HORMONAS ESTEROIDEAS LIBRES

Bioq. Cecilia Andrea Fenili

Laboratorio Maipú.

2017

HORMONAS ESTEROIDEAS EN CIRCULACION

•Derivadas del

ciclopentano perhidrofenantreno

•Naturaleza lipídica.

•Parcialmente insolubles en

medios acuosos

•Interaccionan con proteínas de

transporte

ALBUMINA

Alta capacidad y baja afinidad Transporte de ac grasos, vitaminas,

hormonas, fármacos y sus metabolitos,

complejos no covalentes

CBG (Corticoid binding protein)

•Baja capacidad y alta afinidad •Mayor afinidad por glucocorticoides

SHBG (Sex hormone binding globulin) GLAE (Globulina ligadora de Andróg y Estróg)

• Baja capacidad y alta afinidad • 5 veces mayor afinidad por To que por E2.

Proteinas transportadoras de Esteroides

Aumentan en embarazo y con ACO o TRH (aum de Estrógs)

Sitruk-Ware R, Nath A. Rev Endocr Metab Disord. 2011; 12:63–75.

Esteroide

% libre % unido a

CBG

% unido a

ALBUMINA

% unido a

SHBG

T1/2 en circ

(min)

Cortisol 5 90 5 0.1 100

Aldosterona 42 21 37 0.1 10

P4 <2.0 18 80 0.6 5

To 2.0 0.1 30 68 10

E2 2.0 0 62 36 20

TRANSPORTE DE ESTEROIDES EN CIRCULACION

Dimorfismo sexual

AUMENTO DE SHBG DISMINUCIÓN DE SHBG

Terapia estrogénica ACO THR Embarazo Cirrosis Hipogonadismo Drogas Antiepilépticas Hipertiroidismo

Terapia Androgénica Obesidad Insulina Prolactina Hipotiroidismo Deficiencia endógena Drogas antitiroideas Acromegalia Síndrome de Cushing Glucocorticoides exógenos Progestágenos

Guay. Laboratory tests in androgen deficiency. Fertil Steril 2002.

MODIFICACIONES EN LA SHBG

GLUCOCORTICOIDES: CORTISOL LIBRE

RITMO CIRCADIANO DE CORTISOL TOTAL Y LIBRE

Cortisol Total Cortisol libre

MEDICION DE CORTISOL LIBRE

•CORTISOL SALIVAL (SAF)

•CORTISOL LIBRE URINARIO (CLU)

•LC-MS (no en aplic clínica)

Medición de Cortisol libre:

SAF

SAF

• Hay equilibrio entre el Cortisol libre en plasma y en saliva. •Su concentración es independente de la tasa de producción salival.

J Clin EndocrinolMetab 94: 3647–3655, 2009

UTILIDADES DE SAF 23 HS. Un SAF elevado (23 hs)

• Diagnóstico de S. Cushing endógeno: > 90% de S y E.

• Control de pacientes en remisión y/o recurrencia post cx hipof por E. Cushing.

• Durante una prueba de estímulo con ACTH en pacientes con prot plasmáticas:

• altas (aum de estrógenos) • bajas (enfermedad crítica).

J Clin EndocrinolMetab 94: 3647–3655, 2009

ACOS Y CORTICOIDES

Physiol. Res. 57 (Suppl. 1): S193-S199, 2008

Comparación de cortisol plasmático vs SAF en pacientes con Sme Cushing

Comparación de cortisol plasmático vs SAF en pacientes en tratamiento con estrógenos

Comparación de cortisol plasmático vs SAF post Test de supresión con DXM

Manetti y col, Eur J Endocr, 2013.

S Y E DE SAF DE 23 HS EN EL DIAGNÓSTICO DE S. DE CUSHING

Varían:

• el número de casos y controles,

• los criterios diagnósticos,

• los tipos de controles,

• las metodologías de ensayo,

• los métodos utilizados para generar puntos de corte,

• las técnicas de muestreo de saliva.

Sin embargo:

• se encontraron S y E similares para S. Cushing.

JCEM, 2009, 94(10):3647–3655

EFICIENCIA DIAGNÓSTICA DE MÉTODOS PARA MEDIR CORTISOL

Test para Diagnóstico de S de Cushing

SAF tiene una eficiencia diagnóstica

superior que el CLU de 24 hs y se debería utilizar (bien

estandarizada) como

la prueba bioquímica primaria para el diagnóstico de S.

Cushing.

Elias PC y col JCEM, 2014; 99(6):2045-51.

Endocrine Journal 2010, 57 (4), 331-337

SAF Y CUSHING CÍCLICO

Fácil muestreo frecuente

para la detección de

Cushing cíclico o intermitente.

Meinardi JR y col. 2007 Eur J Endocrinol 157:245–254.

SAF 8 HS • Ritmo circadiano

• útil para el diagnóstico de la ISR?

Limitaciones

• Amplio rango de VR.

• No es útil para el diagnóstico diferencial de ISR 1° y 2°.

• La S y la E para ISR 1° es menor de 35%.

Restituto P y col. 2008; Clin Biochem 41:688–692

SAF: UTILIDAD EN LA DETECCIÓN DE ISR

POST ACTH1-24 (1 gr)

Marcus-Perlman Y y col;2006. Clin Endocrinol Oxf. 64:215–218

SAF PRUEBA DE ACTH

Cortisol sérico Cortisol salival

control control

ISR ISR

hiperE2

hiperE2

SAF Y MONITOREO DE REEMPLAZO CON

GLUCOCORTICOIDES

• Controlar a los pacientes con ISR tratados con cortisol exógeno (hidrocortisona).

• No aporta significativamente a la evaluación de la terapia de reemplazo con glucocorticoides.

Maguire AM y col. 2007; Eur J Endocrinol 156: 471–476.

SAF: UTILIDAD DE SAF EN PEDIATRÍA

El muestreo de saliva es particularmente útil en los niños

con sospecha de S. de Cushing

en los que la toma de muestra

de sangre y de orina

puede ser un desafío.

MEDICIÓN DE SAF

HORMONAS EN SALIVA

• Refleja la hormona libre.

• Muestreo no traumático para el paciente.

• Se ha reportado gran estabilidad de los esteroides en muestras de saliva.

Dificultades en la estandarización de la

técnica de recolección de las muestras.

Matriz variable de la muestra de saliva.

Posible contaminación con sangre periférica.

Sensibilidad de los métodos para medir las hormonas (adaptaciones)

Dificultades para establecer los rangos de referencia.

Posible contaminación por administración de por ej corticoides orales exógenos.

Lewis J. Clin Biochem Rev. 2006;27(3):139–146.

Ventajas Desventajas

CONDICIONES PRE-ANALÍTICAS PARA LA RECOLECCIÓN DE SALIVA

• No realizar la recolección si tiene heridas bucales sangrantes (encías,

etc.): cualquier contaminación con sangre invalida la medición.

• No utilizar limón para estimular la salivación. Vialard-Miguel J y col. Lemon juice alters cortisol assays in saliva. Clin Endocrinol. 2005;63:478–9.

• No realizar actividad física de esfuerzo 12 hs previas, en especial respetando un reposo de 2 hs antes de la recolección de la muestra.

CONDICIONES PRE-ANALÍTICAS PARA LA RECOLECCIÓN DE SALIVA

• No ingerir alimentos (sólidos ó líquidos) en las 3 hs previas a la recolección de la muestra.

• No ingerir alcohol (interfiere en el IE), te, café ó mate en las 8 hs previas (aumentan la actividad de la alfa-amilasa).

• Enjuagarse la boca con agua (buche) sin cepillar, luego de la última ingesta de alimentos.

MEDICACIÓN Y SAF

La Hidrocortisona

no puede ser distinguida

de cortisol endógeno

Cruza

en los inmunoensayos,

La Dexametasona

puede ser distinguida

de cortisol endógeno

No cruza

con los inmunoensayos.

MÉTODOS PARA MEDIR SAF

• RIA MODIFICADO (Contreras y col)

• EQLIA (Vogeser M. Chem Lab Med. 2006; 44(12):1441-5 y

Chiu SK y col. Clin Biochem. 2003;36:211–4).

• QLIA Immulite I ó 1000 modificado (Astarita y col)

EQLIA vs método patrón

POSTANALÍTICA: SAF Y VR

Clin Chem Lab Med 2006; 44(12):1441-1445

• Informar si recibe medicación para disminuir los niveles de colesterol y/o triglicéridos (lípidos) del tipo de las “Estatinas”. (inhiben la 11-beta dehidrogenasa: disminuye conversión a Cortisona, por lo que se observan SAF elevados).

• Informar administración de corticoides (3-6 meses previos).

• Hiposalivación: descripta en Sjögren, antidepresivos, etc.

ETAPA POSTANALÍTICA DE SAF

MEDICIÓN DE CLU

CORTISOL LIBRE URINARIO (CLU)

Recolección de orina de 24 hs

•Los Pacientes deberán recibir instrucciones precisas para la recolección de orina de 24 hs.

•Descartar la 1° orina de la mañana (7 AM) y comenzar a juntar todo el volumen de las micciones siguientes hasta el dia siguiente a las 7.00 AM inclusive.

•Remitir todo el volumen al Laboratorio.

CLU Cortisol libre:

• cortisol no ligado a las proteínas plasmáticas: se filtra en el glomérulo y luego se reabsorbe en el túbulo colector. Alrededor del 3% del cortisol filtrado se elimina por orina.

• cortisol no conjugado al ácido sulfúrico o hialurónico.

Por lo tanto, el cortisol libre urinario no está conjugado

y su nivel en la orina refleja

el nivel de cortisol bioactivo libre en el plasma.

CLU 24 hs

• Refleja la concentración de Cortisol libre (biológicamente activo) integrada de 24 hs.

• Requiere función renal normal.

• Puede ser normal en Cushing cíclico.

• Puede ser normal si el SC es leve.

• Hay que medirlo en 2 muestras de diferentes recolecciones.

Vilar L y col. Pitfalls in the diagnosis of Cushing's syndrome.

Arq Bras Endocrinol Metabol. 2007 Nov;51(8):1207-16.

CLU y Depresión

• Aumenta la excreción urinaria de cortisol libre.

CLU MÈTODOS

• Métodos directos: RIA

• Métodos extractivos (diclorometano): RIA, EQLIA, QLIA.

ESTEROIDES SEXUALES

E2

TESTOSTERONA Y PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS

Simon JA. Fert Steril. 2002;77:S77-S82.

Demers LM. In: Redmond, G, ed. Androgenic Disorders. Raven Press, New York, NY; 1995:21-34.

~30% unida

a albumina

~0.5-2% libre Testosterona libre

TO LIBRE: MÉTODOS

• RIA ANALOGO

• RIA CON EXTRACCiON PREVIA

• CALCULOS BASADOS EN LA LEY DE ACCION DE MASAS

No aplicables en clínica de rutina:

• EQUILIBRIO DE DIALISIS

• ULTRAFILTRACION

• El intervalo de referencia de To libre RIA análogo es 5 veces menor que el del Eq. de diálisis.

• No está claro qué es lo que mide????.

• Correlaciona con To total, por lo que ofrece la misma información y no corrige las diferencias por la concentración de SHBG plasmática.

Stephen J Winters y col. The analog free testosterone assay: are the results in men clinically useful?

Clinical Chemistry 44:10 2178–2182 (1998).

MEDICIÓN DE TO LIBRE POR RIA ANÁLOGO: CRÍTICAS (1998)

TO LIBRE POR RIA ANÁLOGO (FRITZ Y COL. 2008)

Los resultados de To libre RIA análogo correlacionan con los de To Total,

Este método

“NO MIDE la To dializable” o sea que

“NO MIDE To libre”

Fritz KS, McKean AJS, Nelson JC, Wilcox RB. Analog-based free testosterone test results linked to total testosterone concentrations, not free

testosterone concentrations. Clin Chem 2008;54:512– 6.

BioT = [FT] + {(kat x [alb] x [FT]) / (1 + (kat x [FT]))}

FT = {-b + (b2 + 4a[T])} / 2a

a = kat + kt + {kat x kt x ([SHBG] + [alb] – [T])}

b = 1 + (kt x [SHBG]) + (kat x [alb]) – ((kat + kt) x [T])

kat : constante de afinidad de la unión de To a Albúmina

Kt : constante de afinidad de la unión de To a SHBG

Vermeulen, Sodergard, Emadi-Konjin

Vermeulen et al. J Clin Endo & Metab 1999;84(10):3666-72.

Sodergard et al. J Steroid Biochem 1982;16:801-10.

Emadi-Konjin et al. Clin Biochem 2003;36:591-6.

Morris et al. Eur J Endocrinol 2004;151:241-9.

CÁLCULO DE TO LIBRE Y TO BIO

ESTIMACION DE TO LIBRE Y TO BIODISPONIBLE

CÁLCULO DE TOL Y TO BIO

To ACCESS DPC DSL EQLIA IMMULITE

SHBG EQLIA EQLIA EQLIA EQLIA EQLIA

Padilla P. Y col. Estimación por calculo de testosterona biodisponible: Variables a considerar. CUBRA 2005.

TO LIBRE CALCULADA: ES NECESARIO MEDIR LA ALBÚMINA?

En la rutina clínica no sería necesario estimar la Albúmina de cada paciente en mujeres hiperandrogénicas cuando se encuentra en rangos fisiológicos de 40-50 g/L.

Andreas Mueller. The Role of Albumin in the Calculation of Free and Bioavailable Testosterone in Women with

Hyperandrogenemia. In vivo 20: 403-408 (2006).

To libre calculada Albúmina medida nmol/L

To lib

re c

alc

ula

da A

lbúm

ina fija

nm

ol/

L

TO BIO CALCULADA CON DIFERENTES MÉTODOS PARA TO Y SHBG Y DISTINTAS

KA (2005) To Bio

To

SHBG

To Bio

Immulite

Immulite

To Bio

DSL

Immulite

To Bio

Elecsys

Immulite

To Bio

DPC

Immulite

To Bio

Access

Immulite

Muestras MN HN MN HN MN HN MN HN MN HN

RRe Verme

(ka= 1.0)

<

0.462 1.462

4.404 0.0297

0.4107 1.0159

4.1898 <

0.2357

1.0912

3.9103 <

0.2356

1.2270

3.8881 <

0.2477

1.1477

3.4942

RRe Sheeva

(ka=1.0) 0.038

0.405

1.079

3.535

0.0153

0.3043

0.7124

3.3699 <

0.1724

0.8112

3.0885 <

0.1713

0.9095

3.0852 <

0.1787

0.8650

2.7435

Rre Sheeva

(ka=1.6) 0.028

0.283

0.732

2.922

0.0037

0.2171

0.4309

2.7817

<

0.1212

0.5642

2.4746

<

0.1209

0.6320

2.4899

<

0.1242

0.6207

2.1717

To Bio

To

SHBG

To Bio

Immulite

Elecsys

To Bio

DSL

Elecsys

To Bio

Elecsys

Elecsys

To Bio

DPC

Elecsys

To Bio

Access

Elecsys

Muestras MN HN MN HN MN HN MN HN MN HN

RRe Verme

(ka= 1.0)

<

0.4513

1.0253

4.5107

0.0183

0.4085

0.9585

4.1332

<

0.2270

1.0507

3.8304

<

0.2297

1.1787

3.8168

<

0.2453

1.1144

3.4491

RRe Sheeva

(ka=1.0)

0.0375

0.4050

0.7382

3.5981

0.0080

0.3016

0.6612

3.3154

<

0.1679

0.7719

3.0149

<

0.1697

0.8636

3.0183

<

0.1765

0.8343

2.6982

Rre Sheeva

(ka=1.6)

0.0275

0.2850

0.4759

2.9362

0.0325

0.2600

0.3905

2.7231

<

0.1168

0.5311

2.4034

0.0100

0.1600

0.5908

2.4254

<

0.1228

0.5964

2.1241

Saavedra M y col. Estimación de testosterona biodisponible aplicación de diferentes métodos de calculo. Congreso SAEM 2005.

Vermeulen (JCEM 84,3666-72,1999) Södergard ( Steroid Biochem 13, 801-10,1992).

PACIENTES EN TRATAMIENTO CON TO

• Realizar el monitoreo dosando ToBio y ToL,

• Obtener las muestras de acuerdo con la farmacocinética del producto empleado.

• Gel o parche: no realizar la extracción de la muestra inmediatamente después de la aplicación ni del mismo brazo en que fue aplicado por última vez.

TO SALIVAL

• Su exactitud es cuestionada.

• La salivación pasiva es el método de elección para la colección de la muestra.

• To-sal no es directamente comparable a la ToL de suero debido a la unión de To a proteínas de la saliva, lo que afecta sustancialmente la To-sal baja en las mujeres, pero no la To-sal más alta en hombres adultos sanos.

Fiers T y col. Steroids. 2014;86:5-9.

VARIACIONES EN ESTRADIOL LIBRE Y BIODISPONIBLE CON LA EDAD

BMI

E2 libre

E2 biodisponible

DHEA SALIVAL

A4 Y 17ΑLFA-OH-P4 SALIVALES MATUTINOS PARA MONITOREO

EN NIÑOS Y PÚBERES CON HSC CLÁSICA

El tratamiento de la HSC clásica

debida a déficit de 21-hydroxilasa

puede ser

monitoreado por

A4 y 17α-OH-P4 salivales.

Monique J.M. de Groot y col. Clin Chem Lab Med; 2014

TRANSPORTADORES DE VIT D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22528806

• Es la globulina Gc

• También une a los ácidos grasos y los monómeros de actina, además de prevenir su polimerización.

• Rol en: mantenimiento de los niveles totales de la vitamina D regulación de las cantidades de libre (no unida) de vitamina D

disponibles para tejidos y células específicas.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22528806

DBP

VITAMINA D LIBRE

Debería reflejar mejor la actividad biológica de la Vitamina D

que la medición de la

25OH vitamina D total

J Steroid Biochem Mol Biol. 2014;144PA: 132–137.

DETERMINACION DE VIT D LIBRE

No se puede calcular la Vit D como el 0,04% de

la vit D Total.

Porque la

concentración de

DBP varía

Porque existen

polimorfismos de DBP

La medición de directa de Vit D Libre o a través

de la medición de DBP

podría aportar mejor información

que la Vit D Total.

Obesidad, Embarazo, ACO,TRH,

Enf Renal, Enf Hepática,

Proteinuria, UTI

Que afectan su estructura y su

afinidad por Vit D.

Varían con la raza.

DETERMINACION DE VIT D LIBRE

Ultracentrifugación

No para clínica

Cálculos

Se necesitan 3 mediciones de DBP

Es costosa

Ensayos no validados totalmente

Idealmente se debería realizar la genotipificación de DBP

• Métodos de medición directa de Vit D Libre???

DETERMINACION DE VIT D LIBRE DIRECTO

DBP Y VIT D BIODISPONIBLE

Controles Pac crítico Embarazadas Controles Pac crítico Embarazadas Controles Pac crítico Embarazadas

25OHViT D Total DBP Vit D biodisponible calculada

VIT D BIODISPONIBLE Y EMBARAZO

1er Ttrimestre 2do Ttrimestre 1er Ttrimestre 2do Ttrimestre

1er Ttrimestre 2do Ttrimestre

25OH Vit D Total DBP Vit D biodisponible

calculada

CONCLUSIONES

• Medición de esteroides en saliva: refleja las concentraciones de hormona libre y no se ve afectado por las concentraciones de proteínas de transporte.

• Se ha reportado gran estabilidad de los esteroides en muestras de saliva.

• SAF y CLU: para incrementar la sensibilidad diagnóstica es necesario repetir el muestreo y su medición en más de una ocasión.

• Al igual que para el CLU, el muestreo es esencial para obtener resultados confiables (importancia de la claridad de las instrucciones al paciente).

• Vit D libre: incierto futuro de su aplicación. Sólo para embarazo, enf crítica, hipoproteinemias????. Se requiere desarrollo de kits adecuados.

Dra. Cecilia Andrea Fenili

ceciliafenili@diagnosticomaipu.com.ar

Muchas gracias por su atención.