I. GENERALIDADES DE LAS CORINEBACTERIAS

Las corinebacterias, forman parte de la subdivisión Actinomicetos de las eubacterias Gram positivas. Los microorganismos del género Corynebacterium comparten las siguientes características:Paredes celulares quimiotipo IV con ácido meso-diaminopimélico (meso-DAP), arabinosa y galactosa;Ácidos micólicos de aproximadamente 22 a 36 átomos de carbono de longitud

(ácidos corinomicólicos).

Ácidos grasos celulares de cadena recta saturados y no saturados. Menaquinonas dihidrogenadas, con 8 o 9 unidades de isopropeno. Un contenido G+C de aproximadamente 51 a 68 mol %.

La aplicación de técnicas de análisis de secuencias de 16S ANRr y estudios de hibridación, han demostrado que dentro del género Corynebacterium, las especies C. diphteriae, C. ulcerans y C pseudotuberculosis conforman el Grupo C. diphteriae. Estas tres especies comparten, entre otras características, la posibilidad de poder hospedar al bacteriófago que induce la producción de la exotoxina diftérica. Hasta la actualidad no se han reportado casos de difteria en humanos causados por las especies C. ulcerans y C. pseudotuberculosis. Ambas especies producen unafosfolipasa D con idénticas características.

II. Corynebacterium pseudotuberculosis

SINONIMIA: Bacillus pseudotuberculosis ovis, Bacillus pseudotuberculosis, Corynebacterium ovis, bacilo de Preisz Nocard.

Cepas de distintos orígenes de esta especie han sido estudiadas y presentaron variabilidad en las características bioquímicas. En base a ello, se han propuesto dos biotipos por su capacidad de producir la enzima nitrato reductasa y diferencias en las técnicas de fingerprinting DNA (Brown & Olander 1987). Las mismas son referidas como biovariedad equi para los aislamientos que reducen nitratos y la biovariedad ovis para aquellas cepas que no presentan dicha capacidad (Songer et al. 1988). Las cepas aisladas de pequeños rumiantes son nitrato-negativo, por el contrario las positivas fueron aisladas en caballos y ambos biotipos fueron aislados de vacunos. No se ha registrado la transmisión natural entre diferentes especies animales

ECOLOGÍA

Reservorio: C. pseudotuberculosis se encuentra en las lesiones, en el tracto gastrointestinal de las ovejas sanas y en el suelo de las corralizas de las ovejas. Se desconoce el reservorio del tipo equino. Transmisión: La transmisión tiene lugar principalmente a través de heridas de piel, como son los cortes del esquileo y laspicaduras de artrópodos.

III. MORFOLOGÍA Y TINCIÓN

C. pseudotuberculosis es una bacteria diferoide típica. Es un bacilo grampositivo inmóvil, no esporulado, no es ácido resistente, no pose cápsula y con frecuencia contiene gránulos, es anaerobio facultativo y fermentador. Este microorganismo oscila desde formas de bacilos delgados hasta las filamentosas. Su tamaño puede variar de0.5 a 0.6 µm de diámetro por 1.0 a 3.0 µm de longitud. Tiende a la formación de letras chinas y agrupaciones en empalizada.

En las lesiones naturales es muy pleomórfico, pero en medios artificiales es uniformemente cocoide. Se tiñe fácilmente pero de modo irregular, por los colorantesordinarios.

IV. CARACTERISTICAS CULTURALES

Es aerobio y anaerobio facultativo. Crece óptimamente a 37 ºC y pH 7,0 – 7,2. El crecimiento es más abundante si se adiciona suero (de equino) a los medios y en medios como agar suero, agar Löeffler, agar infusión con sangre, agar sangre y agar chocolate. Puede aislarse a partir de las lesiones primarias de la enfermedad, pero en la superficie del agar se desarrollan solamente unas pocas colonias. Cuando se extienden éstas sobre la superficie del medio, se produce un crecimiento uniforme y abundante.

C. pseudotuberculosis desarrolla en agar sangre, dentro de las 48 a 72 h de incubación a 37°C, las colonias son diminutas, convexas, de color blanco grisáceo muy semejante a las colonias de estreptococos, a medida que envejecen se tornan opacas, con anillos concéntricos, secas, semejantes a rosetas y de color crema; además producen una tenue beta hemólisis (hemólisis completa).

Si se agrega el telurito de potasio al agar sangre o al agar chocolate, éstos se van a convertir en medios selectivos diferenciales en los que las colonias desarrolladas son negras o grises. En los medios líquidos crecen con sedimento granular y una película delgada.

V. ASPECTOS PATOGÉNICOS

MECANISMOS

C. pseudotuberculosis: Es un parásito intracelular facultativo, es proteolítico. Posee el antígeno “O” (polisacárido termoestable responsable de la reactividad cruzada con micobacterias y nocardia). La importancia de C. pseudotuberculosis como patógeno in vivo, radica en la presentación de varios factores de virulencia, que incluyen glucolípidos y ácidos micólicos de la pared celular, y las exoenzimas fosfolipasa D de efectos letales en animales como cobayos, conejos y ovejas; esta toxina aumenta la permeabilidad de la red vascular local facilitando su difusión y a la esfingomielinasa, así también al lípido tóxico de su pared celular que le otorga resistencia a la destrucción por los lisosomas y además destruye a los fagocitos.

La actividad sinérgica de las exoenzimas con la exotoxina de Rodhococcus equi provoca la lisis de glóbulos rojos en agar y es la base de la prueba de inhibición de la hemólisis sinérgica (IHS) (Aleman & Spier 2001).

La fosfolipasa D fue inicialmente estudiada por Carne en 1939 (Brown y Olander 1987) quien describió sus propiedades físicas y de patogenicidad. Estructuralmente es una glicoproteína con una composición de aminoácido similar a la de colágeno. La toxina es inactivada por calentamiento a temperaturas mayores de 60°C, por conservación por largos períodos a temperatura ambiente, a pH ácido o por formalina (Brown & Olander 1987). Además como otro factor de patogenicidad se ha consignado un lípido de pared celular análogo al factor cordón de Mycobacterium tuberculosis, que causadegeneración de fagocitos y necrosis hemorrágicas cuando es inyectadointradérmicamente en animales de laboratorio (Coyle y Lipsky 1990, Mohan et al. 2001).

PATOLOGÍA

La infiltración de neutrófilos y la lesión del endotelio son características de los primeros cambios. Las lesiones son abscesos, pero permanece localizado cuando falta la toxina o cuando ésta ha sido neutralizada. Su distribución, su curso y su aspecto son distintos en las diferentes especies y según las vías de inoculación, aunque la implicación de los

ganglios linfáticos es constante. El exudado tiene con frecuencia un tono verdoso. La consistencia varía sobre todo de acuerdo con el tiempo de la lesión, desde cremosa a seca y desmenuzable. Los abscesos antiguos están integrados por macrófagos muertos, con neutrófilos en superiferia, por células gigantes y por tejido fibroso.

Epidemiologia

La opinión es que C. pseudotuberculosis es parásito de los animales y únicamente se encuentra accidentalmente en el suelo. En las ovejas, el esquileo, el raboteo y los baños, son factores importantes en la diseminación de la infección. En las cabras, se deben tener en cuenta el contacto directo, la ingestión y los vectores artrópodos. La frecuencia de la infección aumenta conforme aumenta la edad. La linfoadenitis caseosa ovina es una de las infecciones bacterianas importantes de los pequeños rumiantes. Las hipótesis relativas a la exposición de los équidos ya han sido expuestas. No se ha observado que la enfermedad tenga predilección por alguna edad concreta. Secree que la linfangitis ulcerosa refleja un mal manejo.

VI. PATOGENICIDAD EN ANIMALES DOMÉSTICOS Y DE

LABORATORIO

La mayoría de las formas de infección son crónicas.

ÓVIDOS Y CÁPRIDOS: El C. pseudotuberculosis produce linfoadenitis caseosa; enfermedad caracterizada por la necrosis de caseificación de los ganglios linfáticos. Las lesiones suelen estar localizadas en los ganglios superficiales, pero no son raros los casos de generalización, en lo que los abscesos se distribuyen por todo el cuerpo.Habitualmente se atribuye a una infección de la piel. Después de una inflamación inicial difusa, se forman múltiples abscesos, los cuales se funden unos con otros y se encapsulan. Las células inflamatorias se disponen alrededor de la capsula, añadiendo una capa de supuración y una nueva cápsula. Varios de estos ciclos confieren a las lesiones, especialmente en los óvidos, un aspecto de “rodaja de cebolla”.

Las lesiones antiguas adquieren una capsulan gruesa y fibrosa. El estado de salud general no está afectado a no ser que tenga lugar la diseminación a otros ganglios linfáticos, a las vísceras que provocan un enflaquecimiento progresivo(síndrome de las ovejas flacas).

CABALLOS: C. pseudotuberculosis causa linfangitis ulcerosa (una infección de los miembros inferiores), abscesos en la región pectoral y ventral del abdomen, y abscesos internos.

Los abscesos, ascienden por los ganglios linfáticos, habitualmente por los de las extremidades posteriores, iniciándose a nivel de la articulación del menudillo además en los músculos del tórax y de la región abdominal caudal de los caballos. Su progresión hacia la región inguinal está caracterizada por inflamación y por la formación de abscesos, los cuales se abscedan, dejando úlceras a lo largo de su recorrido. La diseminación hematógena es rara. En ocasiones otras regiones corporales que no son las extremidades resultan afectadas. No se conoce el mecanismo de infección, pero su frecuencia máxima estacional (otoño) y su limitación a una determinada zona geográfica hace pensar en un vector artrópodo. Las lesiones de la habronemosis cutánea del vientre y una dermatitis del vientre medio debida a la actividad de la mosca hematófaga (Haematobius irritans), son posibles puertas de entrada para el microorganismo. Síntomas tales como la inflamación, el dolor y al cojera, dependen tanto de la localización como del tamaño de los abscesos. Rara vez se presenta septicemia, aunque se pueden producir abortos, abscesos renales, enflaquecimiento, y muerte.

El acné contagioso (enfermedad pustulosa de los caballos del Canadá) es una foliculitis poco frecuente de los caballos debido a la infección por C. pseudotuberculosis.

BOVINOS: En el ganado vacuno, las bacterias más comúnmente causan granulomas excoriadas cutáneas. Grandes, infecciones cutáneas (dermatitis) con intervención de los ganglios linfáticos. Estos episodios con frecuencia son agudos y pueden tener carácter epidémico. La infección progresiva es rara. Laslesiones cutáneas ulcerosas asemejan tejido de granulación infectado ylinfangitis puede ocurrir en 2-5% de las vacas. Ubicación en el animal es variable, pero a menudo está asociada con trauma de la piel. Generalmente, la recuperación se produce sin tratamiento o con tratamiento tópico limitada en 2-4 semanas. También pueden producirse aborto y mastitis. En raras ocasiones, la afectación visceral ha sido reportada en el ganado.

ANIMALES DE LABORATORIO: La inoculación intravenosa o subcutánea en animales de laboratorio, causa un extenso daño y necrosis hemorrágica diseminada cuando se inyecta en animales de laboratorio. En el cobayo una inyección intravenosa le causa la muerte entre 4 – 10 días, con formación de abscesos en pulmones e hígados. En el cobayo macho la inyección intraperitoneal produce orquitis típica del bacilo muermoso.En pequeños rumiantes la inoculación intravenosa o subcutánea de la toxina sola o en combinación con cepas viables de C. pseudotuberculosis, causa un edema masivo en el área de inoculación y progresa en 48 hs a una anemia hemolítica fulminante con necrosis y edema pulmonar. La exotoxina ha sido caracterizada "in vivo" como una

hemolisina parcial dado que causa desorganización en las membranas de glóbulos rojos que posteriormente son removidos por el sistema retículo endotelial (Brown y Olander 1987, Johnson et al. 1993). Los pocos casos de infecciones humanas que se conocen, generalmente fueronconsecuencia del contacto con los animales y fueron principalmente linfoadenitis benignas.

VII. DIAGNÓSTICO

Comprende el diagnóstico clínico, microbiológico y también el análisis histopatológico. La semejanza de la enfermedad producida por este microorganismo con otros procesos es tan grande que para el diagnostico es esencial el aislamiento e identificación del agente causal.El diagnóstico diferencial con otras patologías, que se manifiestan con

abscesos de características similares, es sumamente importante. Entre ellas infecciones causadas por Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., Actinomyces, Mycobacterium tuberculosis y paratuberculosis, traumatismo, serosa, cuerpos extraños, reacciones de sensibilidad a inyectables y menos comunes, tumores (Aleman & Spier 2001, Burrel 1980, León et al. 2002b).El diagnóstico diferencial incluye piodermia, abscesos, linfangitis de otras

bacterias (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Rhodococcus equi, Streptococcus spp, o Dermatophilus spp), dermatofitosis, esporotricosis, equino criptococosis,blastomicosis norteamericana y la oncocercosis.

A. DIAGNÓSTICO CLÍNICO

EN EL OVINO: El diagnóstico presuntivo de la infección por C. pseudotuberculosis en el animal vivo, se basa en la palpación de ganglios superficiales, estos se encuentran agrandados, las características macroscópicas de los exudados, signos clínicos como fiebre o pérdida de peso, y datos epidemiológicos como la prevalencia local, la edad del ovino.

La ecografía abdominal es útil para la detección de infección interna del hígado, el bazo o los riñones. La ecografía también es útil para la detección y el drenaje de los abscesos profundos que causan cojera, en particular en la musculaturadel tríceps.

B. ANÁLISIS HISTOPATOLÓGICO

Se observa en general un centro amorfo y eosinófilo de necrosis rodeado por una delgada capa de linfocitos, células plasmáticas, algunas células epitelioides yneutrófilos, bordeado por una red de fibroblastos (León et al. 2002b).

C. DIAGNÓSTICO MICROBIÓLÓGICO

El diagnóstico definitivo se establece a través del cultivo del microorganismo a partir de abscesos obtenidos por necropsia o procedimientos quirúrgicos (Aleman & Spier 2001, León et al. 2002b). Por ejemplo en el equino: Las muestras para cultivo incluyen aspirados de abscesos, hisopado de exudado purulento que se encuentran debajo de las costras asociados, aspirado transtraqueal son necesarios para confirmar la neumonía causada por C. pseudotuberculosis.

ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO: Incluye microscopía y cultivo de las muestras. Las coloraciones microscópicas incluyen Gram y Ziehl Neelsen para realizar el diagnostico diferencial con infecciones producidas por bacilos ácido alcohol resistentes (Chirrido-Zarraga et al. 2005). En la coloración Gram de lasmuestras, se pueden reconocer formas cocobacilares positivas en masa.

CULTIVO: Los cultivos de muestras de pus en placas de agar-sangre e incubadas durante 24-48 horas producen colonias diminutas, blancas, secas y rodeadas de una ß hemólisis tenue, correspondientes a bacilos cortos positivos, algunos agrupados en empalizada que se pueden hacer deslizar intactas sobre la superficie del agar.

PRUEBA DE INTENSIFICACIÓN DE HEMÓLISIS: El ensayo de hemólisis sinérgica frente a Rhodococcus equi e inhibición de la ß - hemolisina del Staphylococcus aureus, ambas pruebas positivas, ponen en evidencia la producción de exotoxinas de C. pseudotuberculosis (Songer et al. 1988).

PROCEDIMIENTO: En placa de agar sangre se siembra Rhodococcus equi en estría simple y diametralmente; perpendicularmente a ella y en estría simple se siembra a Corynebacterium pseudotuberculosis; la hemólisis producida por estaúltima se intensifica a lo largo de la línea.

INHIBICIÓN DE LA ß - HEMOLISINA DEL Staphylococcus aureus

INOCULACIÓN: No es una práctica frecuente debido al periodo que demora. OTROS: Awad describió una reacción de aglutinación en portaobjeto, que consideró eficaz para el diagnóstico de la enfermedad en el ovino. La prueba de reducción de nitratos a nitritos diferencia los biotipos de C. pseudotuberculosis biovariedad ovis y equi (Leardini et al. 2002, Vay y Almuzara 2002).

ENSAYOS SEROLÓGICOS: Se basan en técnicas de inmunofluorescencia indirecta, microaglutinación, inmunodifusión, IHS, fijación de complemento y diferentes procedimientos de ELISA (Kaba et al. 2001). Entre los métodos mencionados, se resaltan las pruebas de ELISA (detección de anticuerpos frente a la toxina) e IHS (Las pruebas serológicas con la prueba de inhibición de hemólisis sinérgica, que detecta IgG a la exotoxina de la fosfolipasa D, es uncomplemento útil para el diagnóstico de infección interna con foliculitis).

Se han evaluado sistemas comerciales para la identificación de corynebacterias como el sistema API CORYNE identification system (Biomerieux, France), API20S system (Analytab Productos, NY), entre otros. Estos sistemas incluyen test enzimáticos y de fermentación de azúcares. Los métodos rápidos ayudan en la identificación pero no superan la precisión de los métodos microbiológicos convencionales, debido a que requieren de pruebas adicionales para arribar a la identificación final (Coyle y Lipsky 1990, Funke et al. 1997, Hommez et al. 1999, Lipsky et al. 1982).

PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS

1. UREASA NEGATIVO2. UREASAPOSITIVO

VIII. ASPECTOS INMUNOLÓGICOS

Las respectivas funciones de los anticuerpos y de las respuestas mediadas por células que tienen lugar durante las infecciones son dudosas. La antitoxina impide la diseminación de los abscesos. La linfoadenitis caseosa puede ser progresiva, y los abscesos de los équidos recidivan.

En los óvidos, las asociaciones bacterina-toxoide impiden la diseminación (aunque no protegen frente a la infección) por lo menos durante un año inducen respuestas protectoras tanto en las cabras como en los caballos.

Entre las vacunas disponibles para inmunización de ovinos y caprinos se encuentran la vacuna USDA (Nacional Animal Disease Center, Ames, IA USA) que contiene pared

celular de C. pseudotuberculosis no viable con o sin muramyl dipéptido y la vacuna GlanvaCTM6 (CSL Limited, New Zealand), que es una vacuna multicomponente que incluye antígenos ultrafiltrados de C. pseudotuberculosis, Clostridium perfringens tipo D, Clostridium tetani, Clostridium novytipo B, Clostridium septicum y Clostridiumchauvoei.

IX. TRATAMIENTO Y CONTROL

En las ovejas y en las cabras, el tratamiento con antibióticos no es eficaz. El control está encaminado a limitar la exposición mediante la separación o selección de los animales afectados, y a unos escrupulosos cuidados higiénicos durante operaciones tales como el esquileo, los baños y las practicas quirúrgicas. Las asociaciones bacterina-toxoide pueden resultar eficaces para limitar las infecciones.En el caballo, la linfangitis e infección interna deben ser tratados con antibióticos a largo plazo. El organismo es susceptible a los agentes antimicrobianos más comúnmente administrados, sin embargo, el tratamiento antimicrobiano de los

abscesos externos no complicados puede prolongar la enfermedad al retrasar la maduración estos. La hinchazón de los abscesos externos se tratan con paños calientes, cataplasmas, o hidroterapia hasta que se rompan o se drenan quirúrgicamente. Los abscesos se deben lavar y enjuagar con soluciones diluidas antisépticas. Los abscesos profundos en el tríceps o región cuádriceps requieren ecografía para guiar la colocación de un drenaje permanente.

La Fenilbutazona alivia el dolor y la hinchazón. Además están indicados cuidados complementarios y de enfermería general. Si el tratamiento tiene éxito, la hinchazón retrocede gradualmente durante días o semanas. La Infección interna tiene una tasa de mortalidad de 30-40%, incluso con un tratamiento adecuado. Los casos severos o no tratados de linfangitis a menudo se vuelven crónicos y se produce fibrosis e inflamación de la pierna. Se recomienda para la prevención de la enfermedad: el aislamiento de los caballos infectados, control de moscas, y una buena higiene.

LA SELECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS: Hay que considerar diversos factores que afectan la terapia como:

La localización intracelular de microorganismo.

La encapsulación de los abscesos

La presencia de pus.

La necesidad de largos períodos de tratamiento, el riesgo de complicaciones y el costo .

Las vacunas se administran a ovejas y cabras (A.S.I.A. 1999, Paton et al. 1995). Las campañas de vacunación implementadas en países, como Australia, incluyen en ovinos una primera vacunación del animal a los 8 y a las 12 semanas de vida y la administración anual de una dosis (A.S.I.A. 1999, Paton etal.1995). En cabras se recomienda para mantener una inmunidad efectiva repetir la administración cada 6 meses. Pequeñas dosis de la vacuna son efectivas, previniendo y disminuyendo losefectos adversos por la enfermedad. La vacuna se aplica en la zona alta del cuello, cercana a la oreja, y puede causar la formación de un granuloma estéril en el sitio de inyección que persiste durante algunas semanas o meses (Alemán y Spier 2001). La inmunización debe ser acompañada con otras medidas de control para prevenir y eliminar la enfermedad (A.S.I.A.1999).Conjuntamente con el tratamiento antibiótico se sugiere en muchos casos la remoción quirúrgica del ganglio o la punción con aspiración del contenido y limpieza diaria con antisépticos como por ejemplo una solución de Yodo Povidona (A.S.I.A. 1999). Se ha observado que en pequeños rumiantes, el drenaje y la apertura de los abscesos no es usualmente utilizado para la resolución de la enfermedad, el tratamiento de elección sería la remoción de los nódulos linfáticos afectados (Alemán y Spier 2001).

C. pseudotuberculosis es sensible "in vitro" a antibióticos usados comúnmente en el tratamiento de infecciones bacterianas, tales como penicilina, trimetroprimasulfametoxasol, tetraciclina, eritromicina, cefalosporina, cloranfenicol y rifampicina, sin embargo, se ha observado fracasos en la terapias in vivo dado que el microorganismo suele estar encapsulado dentro de un nódulo linfático. (Aleman y Spier 2001, Coyle y Lipsky 1990, Judson y Songer 1991, Von Graevenitz y Krech 1992

Los aislamientos de la biovariedad ovis, son significativamente más resistentes a la mayoría de los aminoglucósidos, que los biovariedad equi: la causa es la incapacidad de síntesis de la enzima nitrato reductasa en los biotipos ovis dado que esta imposibilidad está asociada a una reducción de la habilidad de las células bacterianas de transportar aminoglucósidos y compuestos de estructura similar (Judson y Song