Universidad del Zulia

Facultad experimental de ciencias

División de Estudios Básicos sectoriales

Departamento de química

Química Analítica III

Prof. Chávez Gerson

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

Realizado por:

Marienmy Velásquez

C.I.: 22.606.896.

Maracaibo, febrero de 2015

Introducción

La Cromatografía líquida o de líquidos, es una técnica analítica la cual permite

separar físicamente los distintos componentes de una solución por la adsorción

selectiva de los constituyentes de una mezcla. Consiste en un contacto entre

dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria (puede ser alúmina,

sílice o resinas de intercambio iónico que se encuentran disponibles), y una

móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis, y que en este caso

es un líquido o mezcla de varios líquidos. Los intercambiadores iónicos son

matrices sólidas que contienen sitios activos (también llamados grupos

ionogénicos) con carga electrostática (positiva o negativa), en ellos queda

retenida la muestra sobre el soporte sólido por afinidad electrostática.

Dependiendo de la relación carga/tamaño unos constituyentes de la mezcla

serán retenidos con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros, es decir

serán adsorbidos, lo que provocará su separación. Las sustancias que

permanecen más tiempo libre en la fase senil, avanzan más rápidamente con el

fluir de la misma y las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas

avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir.

Se la denomina cromatografía líquida de alta presión o cromatografía líquida de

alta resolución (high pressure liquid chromatography) (HPLC), para distinguir los

más nuevos de los métodos básicos aún utilizados. El HPLC es una técnica

utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes

tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna

cromatográfica. En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna

cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con

pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su

superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de

la columna.

Evolución de las bases de la separación cromatográfica.

Cromatografía líquida tal como lo conocemos hoy en día realmente se inició en

1969, cuando la primera HPLC moderno fue diseñado y comercializado como un

analizador de ácido nucleico. Columnas toda la década de 1970 no eran fiables,

las tasas de flujo de la bomba fueron inconsistentes, y muchos compuestos

biológicamente activos escapado a la detección mediante detectores de UV y de

fluorescencia. Centrarse en los métodos de purificación en los años 70 se

transformó en análisis más rápidos en la década de 1980, cuando los controles

computarizados fueron integrados en equipos de HPLC. Un mayor grado de

informatización y luego llevó al énfasis en el equipo más preciso, más rápido y

automatizado en la década de 1990. Atípico de muchas tecnologías de los años

60 y 70, el énfasis en la mejora no fue el "más grande y mejor", sino en "más

pequeño y mejor". Al mismo tiempo, la interfaz de usuario de HPLC estaba

mejorando, era crítico para ser capaz de aislar cientos de péptidos o

biomarcadores de cada vez menor tamaño de las muestras.

Laboratorio de instrumentación analítica sólo ha sido reconocido como una

industria separada y distinta por NAICS y SIC desde el 1987 - Esta segmentación

del mercado incluye no sólo el gas y la cromatografía líquida, sino también la

espectrometría de masas y los instrumentos espectrofotométricos. Desde

reconocido por primera vez como un mercado separado, las ventas de equipos

de laboratorio de análisis aumentaron de alrededor de $ 3.5 mil millones en

1987 a más de $ 26 mil millones en 2004. Los ingresos en el mercado de

cromatografía líquida mundo, en concreto, se espera que crezca de $ 3.4 mil

millones en 2007 a $ 4,7 mil millones en 2013, con un ligero descenso en el

gasto previsto en 2008 y 2009 a partir de la crisis económica mundial y la

disminución o estancamiento del gasto. La industria farmacéutica por sí solo

representa el 35% de todos los instrumentos de HPLC en uso. La principal fuente

de crecimiento de la LC se deriva de las ciencias biológicas y las compañías

farmacéuticas.

Con respecto a la técnica se ha mejorado y sobre-llevado los siguientes

parámetros:

Proceso de ensanchamiento de banda: Existen varios procesos que tienen

lugar en la columna durante una separación cromatográfica y que contribuyen a

la variancia del pico, σ2, o ensanchamiento de la banda. Las teorías de la

dispersión de la banda en cromatografía de gases y de líquidos son

prácticamente idénticas. La altura del plato expresa en términos simples la

magnitud del ensanchamiento de la banda y los factores que lo afectan. Es una

función de procesos termodinámicos y cinéticos dentro de la columna. Estos son

(a) irregularidades del flujo que provocan mezclado convectivo, (b) difusión

transversal y longitudinal en la fase móvil y (c) una velocidad finita en el

equilibrio del soluto entre las fases estacionaria y móvil (transferencia de masa).

Difusión por remolinos: La inhomogeneidad en las velocidades de flujo y en

la longitud de los caminos alrededor de las partículas del empaque es el primero

de los factores. Deben existir caminos de flujo de longitud desigual a través de

cualquier empacado que no sea perfecto. Algunas moléculas de soluto de una

especie única pueden ser barridas a través de la columna cerca de la pared,

donde la densidad del empacado es comparativamente baja, en particular en

columnas de diámetro pequeño. Otras moléculas del soluto pasan por el centro

de la columna, con un empacado más compacto y a una correspondiente menor

velocidad. Las moléculas que siguen un camino más corto eluyen antes que

aquellas que siguen caminos más erráticos (y largos). Esto provoca para cada

soluto un ensanchamiento de la banda de elución. Para minimizar el efecto, las

partículas del empaque deben tener un diámetro promedio tan pequeño y deben

ser empacadas tan uniformemente como sea posible. Por supuesto, conforme las

partículas son más pequeñas, la presión necesaria para impulsar la fase móvil a

través de la columna será mayor y más difícil será empacar la columna de

manera uniforme. De todas formas, debido a la mayor eficiencia que se obtiene

con partículas de menor diámetro, la longitud de la columna puede reducirse en

alguna medida. Debe establecerse un compromiso entre el tamaño de las

partículas, la longitud de la columna y la presión requerida. En cromatografía

gas-líquido, cuando se utilizan películas en el interior de las columnas capilares

el término es despreciable.

Difusión longitudinal: La difusión longitudinal, o axial -esto es, movimiento

molecular aleatorio dentro de la fase móvil .es un segundo proceso que produce

ensanchamiento del pico. La contribución de la difusión longitudinal a la altura

del plato es significativa sólo a velocidades bajas de fase móvil. Entonces, las

velocidades altas de difusión del soluto en la fase móvil pueden causar que las

moléculas se dispersen axialmente mientras emigran lentamente a través de la

columna. Si esto pasa se produce ensanchamiento del pico.

Transferencia de masa: La resistencia a la transferencia de masa del soluto

en la superficie de la fase estacionaria es otro factor que contribuye al

ensanchamiento del pico. El movimiento molecular lento dentro de la fase

estacionaria significa un mayor tiempo de residencia en esta fase de una

molécula de soluto, mientras que otras moléculas avanzan con la fase móvil.

Conforme la fase móvil se mueva más rápidamente a través de la columna y

más lenta sea la transferencia de masa, más ancha será la banda del soluto que

eluye de la columna. Se deben escoger líquidos no viscosos para la fase

estacionaria de manera que el coeficiente de difusión no sea indebidamente

pequeño. Es benéfico reducir el espesor de la fase estacionaria, aunque

disminuye la capacidad de la columna.

Otro término que afecta a la anchura de banda es el correspondiente a la

resistencia a la transferencia de masa radialmente entre líneas de corriente de

fase móvil adyacentes. Disminuir el tamaño de las partículas de la fase

estacionaria siempre es útil para reducir la altura del plato. En cromatografía

líquida en columna, en contraste con la cromatografía gas-líquido, las mayores

diferencias provienen de (1) la disminución en un factor de 10000 en el valor del

coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil cuando la fase móvil está

constituida por un líquido en lugar de un gas y (2) la presencia de zonas de fase

móvil estancada, atrapada dentro de los poros y canales de la fase estacionaria.

Las moléculas de soluto se mueven por difusión hacia dentro y hacia afuera de

estos poros. Estas moléculas se retrasan en su movimiento hacia adelante,

relativo a la banda principal de un soluto dado, y nuevamente se produce un

aumento en la dispersión molecular.

También la velocidad de la fase móvil difiere entre un punto y otro debido a las

perturbaciones provocadas por las partículas de soporte. Las líneas de corriente

del líquido de la fase móvil cercanas a los límites de las partículas se mueven

lentamente, mientras que las líneas de corriente cercanas al centro entre

partículas se mueven más rápidamente. Por difusión lateral las moléculas de

soluto se transfieren constantemente a una línea de corriente diferente. Por lo

tanto, la obstrucción del camino de una molécula de soluto se debe tanto a la

difusión entre líneas de corriente, como a la necesidad de viajar alrededor de las

partículas de la fase estacionaria.

El efecto de zonas estancadas se puede minimizar de varias formas. La

estructura interna del empaque se puede hacer impenetrable; un ejemplo son

los empaques peliculares con un núcleo sólido y la superficie recubierta. La

reducción del diámetro de las partículas es muy efectivo. También se puede

elegir soportes que tengan poros muy amplios, de forma que el líquido fluya

fácilmente hacia dentro y hacia afuera y aun a través de los canales de los

poros.

Efecto del tamaño de partícula, tamaño de poro y longitud de

columna en la resolución: El tamaño de partícula juega un papel

importantísimo en la calidad y eficacia de la columna. Como se observa en la

ecuación de Van Deemter, la altura equivalente de plato teórico es función del

diámetro de la partícula de relleno:

Donde dp es el diámetro de las partículas y u la velocidad lineal de la fase móvil.

De la ecuación anterior se desprende la importancia del diámetro de partícula,

ya que a diámetros menores se obtendrá una menor altura equivalente de plato

teórico y, por lo tanto, una mayor eficacia del sistema.

Las partículas utilizadas inicialmente para rellenos en cromatografía liquida eran

bastante grandes (de más de 40 picometros) y totalmente porosas. Este tipo de

partículas presentan una gran superficie específica y, por lo tanto, las columnas

preparadas con ellas presentan una gran capacidad de carga (admiten gran

cantidad de muestra) pero, como contrapartida, dan lugar a un gran

ensanchamiento de la banda cromatográfica ya que influyen significativamente

sobre los términos de transferencia de masa de la ecuación de Van Deemter.

Como solución parcial a este problema, se comenzaron a utilizar los

recubrimientos de estas partículas por capas de fase estacionaria (adsorbente o

intercambiadora de iones). Este tipo de rellenos (rellenos peliculares) dan lugar

a picos más estrechos (figura 1), aunque no son la solución óptima.

Figura 1.- Influencia del tamaño de partícula.

Los mayores avances se han realizado al reducir los tamaños de las partículas

del relleno a unos niveles en los que consiguen grandes incrementos en la

eficacia de la columna sin que por ello se tengan unas presiones tan

excesivamente elevadas en cabeza de columna que hagan inviable el análisis

(figura 1).

En la actualidad, los tamaños de partícula habituales se encuentran

comprendidos entre 10 y 3 picómetros de diámetro, aunque en la gran mayoría

de los casos, los análisis se están realizando con rellenos de 10 o 5 picómetros.

Un último detalle, aunque de gran importancia, es que cuanto menos sea el

tamaño de partícula, la presión en la cabeza de columna se incrementa de forma

proporcionalmente inversa al cuadrado del tamaño de la partícula. Por este

motivo, es fácil comprender el por qué no se encuentran en el mercado rellenos

con un tamaño de partícula de menos de 3 picómetros.

El efecto de la longitud de la columna en la resolución se puede comprobar en

las ecuaciones que rigen los procesos cromatográficos, la eficacia de la columna

depende, entre otros factores, de la longitud de la columna y, a igualdad de

otros parámetros, mayores longitudes de la columna permitirán obtener

mayores eficacias.

Por otra parte, debe tenerse en cuenta que, a mayor longitud de la columna, la

presión en cabeza se eleva considerablemente, por lo que hay que alcanzar un

compromiso, a la hora de seleccionar la columna, entre eficacia y caída de

presión. Las columnas de cromatografía liquida en ningún caso pueden tener

longitudes extremadamente grandes; se ha comprobado que para tamaños de

partículas de 10 a 5µm, resulta difícil conseguir empaquetar buenas columnas

de longitud superior a 30cm; para tamaños de partícula de 3µm, la longitud de

la columna no podrá ser superior a 20cm sin riesgo de que la presión en cabeza

de columna sea excesivamente elevada.

Tipos de cromatografía liquida

Cromatografía de reparto: La cromatografía de reparto ha llegado a ser el

tipo de cromatografía de líquidos más ampliamente utilizado. En el pasado, la

mayoría de las aplicaciones se han referido a compuestos polares no iónicos de

baja a moderada masa molecular < 3000). Sin embargo, recientemente se han

desarrollado algunos métodos que han extendido las separaciones de reparto a

los compuestos iónicos.

La cromatografía de reparto se puede subdividir en cromatografía líquido-líquido

y cromatografía con fases unidas químicamente (enlazadas). La diferencia entre

estas técnicas radica en la forma como se retiene la fase estacionarla sobre las

partículas soporte del relleno. En líquido-líquido, la fase estacionaria líquida se

retiene sobre la superficie del soporte por adsorción física. En fase unida

químicamente, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del

soporte. La cromatografía de reparto, al principio era del tipo líquido-líquido; sin

embargo, en la actualidad los métodos de fase enlazada son los que predominan

debido a las desventajas de los sistemas líquido-líquidos. Una de esas

desventajas es la pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil, lo

que hace necesario un periódico recubrimiento de las partículas del soporte. Por

otra parte, el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide el uso de

los rellenos de fase líquida en la elución con gradiente. La discusión se centrará

exclusivamente en la cromatografía de reparto con fases unidas químicamente.

Cromatografía de adsorción: La cromatografía de adsorción, o líquido-sólido,

es la forma clásica de cromatografía de líquidos que introdujo Tswett por vez

primera a principios de este siglo. Más recientemente, se ha convertido en un

método importante de HPLC.

Las únicas fases que se utilizan en HPLC líquido-sólido son la sílice y la alúmina,

siendo la primera la que se prefiere para casi todas las aplicaciones debido a su

mayor capacidad de carga y a su mayor diversidad de presentaciones. Con

pocas excepciones, las características de adsorción de los dos adsorbentes son

similares. Con ambos, el orden de tiempos de retención es: olefinas <

hidrocarburos aromáticos < haluros = sulfuros < éteres < nitrocompuestos <

esteres = aldehídos = cetonas < alcoholes = aminas < sulfonas < sulfóxidos <

amidas < ácidos carboxílicos.

Cromatografía iónica: La cromatografía iónica está relacionada con los

métodos modernos y eficaces para la separación y determinación de iones que

se basan en el uso de las resinas de intercambio iónico. La cromatografía iónica

empezó a desarrollarse a mediados de los años setenta, cuando se demostró

que mediante las columnas de HPLC rellenas con resinas de intercambio

catiónico o aniónico, se podían resolver fácilmente mezclas de cationes o

aniones. Por entonces, la detección se realizaba por lo general con medidas de

conductividad.

La cromatografía iónica se desarrolló durante el proyecto Manhattan que

optimizaba la separación con resinas de intercambio catiónico de los cationes de

las tierras raras estrechamente relacionados. Este espectacular trabajo, en el

cual se basa la teoría de las separaciones por intercambio iónico, se extendió

tras la 2ª Guerra Mundial a muchos otros tipos de materiales y al final condujo a

los métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidos y

otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna

empezó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación por

intercambio iónico se retrasó debido a la inexistencia de un método general y

sensible para la detección de especies como los cationes alcalinos y

alcalinotérreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se

remedió en 1975 al desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la

técnica de supresión del efluente, la cual hace posible la detección

conductimétrica de los iones eluidos. Esta técnica se describe posteriormente.

Cromatografía de exclusión por tamaños: La cromatografía de exclusión

por tamaños, que también se ha denominado cromatografía en geles

permeables o de filtración en geles, es una técnica muy valiosa que se aplica

particularmente a especies de alto peso molecular. Los rellenos para la

cromatografía de exclusión por tamaños están constituidos por pequeñas

partículas (de unas 10 µm) poliméricas o de sílice que contienen una red

uniforme de poros en los que pueden difundir las moléculas del soluto y del

disolvente. En los poros, las moléculas son atrapadas efectivamente y

eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia medio en los poros

depende del tamaño efectivo de las moléculas de los analitos. Las moléculas que

son más grandes que el tamaño medio de poros del relleno son excluidas y de

esta forma, esencialmente no se retienen y, por tanto, son las primeras que

eluyen. Las moléculas que tienen diámetros que son significativamente menores

que los poros, pueden penetrar a través del laberinto de poros y así resultan

atrapadas durante más tiempo; éstas son las últimas en eluir. Entre estos dos

extremos, están las moléculas de tamaño intermedio cuya penetración media en

los poros depende de su diámetro. Dentro de este grupo, tiene lugar el

fraccionamiento, que está directamente relacionado con el tamaño molecular y

en cierto modo con la forma molecular. Obsérvese que las separaciones por

exclusión por tamaños difieren de los otros procedimientos que se han

considerado, en que no implican una interacción química o física entre los

analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de

interacciones dado que originan una mala eficacia de la columna.

Instrumentación:

Conocimiento básico del equipo e instrumental necesario para el análisis

cromatográfico. Discusión de detección de fallas y/o anomalías en el sistema;

corrección y ajustes al mismo.

Figura 2.- Equipo para HPLC

Solventes: La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de

solventes. Cuando se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para

que tome solventes de diferentes botellas en una proporción determinada y

realice la mezcla en una cámara de mezclado. Dependiendo de la forma en que

se usa el solvente tenemos dos métodos:

Método Isocrático: Cuando, durante toda la separación, se utiliza siempre el

mismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es normal realizar un

gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para

mejorar la eficiencia y acortar la duración del proceso. Estos gradientes de

solvente también son realizados en forma automática por las bombas.

Método de Gradiente de Elución: Es un término que se utiliza para describir

el proceso mediante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden

efectuarse de dos maneras:

A baja presión

A alta presión

Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener

presente dos objetivos:

Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el

menor tiempo posible.

Asegurar alta precisión y exactitud.

Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir

cinco pasos fundamentales:

Determinar la composición inicial y final del solvente.

Ajustar el tiempo del gradiente.

Determinar la forma del gradiente (lineal, cóncava o convexa).

Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución.

Regresar a las condiciones iniciales la columna.

La bomba envía el solvente a través de caños de diámetro pequeño,

generalmente de acero inoxidable, hacia la válvula inyectora. Esta consiste en

una válvula de varias vías que permite introducir en el flujo de solvente, la

muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se

produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan por

el detector. Este produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de

materia y esa señal es enviada al registrador que realiza un gráfico de

intensidad en función del tiempo (cromatograma). Idealmente, se trata de picos

gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El

integrador calcula además el área correspondiente a cada pico, la cual es

proporcional a la cantidad de sustancia. Dado que los detectores de HPLC son no

destructivos, es posible recuperar los productos que salen de él. De esta

manera, dependiendo del tamaño del loop de inyección, de la columna, y del

tipo de bomba, es posible realizar además de separaciones analíticas,

cromatografías preparativas.

Criterios para la elección del solvente:

Disponible comercialmente

Precio

Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad

de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impurezas.

Disolver la muestra

Miscible con otros solventes para formar mezclas útiles

No degradar o disolver la fase estacionaria

Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión

Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se

usan detectores UV)

Filtración y Desgasificación de solventes

Filtros: Hay tres métodos comunes que se utilizan hoy en día para la filtración

previa de los Solventes en HPLC:

Filtro a la entrada del solvente: Este tipo de filtro usualmente se construye

de acero inoxidable u otra aleación resistente a la corrosión y se sitúa dentro de

la botella de depósito del solvente (depósito de la fase móvil) donde se une a la

entrada de la presión baja. Está al lado de del HPLC, bombea usando un taladro

pequeño de Teflón u otra tubería inerte. El filtro tiene un poro medio, clasificado

según tamaño que usualmente oscila entre rangos de 1 a 5 micra. Debido a los

métodos industriales de fabricación de estos filtros,, sólo un poro medio clasifica

según tamaño. El tamaño absoluto del poro mínimo es usualmente alrededor de

1 micra, para aquel material por debajo de este mínimo puede alargar el HPLC

bomba, columna, y otro componentes del sistema. Con el tiempo estos tipos de

filtros reducen eficacia de la bomba.

Filtración al vacío: Este aparato consta de un embudo de vidrio, vidrio se filtra

poseedor, y frasco de la recepción del vidrio. Se aplica vacío al frasco y solvente

se filtra cuando pasa por un disco teclea membrana dentro del poseedor del

filtro. Este sistema tiene la ventaja de usar membrana filtra que tiene un muchos

mejor definió poro clasifica según tamaño y puede bajar a 0.2 poro de la micra

clasifica según tamaño. El poro más bajo clasifica según tamaño puede eliminar

la mayoría de materia del [particulate] halló en el HPLC ambiente del laboratorio.

El problema con este sistema es ese que está muy frágil desde se hace fuera de

vidrio y solvente necesita se transferir del frasco al HPLC botella del solvente del

solvente donde se le expone a la atmósfera el solvente y puede ser fácilmente

recontaminado con partículas del polvo y otros partículas de materia en el aire.

Filtración en línea: Este sistema consta de un [polymer] o filtro del [inline]

limpio hecho de acero que tiene un tubo tropieza con la botella solvente de la

fabricante y otro funcionamiento del tubo a una presión baja bombea que dibuja

el HPLC solvente por un disco se filtra albergó dentro del albergue del filtro del

[inline] y lo distribuye en un frasco del almacenamiento o en el depósito

solvente. Este sistema como con el sistema del embudo describió sobre, tiene la

ventaja de usar disco filtra con pues definió poro clasifica según tamaño y un

poro mínimo clasifica según tamaño de 0.2 micra que está 5 chronometra más

bajo que la entrada solvente filtra aparato del tipo. La desventaja si este sistema

es ese que requiere una presión separada baja bombea y si construyó de

[polymers polypropylene] tal como y/ o nilón que contaminaría solventes

seguros orgánicos.

Tuberías: Las tuberías deben ser de acero inoxidable, las cuales son resistentes

a la corrosión, se utiliza PEEK (PoliEterCeterona), que son resistentes a los

disolventes fuertes y fases móviles agresivas.

Características:

Los tubos de PEEK son extremadamente flexibles y pueden cortarse

fácilmente a las longitudes deseadas.

Además puede emplearse para su conexión, además de los conectores de

material polimérico, cualquier rosca o cono de acero inoxidable.

Los tubos de PEEK vienen codificados por su color, el cual gracias al

especial proceso de fabricación es totalmente indeleble.

Los tubos de PEEK pueden trabajar hasta presiones de 5000 psi

dependiendo del diámetro, y hasta temperaturas de 100°C.

Sistemas de bombeo: Sistema isobárico y sistema de gradiente

Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen:

La generación de presiones por encima de 400 kg/cm2.

Un flujo libre de pulsaciones.

Un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min.

El control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo.

Componentes resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o teflón).

Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no

constituyen un riesgo de explosión, debido a que los líquidos no son muy

compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema sólo

supone una pérdida de disolvente. Es evidente que esta pérdida puede suponer

un riesgo de incendio.

Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se

denomina una elución isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación

se aumenta notablemente por una elución con gradiente. En este caso se

utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polaridad significativamente

distinta. Una vez comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de

forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de

etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo están

equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde

dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una velocidad que varía

continuamente y la relación de volumen de los disolventes se puede modificar

lineal o exponencialmente con el tiempo.

La Figura 3 ilustra la ventaja de una elución con gradiente en la separación de

una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elución isocrática

con metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elución con gradiente,

que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la

concentración de metanol un 8%/min. Obsérvese que la elución con gradiente

acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la resolución de los

primeros picos. Nótese también que la elución con gradiente produce unos

efectos similares a los producidos por la programación de temperatura en

cromatografía de gases.

Figura 3.- Mejora de la eficiencia de la separación mediante la elución con gradiente.

Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1% Permaphase

ODS. Muestra: 5 μL de bencenos clorados en isopropanol. Detector: fotómetro de

UV (254 nm). Condiciones: temperatura 60ºC, presión 80 kg/cm2. (a) Elución con

gradiente: metanol 40% / agua 60% e incremento de la proporción de metanol a

una velocidad de un 8% / min (b) Elución isocrática con metanol 50% / agua

50%.

Sistema de inyección

A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de

líquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la

columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña

a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de

ser muy pequeños, de unas pocas décimas de microlitro a tal vez 500 µL.

Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.

Figura 4.- Bucle de muestra para cromatografía de líquidos.

En cromatografía de líquidos el método más ampliamente utilizado para la

introducción de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en

la Figura 4. Estos dispositivos están normalmente integrados en el equipo

cromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten la elección de

tamaños de muestra desde 5 a 500 µL. Con bucles de este tipo se puede

introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisión relativa

de unas décimas por ciento. También existen válvulas de inyección de

micromuestras, con bucles con volúmenes de 0,5 a 5 µL.

Tipos de Columnas. Nuevos avances (columnas UPLC)

La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud

entre 5 y 30 cm. Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si

es necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las

columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los

rellenos más comunes son 3, 5 y 10 µm.

Tal vez la columna más frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y

4.6 mm de diámetro interno, y empaquetada con partículas de 5 µm. Estas

columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro. También, se han empezado a

fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen menores

dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener

diámetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partículas de

3 o 5 µm. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta

100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo consumo

de disolvente. La última propiedad es de considerable importancia, puesto que

los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son

muy caros.

Pre-columnas: En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna

analítica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en

suspensión y los contaminantes de los disolventes. Además, en cromatografía

líquido-líquido, la precolumna sirve para saturar la fase móvil con la fase

estacionaria y así minimizar las pérdidas de ésta en la columna analítica. La

composición del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna

analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común mayor para

minimizar la caída de presión.

Termostatos: En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la

temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo,

muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas

décimas de grado centígrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría

de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas

que controlan la temperatura de la columna a las décimas de grado, desde la

temperatura ambiente hasta 150 ºC. Para poder controlar con precisión la

temperatura, las columnas también se pueden colocar en camisas con agua que

provenga de un baño a temperatura constante.

Tipos de rellenos de la columna: En cromatografía de líquidos se han

utilizado dos tipos básicos de rellenos, pelicular y de partícula porosa. El primero

consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos

diámetros característicos de 30 a 40 µm. En la superficie de estas bolas se

deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o de una resina de

intercambio iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento

adicional, constituido por una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por

adsorción. Las bolas también se pueden tratar químicamente para obtener una

capa superficial orgánica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan

ampliamente en las pre-columnas y no en las columnas analíticas.

Los típicos rellenos de partículas porosas de cromatografía de líquidos están

formados por micro-partículas porosas con diámetros entre 3 y 10 µm y con la

menor dispersión posible para un tamaño determinado. Las partículas son de

sílice, alúmina o resinas de intercambio iónico, aunque la sílice es el material

más común. Las partículas de sílice se sintetizan aglomerando partículas de

sílice de tamaños inferiores al micrón en unas condiciones tales que se forman

partículas mayores con diámetros muy uniformes. Las partículas que resultan se

recubren muchas veces con películas orgánicas, que se unen química o

físicamente a la superficie.

Columnas UPLC

La UPLC es el resultado de una innovación que llevó al diseño holístico

simultáneo de una nueva tecnología de partícula para LC, un nuevo diseño de

columna, inyectores, bombas y detectores. La combinación de la mejora en

prestaciones de las columnas rellenas de material híbrido con tamaño de

partícula inferior a 2-μm y la capacidad única del sistema ACQUITY UPLC de

suministrar la fase móvil a alta presión y con una mínima dispersión, que

permite aprovechar al máximo los beneficios de ese nuevo material, produce

como resultado picos más estrechos y más concentrados. Los Sistemas ACQUITY

UPLC aumentan el rendimiento y reducen el consumo de eluyente sin

comprometer los resultados analíticos.

El lanzamiento de la UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography, ha sido

uno de los avances más significativos en la ciencia de las separaciones en la

última década. El rendimiento de la HPLC limitaba su eficacia. Los laboratorios

ligados al uso del HPLC no podían seguir el ritmo creciente de demandas de

analizar más muestras, más rápidamente y con resultados más fiables. Eso llevó

a inventar una nueva categoría en prestaciones cromatográficas.

Detectores

A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografía de líquidos no

hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores

de ionización de llama y de conductividad térmica. Uno de los mayores retos en

el desarrollo de la cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los

detectores.

Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las

propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción

de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea

sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de

HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento

de banda.

Los detectores en cromatografia de líquidos son de dos tipos básicos. Los

detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una

propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante

dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por

contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a

alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o

intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil. En la Tabla 1 se

indican los detectores más comunes empleados en HPLC y algunas de sus

propiedades más importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos

publicados en los que tenía un papel importante la cromatografia de líquidos,

reveló que el 71 % se utilizaban en la detección de la absorción UV, el 15% la

fluorescencia, el 5,4% el índice de refracción, el 4,3% empleaba medidas

electroquímicas y el 4,3% restante otras medidas.

Detectores de absorbancia

La Figura 5 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la

medida de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatográfica. A fin

de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumnar, el volumen de estas

cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volúmenes se limitan por lo

común de 1 a 10 µL y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilización de

cubetas de este tipo está restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.

Tabla 1. Características de los detectores de HPLC

Figura 5.- Celda de detector ultravioleta en HPLC

Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno

de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce

su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan

detectores fotoeléctricos contrastados. También se utilizan instrumentos de un

solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan

en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la

absorbancia.

Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros

Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con

una lámpara de mercurio como fuente. Lo más común en estos casos es aislar la

línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos también se

pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros.

Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza de forma restringida para

aquellos solutos que absorben a alguna de estas longitudes de onda. Algunos

grupos funcionales orgánicos y diversas especies inorgánicas exhiben una banda

ancha de absorción a una o más de esas longitudes de onda.

Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores

La mayoría de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que

consisten en un espectrofotómetro de barrido con óptica de red. Algunos se

limitan a la radiación ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiación

ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos operacionales. Por

ejemplo, se puede obtener el cromatograma completo a una sola longitud de

onda o alternativamente, cuando los picos que eluyen están suficientemente

separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. En este

caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la mejor longitud de

onda en cada caso. Cuando se desean los espectros completos con fines de

identificación, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente

que permita el barrido de la región de longitud de onda que interesa.

Los detectores espectrofotométricos de ultravioleta más potentes son los

instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de

instrumentos, que permiten recoger los datos de un espectro completo en

aproximadamente un segundo. De esta forma, los datos espectrales para cada

pico cromatográfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo

de la columna. Una de las formas de presentación de los datos espectrales, que

resulta útil para la identificación de las especies y para elegir las condiciones de

la determinación cuantitativa, consiste en un gráfico tridimensional tal como el

que se muestra en la Figura 6 En este caso, los espectros se obtuvieron a

intervalos de cinco segundos. La aparición y desaparición de cada uno de los

esteroides en el efluente de la columna resulta evidente.

Figura 6.- Espectros de absorción del efluente de una columna de HPLC

tomados a intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo.

Comercialmente se ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con

barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro

semicirculares. El segundo, mucho más sofisticado, es un tipo de detector

infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier.

Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiación

ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de

fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los

volúmenes de 1.5 a 10 µL. Los instrumentos de infrarrojo más sencillos pueden

trabajar a una o más longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener

los espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elución. Los

instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera análoga a los

instrumentos de series de diodos para las medidas de absorbancia ultravioleta

que se han descrito en la sección anterior.

Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a

la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo,

las bandas anchas de absorción infrarroja del agua y de los alcoholes impiden

prácticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones.

Detectores de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los

fluorímetros y espectrofluorímetros. En la mayoría de ellos, la fluorescencia se

detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente

respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente

de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación

fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia

probablemente se basarán en el uso de fuentes de láser sintonizables, las cuales

permiten una mayor sensibilidad y selectividad.

Una ventaja inherente a los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad,

que resulta ser más de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de

absorbancia. En cromatografía de líquidos se ha aprovechado esta ventaja para

la separación y determinación de los componentes fluorescentes de las

muestras.

Detectores de índice de refracción

Estos detectores miden la diferencia de índice de refracción, entre el disolvente

que en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el

efluente de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos

están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo de modo que si

las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación

de un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la

superficie fotosensible del detector provoca una variación de la señal de salida,

la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma.

Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi

todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores

de llama en cromatografia de gases. Además, son fiables y no dependen del

caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han

de mantener a una temperatura constante en unas pocas milésimas de grado

centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros

detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente.

Detector de dispersión de luz

Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la

HPLC, el detector de dispersión de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la

columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla

mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las finas gotitas se llevan a través de un

tubo de conducción a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación

de la fase móvil, lo que origina unas finas partículas de analito. La nube de

partículas de analito pasa a través de un haz láser. Mediante un fotodiodo de

silicio se detecta la radiación dispersada perpendicularmente al flujo. Una de las

mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser

aproximadamente la misma para todos los solutos no volátiles. Además es

notablemente más sensible que el detector de índice de refracción.

Detectores electroquímicos

Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de

detectores electroquímicos. Estos dispositivos se basan en cuatro métodos

electroanalíticos que incluyen la amperometría, la voltamperometría, la

coulombimetría y la conductimetría.

Calibración Tratamiento y Evalucación de datos

El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de señal

electrónica, y así no es visibles a nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma-

papel-registrador gráfico se utilizaba muy popularmente. Hoy en día, una

computadora con un posesor de base de datos (integrador) es más común. Hay

varios tipos de procesadores de datos, e incluye un sistema simple que consiste

en construir la impresora y el procesador de textos, y un tipo de computadora

personal que consta de monitor, teclado e impresora. También hay programas

que están diseñados específicamente para el sistema LC. Ofrece no sólo la

adquisición de datos, pero también cateréticas como máximo de ajuste, la

corrección de línea base, el cálculo automático de la concentración, la

determinación del peso molecular, etc.

Cuantificación

El uso de la cromatografía se ha extendido en todo el mundo, en las últimas

cuatro décadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porque se

puede realizar un análisis cuantitativo de las especies proporcionadas. En la

cromatografía en columna, el análisis cuantitativo se basa en la comparación de

la altura, o del área, del pico del analito con la de uno o más patrones

inyectados bajo las mismas condiciones cromatográficas. El uso de una u otro

termino dependerá de las características de la banda obtenida, aunque en la

actualidad con el uso de sistemas de integración de área computarizados, la

precisión es muy alta para el cálculo de área, sin embargo siempre es

importante conocer las otras herramientas a utilizar para calcular el área de una

banda y en qué momento es mejor usar altura en vez de área por si llega a

faltarle sistema computarizado.

Para lograr un análisis cuantitativo de los componentes separados de una

muestra existe una gran variedad de métodos de análisis entre los que se

pueden mencionar:

Calibración absoluta

Método del estándar interno y normalización de área (con y sin factor de

respuesta) Cada método tiene sus ventajas y desventajas.

Curva de calibración

Para realizar el cálculo de composición, se inyecta masas exactas del

componente puro al cromatógrafo y se determina el área. Se realiza un gráfico

relacionando el área de pico con la masa, se obtendrá entonces una curva de

calibración que debe ser lineal y pasar por el origen.

Figura 7.- Curva de Calibración.

La ecuación de esta curva vendrá dada entonces por

Entonces se inyecta una masa exacta de la muestra (Winj) y se determina el

área del componente a analizar, por ejemplo el componente A, de la curva

extrapolando la masa de

A por y después se aplica la siguiente ecuación:

Las desventajas de este método son que la inyección de la muestra debe ser

exacta y que las condiciones del sistema no deben cambiar de una inyección a

la otra. Las inyecciones exactas se logran más con un sistema automatizado de

inyección o con el uso de válvulas de inyección manuales con lazo de volúmenes

exactos como el caso de cromatografía liquida de alta resolución.

Cálculo de sensibilidad: Límite de detección y límite de

cuantificación

Sensibilidad: este parámetro se evalúa mediante la estimación del límite de

cuantificación (Lc) y el límite de detección (Ld). Para ello es necesario trabajaron

con diferentes concentraciones, respectivamente.

Límite de detección: “la menor cantidad de analito que puede detectarse en

una muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, bajo las condiciones del

experimento indicadas. Así, las pruebas de límite confirman simplemente que la

cantidad de analito se encuentra por encima o por debajo de un cierto nivel.”

Límite de cuantificación: “La menor cantidad de analito en una muestra que

puede determinarse con precisión y exactitud aceptables bajo las condiciones

del experimento establecidas”. En esencia, idéntico a ICH Q2A Límite de

cuantificación (LC) = límite de cuantificación (LOQ). Los métodos mencionados

serán de gran ayuda a la hora de realizar la estandarización del método. Sin

embargo, es importante aclarar que en este documento no se pudo lograr un

tratamiento estadístico completo debido a problemas técnicos presentados con

el cromatógrafo de gases.

Estándar interno

1) Se agrega una cantidad igual del estándar (SI) a la solución de calibrado y

a las muestras de modo de tener la misma concentración del estándar

2) Se inyecta la solución de calibrado (concentración conocida C1 del

componente a cuantificar)

3) Se mide el área de las señales del componente a cuantificar (A1) y del SI y

calculo el factor de respuesta relativo:

4) Se inyecta la muestra problema (que contiene una cantidad conocida de

SI) y mido el área de la señal del componente a cuantificar y del SI.

5) usando el factor F calculo la concentración del componente en la muestra

inyectada C’1

Ventajas

• Es independiente del volumen de inyección

• No requiere precisión en la preparación de la solución de SI ni conocer su

pureza, solo agregar la misma cantidad a muestras y solución de calibrado

• Es independiente de los errores por diluciones una vez agregado el SI

• Es independiente de variaciones en el flujo o en las condiciones de corrida

Desventajas

• Requiere disponer de una sustancia (el SI) que no se superponga con ninguno

de los componentes de la muestra y que sea eluida en las mismas condiciones

• La preparación de muestras y soluciones de calibrado es más laboriosa.

Estándar externo

1) Inyecta una masa conocida M1 del componente a cuantificar (solución de

calibrado de concentración C1)

2) se mide el área de la señal (A1) y calculo el factor:

3) inyecto la muestra problema y mido el área de la señal del componente a A’1.

Se Cuantificar.

4) usando el factor calculo la masa del componente en la muestra inyectada y/o

la concentración.

Ventajas

• Sencillo de implementar

Desventajas

• Requiere volúmenes de inyección precisos y reproducibles

• Requiere una gran estabilidad en el tiempo del sistema cromatográfico (flujos,

ancho de picos, etc.)

• Si se pasan varias muestras, debe inyectarse la solución de calibración

periódicamente (por ejemplo cada 3 o 5 muestras) para verificar que el sistema

está estable

• El método es susceptible a errores introducidos al hacer diluciones, etc.

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente,

debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibración) y/o

inyectar cantidad de estándar externo acorde a cada muestra.

Referencias

• http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l%C3%ADquid a

• Skoog W., Holler J., Nieman T, 2001, Principios de análisis instrumental.

Quinta edición, Madrid, España, Editorial Mc Graw-Hill/Interamericana.

• http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8248/4/T4cromatliquid.pd f

• http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%AD a

• http://es.wikipedia.org/wiki/Coeficiente_de_repart o

• http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/

cromatografia/cr o matografia_liquida_de_alta_eficacia.pd f