestructura celular es necesario hacer secciones de tejido muy delgadas, del orden de nanometros, denominadas ultrafinas, y usar un microscopio electrónico de transmisión. La obtención de secciones ultrafinas implica que tenemos que endurecer enormemente el tejido. Esto se puede conseguir mediante congelación, obteniendo entonces la secciones con un ultracriotomo. Sin embargo, lo más frecuente es incluir el tejido en un material de alta dureza como son las resinas de tipo epoxy, y en menor medida las resinas acrílicas como el metacrilato. Ambas se infiltran en el tejido en forma líquida y posteriormente polimerizan sin afectar a la ultraestructura celular.

El procedimiento estándar de inclusión en resinas tipo epoxy es similar al descrito para la parafina con algunas modificaciones. Así, los pasos que se siguen son fijación de las muestras, por inmersión o perfusión, deshidratación, líquido intermediario, infiltración y polimerización en el medio de inclusión. Algunos medios de inclusión de tipo acrílico, por ejemplo la resina LR white, son parcialmente miscibles con el agua por lo que no es necesario deshidratar completamente la muestra o el líquido intermediario, y además polimerizan con luz ultravioleta a bajas temperaturas. Estos medios son buenos para estudios citoquímicos.

En las inclusiones en resinas tipo epoxy, normalmente para muestras que se observarán en el microscopio electrónico, se suelen seguir las siguientes recomendaciones:

a) Las soluciones fijadoras suelen contener glutaraldehído y es necesaria una postfijación posterior entetróxido de osmio. Con ello nos aseguramos una fuerte fijación para preservar la ultraestructura celular y que no perderemos los lípidos que forman las membranas celulares durante el proceso de inclusión, gracias al tetróxido de osmio.

b) Partimos de tamaños de muestras mucho más pequeñas, de unos pocos milímetros, puesto que no nos interesa ver la organización general del tejido sino detalles del mismo. Si queremos observar zonas diferentes de un órgano es conveniente hacer bloques de muestra pequeños e independientes de cada una de ellas.

c) La resinas más comúnmente usadas para la inclusión no son hidrosolubles, por lo que tenemos que sustituir el agua del tejido por un solvente orgánico que sea miscible con la resina. Para ello se deshidrata el tejido mediante incubaciones sucesivas en gradaciones crecientes de etanol o acetona. Como líquido intermediario entre la acetona pura o el etanol de 100° y las resinas se suele utilizar el óxido de propileno.

d) El endurecimiento del medio de inclusión, la resina, no es por enfriamiento sino por polimerización, normalmente a 60 °C.

e) Al medio de inclusión, la resina, se le añaden aceleradores y plastificantes que regulan las características de la polimerización y la dureza de la resina polimerizada. Las resinas tipo epoxy son las más usadas puesto que aportan una mayor homogeneidad en las polimerización y más facilidad a la hora de obtener secciones regulares. Por el contrario las resinas acrílicas presentan algunos inconvenientes y hay que ser muy cuidadosos a la hora de elegir las condiciones de polimerización, obtención y tratamiento de los cortes ultrafinos.

A continuación se muestra un proceso de inclusión habitual en resinas de tipo epoxy.

Esquema de la inclusión en resina de tipo epoxy de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia pueden variar en función del tamaño de la muestra o tipo de tejido.

T é n i c a s h i s t o l ó g i c a s  

4 . C O R T E

Las caterísticas tisulares y celulares finas se observan con los microscopios. Sin embargo, con estos aparatos sólo se pueden observar muestras de tejido que tengan un grosor muy pequeño, debido a problemas de difusión y penetración de la luz en el caso de los microscopios ópticos y de penetración de los electrones en el caso del microscopio electrónico de transmisión. Por tanto tenemos que hacer secciones de los tejidos que queremos estudiar, las cuales pueden ir desde un grosor de unos cuantos nanometros hasta centenares de micras. Algunos tejidos como los de las plantas, por sus características celulares, permiten su observación en secciones de cientos de micras de grosor.

Como hemos mencionado en las páginas anteriores, podemos decir que cuanto más delgada queramos hacer una sección de tejido más endurecido ha de estar dicho tejido antes de seccionarlo. La dureza de los tejidos depende de sus características (por ejemplo, las paredes celulares hacen que las plantas tengan tejidos duros), de la fijación que hayamos realizado y sobre todo del material en que hayamos incluido dicho tejido. Una manera más directa de endurecer el tejido es mediante congelación.

Los aparatos mecánicos para hacer secciones de un grosor de micrómetros se denominan microtomos y existen diferentes tipos según el grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, según el medio de inclusión en el que se encuentre el tejido o según el proceso de endurecimiento de la muestra: por congelación o por inclusión.

Los microtomos más usados son:

Microtomo para parafina: Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 µm de grosor. Estas secciones se observan con el microscopio óptico.

Vibratomo: Corta material no incluido, aunque sí fijado o duro, en secciones de que puede ir desde 30 hasta centenares de µm de grosor. Estas secciones se observan con el microscopio óptico.

Microtomo de congelación: Con él se consiguen secciones de 30 a unas 100 µm de grosor a parti de material congelado y se observación con el microscopio óptico.

Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 µm, para observar con el microscopio óptico.

Ultramicrotomo: Con él se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones de 1 a decenas de nanometros de grosor. Las secciones de 0.5 µm o más se observan con el microscopio ópitico, mientras que las de un grosor de decenas de nanometros van destinadas a ser observadas con el microscopio electrónico de transmisión.

Ultracriotomo: Su uso no está muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanometros de material que no se debe incluir. Estas secciones van destinadas a su observación con el microscopio electrónico de transmisión.

Los aparatos de corte más usados tradicionalmente para estudiar las características generales de los tejidos y de las células son el microtomo para material incluido en parafina para observaciones con el microscopio óptico y el ultramicrotomo para observaciones con el microscopio electrónico de transmisión. El criostato se usa también frecuentemente en microscopía óptica por el ahorro de tiempo que supone ya que no necesita incluir el tejido, incluso se puede cortar material no fijado.

T é c n i c a s h i s t o l ó g i c a s  

4 . M I C R O T O M O S P A R A P A R A F I N A

Los microtomos para cortar material incluido en parafina son probablemente los más usados en los laboratorios de histología. Todos poseen varias partes comunes: una cuchilla, un portabloques y un sistema mecánico que permite acercar el bloque de parafina a la cuchilla, a una distancia que se corresponde con el grosor de la sección que pretendemos obtener, y realizar el corte.

Microtomo para parafina con mecanismo de rotación.

Hay dos tipos de microtomo para parafina: el de rotación y el de deslizamiento. El microtomo de rotación provoca el corte gracias a la transformación de un movimiento de rotación en otro de ascenso y descenso del portamuestras. En el movimiento de bajada sobre la cuchilla se produce un acercamiento del portamuestras hacia la cuchilla según el grosor de corte seleccinado. En el portamuestras existe un sistema mecánico que permiteorientar la superficie de corte de la muestra respecto a la cuchilla. En estos microtomos la cuchilla se mantiene fija durante el proceso de corte, pero puede regularse elángulo de ataque, es decir, el ángulo de la hoja de la cuchilla respecto a la superficie de la muestra. Con el microtomo de deslizamiento se obtienen cortes mediante un movimiento de deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o viceversa. En estos microtomos el movimiento lo proporciona directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la vuelta cuando se eleva la posición del bloque, o de la cuchilla, una distancia que nos dará el grosor del corte.

Microtomo para parafina con mecanismo de deslizamiento.

Tanto el microtomo de rotación como el de deslizamiento tienen ventajas e inconvenientes. La principal ventaja del de rotación es su presición, la posibilidad de obtener secciones seriadas con facilidad y la automatización del proceso de corte mediante motores eléctricos. Los microtomos de deslizamiento son más sencillos mecánicamente y su disposición permite cortar bloques más grandes o bloques de celoidina, aunque están cayendo en deshuso.

Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de parafina antes de hacer el primer corte útil a nuestra muestra. En primer lugar hay que retallar el bloque hasta hacer una pirámide truncada. Antes de retallar hay que considerar cual de las caras laterales de esta pirámide será el frente de ataque, es decir, cual será la que primero se ponga en contacto con la cuchilla. Esta cara deberá ser más ancha que la opuesta, y ambas han de ser paralelas. Con el retallado se consigue una buena orientación de nuestra muestra en las secciones, la diferencia en el tamaño de la caras permite que cada nuevo corte arrastre sin problemas al previamente cortado y, por último, las caras paralelas hacen que se obtengan tiras rectas de cortes. Una vez retallada la pirámide, y antes de obtener secciones de nuestra muestra, es necesario un proceso de desbastado, es decir, la eliminación del espesor de parafina que hay entre la superficie del bloque y nuestra muestra.

Preparación del bloque de parafina antes de iniciar la obtención de secciones útiles.

Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antes de empezar a cortar es elángulo de ataque o inclinación de la cuchilla respeto a la superficie de corte de la pirámide. Lo normal es orientar la cuchilla con un ángulo de uno 10° respecto a la superficie de corte, aunque se puede modificar según nuestras necesidades.

Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen tiras de secciones unidas por las caras paralelas a la cuchilla. Estas tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes de su fijación definitiva en la superficie de un portaobjetos, han de estirarse para que nuestro tejido quede perfectamente extendido. Aprovechando la hidrofocidad de la parafina, las secciones se colocan sobre agua calentada a unos 35 °C a 40 °C y el calor las hace extenderse sin llegar a su punto de fusión, que está en torno a los 60 °C. El estiramiento se puede realizar en baños de agua con regulación térmica o sobre los propios portaobjetos cubiertos de agua y colocados sobre una plancha térmica regulable.

Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en tiras que serán colocadas sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40 °C. El portaobjetos ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la hidrofobicidad de la parafina hace que las secciones se estiren sobre la superficie del agua y una vez evaporada queden adheridas al portaobjetos.

La superficie del portaobjetos donde se colocan las tiras de cortes ha de estar previamente tratada para que nuestro tejido quede adherido durante el procesamiento posterior. Para ello los portaobjetos se recubren con soluciones de gelatina☆, albúmina, u

otras sustancias y se dejan secar, de manera que hacen de adhesivo entre el cristal y nuestro tejido.

Una vez que el agua se ha evaporado y están extendidas las tiras de cortes de parafina sobre el portaobjetos, se procede a un secado exahustivo en una estufa a una temperatura de entre 35 °C y 40 °C durante toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos con las secciones están listos para el procesamiento posterior.

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4 . V I B R A T O M O

Puede haber varias razones para evitar la inclusión de un tejido del que posteriormente obtener secciones. Durante los procesos de inclusión, como las inclusiones en parafina o en resinas tipo epoxy, se ha de someter a las muestras a deshidratación. Esto ocasiona a veces daño en algunas moléculas o regiones moleculares que son las que queremos detectar posteriormente con técnicas como la inmunocitoquímica. Además, para observar algunas características tisulares o celulares se requieren secciones gruesas del orden de 50 µm, a veces de 100 o 200 µm. Por ejemplo, para estudiar la organización espacial de determinadas células como las neuronas es recomendable hacer cortes de un grosor superior a las 50 µm y emplear inmunocitoquímica o histoquímica para ponerlas de manifiesto. La obtención de secciones gruesas sin necesidad de inclusión se puede conseguir de dos maneras diferentes: mediante congelación de la muestra y corte en un microtomo de congelación o mediante el uso del vibratomo.

Vista lateral de la cubeta de un vibratomo.

El vibratomo es un aparato con el que se obtienen secciones de un grosor que puede oscilar entre las 40-50 µm hasta varios centenares de µm partiendo de una muestra animal endurecida sólo mediante fijación. El mecanismo de corte consiste de una plataforma sobre la que se sitúa la muestra, que puede regularse en altura y nos permite seleccionar el grosor del corte, y de una cuchilla de borde muy afilado que se deplaza horizontalmente sobre la muestra realizando el corte. La característica del vibratomo es que la cuchilla, además de avanzar sobre la muestra, posee un movimiento de vibración lateral a modo de sierra que facilita el corte y evita arrastrar el tejido. La muestra se encuentra adherida, normalmente mediante pegamento de contacto, directamente a un bloque portamuestras que se coloca sobre la plataforma elevadora.

Pegado de la muestra al bloque portamuestras.

No todas las muestras son apropiadas para ser cortadas en un vibratomo. Así, aquellas que sean muy blandas o que posean porciones demasiado duras o elásticas son normalmente arrastradas por la cuchilla, a pesar de que disminuyamos la velocidad de avance y aumentemos la oscilación de la cuchilla. Es decir, la muestra ha de tener una cierta consistencia y no poseer elementos distorsionadores del corte.

Otra característica del vibratomo es que todo el proceso de corte se realiza bajo una solución acuosaque normalmente es una solución tamponada o una solución salina. Para ello tanto la muestra como el borde de corte de la cuchilla han de estar sumergidos y los cortes que se obtienen se denominan cortes en flotación, es decir, no sujetos a ningún soporte. Estos cortes se pueden procesar de esta manera, flotando, o adherirse a un portaobjetos y procesarlos después. Sin embargo, el proceso de secado necesario para la adhesión al portaobjetos suele conllevar alteraciones de la calidad del tejido. Así, los cortes se suelen procesar durante toda la técnica en flotación y posteriormente se montan sobre portaobjetos para su observación con el microscopio óptico.

4 . C R I O T O M O S

La congelación de los tejidos es una manera rápidade endurecerlos sin necesidad de inclusión. Esto tiene una serie de ventajas. a) La preservación molecular es máxima, lo cual es muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. b) Las muestras congeladas pueden cortarse en secciones finas, del orden de 5-15 µm, y más gruesas del orden de cientos de µm. El vibratomo permite también cortes sin incluir pero no se pueden conseguir secciones finas. c) La obtención debuenas secciones no depende del tipo de tejido (excepto tejidos mineralizados como el hueso o aquellos excesivamente cornificados). d) Por último, es posiblemente la manera más rápida de obtener secciones puesto que es posible congelar la muestra sin necesidad de fijación y cortarla de inmediato, como las biopsias. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser una congelación muy rápida, normalmente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, lo que evita la formación de cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares.

Criostato. El compartimento de color azul es la cámara refrigerada a la temperatura seleccionada. En esta cámara se encuentra la muestra, la cuchilla y es donde se recogen las secciones.

En el caso de que no se requiera un corte rápido las muestras normalmente se fijan y posteriormente se incuban en una solución anticogelante que contiene sacarosa y glicerol. Con ello se evita que durante la congelación se formen cristales de hielo grandes que puedan dañar las estructuras celulares. También se evitan daños

tisulares con una congelación muy rápida, por ejemplo, con nitrógeno líquido. Dicha congelación permite preservar incluso la ultraestructura celular y observarla al microscopio electrónico, siempre con el uso previo de anticongelantes. Para observaciones que no necesiten una preservación ultraestructural se suele realizar la congelación de la muestra a temperaturas superiores (entre -80 oC y -20 oC) que dependen del aparato empleado para realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso previo de anticongelantes.

Criostato. El mecanismo de rotación y corte del criostato se encuentra dentro de una cámara refrigerada.

Los dos aparatos más usados para realizar cortes por congelación son elmicrotomo de congelación y el criostato. El microtomo de congelación realiza cortes de decenas de µm de grosor y consiste en una plataforma que se enfría a bajas temperaturas sobre la que se coloca la muestra. Tras cada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte seleccionado. En los microtomos de congelación antiguos se producía la congelación mediante gas carbónico que había que suministrar regularmente. Actualmente se produce la congelación (de -30 a menos -40 °C) de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema de refrigeración externo al propio dispositivo de corte. Además, existe la posibilidad de congelar también la cuchilla si se desea. En los apartos actuales la muestra se congela por contacto directo con la plataforma y su temperatura es constante durante todo el tiempo de corte. Las secciones que se obtienen, de decenas a cientos de µm, se recogen con un pincel, se añaden a un recipiente con tampón de trabajo y se trabaja con ellas en flotación, igual que en el caso del vibratomo.

Criostato. Proceso mediante el que se pegan las secciones a un portaobjetos.

El criostato se utiliza para obtener secciones por congelación de 10 a 30 µm, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte se encuentra encerrado en una cámara refrigerada cuya temperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 °C. La congelación se suele hacer en una plataforma dentro de la propia cámara refrigerada que se encuentra a una temperatura inferior, en torno a -50 °C. También se puede congelar el tejido externamente con la rapidez que deseemos, por ejemplo con nitrógeno líquido, pero es conveniente colocar la muestra en la cámara del criostato hasta que consiga igualar su temperatura con la de ésta para obtener secciones homogéneas. Antes de la congelación, la muestra se encastra en un medio que es líquido a temperatura ambiente y sólido a la de corte.

Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque sólido, encastrado pero no incluido. Esto permite manipular la muestra y adherirla a un soporte portamuestras, el cual se fijará a un eje que avanza sobre la cuchilla. La preparación del bloque y el mecanismo de corte es similar al que se describió para el microtomo de rotación para parafina. Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se descongelan rápidamente en este proceso de pegado puesto que los portaobjetos están a temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para las técnicas que deseemos.

4 . U L T R A M I C R O T O M O

Para la observación con detalle de laultraestructura celular es necesario realizarsecciones muy delgadas, del orden de nanometros, denominadas ultrafinas, y observarlas con el microscopio electrónico de transmisión. Para ello se incluye la muestra en resina, generalmente de tipo epoxy, que una vez polimerzada resulta en un bloque de gran dureza. La obtención de secciones ultrafinas se lleva a cabo con un aparato denominadoultramicrotomo. Otra manera menos habitual de obtener secciones ultrafinas es mediante elultracriotomo, para lo cual la muestra se congela y se corta en una cámara refrigerada a muy bajas temperaturas. Este último es un mecanismo similar al visto para el criostato. Es un aparato que sólo se usa cuando queremos detectar con microscopía electrónica moléculas que son dañadas durante el proceso de inclusión.

El ultramicrotomo tiene un diseño de corte similar al microtomo de parafina de rotación, pero mucho más preciso y sofisticado. Quizá el sistema más delicado sea el que hace avanzar el bloque sobre la cuchilla pues debe hacerlo a intervalos de varios nanometros. Actualmente este sistema de avance es mecánico pero en los ultramicrotomos más antiguos era por calor, que producía dilatación del eje sobre el que se sujetaba la muestra. También tiene un sistema completo de orientación de la muestra sobre el borde de la cuchilla para que el plano de corte se pueda orientar perfectamente a la superficie de nuestra muestra. Al realizar cortes muy delgados cualquier vibración o cambio de temperatura afecta la homogeneidad del grosor del corte, por tanto el ultramicrotomo debe situarse en una habitación donde no haya vibraciones y mantenerla a temperatura constante para evitar dilataciones del brazo que porta la muestra, dentro de lo posible. Además, estos aparatos se colocan sobre mesas especiales para disminuir las vibraciones. Todos los ultramicrotomos actuales tienen un panel de control externo al aparato desde donde se controla electrónicamente el proceso de corte: inicio de corte,

grosor de la sección, velocidad de corte, ventana de corte, iluminación de la muestra, etcétera.

Antes de realizar el primer corte ultrafino de una muestra, al igual que ocurría con los cortes de parafina, es necesario retallar y desbastar el bloque para crear una pirámide truncada. Aunque todo este proceso se puede hacer a mano con una cuchilla, se suele utilizar un aparato denominado piramitomo que lima y crea las caras de la pirámide con un disposivo a modo de torno, además de producir el desbastado para obtener la superficie de corte. Hay que tener en cuenta que este proceso ha de ser preciso porque la superficie de corte debe ser muy pequeña, en torno a unos 0,5 mm2. Los lados de la superficie de corte deben ser similares a los descritos para el corte en inclusiones de parafina, dos lados han de ser paralelos y uno más grande que el otro. Con esto nos aseguramos que una nueva seccián empujará a la previa del borde de la cuchilla y que conseguiremos tiras rectas de secciones. Antes de hacer las secciones ultrafinas se suele hacer una sección semifina, de 0.5 o 1 µm para tener una imagen de la muestra al microscopio óptico.

Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultramicrotomo.

Las cuchillas empleadas para hacer secciones ultrafinas son específicas para este tipo de aparatos puesto que han de tener unos

filos muy agudos. Las más comúnmente usadas son de vidrioespecial y se otienen mediante unos aparatos que mediante ralladuras con puntas de diamante y golpes secos sobre barras de vidrio son capaces de producir dichas cuchillas. Sin embargo, la mejor calidad de corte se consigue con cuchillas con filo de diamante, pero son mucha más caras. Aunque los ultramicrotomos actuales tienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de corte se pueden obtener secciones de distinto grosor. El grosor de una sección ultrafina se conoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie. Este color puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro pálido (90 a 120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), púrpura (150 a 190 nm), etcétera.

5 . T I N C I Ó N

Los tejidos animales son en su gran mayoría incoloros, excepto aquellos que poseen algún tipo de pigmento como hemoglobina de la sangre o la melanina de la epidermis. En las plantas, sin embargo, existe una mayor variedad de pigmentos naturales que permiten su observación directa con el microscopio óptico, a lo que también ayuda la presencia de las paredes celulares, las cuales facilitan la delimitación celular y la discriminación entre diferentes tejidos. Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir cómo teñir los tejidos para poder desentrañar sus características morfológicas. Se observó que algunos pigmentos como el carmín o la eosina, disueltos en agua, se unían a determinados componentes de las células. La expansión de la industria textil en el siglo XIX y su necesidad de colorear las telas provocó un rápido desarrollo de los tintes o pigmentos. Muchas de estas sustancias fueron usadas como colorantes en la histología de los animales y de las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzándose un enorme desarrollo y perfeccionamiento de nuevas técnicas y moléculas sintéticas que se usan según las necesidades del investigador. Con la llegada de la biología molecular se han puesto en marcha otras técnicas mucho más sofisticadas para observar elementos celulares, entre las que se pueden destacar aquellas que usan anticuerpos, inmunocitoquímicas, las que usan sondas de ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o más sofisticadas aún como las que mediante el diseño de animales transgénicos permiten identificar y observar a las células que expresan un determinado gen, incluso en el organismos vivo, gracias a la fluorescencia de la proteína verde fluorescente (GFP).

No vamos a describir con detalle las técnicas más complejas, al menos no en estas páginas básicas, sino las más comunes, las que se

suelen emplear en un laboratorio para el estudio general de los tejidos. Dividiremos el conjunto de técnicas histológicas en cuatro categorías.

a) Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas que se unen a componentes tisulares por afinidad química.

b) Histoquímica. Son aquellas técnicas de tinción que implican la modificación química de algunas moléculas tisulares para posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes. En este apartado incluiremos también a los métodos de tinción basados en la capacidad catalítica de algunas enzimas presentes en los tejidos que queremos estudiar.

c) Lectinas. Las lectinas son dominios de proteínas, como las selectinas, que son capaces de reconocer glúcidos que forman parte de polisacáridos. Tienen una gran especificidad y se usan para determinar el tipo de glúcido que aparece en las glucoproteínas de las células o de la matriz extracelular de los diferentes tejidos.

d) Inmunocitoquímica. Son técnicas histológicas muy potentes basadas en la alta especificidad de unión de los anticuerpos a los antígenos contra los que se produjeron. Estos antígenos pueden ser cualquier molécula tisular que, purificada en inyectada en un animal, sea capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos anticuerpos añadidos a una sección de tejido reconocerán y se unirán específicamente a dicha molécula.

e) Hibridación. Son técnicas basadas en la unión complementaria de las bases de ácidos nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo, y de la guanina con al citosina). Esto hace que dos cadenas complementarias de ácidos nucleicos se unan entre sí de forma muy específica, es decir, hibriden. Siguiendo este principio se pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de ADN o ARN con una secuencia de bases determinada que llevan una molécula unida para poder detectarlas. La secuencia de bases de la sonda es complementaria a otra que está presente en la célula, normalmente en forma de ARNm. Con ello podemos observar qué células expresan un determinado gen.

5 . T I N C I O N E S G E N E R A L E S

La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas. Las tinciones generales están basadas

en el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades electro-químicas. Se utilizan normalmente para teñir a las células y componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio óptico y por ello se realizan habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las más utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato. Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son moléculas que poseen tres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromóforo, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se denomina cromógeno.

Según la naturaleza química del cromóforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinónicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, derivados del xanteno y derivados de las talocianinas.

Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:

Básicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora. Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glicosaminoglicanos. Así, ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, así como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes ácidos. Ejemplos de colorantes básicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina

Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.

Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teñir tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.

Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera específica y para ello usamos colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tinción denominada azán contiene azocarmín y naranja-anilina-ácido acético que tiñe los núcleos de rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teñido de azul. Otra tinción combinada es el tricrómio de Mallory que tiñe el colágeno de verde, las células musculares de rojo.

Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solución se dice que ha ocurrido un fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorción de la luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vuelve púrpura cuando se une a ciertos gránulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color que en solución se denomina ortocromasia.

Tinción general. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante básico y otro ácido para teñir de diferente color a las estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, y la hidratación puesto que estos colorantes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).

Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado permite eliminar el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del

agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.

Tinción de semifinos. Cuando se procesa material para microscopía electrónica es necesario, a veces, hacerse una idea de qué zona del tejido vamos a cortar. Téngase en cuenta que el área de una sección para observar con el microscopio electrónico es muy pequeña. Además, el proceso de osmificación que ha de llevarse a cabo previamente a la inclusión acarrea el oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta aún más la orientación de la muestra. Por ello es frecuente hacer secciones de 0.5 a 1 µm de grosor con el ultramicrotomo para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener áreas más grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtención de las secciones ultrafinas. El colorante usado para teñir secciones semifinas es normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido.

Sección semifina de un glomérulo de un riñón obtenida a partir de una inclusión en resina y teñida con azul de toluidina.

Proceso de tinción de una sección semifina. La porosidad de la resina, el calor y las propiedades del colorante (azul de tolouidina) hacen que se pueda teñir el tejido sin necesidad de eliminar previamente la resina .

Contraste de ultrafinos. El contraste no es una tinción, puesto que no aporta color a la muestra, pero sí es un proceso habitual para poder observar los componentes ultraestructurales de la célula. Por ese motivo lo incluimos en este apartado. Aunque las secciones para microscopía electrónica se pueden observar directamente con el microscopio electrónico se suelen tratar previamente con metales pesados en un proceso denominado contraste, obteniendo así una

imagen óptima de la ultraestructura celular. Téngase en cuenta que en la microscopía electrónica lo importante no es añadir sustancias coloreadas sino moléculas que puedan interferir con el camino de los electrones emitidos por el microscopio y que chocan contra la muestra. Los electrones que logran atravesar la muestra inciden sobre una pantalla fosforescente que emitirá destellos de luz cuando reciban el impacto de un electrón y permite observar las características del tejido. Los metales pesados unidos al tejido impedirán que pasen los electrones y por tanto se verá una zona negra en la pantalla fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la célula donde no estén estos metales provocarán áreas luminosas en dicha pantalla. Por ello todas las imágenes originales de microscopía electrónica son en blanco y negro, aunque se puedan colorear posteriormente con un ordenador.

Proceso de contraste de secciones ultrafinas. Los tiempos de incubación en citrato de plomo y acetato de uranilo son aproximativos. Las lentejas de hidróxido sódico eliminan humedad del aire y dificultan la pricipitación del citrato de plomo. Los lavados en agua se llevan a cabo sumergiendo repetidas veces (en inglés, "deeping") la rejilla en el agua durante un tiempo de aproximadamente 30 segundos en cada pocillo con agua destilada.

Corte y recogida de secciones en una rejilla.

Las secciones ultrafinas recién obtenidos quedan flotando sobre una balsa de agua que posee la propia cuchilla y no se recojen sobre portaobjetos sino directamente sobre soportes de níquel o cobre denominados rejillas. Son discos circulares con un enrejado de hilos que dejan cavidades, las cuales son de distino tamaño según el tipo de rejilla, normalmente desde 100 a varios cientos de µm cuadradas. Estas rejillas tienen la ventaja de que permiten una gran nitidez de las imágenes del tejido que ofrece el microscopio electrónico puesto que los electrones sólo atraviesan la sección antes de incidir sobre la pantalla de visualización. Sin embargo, presentan el problema de que la porción de sección que caiga sobre el hilo de la rejilla quedará oculto. Por ello existen las "rejillas" de ojal, que tienen una sola cavidad y suficientemente grande como para que quepa un corte entero. Obviamente es necesario suministrar un soporte para que la sección no se cuele por la cavidad. Este soporte es normalmente una membrana muy fina hecha de una sustancia denominada formvar, la cual deja pasar los electrones y sostiene a las secciones.

5 . H I S T O Q U Í M I C A

Incluiremos dentro de las técnicas histoquímicas a aquellas que supongan una reacción química en la que intervienen moléculas pertenecientes al propio tejido (trataremos la detección de glúcidos mediante lectinas y la inmunohistoquímica en apartados diferentes a

éste, aunque algunos autores las incluyen como ténicas histoquímicas). El objetivo de la histoquímica es poner de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular "in situ". Estas moléculas son difícilmente discernibles con colorantes generales. Durante el procesamiento del tejido previo a la reacción histoquímica, como la fijación o la inclusión, hay queevitar dañar a la molécula que queremos detectar porque de otra manera resultaría en falsos negativos, es decir, no tener tinción cuando en realidad la molécula de interés sí está presente en el tejido, aunque deteriorada. En algunas ocasiones es necesario realizar pasos previos a la reacción histoquímica para descubrir la molécula que queremos detectar, por ejemplo usando un fijador adecuado, ya que de otra manera no reaccionaría con los reactivos químicos. Vamos a dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos: reacciones químicas e histoquímica enzimática.

Las reacciones químicas consisten en la modificación química de moléculas del tejido para posteriormente poder colorearlas. Existen técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y nucleótidos. La técnica histoquímica más empleada es la reacción de PAS (Periodic Acid Schiff). Se utiliza para la detección de hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando están en cantidades relativamente grandes en los tejidos. La modificación química del tejido consiste en la oxidación mediante el ácido periódico de los enlaces entre los carbonos próximos que contienen grupos hidroxilos. Esto provoca la formación de grupos aldehídos que serán reconocidos por el reactivo de Schiff, el cual se combinará con ellos para dar un color rojizo brillante. Entre los componentes del reactivo de Schiff está la pararosanilina (un componente de la fucsina básica) tratada con ácido sulfúrico. Una gran ventaja de la tinción histoquímica PAS es su capacidad de discriminación de tipos de glúcidos con pequeñas modificaciones de la técnica.

Tinción con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de la derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las células caliciformes teñidas de rosado con la ténica de PAS por su alto contenido en mucopolisacáridos, mientras que en una tición general aparecen transparentes, sin teñir.

Pasos de la tinción histoquímica PAS-Hemtaoxilina sobre cortes de parafina. Los pasos con letras en color verde son los específicos para esta tinción.

La histoquímica enzimática o histoenzimología se basa en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijación. Estos enzimas y las células que los poseen se ponen de manifiesto mediante una reacción enzimática que convierte a unos sustratos solubles e

incoloros en productos insolubles y coloreados. Los sustratos son específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar preciso donde se produjo la reacción, es decir, donde se localiza el enzima. Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etcétera. Hay que tener en cuenta que cuando queremos detectar una actividad enzimática es recomendable no incluir el material en medios como la parafina puesto que la deshidratación y la temperatura elevada pueden dañar la conformación de la enzima y por tanto la actividad de su centro activo. Por ello estas técnicas se realizan normalmente en secciones obtenidas por congelación o con el vibratomo.

La actividad NADPH diaforasa se asocia a la enzimas sintasas del óxido nítrico en sistema nervioso y vascular. A estos enzimas se les ha relacionado con el control del flujo sanguíneo y con ciertos aspectos de la fisiología del sistema nervioso. Esta técnica permite detectar neuronas que expresan la enzima sintasa del óxido nítrico de una forma sencilla y rápida. La reacción es NADPH + tetrazolio = NADP+ + formazán. Es el formazán el producto coloreado e insoluble que se puede observar con el microscopio óptico, incluso con el electrónico.

Imagen de un corte de 60 µm de grosor de cerebro obtenida con un criostato y procesada para histoquímica enzimática que pone de manifiesto una actividad diaforasa perteneciente a la enzima óxido nítrico sintasa neuronal que aparece en algunas neuronas (células con un color azul intenso).

Los pasos para la detección histoquímica de la actividad diaforasa es muy sencilla. Tras una fijación, preferentemente por perfusión, hay que permeabilizar el tejido con un disolvente de lípidos como el Triton-X100. El revelado se produce a 37 oC y el final de la reacción se controla mediante observaciones periódicas. La concentración de los sustratos (NADPH y azul de tetrazolio) varía según el tejido o el proceso de fijación.

5 . L E C T I N A S

Aparte de las técnicas de tinción generales y las histoquímicas, más específicas, existen otras que se usan para detectar moléculas tisulares con una alta especificidad. Ello es posible gracias a la capacidad que tienen ciertas moléculas como las lectinas o las inmunoglobulinas para reconocer y unirse sólo a una molécula determinada presente en el tejido. En esta página vamos a tratar sobre el uso de las lectinas para la detección en los tejidos dedistintos tipos de glúcidos de manera específica. En muchos textos la técnica de las lectinas se incluye dentro del apartado de la histoquímica.

Las lectinas son proteínas que tienen dominios o secuencias de aminoácidos que son capaces de reconocer y unirse a glúcidos terminales que forman parte de cadenas de oligosacáridos, bien libres o formando parte de otras moléculas como las glicoproteínas. Por ello se dice que las lectinas reconocen glicoconjugados. Las lectinas están ampliamente distribuidas en los tejidos animales y vegetales y sus funciones son muy variadas. Por ejemplo, la salida de los linfocitos desde el torrente sanguíneo hacia los tejidos dañados se produce

gracias a la acción de unas lectinas denominadas selectinas que expresan las células endoteliales próximas al lugar de la lesión. Es decir, el linfocito puede salir por la pared endotelial gracias a la unión de las selectinas endoteliales a los glúcidos de la membrana del linfocito. En el laboratorio de histología las lectinas se usan, sin embargo, para estudiar la distribución tisular de distintos tipos de azúcares de manera específica. Se pueden usar diferentes tipos de lectinas en base a su especificidad de reconocimiento de azúcares determinados. Hay al menos cinco grupos de lectinassegún se unan a manosa (Man), a galactosa/n-acetilgalactosamina (Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc), a fucosa (Fuc) o a ácido siálico (Neu5Ac), respectivamente.

Comercialmente hay disponibles docenas de lectinas diferentes que se nombran según el organismo animal o la planta de la que se obtienen. En el siguiente cuadro se listan las lectinas usadas comúnmente según el glúcido que reconocen.

CarbohidratoNombre científico

Acrónimo Carbohidrato específico

Glucosa / Manosa

Galanthus nivalisCanavalia ensiformisLens culinarisPisum sativum

GNACon-ALCAPEA

Manα1,3Man > Manα1,6Man > Manα1.2Man αMan > αGlc > GlcNAc αMan > αGlc > GlcNAc αMan > αGlc > GlcNAc

N-Acetilglucosamina

Griffonia simplicifolia Datura stramonium Tritricum vulgare

GSA-IIDSAWGA

Terminal α,βGlcNAc, glucógenoGalβ1,4GlcNAc(N-acetillactosamina) > GlcNAcGlcNAc(β1,4GlcNAc)1-2 > β1,4GlcNAc1NeuAc

N-Acetilgalactosamina / galactosa

Dolichus biflorusHelix pomatiaArachis hypogaeaRicinus

DBAHPAPNARCA-I

GalNAcα1,3GalNAc > αGalNAcGalNAcα1,3GalNAc > αGalNAcTerminal Galβbe1,3GalNAc

communisTerminal βGal > αGal > GalNAc

L-Fucosa

Aleuria aurantiaLotus tetragonolobus

Ulex europaeus

AAALTA

UEA-I

αL-FucαL-Fuc > αL-Fuc1,2Galβ1,4GlcNAc > L-Fucα1,2Galβ1,3GlcNAcαL-Fuc

Ácido siálico

Maackia amurensisSambucus nigra

MAASNA

NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcNeuAcα2,6Gal = NeuAcβ2,6GalNAc

Tabla con las lectinas más usadas en la que se muestra el carbohidrato o carbohidratos que se detectan, las especies de donde se obtienen las lectinas que reconocen a dichos carbohidratos, el acrónimo de las lectinas y los tipos de enlaces que se reconocen específicamente por cada lectina. El símbolo > significa afinidad creciente hacia su izquierda, lo que indica que una lectina puede reconocer a un carbohidrato específico enlazado de diferentes formas con otras moléculas, pero con diferente afinidad.

Para poder observar el lugar de unión específica entre la lectina y su glúcido tenemos que unir a la lectina un marcador que nos produzca una señal visible con el microscopio óptico o electrónico de transmisión. Normalmente el marcaje consiste en la unión de una enzima como la peroxidasa de rábano o la fosfatasa alcalina. Es el resultado de la reacción enzimática lo que se puede observar. También se usa como marcador una molécula fluorescente que se puede observar directamente en el tejido con un microscopio de fluorescencia. Cuando la enzima o la molécula fluorescente están directamente unidas a la lectina se denomina método de detección directa y cuando se unen a la lectina mediante una molécula interpuesta se denomina detección indirecta. Las moléculas interpuestas más comunes son la biotina o anticuerpos específicos (inmunoglobulinas tipo G) obtenidos contra la lectina.

Detección de lectinas mediante métodos indirectos en cortes adyacentes de epitelio del pie de Haliotis tuberculata (oreja de mar, invertebrado prosobranquio). La imagen de la izquierda muestra la detección de glucosamina mediante la lectina WGA biotinilada y su posterior revelado de la peroxidasa unida a avidina (color marrón). En la imagen de la derecha se muestra la detección de fucosa mediante la lectina AAA unida a digoxigenina. Mediante un anticuerpo contra la digoxigenina unido a fosfatasa alcalina se pone de manifiesto la localización de la fucosa (color azul).

Pasos para la detección de glúcidos con lectinas. Los tiempos pueden variar según el material o la lectina usada. En este ejemplo se usa un método de detección indirecta puesto que la lectina lleva unida una proteína intermendiaria que es la biotina, la cual será reconocida por la

avidina del complejo ABC ("avidin-biotin-complex") que contiene moléculas de la enzima peroxidasa. Es la reacción de este enzima tras añadir los sustratos apropiados, diaminobencidina más peróxido de hidrógeno, la que produce productos insolubles y visibles con el microscopio óptico. El paso de BSA (albúmina de suero bovino) sirve para saturar posibles sitios de unión inespecíficos de la lectina. Si en vez de cortes en parafina hubiésemos usado cortes de vibratomo podrímos procesar, tras la reacción de la peroxidasa, dichos cortes para observar el producto de reacción con el microscopio óptico y también con el electrónico de transmisión.

La técnica con lectinas se suele complementar con una serie de tratamientos que sirven para obtener más información acerca de la composición sacarídica de los glicoconjugados. Por ejemplo, la desulfatación se usa para demostrar las uniones tipo ésteres de sulfato de las cadenas terminales y la eliminación tipo beta permite conocer si las cadenas sacarídicas son uniones con enlaces tipo O (uniones covalentemente a grupos hidroxilo) o tipo N (enlaces convalentes a grupos amino). En este último caso la alcalinización de los cortes elimina las uniones tipo O

5 . I N M U N O C I T O Q U Í M I C A

La inmunocitoquímica es una técnica para la localización de moléculas en los tejidos mediante el empleo deanticuerpos. Es una técnica que gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la estandarización de su protocolo se ha convertido en un método sencillo, rápido y muy potente. Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las técnicas inmunocitoquímicas son del tipo G, producidas por unas células del sistema inmunitario denominados linfocitos B durante la respuesta inmune. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le inyectamos una molécula, en este caso nuestra molécula problema, que reconoce como extraña. Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual se purifican. Éstos se usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica. Las moléculas complejas como la proteínas tienen en su estructura varios determinantes antigénicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que cada determinante antigénico activará un

clon, línea de linfocitos B, que producirá anticuerpos contra él. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B activados por la molécula inyectada irán a parar al suero. Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando anticuerpos policlonales. Existe una técnica que perimite aislar y cultivar en el laboratorio (in vitro) de forma inividualizada a cada uno de los clones de linfocitos B activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producirá un solo tipo de inmunoglobulina G que reconocerá sólo a uno de los determinantes antigénicos de la molécula inyectada. A estos anticuerpos se les denomina monoclonales ya que proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas.

Esquema resumido de las diferencias en la obtención de anticuerpos policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha).

Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos dominos: la fracción cristalizable y la variable. El dominio variable es el que se encarga de reconocer al determinante antigénico de nuestra molécula. Hay dos sitios de unión por lo que cada inmunoglubulina podría reconocer a dos moléculas o determinantes antigénicos, que han de ser iguales. La fracción cristalizable tiene una estructura

similar para todas las inmunoglubulinas G producidas por los individuos de una misma especie.

Para que un anticuerpo se una a su determinante antigénico localizado en una molécula, ésta no debe alterarse. De otro modo ese determinante antigénico no será reconocido por el anticuerpo. Por ello el proceso defijación del tejido debe elegirse para preservar al máximo a la molécula que queremos detectar. Así, se usan diferentes fijadores según el tipo de molécula en la que estemos interados. También es necesario considerar el método de obtención de los cortes. Inclusiones en parafina pueden dañar las moléculas por lo que en la mayoría de los casos se suele trabajar con cortes de vibratomo o con secciones obtenidas por congelación.

Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molécula que queramos detectar, no son visibles con el microscopio por lo que la tendremos que conjugar (unirla) a otras moléculas que nos den una señal visible. Estas moléculas que aportan visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos tipos: moléculas fluorescentes y enzimas. Las primeras se pueden observar con el microscopio de fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir determinados sustratos solubles en productos insolubles y coloreados. La señal aparece allí donde está la sustancia fluorescente o el enzima, que es donde se ha unido la inmunoglubulina.

El método del marcado con sustancias fluorescentes tiene una serie de ventajas que veremos más adelante, pero tiene la desventaje de que no son marcajes permanentes puesto que la luz emitida por la molécula fluorescente se desvanece con el tiempo. Sin embargo, las secciones procesadas con anticuerpos unidos a enzimas pueden deshidratarse, montarse y mantenerse permanentemente para su obeservación. Las enzimas habituales que se unen a las inmunoglobulinas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.

Métodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios unidos específicamente a una molécula del tejido.

La conjugación directa de un marcador (enzima o fluorescente) con la inmunoglobulina se denomina método de detección directa. Hoy en día se suele emplear el método de detección indirecta, que consiste en colocar una serie de intermediarios entre la inmunoglobulina y la molécula marcadora. Inicialmente se usó el método indirecto denominado peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver figura anterior), pero actualmente es más frecuente usar el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figura anterior). El método indirecto permite una mayor versatilidad de la técnica y mayor intensidad de señal frente a una misma cantidad de antígeno.

La inmunofluorescencia se basa en las propiedades de los fluorocromos. Son moléculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda. Aunque la

inmunofluorescencia se puede usar para detectar a una sola molécula tisular, su verdadero potencial se muestra cuando necesitamos una múltiple inmunodetección, es decir, dos o más moléculas presentes en una misma célula o matriz extracelular de forma simultánea. Esto es posible porque existe una gran variedad de fluorocromos que son capaces de emitir luz visible tras ser excitados con diferentes longitudes de onda, luego seleccionando el intervalo de longitudes onda con el que iluminamos un tejido podemos excitar de modo individual, y secuencial, varios fluorocromos que hayamos usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes, para detectar moléculas diferentes. Tomando fotografías tras cada excitación y superponiendo dichas imágenes podemos averiguar si las moléculas se expresan, por ejemplo, en la misma célula.

Detección de la molécula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoquímica usando un anticuerpo primario sin marcar, un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el complejo avidia-biotina-peroxidasa.

Inmunocitoquímica con detección indirecta y enzimática. La sección se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante después se incuban en una solución de bloqueo que satura los posibles sitios de unión inespecífica, gracias a una alta concentración de proteína como la albúmina de suero bovino. Tras cada paso de unión de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solución tamponada de fosfato (tampón fosfato), en la que también van disueltos los anticuerpos. La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el peróxido de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio ótico.

Detección con inmunofluorescencia de dos antígenos en una sección de tejido nervioso: la molécula calbindina (a la izquierda) y parvoalbúmina (a la derecha), usando fluoresceína y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante un método de marcaje indirecto. Se pueden observar cuerpos celulares y prolongaciones nerviosas. Las flechas blancas indican células que poseen ambas proteínas (calbindina y parvoalbúmina) mientras que la flechas azules indican cuerpos celulares que sólo expresan parvoalbúmina. Obsérvense las zonas oscuras, negativas, en la imagen de la izquierda.

Detección simultánea de dos moléculas situadas en misma sección mediante inmunofluorescencia. La razón de que los dos anticuerpos

primarios procedan de dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro animal, normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de ratón y conejo, respectivamente, es lo que permite a cada anticuerpo secundario reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.

5 . H I B R I D A C I Ó N   i n s i t u

No se puede considerar a la hibridación in situ como una técnica de uso general. Sin embargo, aporta una información sobre la fisiología de las células y los tejidos que no es posible obtener con otras técnicas. La hibridaciónin situ se usa ampliamente en investigación en desarrollo embrionario, diferenciación de células madre, manipulaciones genéticas o cambios en la fisiología celular frente a señales externas, entre otras. Permite descubrir la expresión de un gen mediante la detección de su transcrito procesado, el ARN mensajero. Podemos descubrir qué células expresan un gen determinado y cuándo lo expresan. La expresión génica es un testimonio directo de la funcionalidad celular. Existe otra aplicación de la hibridación in situ y consiste en la localización física de un gen sobre un cromosoma.

La hibridación in situ se basa en la complementariedad de bases de nucleótidos. Del mismo modo que en la inmunocitoquímica se usan los anticuerpos, en la hibridación in situ se usa una secuencia de nucleótidos, denominada sonda, que es complementaria a la secuencia del ARN mensajero que queremos detectar y que está conjugada con una molécula que luego pondremos de manifiesto y que nos sirve de marcador.

Quizá una de las razones por las que la hibridación in situ no es común todavía en los laboratorios de histología es porque sintetizar una sonda es complicado y generalmente no se puede usar en una especie animal o vegetal distinta a aquella para la que se ha producido dicha sonda. Ello es porque un mismo gen (ARN mensajero) en dos especies distintas tienen secuencias que no son idénticas y por tanto hay que fabricar una sonda para cada especie. Sin embargo, una vez obtenida la sonda el proceso de hibridación es sencillo.

Para obtner una sonda de un ARNm deseado lo primero que tenemos que hacer es conocer la secuencia de bases de dicho ARNm. Si esa esa secuencia está publicada en las bases de datos en Internet todo el proceso se simplifica enormente puesto que hoy en día se

pueden pedir comercialmente la síntesis de forma química de secuencias largas de ARN (hasta 1000 nucleótidos es común). Incluso, se pueden comprar las sondas ya marcadas, con lo que nos ahorramos una gran cantidad de tiempo en el laboratorio.

Sin embargo, en muchos casos no conocemos la secuencia de bases del gen deseado por lo que hay que averiguarlo primero para obtener posteriormente la sonda. Para obtener una sonda hay primero que clonar la secuencia de bases del gen (ARN mensajero) que queremos detectar. Clonar implica realizar una serie de pasos: 1) Una vez purificado el ARN de nuestro tejido, los ARN mensajeros se retrotranscriben (transcripción inversa), es decir, se hacen copias complementarias de ADN de todos los fragmentos de ARN mensajero. Se obtienen hebras de ADN denominadas cDNA. 2) Mediante la técnica de PCR ("polymerase chain reaction") se consiguen multitud de copias de manera específica de la secuencia de ARN mensajero que queremos estudiar. 3) Dichas copias se integran en unplásmido y posteriormente se introduce en bacterias. 4) Se cultivan las bacterias para que proliferen y así también conseguir gran cantidad de plásmidos, que se duplican en cada división bacteriana. 5) Los plásmidos se extraen y purifican. 6) Mediante un proceso de transcripción similar al que ocurre en el núcleo de las células, a partir de estos plásmidos se consiguen numerosas réplicas complementarias a nuestra secuencia inserta, que será también complementaria a la secuencia del ARN mensajero que queremos detectar. El resultado de la transcripción realizada repetidas veces es un gran número de cadenas de ARN denominadas sondas. Durante su síntesis es cuando se añaden los nucleótidos conjugados con las moléculas marcadoras que nos servirán para detectarla una vez la hibridación se haya producido. Normalmente son moléculas pequeñas como la digoxigenina y la biotina, aunque también se pueden utilizar moléculas fluorescentes, que se unen a los nucleótidos que formarán parte de la sonda.

Esquema resumido del proceso de hibridación in situ. NBT (nitro blue tetrazolium) y el BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato, sal de toluidina) son los sustratos de la fosfatasa alcalina.

Imagen que muestra neuronas (de color azul) que expresan el receptor D1 para la dopamina en el cerebro basal de una lamprea.

Esquema del proceso de hibridación in situ sobre secciones de criostato.

La hibridación in situ se puede combinar con otras técnicas como la inmunocitoquímica o tinciones generales

6 . O B S E R V A C I Ó N

El último paso de todo proceso histológico es la observación del resultado producido por la técnica realizada. El poder de resolución del ojo humano es de 0.2 mm (poder de resolución: distancia mínima a la que se discriminan dos puntos), mientras que una célula eucariota típica suele tener unas dimensiones que oscilan entre 10 y 50 micrómetros (µm. 1 µm=10-6 mm). Además, si queremos estudiar la ultraestructura celular hay que tener en cuenta que el grosor de una membrana celular es de unos 7 nanometros. Todo ello implica que necesitamos aparatos que nos permitan aumentar al imagen de las muestras para discriminar estructuras tisulares diminutas como son las células o sus compartimentos. Estos aparatos se llaman microscopios.

Hay dos tipos de microscopios: los ópticos y los electrónicos.

Los microscopios ópticos, o de campo claro, ultilizan la luz visible y lentes de cristal que permiten un aumento de las muestras de unas 1000 veces, con un poder de resolución de unos 0,2 micrómetros. Esto es la máxima resolución que permite la luz visible, por sus propiedades de onda. Se usan para observaciones generales, características celulares y tisulares, y están presentes en todos los laboratorios de histología.

Los microscopios electrónicos se basan en la alta frecuencia de los electrones para conseguir un poder de resolución de 1 nanometro. Se usan para observar la ultraestructura de la célula y los tejidos, es decir, para estudiar el nivel subcelular, como orgánulos, membranas u organizaciones moleculares (por ejemplo, se pueden observar los ribosomas). Hay dos tipos de microscopios electrónicos: los de transmisión, que se usan para estudiar la ultraestructura de la celula en secciones muy finas, y el de barrido, que permite estudiar superficies.

A los microscopios, sobre todo los ópticos, se les pueden añadir dispositivos que permiten ampliar su potencialidad. Por ejemplo, al microscopio óptico se le puede adaptar una fuente luminosa y una serie de filtros para observar moléculas fluorescentes, o filtros para destacar cambios de densidad en el tejido, etcétera. A las diferentes formas de utilizar los microscopios para la observación de características de los tejidos se les llamamicroscopía. Así podemos hablar de microscopía óptica de contraste de fase, de fluorescencia, electrónica, etcétera.

6 . M I C R O S C O P I O Ó P T I C O El microscopio óptico es un elemento esencial para los estudios generales de

histología puesto que es el que nos permite observar las diferentes características morfológicas de las células y los tejidos. Se basa en el uso de lentes para aumentar los rayos de luz que atraviesan una muestra de tejido. Su invención se remonta al siglo XVII. Desde entonces se ha ido perfeccionando hasta llegar a los modernos microscopios. Durante estos siglos, el mayor avance en cuanto a perfección y calidad se ha producido en su principal elemento, las lentes, las cuales aumentan la imagen de las secciones de tejido y permiten hacer visibles al ojo humano detalles nítidos que de otra manera sería imposible observar.

Los microscopios ópticos tienen un límite máximo de resolución de 0,2 µm. El poder de resolución es la distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos. Este límite viene determinado por la longitud de onda de la fuente de iluminación, en este caso la luz visible.

Contiene normalmente dos sistemas de lentes: el objetivo y el ocular. El primero recoge la luz que atraviesa la sección de tejido, mientras que el ocular es el que proyecta la imagen sobre la retina. El aumento total que permite un microscopio óptico se calcula multiplicando la magnificación que produce el objetivo por la que produce el ocular. Por ejemplo, si estamos usando un objetivo de 40x (aumenta 40 veces) y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el resultado final sera de 400x, es decir, vemos la muestra aumentada 400 veces. Usando microscopios ópticos avanzados se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100x junto con oculares de 10x o 15x). Algunos microscopios ópticos tienen lentes internas que producen aumentos adicionales que tendremos que tener en cuenta para calcular la magnificación de la imagen que se observa. No debemos confundir los aumentos con el poder de resolución. Por más que consigamos aumentar una imagen tomada de un microscopio, incluso con metodología digital, no se puede aumentar la resolución de la imagen.

PARTES del MICROSCOPIO

Un microscopio óptico básico está formado por las siguientes partes:

Oculares. Son las lentes que forman la imagen que observaremos con nuestros ojos. Todos los microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo. Por eso a los microscopios actuales se les llama binoculares. Los primeros microscopios eran monoculares, es decir, poseían un solo ocular. Hay que tener en cuenta que en los

microscopios más avanzados tanto el objetivo como el ocular suelen estar compuestos por varias lentes. En los microscopios más básicos al menos uno de los oculares puede regularse, que consiste alejarse o acercarse al objetivo, permitiendo ajustar el enfoque a las condiciones de visión, dioptrías, de cada observador.

Partes de un microscopio simple.

Objetivos. Los objetivos son las lentes quereciben la imagen directamente de la sección histológica y quizá sean los elementos más importantes del microscopio. Hoy en día los microscopios ópticos poseen un tambor o revólver donde se encuentran varios objetivos. Cada uno de ellos posee lentes que permiten diferentes aumentos. Las magnificaciones de los objetivos más usados suelen ser de 10x, 20x, 40x y 100x. Rotando el revólver se puede seleccionar el objetivo y por tanto el aumento al que queremos observar la preparación. Aparte de los aumentos, los objetivos tienen una serie de características para mejorar la imagen. Así, pueden ser acromáticos, de fluorita o apocromáticos, los cuales corrigen alteraciones cromáticas, de campo plano que eliminan la curvatura del campo de observación, etcétera.

Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x) es necesario emplear un líquido denominado aceite de inmersión , que se añade entre el objetivo y la muestra. Esto es debido a que la refracción de la luz es alta en el aire y provoca alteraciones en la imagen que se ponen de manifiesto con objetivos con esta capacidad de aumento. El aceite de inmersión reduce enormente esta refracción permitiendo imágenes mucho más nítidas.

Imágenes resultantes del uso de objetivos con diferentes aumentos (especificados en las imágenes) al observar un epitelio estratificado plano queratinizado.

Platina. Es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con nuestro tejido. Posee un dispositivo para sujetar al portaobjetos, el cual se puede desplazar en el plano de la platina, movimiento controlado manualmente.

Condensador. Es un dispositivo con una lente que concentra y focaliza la luz proveniente de la fuente sobre la sección de tejido.

Diafragma. Se sitúa entre la fuente luminosa y el condensador. Permite aumentar el contraste de la muestra y la profundidad de campo, es decir, el espesor de la muestra que está enfocado.

Lámpara luminosa. Es la que proporciona la luz que atraviesa la sección de tejido. Incialmente se usaba la luz natural, la cual se podía concentrar en la sección de tejido mediante espejos cóncavos. Actualmente se usa una lámpara cuyo haz de luz atraviesa el diafragma, el condensador, la muestra, y tras ello penetra por el objetivo y atraviesa los oculares hasta nuestros ojos. La intensidad de la fuente luminosa se puede regular mediante un reostato.

Macrométrico y micrométrico. El enfoque de la muestra se consigue variando la distancia de la muestra a la lente del objetivo. Esta distancia depende de los aumentos que produzca el objetivo, mayor cuando menores aumentos produzca, y del tipo de objetivo. Esto se controla mediante dos ruedas denominadas macrométrico y micrométrico, respectivamente. La primera permite movimientos ascendentes y descendentes amplios de la platina y la segunda ajustes finos.

Recorrido de la luz desde la fuente, a través de los diferentes lentes de un microscopio básico, hasta el observador.

MODIFICACIONES

Contraste de fase. Esta modificación del microscopio de campo claro necesita de objetivos especiales y se basa en ligero un retraso que sufre la luz cuando pasa por las estructuras tisulares en función de la densidad. De esta manera se consiguen diferentes luminosidades para distintas estructuras tisulares. Se emplea para ver muestras sin teñir o acuosas, así como células vivas, por ejemplo en cultivos celulares.

Campo oscuro. La observación en campo oscuro es un buen sustituto del contraste de fase para observar especímenes sin teñir o medios acuosos. Consiste en la incorporación de un objeto opaco bajo el condensador, entre la fuente luminosa y la sección de tejido. Este objeto sólo deja pasar la luz más lateral que incidirá sobre la muestra de forma oblicua y sólo aquella luz que sea reflejada por la muestra llegará a los objetivos. Allí donde no haya tejido aparecerá obscuro y distintas densidades o propiedades del tejido reflejarán diferente cantidad de luz.

Contraste de interferencia y Nomarski. Este tipo de microscopía aparece sólo en los microscopios más avanzados y suponen tener objetivos especiales. Estos métodos dan a los tejidos un aspecto tridimensional, es decir, aumentan la profundidad de campo (espesor de tejido que está simultánemente enfocado, es decir, que se ve nítidamente). Se basa en el uso de filtros que polarizan la luz, lo cual consiste en dejar pasar sólo a la ondas electromagnéticas que vibran en un determinado plano. Posteriormente pasan por un prisma que reagrupa esta luz en elementos separados por una distancia que es similar al poder de resolución del objetivo que se está usando. Existe un prisma para cada objetivo. Entonces la luz pasa por el muestra y las diferencias de densidad del tejido, como los bordes de las células o densidades del interior celular o matriz extracelular, provocarán alteraciones en la luz que se dirige hacia los objetivos, los cuales

transformarán esas diferencias en cambios en la luminosidad. Todavía existe una lente adicional entre el objetivo y los oculares que permiten modular la luminosidad aún más.

FLUORESCENCIA

El microscopio de fluorescencia se usa para observar sustancias fluorescentes denominadas fluoróforos. Una molécula fluorescente es aquella que es capaz de captar radiación electromagnética con una longitud de onda determinada y emitir otra radiación electromagnética con otra longitud de onda diferente, normalmente dentro del espectro de la luz visible. Los fluoróforos se utilizan como marcadores para la detección de otras moléculas tisulares, normalmente mediante la técnica de inmunofluorescencia. Los usados en microscopía absorven en el rango de la luz ultravioleta, normalmente producida por una lámpara de mercurio, y emiten en el rango de la luz visible. Para seleccionar el rango de longitud de onda con que serán iluminados se utilizan filtros específicos localizados entre la fuente y la muestra que sólo dejan pasar un determinado rango de frecuencias. Con un tambor de filtros se consigue iluminar la muestra con diferentes rangos de ondas electromagnéticas y por tanto activar selectivamente a diferentes fluoróforos.

La microscopía de fluorescencia nos permite usar más de un fluoróforo para detectar varias moléculas tisulares de forma simultánea siempre que el espectro de absorción y emisión de estos fluoróforos no se solape, puesto que entonces sería imposible discriminarlos.

Imágenes de fluorescencia. A la izquierda, inmunocitoquímica para el neuropétido Y en cerebro de rata, utilizando el fluoróforo Texas-Red. A la derecha, motoneuronas en cerebro de lamprea marcadas con el

trazador neuronal fluoresceína que es en sí mismo un fluoróforo. Cada uno de los fluoróforos se ha estimulado con frecuencias diferentes y lo que se observa es la emisión en el espectro de la luz visible de cada uno de ellos, rojo y verde, respectivamente.

Una aplicación más avanzada de la fluorescencia se da en los microscopios confocales, los cuales permiten eliminar la luz difusa procedente de fluoróforos que están en el tejido fuera del plano de enfoque. Esta luz difusa, que aparece en los microscopios de fluorescencia convencionales, provoca una difuminación y pérdida de nitidez de la imagen. Por tanto, con el microscopio confocal se consiguen imágenes mucho más nítidas y mediante la digitalización y solapamiento de planos de foco sucesivos se pueden conseguir imágenes tridimensionales.

6 . M I C R O S C O P I O E L E C T R Ó N I C O

Cuando se quieren observar estructuras celulares que están por debajo del límite de resolución del microscopio óptico, como orgánulos, membranas, estructuras citosólicas, complejos moleculares de la matriz extracelular o virus, se recurre al microscopio electrónico. Se inventó en la primera mitad del siglo XX y su aplicación a la histología desveló las estructuras celulares más pequeñas denominadas en su conjuntoultraestructura celular. Por tanto, observar ultraestructuralmente a la célula significa observarla con el microscopio electrónico. Este tipo de microscopio tiene un límite de resolución más pequeño que 1 nanometro gracias a que nousan la radiación electromagnética de la luz visible sino la alta frecuencia de un haz de electrones que incide sobre la muestra, y permite aumentos de varios millones de veces.

El microscopio electrónico no usa lentes sino imanes que concentran los haces de electrones emitidos por un filamento. Normalmente son aparatos grandes puesto que el viaje de los electrones tiene que ocurrir en vacío. Por eso, aparecen grandes tubos dentro de los cuales se crea y manipula el haz de electrones.

En histología se usan dos tipos de microscopios electrónicos: de transmisión y de barrido.

Microscopio electrónico de transmisión

En este tipo de microscopio se produce el haz de electrones en un filamento de tungsteno que funciona como cátodo. Los electrones se condensan mediante electroimanes y se focalizan sobre una sección

de tejido. Lassecciones de tejido deben ser muy fina, se denominan ultrafinas (de unas decenas de nanometros), para permitir que sean atravesadas por los electrones y para conseguir imágenes nítidas. Previamente las secciones deben ser tratadas con metales pesados como el osmio, el plomo y el uranilo. La función de estos metales es similar a las tinciones usadas en el microscopio óptico, dar color, pero sólo en tonolidades de grises, a las estructuras celulares ya que se concentran fundamentalmente en membranas y en los complejos macromoleculares. Los electrones que chocan con estos metales rebotarán y no cruzarán el tejido. Aquellos que consigan atravesar el tejido chocarán contra una pantalla fluorescente que emitirá un destello luminoso tras cada choque. Esa imagen emitida por lapantalla fluorescente es la que podemos observar nosotros. Por ello las imágenes observadas con el microscopio electrónico son siempre en blanco y negro, aunque posteriormente se pueden colorear con un ordenador.

Comparativa de la composición básica de un microscopio óptico (izquierda), electrónico de transmisión (centro) y electrónico de barrido (derecha).

Imágenes tomadas en con microscopio electrónico de transmisión. Se puede ver la capacidad de estos microscopios observando el incremento de resolución de las imágenes de izquierda a derecha. Las líneas negras de la imagen de la derecha corresponden a las membranas celulares

Microscopio electrónico de barrido

Los microscopios electrónicos de barrido sirven para observar superficies tisulares. Ello es posible porque los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan con su superficie y rebotan. Para que esto ocurra hay que cubrir a la muestra con una máscara de metales que se adapta perfectamente al relieve de la muestra. La muestra se barre con el haz de electrones y los electrones reflejados por un punto de la superficie son captados por una pantalla receptora que creará una imagen en una pantalla digital. La imagen completa se formará cuando el haz recorra toda la superficie de la muestra y se consiga información de cada uno de los puntos. Es decir, se escanea la muestra, y de ahí el nombre de microscopio de barrido o en inglés "scannig".

Por supuesto, las muestras que se observan no son secciones, sino porciones de órganos con superficies de interés. Se pueden observar superficies de secciones hechas con un vibratomo o con un microtomo de congelación, pero no aquellas qeu han sido incluidas en resina o parafina.

Imágenes obtenidas con un microscopio electrónico de barrido. Muestran el interior del canal central de una médula espinal de lamprea. Se pueden observar numerosos cilios (con más detalle en B) y pequeñas microvellosidades en los dominios apicales de las células que forman las paredes de dicho canal. (Ver imagen de barrido de estomas de una hoja).