Identificación de extractos de plantas con efectos en la ...

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS

AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD IRAPUATO

Identificación de extractos de plantas con efectos en la

longevidad de Saccharomyces cerevisiae

Tesis que presenta

L.B.G. Sanjuanita Lizzeth Salazar Martínez

Para obtener el grado de

Maestro en Ciencias

En la especialidad de

Biotecnología de plantas

Directores de la Tesis Dr. Luis Rafael Herrera Estrella

Dr. Alexander de Luna Fors

Irapuato, Guanajuato Agosto 2016

Este trabajo se realizó en el Laboratorios 5: “Fisiología e ingeniería metabólica de

plantas” y el Laboratorio 6: “Biología de Sistemas Genéticos” del Laboratorio Nacional

de Genómica para la Biodiverisdad (LANGEBIO) del CINVESTAV-IPN Unidad

Irapuato, bajo la dirección del Dr. Luis Rafael Herrera Estrella y el Dr. Alexander de

Luna Fors, con el apoyo del CONACyT a través del programa de becas para el estudio

de posgrado CVU 563854 y del CINVESTAV-IPN a través de la beca de obtención de

grado.

Índice

- Dedicatoria i

- Agradecimientos ii

- Lista de abreviaturas iv

- Lista de figuras vi

- Lista de tablas viii

- Resumen 1

- Abstract 4

1.0 Introducción 7

2.0 Antecedentes 9

2.1 Procesos celulares e intervenciones del medio que promueven la longevidad y

retrasan el envejecimiento 9

2.2 Productos naturales que promueven el incremento de la duración de la vida 10

2.3 Saccharomyces cerevisiae como modelo para el estudio del envejecimiento 13

3.0 Hipótesis 17

4.0 Objetivo general 18

4.1 Objetivos específicos 18

5.0 Materiales y métodos 19

5.1 Elaboración de las bases de datos 19

5.2 Cepas de Saccharomyces cerevisiae y medios 19

5.3 Compuestos promotores de la longevidad 20

5.4 Plantas medicinales y preparación de extractos 20

5.5 Cinéticas de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae 23

5.6 Ensayo de longevidad – Envejecimiento cronológico de Saccharomyces

cerevisiae 23

5.7 Cromatografía en capa fina 25

6.0 Resultados 27

6.1 Bases de datos 27

6.2 Ensayo prueba usando siete compuestos identificados como promotores de

longevidad 28

Página

6.3 Efecto de treinta extractos de plantas medicinales en la supervivencia de

Saccharomyces cerevisiae 36

6.4 Efecto de seis extractos candidatos en la CLS de tres cepas referencia de


6.5 Perfil químico de los extractos que muestran efecto sobre la supervivencia de


6.6 Efecto del extracto de Eriobotrya japonica (níspero) en cepas mutantes de

genes relacionados al envejecimiento para identificar mecanismos de acción 62

7.0 Discusión 68

7.1 Los compuestos metformina, espermidina y rapamicina aumentan la CLS de


7.2 Seis extractos de plantas medicinales incrementan significativamente la CLS

de Saccharomyces cerevisiae 71

7.3 El efecto de los extractos candidatos sobre la CLS difiere de acuerdo a la

cepa de referencia donde se prueba 74

7.4 El extracto de Eriobotrya japonica interactúa con dos genes que están

relacionados al envejecimiento en Saccharomyces cerevisiae 75

8.0 Conclusión 80

9.0 Perspectivas 81

10.0 Referencias 82

- Anexo 1. Base de datos de compuestos promotores de la longevidad 89

- Referencias al Anexo 1 93

- Anexo 2. Base de datos de extractos crudos de plantas con efecto en la

longevidad 96


- Anexo 3. Base de datos de plantas medicinales 101


- Apéndice. Lista de medios 115

Página

i

Dedicatoria

A mis amados papás, Juany y Esteban, por ser mi todo. Por iluminar y guiar mi camino

aún en los momentos más oscuros. Porque ustedes siempre serán mi alma y mi corazón.

A mis hermanos, Emmanuel y Eduardo, por caminar siempre juntos. Por darme todo su

amor incondicionalmente. Porque ustedes son lo más maravilloso del mundo para mí.

A mi segunda mamá, Magda, por dedicarme un lugar especial en tu corazón. Porque sin

importar la distancia sé que estás conmigo.

A mis abuelitas, Elena y Natalia, porque son el tesoro más grande que tengo. Por

tenerme siempre en sus pensamientos y darme sin condición todo su afecto.

A la memoria de mis queridos abuelitos, Jesús y Jacinto, porque a pesar de la lejanía

corpórea, sé que su corazón está junto al mío y lo estará siempre.

Al hombre más increíble que he conocido, Rogelio, por todo tu amor, comprensión y

apoyo. Por permitirnos emprender juntos el viaje más fantástico y extraordinario de

nuestras vidas. Te amo.

“Puedes, deberías, y si eres lo suficientemente valiente para empezar, lo harás”.

Stephen King

ii

Agradecimientos

A mis papás, Juany y Esteban, por todo su amor y apoyo. Por permitirme abordar esta

aventura lejos de casa. Por secundar mis locuras para cumplir mis sueños y metas. Por

acompañarme hasta el fin del mundo. Los amo infinitamente.

A mis hermanos, Emmanuel y Eduardo, por nunca dejarme sola y estar al pendiente de mí,

ya que lo más duro de estar lejos fue el no poder verlos diariamente. Gracias por hacer de

mi estadía algo más llevadero con cada una de sus llamadas y mensajes.

A toda mi familia, en especial a mis abuelitas, a mi tía Magda y a Mini, por comprender mis

ausencias en momentos familiares importantes. Por recibirme en cada visita con los brazos

abiertos y una sonrisa, por volverme hacer sentir en casa.

Al doctor Luis Herrera, por darme la oportunidad de trabajar bajo su dirección y darme un

espacio en su laboratorio. Por dejarme hacer lo que más me gusta, la investigación,

permitiéndome crecer y fomentando mi lado crítico. Por darme un reto de trabajo con un

tema totalmente nuevo para mí y hacerme ver todo mi potencial, haciendo esta experiencia

invaluable.

Al doctor Alex de Luna, por abrirme las puertas de su laboratorio, ha sido una experiencia

gratificante trabajar bajo su dirección. Por mostrarme lo increíble que es trabajar con el

envejecimiento en levaduras, con el robot y con el análisis de miles de datos. Por estar al

tanto de cada extenuante experimento. Por alentarme y confiar en mí.

Al doctor Jorge Molina, por sus excelentes comentarios y por enriquecer mi proyecto con

nuevas ideas. Por adoptarme unos días en su laboratorio y apoyarme con los experimentos

de capa fina. Por entusiasmarse y llevarme en la búsqueda de nuevas muestras por todo el

Cinves para complementar mis experimentos.

Al doctor José Ruiz por darme la más inolvidable bienvenida al Cinvestav, he de confesar

que aún tengo sueños donde dice mi nombre preguntándome por una gráfica y que no sé

contestar. Infinitamente gracias por fomentar el siempre cuestionarme todo. Gracias por

iii

formar parte de mis tutores y por preguntar aquello que no había pensado y que le da un

nuevo giro al proyecto.

A mis compañeros y amigos del L5, Ara, Rosy, Sandy, Lolis, Lenin, Thelma, Gera, Javi,

Jonathan, Elohim, Félix, Alan y Libia, por siempre tener la disposición de discutir los

proyectos. Por las reuniones y la convivencia. Por hacer más amena mi estadía en el

laboratorio.

A mis amigos y compañeros del L6, Erika Garay, Diana, Sergio, Selene, Abraham, Alex,

Adriana, Johny, Erika y Jorge, por acogerme en el laboratorio y hacerme partícipe de él.

Por las convivencias dentro y fuera del laboratorio, por las innumerables discusiones en la

comida o a la hora del té de los tantos y múltiples temas que nos rondaban por la cabeza.

Por simplemente ser ustedes.

A las magníficas personas que conocí en el Cinvestav, a mis compañeros de generación,

pero sobre todo a las personas que sin buscar nada me entregaron su más sincera amistad y

que valoro con todo mi corazón. Muchas gracias por formar parte de mi segunda familia,

especialmente a Sara, Arlet y Rosy.

Al Conacyt, por brindarme el apoyo económico para poder realizar mi proyecto de

maestría. Al Cinvestav Irapuato, por hacerme parte de sus filas de estudiantes con sed de

conocimiento. Al Instituto de Biología de la UNAM, especialmente al doctor Javier

Caballero, al maestro Francisco Basurto y a Laura Cortés; y al Cicy, en especial a la

maestra Clarisa Jiménez y a Verónica Limones, por su apoyo para la adquisición de las

especies de plantas medicinales. Al doctor Alfredo Herrera por facilitarme especies de

hongos patógenos para un experimento prueba. A Paulina, Marisa, Juan y Mary, del grupo

de Fitoquímica, por su apoyo y paciencia en los ensayos de HPTLC.

Finalmente, no me bastan las palabras para decirte lo mucho que agradezco todo lo que

has hecho por mí y para mí, Rogelio. Gracias por estar conmigo en las extraordinarias, las

increíbles, las buenas, las malas, las más malas, las pésimas y las peores. Por darme esa

palabra de aliento que tanto necesitaba, por darme lo justo, en el momento exacto, para no

desistir y dejarme caer. Por alentarme y estar junto a mí, aún en la distancia, porque yo

siempre te sentí cerca. Desde siempre y para siempre.

iv

Lista de abreviaturas

% – Por ciento

/ – Y

: – A

:: – Sustituido

= – Igual

& – Y

o – Grados

oC – Grados Celsius

– Alfa

– Beta

– Nulo

L – Microlitros

m – Micrómetro

M – Micromolar

ADN – Ácido desoxirribonucléico

AMP – Adenosil mono fosfato

ANOVA – Análisis de varianza

CICY – Centro de Investigación Científica de Yucatán

cm – Centímetros

et al. – Y colaboradores

FDA – Food and Drug Administration = Agencia de Drogas y Alimentos

g – Gramos

g/L – Gramos por litro

Gto – Guanajuato

h – Horas

v

HPLC – High Performance Liquid Chromatography = Cromatografía líquida de

alta resolución

In – Logaritmo natural

mg – Miligramos

min – Minutos

mL – Mililitros

mL/L – Mililitros por litro

mM – Milimolar

NAD+ – Nicotin adenin dinucleótido oxidado

nm – Nanómetros

nM – Nanomolar

OD – Optical Density = Densidad óptica

RF – Relación de frentes

rpm – Revoluciones por minuto

SC – Sintético Completo

sp – Sin especie

UNAM – Universidad Nacional Autónoma de México

WT – Wild Type = Silvestre

X – Por

YNB – Yeast Nitrogen Base = Base nitrogenada para levadura

YNB-lf – Yeast Nitrogen Base – low fluorescence = Base nitrogenada para

levadura de baja flourescencia

YPD – Yeast Extract Peptone Dextrose = Extracto de levadura peptona

dextrosa

vi

Lista de figuras

Figura Descripción Página

1 Especies de plantas medicinales ensayadas. 22

2 Arreglos de las placas para cada experimento. 24

3 Ensayo de la longevidad. 26

4

Cinéticas de crecimiento y análisis multivariable de la tasa de

duplicación (T) para poblaciones tratadas con compuestos

promotores de longevidad.

30

5

Curvas del porcentaje de la supervivencia de las poblaciones con los

compuestos que tienen efecto en la CLS de S. cerevisiae, y su análisis

estadístico.

33

6 Curvas del porcentaje de la supervivencia de las poblaciones con los

compuestos que no presentan efecto en la CLS de S. cerevisiae. 35

7 Curvas del porcentaje de la supervivencia de las poblaciones de

levadura incubadas con los extractos de infusiones acuosas. 38


levadura incubadas con los extractos de decocciones acuosas. 42


levadura incubadas con los extractos etanólicos. 46


levadura incubadas con los extractos metanólicos. 48

11

Curvas del porcentaje de supervivencia de tres cepas de referencia

incubadas con la infusión de hojas de Bidens pilosa, y su análisis

estadístico multivariable.

51

12

Curvas del porcentaje de supervivencia de dos cepas de referencia

incubadas con la infusión de flores de Calendula officinalis, y su

análisis estadístico multivariable.

52

vii

Lista de figuras (Continuación)

Figura Descripción Página

13


incubadas con la infusión de hojas de Lavandula angustifolia, y su

análisis estadístico multivariable.

54

14


incubadas con la decocción de hojas de Eriobotrya japonica

(UNAM), y su análisis estadístico multivariable

55

15


incubadas con la decocción de hojas de Eriobotrya japonica

(parque), y su análisis estadístico multivariable.

56

16


incubadas con extractos metanólicos, y su análisis estadístico

multivariable.

57

17 Resultados del análisis por HPTLC de los extractos candidatos para

identificar patrones de sus compuestos fenólicos. 61

18 Resultados del análisis por HPTLC de los extractos candidatos para

identificar patrones de actividad antioxidante. 61

19

Curvas del porcentaje de decaimiento de las cepas mutadas en genes

relacionados con el envejecimiento por aumentar la supervivencia,

tratadas con extracto de níspero al 5%, y su análisis estadístico

multivariable..

65

20

Curvas del porcentaje de decaimiento de las cepas mutadas para

genes relacionados con el envejecimiento por disminuir la

supervivencia, tratadas con extracto de níspero al 5%, y su análisis

estadístico multivariable.

67

21 Vías regulatorias involucradas en incrementar la duración de la vida

cronológica de la levadura (Longo et al., 2012). 77

viii

Lista de tablas

Tabla Descripción Página

1 Concentración de compuestos promotores de longevidad. 28

2 Composición química reportada previamente para los extractos

candidatos. 60

1

Resumen

El envejecimiento es un proceso complejo causado por diversas vías moleculares que se

ven influenciadas por factores genéticos y ambientales. Éste se define como la

disminución de funciones y de la resistencia al estrés a través del tiempo, ocasionando el

aumento en la mortalidad. Los efectos están relacionados con la acumulación continua

de estresantes, que incrementan el daño a biomoléculas, comprometiendo eventualmente

la homeostasis celular (Argyropoulou et al., 2013). Por lo anterior, el envejecimiento es

el factor de riesgo más importante en padecimientos crónicos como el cáncer, las

enfermedades cardiovasculares, las enfermedades neurodegenerativas y la diabetes,

entre otros (Longo et. al., 2012; Masoro, 2009).

La intervención que se ha estudiado por su efecto en extender la longevidad de

los organismos es el uso de compuestos naturales. La metformina, el extracto de ginseng

y una lista creciente son ejemplos de compuestos obtenidos de plantas medicinales que

se usaron originalmente para combatir enfermedades que se desarrollan en la vejez y que

posteriormente se identificó que tenían efectos en el retraso del envejecimiento. Esto

lleva a pensar que el efecto de las plantas medicinales para combatir una enfermedad es

sólo una consecuencia y que el efecto directo del extracto es reducir los daños y activar

mecanismos de protección desembocando en un incremento de la salud y en un retraso

del envejecimiento, dando como resultado final, retrasar la aparición de enfermedades o

combatirlas (Argyropoulou et al., 2013).

Además, los ejemplos antes mencionados nos llevan a considerar otro punto

interesante, que la extensión del tiempo de vida mediante la interacción con compuestos

provenientes de plantas es un fenómeno común y que se podrían identificar otros

mediante rastreos a gran escala. Cabe resaltar que el efecto de muchos de los

compuestos ya conocidos se identificó originalmente en los organismos modelo más

simples, como la levadura Saccharomyces cerevisiae (Kaeberlein, 2010).

Es por ello que el objetivo del presente trabajo fue identificar extractos de plantas

medicinales que extendieran la longevidad usando un método automatizado para el

análisis masivo del tiempo de vida cronológica (CLS) de S. cerevisiae.

2

Para cumplir con el objetivo general, primeramente se elaboró una base de datos

de compuestos promotores de longevidad, enfocándose principalmente en aquellos

compuestos aislados de plantas. Se recopiló información de 40 compuestos, 35 de ellos

provenientes de plantas; se describieron sus mecanismos de acción, así como los

organismos modelo donde se han probado y la información relacionada con sus efectos

en el envejecimiento. También se elaboró una base de datos con más de 30 extractos

crudos de plantas promotoras de longevidad, describiendo la especie y parte de la planta

usada para obtener el extracto, el tipo de extracto y los organismos modelo donde se

probaron, y la información que se tienen del efecto del extracto en el envejecimiento.

Además, se elaboró una base de datos de especies de plantas medicinales usadas en la

cultura popular mexicana y las más usadas en general para tratar enfermedades

relacionadas con la vejez, formada por 100 especies con efecto documentado para

tratarlas.

A partir de la base de datos de los compuestos promotores de la longevidad se

eligieron siete para realizar un ensayo prueba. El ensayo mostró que tres compuestos,

metformina, espermidina y rapamicina, incrementan significativamente la CLS de la

levadura, lo cual concuerda con los resultados descritos por otros grupos. Nuestro

ensayo automatizado de densidad óptica demostró que es capaz de identificar

compuestos o extractos que extienden la longevidad en el modelo del envejecimiento

cronológico de la levadura S. cerevisiae.

Posteriormente, la base de datos de plantas medicinales se usó como referencia

para la recolección de las 30 especies (36 muestras), y para la preparación de los

extractos. Se realizó un rastreo a gran escala de extractos de plantas medicinales que

fueran capaces de extender la longevidad en el envejecimiento cronológico de la

levadura S. cerevisiae, revelando que extractos de seis plantas: Acrocomia mexicana,

Bidens pilosa, Calendula officinalis, Eriobotrya japonica (dos muestras biológicas),

Lavandula angustifolia, Sedum dendroideum, incrementaban significativamente la CLS

de la levadura. Los seis extractos candidatos se probaron en tres cepas de referencia,

mostrando que todas tenían efecto en incrementar la CLS de la cepa diploide S288c,

pero muestran una variación en el efecto hacia las cepas haploides S288c y YEG01.

3

Además, para los seis extractos se caracterizó su perfil de compuestos fenólicos y el

efecto antioxidante, identificando al ácido 3,4 dimetoxicinámico en el extracto de L.

angustifolia, la rutina y el ácido clorogénico en C. officinalis y el ácido clorogénico en

E. japonica; y un efecto antioxidante en los extractos de L. angustifolia y E. japonica.

Finalmente, se identificó el mecanismo de acción del extracto de E. japonica

usando algunas cepas mutantes para genes relacionados con el envejecimiento. Se

determinó que el efecto del extracto de E. japonica depende de Ras2 y Swr1 para

incrementar la CLS de la levadura; que el extracto potencía el efecto de la ausencia de

Ald6, pero sin interactuar directamente con ella; que compensa la falta del gen STE12; y

que además de compensar, mejora la CLS en mutantes en el gen HAP3.

Con estos datos se concluyó que el ensayo automatizado es efectivo para

identificar extractos y/o compuestos que incrementan la CLS de la levadura; que a través

de este ensayo se identificaron seis extractos de plantas medicinales que extienden la

vida cronológica de S. cerevisiae; y que se identificó el mecanismo de acción para uno

de ellos, el extracto de E. japonica. Esto nos permite plantearnos nuevas perspectivas,

como probar los seis extractos con diversos aislados naturales de S. cerevisiae,

identificar los compuestos individuales de los extractos que son los responsables del

efecto, identificar el mecanismo de acción de los cinco extractos restantes, probar el

efecto de los extractos en otros organismos modelo, y, por supuesto, probar las 70

especies de plantas medicinales restantes, propuestas en la base de datos.

4

Abstract

Aging is a complex process caused alterations in diverse molecular pathways that are

influenced by genetic and environmental factors. Aging is defined as the diminishment

of functions and stress resistance of an individual through the time; causing a reduction

in life expectancy. These effects are related to the continuous accumulation of stressors;

increasing the damage to biomolecules, and compromising eventually the cellular

homeostasis (Argyropoulou et al., 2013). Therefore, aging is the most important risk

factor in chronic diseases such as cancer, cardiovascular diseases, neurodegenerative

diseases, and diabetes, among others (Longo et. al., 2012; Masoro, 2009).

Environment interventions are being studied to extend longevity in organisms;

one of them is the use of natural compounds. Metformin, ginseng extract, and an

increasing list of plant extracts are examples that were firstly used against age-related

diseases. Afterwards, it was noticed an effect in delaying the aging process. An

alternative explanation for the effect of medicinal plants against diseases is that it was

just a consequence of the direct effect to reduce the damage and delay the aging process.

The final result would be in either case a delay in the appearance of age-related diseases

or an opposition against them (Argyropoulou et al., 2013).

The previous examples allowed us to consider that the lifespan increment given

by the use of plant compounds is a common phenomenon, and that more could be

identified by high throughput screenings. Worth to mention is that there are several anti-

aging compounds that were identified within the simplest model organisms, for example

the Saccharomyces cerevisiae yeast (Kaeberlein, 2010).

Thereby, the main objective in this project was to identify medicinal plant

extracts that increase the longevity, by means of an automatized massive analyzing

method, measuring their effect on the chronological lifespan (CLS) of S. cerevisiae.

In order to accomplish this objective, it was firstly necessary to elaborate a

database of known anti-aging compounds, focusing primarily in isolated plant

compounds. This database holds information for 40 compounds from which 35 were

isolated from plants; their anti-aging related information, their action mechanisms, and

5

the model organisms where they were tested. Further on, a database for 30 longevity

promoting plant crude extracts was elaborated; the database holds descriptions for the

plant species, the plant used part, the extract type, the tested model organisms used for

each extract, and the anti-aging related information for each extract. Furthermore, a

database for medicinal plants species used in Mexican popular culture and the most used

in general to treat age-related diseases was elaborated; this database holds 100 species

with documented effect.

Starting from the longevity promoting compound database, seven anti-aging

compounds were chosen in order to perform a testing assay. The testing assay proved

that three compounds; metformin, spermidine and rapamycin, significantly increased the

yeast CLS, which matches other group‟s results. Our optic density automatized assay

was capable to identify compounds or extracts that do extend longevity in the

chronological aging model for S. cerevisiae.

Afterwards, the medicinal plant database was used as a reference in order to

gather 30 species (36 samples) and later on to prepare the extracts. A massive medicinal

plant extract screening was performed, considering their capacity to extend longevity in

the chronological aging model for S. cerevisiae. This screening revealed that extracts

from six plants: Acrocomia mexicana, Bidens pilosa, Calendula officinalis, Eriobotrya

japonica (two biological samples), Lavandula angustifolia, and Sedum dendroideum,

were capable to significantly increase the yeast CLS. The six candidate extracts were

tested on three reference yeast strains, demonstrating that all of them had a visible effect

in the CLS increment for diploid strain S288c, but there was an appreciable variation in

the effect on haploid strains S288c and YEG01. Additionally, the phenolic compounds

profile and their antioxidant effect were characterized for the six extracts; identifying 3,4

dimetoxicinamic acid in L. angustifolia extract, rutin and chlorogenic acid in C.

officinalis extract, chlorogenic acid in E. japonica extract, and antioxidant effect in the

L. angustifolia and E. japonica extracts.

Finally, the mode of action of E. japonica extract was identified using aging

related gene mutant. It was determined that the yeast CLS increment by effect of E.

japonica extract depended on Ras2 and Swr1; the extract improved the effect of Ald6

6

absence, and that although the active compound of the extract does not interact directly

with it; the extract compensated the STE12 gene absence; and it improved the CLS in

HAP3 mutants.

From this study it was concluded that extracts and/or compounds that increase

yeast CLS can be effectively identified by the automatized assay; that six medicinal

plant extracts that increase the chronological lifespan for S. cerevisiae, were identified

through this assay; and that the action mechanism from one of them (E. japonica extract)

was identified. These results allow us to propose new perspectives for this research; to

test the six extracts on different natural isolates of S. cerevisiae, to identify individual

extract compounds responsible for the anti-aging effect, to identify the action

mechanism for the non-tested five extracts, to test the extract effect in other model

organisms and, of course, to test the 70 remaining medicinal plant species from the

database.

7

1.0 Introducción

El envejecimiento puede definirse como un desequilibrio entre el daño celular y sus

mecanismos de reparación. Los organismos están expuestos constantemente a

estresantes internos, relacionados con el metabolismo, y externos, relacionados con el

ambiente y la dieta, que producen daño en las biomoléculas celulares. Sin embargo, los

organismos cuentan con mecanismos de reparación, como neutralización de los

estresantes, identificación y reparación del daño, eliminación de biomoléculas

disfuncionales, que les permiten mantener bajos los niveles del daño. Sin embargo, una

vez que el organismo empieza a envejecer, estos mecanismos se ven gradualmente

comprometidos, y eventualmente se deterioran las funciones celulares produciendo la

acumulación de altos niveles de estresantes, incrementando la discapacidad y la

morbilidad, y llegando inevitablemente a la muerte (Argyropoulou et al., 2013).

Por lo anterior, el envejecimiento es el factor de riesgo más importante en

padecimientos crónicos como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, las

enfermedades neurodegenerativas y la diabetes, entre otros. Esto ha llevado a

incrementar el interés en estudiar las bases biológicas del envejecimiento y de la

extensión de la duración de la vida, convirtiéndose en un tema de suma importancia para

los humanos (Longo et. al., 2012; Masoro, 2009).

El estudio del envejecimiento en humanos es muy complejo porque está dado por

la interacción entre factores genéticos, epigenéticos, ambientales e incluso culturales

(Capri et al., 2006). Por lo tanto, se han buscado organismos modelo apropiados para el

estudio del envejecimiento. Entre éstos se encuentran las levaduras, los gusanos, las

moscas y los roedores, porque conservan vías y genes relacionados al envejecimiento en

los humanos (Kenyon, 2010).

De estos organismos, la levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los

mejores candidatos por la relativa facilidad y rapidez con que la longevidad se puede

cuantificar. Esto ha permitido un rápido progreso para definir mecanismos moleculares

del envejecimiento e identificar factores que modifican su longevidad, tal como el efecto

de sustancias anti-envejecimiento (Kaeberlein, 2010; Longo et. al., 2012).

8

Los compuestos naturales, por sus diversas estructuras, pueden ser candidatos

químicos para aumentar la salud e incrementar la duración de la vida o retrasar el

envejecimiento. Una parte de los compuestos naturales, que pueden estar como

moléculas puras o en extractos crudos, se han encontrado que retrasan la senescencia

celular o el envejecimiento in vivo. Es interesante recalcar que un gran número de estos

compuestos naturales son metabolitos provenientes de plantas que se han usado como

medicinales (Argyropoulou et al., 2013).

Existe un gran número de plantas con propiedades terapéuticas ampliamente

usadas por el hombre en la medicina tradicional. A pesar de su uso para combatir

diabetes, artritis, desórdenes cardiacos, desórdenes neurodegenerativos, y diversos tipos

de cáncer, entre otras, se sabe poco sobre los metabolitos responsables de sus efectos y

de sus mecanismos de acción. Es probable, por lo tanto, que sus blancos puedan tener

efectos benéficos o adversos en la longevidad de las células.

En este trabajo se propuso identificar extractos de plantas medicinales que

tuvieran efecto sobre el envejecimiento de la levadura S. cerevisiae. En particular, se

planteó probar aquellos extractos que han sido usados tradicionalmente para tratar

enfermedades típicas en la vejez y proponerlos como candidatos a compuestos naturales

anti-envejecimiento que permitan, a largo plazo, retrasar el envejecimiento en otros

organismos, incluyendo el humano, y aumentar el tiempo de vida sana.

9

2.0 Antecedentes

2.1 Procesos celulares e intervenciones que promueven la longevidad y retrasan el

envejecimiento

Ya se mencionaron los efectos asociados al envejecimiento, su definición y sus causas

(Argyropoulou et al., 2013). Cabe señalar que se ha encontrado que existen mutaciones

que atrasan el envejecimiento, retrasando la aparición de las enfermedades relacionadas

con la vejez y promoviendo la extensión de la duración de la vida. Este vínculo abre la

posibilidad de combatir muchas enfermedades como un solo fenómeno, el

envejecimiento (Kenyon, 2010).

Muchas de las mutaciones que extienden la duración de la vida afectan genes de

respuesta a estrés o a sensores de nutrientes. Entre éstos está TOR (kinase target of

rapamycin = cinasa blanco de rapamicina), insulina/IGF-1 (insulin/insulin-like growth

factor = insulina/insulina como factor de crecimiento), AMPK (AMP-activated protein

kinase = proteína cinasa activada por AMP) y sirtuinas (deacetilasas de proteínas

dependientes de NAD+) (Greer et al., 2007; Kaeberlein et al., 2005; Kenyon, 2010;

Rogina & Helfand, 2004).

Se ha observado que al inhibir la vía de señalización por insulina, insulina/IGF-1,

se incrementa la duración de la vida; activando factores de transcripción de respuesta a

estrés (FOXO, heat shock, respuesta a xenobióticos), que a su vez activan genes de

respuesta a estrés (catalasas y SOD2) y la autofagia. Por su parte, al inhibir TOR, que es

el mayor sensor de aminoácidos y nutrientes, se observa un incremento en la longevidad;

se activan factores de transcripción de respuesta a estrés que promueven la autofagia, así

como la inhibición de la S6 cinasa que produce una inhibición de la traducción. Las

AMPK‟s son nutrientes y sensores de energía; su sobreexpresión extiende la duración de

la vida, activando factores de transcripción de respuesta al estrés. Estas tres respuestas se

han conservado desde las levaduras hasta los mamíferos. Finalmente, el sobreexpresar

las sirtuinas extiende la longevidad en levaduras, gusanos y moscas, activando factores

de transcripción de respuesta al estrés (Kenyon, 2010).

10

El bloquear por completo alguna vía puede tener consecuencias importantes

sobre el tiempo de la vida. Por ejemplo, en ratones, el eliminar la vía insulina/IGF-1

causa el desarrollo de la diabetes (Selman et al., 2008). Sin embargo, se puede fomentar

pequeñas perturbaciones en su expresión para aumentar la duración de la vida, incluso se

cree que el efecto puede incrementar la duración de la vida en humanos. Es por ello que

se buscan intervenciones del medio que interactúen con los genes relacionados con el

envejecimiento, fomentando un efecto similar a las mutaciones y que aumenten la

duración de vida del organismo.

La intervención que más se ha descrito que extiende la longevidad en los

diversos organismos modelo, desde levaduras hasta primates, es la restricción calórica o

dietética. Ésta se refiere al consumo reducido de calorías totales en una dieta, sin llegar a

la malnutrición. La restricción calórica incrementa la longevidad, pero también reduce el

riesgo de un gran número de las enfermedades relacionadas con la edad (Argyropoulou

et al., 2013; Bioshop & Guarente, 2007). El efecto de la restricción calórica de aumentar

la duración de la vida y retrasar el envejecimiento se ha relacionado con la inhibición de

las vías insulina/IGF-1 y TOR (Kenyon, 2010).

Otra de las intervenciones del medio que se ha estudiado es el uso de los

compuestos naturales; su amplio rango de actividades biológicas y su diverso número de

estructuras son una fuente para buscar nuevos candidatos que retrasen el envejecimiento.

Se ha demostrado que los compuestos naturales pueden ser usados como moduladores

de vías involucradas en la regulación del envejecimiento, por ejemplo, cuando se

mimetiza el efecto de la restricción calórica al atenuar señales de vías de censado de

nutrientes; también pueden actuar como protección a biomoléculas, neutralizando

estresantes o activando sutilmente vías de respuesta al estrés (Argyropoulou et al., 2013;

Lutchman et al., 2016).

2.2 Productos naturales que promueven el incremento en la duración de la vida

Los compuestos naturales que retrasan el envejecimiento a nivel de organismo se han

clasificado principalmente en aislados de microorganismos y aislados de plantas, por su

11

procedencia. La rapamicina es un compuesto proveniente de la bacteria Streptomyces

hygroscopicus que tiene uso médico como un inmunosupresor. Organismos como

levaduras, gusanos, moscas y ratones han sido tratados con rapamicina mostrando una

extensión en la duración de la vida en comparación con los organismos no tratados. En

los ratones se observó el efecto incluso cuando se inicia el tratamiento en una etapa de

edad tardía, hasta 600 días, el equivalente a 60 años humanos. El aumento en la

longevidad de los organismos cuando se tratan con rapamicina se da a través de la

inhibición directa de la proteína Tor, así como el incremento en la autofagia (Alvers et

al., 2009; Argyropoulou et al., 2013; Laplante & Sabatini, 2012; Rallis et al., 2013).

Un ejemplo de un compuesto natural que se aisló de una planta es el resveratrol,

el cual es un polifenol que se encuentra en las uvas y el vino tinto. En las levaduras, el

resveratrol actúa como un mimetizador de la restricción calórica estimulando a SIR2 e

incrementando la duración de la vida hasta en un 70% (Howitz et al., 2003). En gusanos

y moscas también extiende la longevidad a través de SIR2; para el caso de ratones con

dietas altamente calóricas mejora la salud y supervivencia, y en ratones sanos retarda el

deterioro causado por la edad (Baur et al., 2006; Pearson et al., 2008).

Otro caso interesante es la metformina, que es una biguanida proveniente de la

planta medicinal Galega officinalis y que ha sido usada comúnmente para combatir la

diabetes tipo 2 en humanos. Además de su efecto antidiabético, en estudios más

recientes se observó que en gusanos tratados con metformina incrementaban su salud y

locomoción, y extendían su longevidad (Onkel & Driscoll, 2010). Y en hembras de ratón

que fueron tratadas con metformina retrasaba el envejecimiento y aumentaba la duración

de la vida (Anisimov et al., 2008). Actualmente se ha identificado a la metformina como

un mimetizador de la restricción calórica que activa AMPK, siendo esta regulación la

que incrementa la duración de la vida en los organismos (Kalra et al., 2016).

Además de probar moléculas provenientes de plantas como las antes

mencionadas, se han probado extractos crudos por representar una fuente valiosa de

compuestos bioactivos naturales con potencial para retrasar el envejecimiento en

organismos modelo. Cabe mencionar que los efectos biológicos en la extensión de la

longevidad pueden ser atribuidos a un número reducido de fitoquímicos o incluso estar

12

mediado por una sola molécula bioactiva. Es por ello que el objetivo final de trabajar

con extractos crudos es identificar los ingredientes bioactivos; sin embargo, no hay que

perder de vista que para un gran número de casos el efecto puede resultar de la sinergia

de la acción de muchos compuestos que al ser probados individualmente pierden su

efecto (Argyropoulou et al., 2013).

El extracto crudo de ginseng (Panax ginseng) ha sido usado en la medicina

hebolaria tradicional de Asia por más de 2,000 años. Estudios clínicos han mostrado que

mejora las funciones fisiológicas, las funciones inmunes y condiciones asociadas con la

diabetes. Actualmente se encuentra en pruebas clínicas para identificar su potencial para

reducir los riesgos en enfermedades cardiovasculares y en un futuro convertirse en un

apoyo para el control de la presión vascular (Komishon et al., 2015). Además de estos

beneficios, la decocción de la raíz extiende la duración de la vida de Caenorhabditis

elegans, incrementando la expresión de proteínas pequeñas de choque térmico y

atenuando los niveles intracelulares de peróxido de hidrógeno (Yu et al., 2010).

La metformina, el extracto de ginseng y una lista creciente son ejemplos donde

una planta medicinal se usó originalmente para combatir una enfermedad que se

desarrolla en la vejez y que posteriormente se identificó que tenía efecto en el retraso del

envejecimiento. Esto nos lleva a pensar que el efecto de las plantas medicinales de

combatir la enfermedad sea sólo una consecuencia y que el efecto directo del extracto

sea reducir los daños y activar mecanismos de protección desembocando en un

incremento de la salud y en un retraso del envejecimiento, dando como resultado final,

retrasar la aparición de enfermedades o combatirlas (Argyropoulou et al., 2013).

Además, los ejemplos antes mencionados nos llevan a considerar otro punto

interesante, que la extensión del tiempo de vida mediante la interacción con compuestos

provenientes de plantas es un fenómeno común y que se podrían identificar otros

mediante rastreos a gran escala. Cabe resaltar que muchos de los compuestos ya

conocidos se identificaron originalmente en los organismos modelo más simples, como

la levadura Saccharomyces cerevisiae (Kaeberlein, 2010).

13

2.3 Saccharomyces cerevisiae como modelo para el estudio del envejecimiento

Estudios en organismos modelo como Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis

elegans y Drosophila melanogaster han revelado que muchos procesos biológicos están

altamente conservados. Uno de dichos fenómenos es el envejecimiento. Indicio de esto

es que en muchos eucariontes se observa un decaimiento exponencial en el estado físico

y la fecundidad a través del tiempo, pero se vuelve más evidente después de la fase

reproductiva (Sinclair et al., 1998).

La levadura S. cerevisiae es uno de los organismos modelo más importantes en la

investigación relacionada con el envejecimiento. No solo porque fue el primer

organismo eucarióntico en tener secuenciado su genoma completo y fue el primer

organismo que se estudió a nivel transcriptómico, sino que además en comparación con

otros sistemas, la facilidad y rapidez con la cual la longevidad puede ser cuantificada ha

permitido un progreso rápido para definir procesos moleculares involucrados con su

envejecimiento, además de la identificación de factores que pueden modificar su

longevidad. Otras ventajas son las diversas colecciones de cepas con genes eliminados

individualmente, lo que nos permite un mayor entendimiento y su comparación con

otros organismos como los humanos, ya que aproximadamente el 45% de los genes de S.

cerevisiae son homólogos con los genes de mamíferos y cientos de genes que han sido

relacionados con enfermedades en humanos tienen un ortólogo en la levadura. Incluso,

recientemente, se remplazaron 414 genes esenciales de la levadura con genes ortólogos

humanos mostrando que 47% de los genes de la levadura (176 genes) pueden ser

“humanizados” exitosamente (Huges, 2002; Kachroo at al., 2015; Kaeberlyn, 2010).

Lo que hemos llegado a entender sobre el envejecimiento en la levadura nos ha

llevado a establecer que algunos aspectos son específicos del organismo, pero que los

más importantes se han conservado evolutivamente. Este alto grado de conservación en

procesos celulares ha hecho de S. cerevisiae, además, un sistema valioso para identificar

nuevos compuestos con rastreos a gran escala, conocer sus blancos y tener un análisis

detallado de sus efectos celulares. Un ejemplo de ello es la inhibición del complejo TOR

cinasa por la rapamicina, cuyo efecto se observó inicialmente en la longevidad de la

levadura y posteriormente se observó en otros organismos, incluso en ratones,

14

incrementando la duración de la vida. Es importante destacar que los compuestos

naturales anti-envejecimiento como la rapamicina, el resveratrol y la espermidina,

fueron primeramente identificados y caracterizados en la levadura, y actualmente se

encuentran en fase de pruebas clínicas. Sin embargo, cabe resaltar que S. cerevisiae no

sólo se ha usado para identificar compuestos anti-envejecimiento, sino también para

identificar extractos crudos que tengan un efecto semejante. Recientemente se

identificaron seis extractos de plantas que extienden significativamente la duración de la

vida de la lavadura y que además mostraron tener un efecto geroprotector (Huges, 2002;

Kaeberlyn, 2010; Lutchman et al., 2016).

En la levadura se han establecido dos modelos del envejecimiento para su

estudio: el envejecimiento replicativo y el envejecimiento cronológico. El

envejecimiento replicativo es un modelo de envejecimiento de células mitóticamente

activas en donde la duración de la vida de la célula madre es definida por el número de

células hijas que produce antes de la senescencia. La RLS (Replicative Lifespan =

Tiempo de la vida replicativa) es medida por la remoción física de las células hijas, que

son fáciles de distinguir por su menor tamaño que el de la célula madre cuando se

observan en el microscopio óptico. El envejecimiento cronológico es un modelo de

envejecimiento para células post-mitóticas en donde la duración de la vida se define

como el tiempo que una célula de levadura puede sobrevivir en un estado de quiescencia

o no división. La CLS (Chronological Lifespan = Tiempo de la vida cronológica) ha sido

medida cultivando las células, principalmente en medios líquidos, hasta entrar en un

estado de no división después de que la fuente de carbono se termina (Kaeberlyn, 2010;

Longo et al., 2012).

La naturaleza del daño es particular para cada modelo. En el replicativo, el daño

producido en la división celular es asimétrico y afecta principalmente a la célula madre

produciéndole el envejecimiento. Los círculos de ADN ribosomal extracromosomal

nuclear, proteínas oxidadas en el citoplasma y el daño mitocondrial contribuyen a la

senescencia replicativa. Por su parte, en el modelo cronológico, el daño se acumula a

través del tiempo en la célula que no se divide hasta alcanzar un daño severo evitando

que la célula pueda reingresar al ciclo celular; es así que el etanol acumulado

15

inicialmente se convierte en ácido acético induciendo una respuesta apoptótica y a la

muerte celular. Hasta el momento no se ha encontrado una correlación fuerte entre RLS

y CLS. Se ha observado que se puede incrementar la CLS sin mostrar cambios en la

RLS de la levadura, además que el envejecimiento cronológico ocurre cuando la

duración de vida replicativa aún no se ha afectado. Sin embargo, hay casos específicos

donde al incrementar la CLS también incrementa la RLS, por ejemplo en la supresión

del gen que codifica para la S6 cinasa ribosomal, homóloga en levadura SCH9, donde

primero se observó un incremento en la CLS y posteriormente un incremento similar en

la RLS. El incremento en la longevidad también se observó en gusanos, moscas y

ratones. Ambos ensayos, CLS y RLS, han sido usados para un primer acercamiento en el

campo de estudio del envejecimiento (Fabrizio & Longo, 2003; Kaeberlyn, 2010;

Sinclair et al., 1998).

Los genes principales y las vías que regulan la CLS de la levadura y que son

similares en gusanos, moscas y mamíferos son las del censado de nutrientes y del control

de su utilización. Éstas son la vía Tor/S6K que es activada por aminoácidos y otros

nutrientes, y la vía Ras/AC (adenilato ciclasa)/PKA (protein kinase A = proteína cinasa

A) que es la principal vía activada por glucosa y que también se ve afectada por otros

nutrientes. A pesar de que las dos vías se traslapan parcialmente, tienen efectos pro-

envejecimiento distintos. Un modo primario de acción en estas vías es la convergencia

sobre el regulón de resistencia a estrés que incluye a Rim15 y a factores de transcripción

como Msn2/Msn4 y Gis1; además estos factores regulan el metabolismo y la

acumulación y utilización de fuentes de carbono intra y extracelular. Sir2 también está

conectado a la actividad de Msn2/Msn4, sin embargo, los efectos en la CLS son

complejos. Los mecanismos que incrementan la CLS en levaduras son la inhibición de

las vías Tor/S6K o Ras/AC/PKA, y la expresión de genes de respuesta a estrés para la

protección de daño a macromoléculas y estrés celular; y se ve afectada por daño severo,

por las vías de estrés pro-senescencia que incluyen el estrés oxidativo, disfunción

mitocondrial, especies reactivas de oxígeno (ROS), reducción de la autofagia, daño al

ADN nuclear, mutagénesis y replicación de estrés, además por las alteraciones

metabólicas y por el estrés extrínseco (Kaeberlein, 2010; Longo et. al., 2012).

16

Finalmente, en años recientes se desarrolló una estrategia sistemática para

encontrar factores de longevidad en S. cerevisiae y la interacción genética de estos

factores. Este trabajo se desarrolló mediante un ensayo automatizado basado en

competición para la CLS, definida como fase estacionaria de supervivencia de

poblaciones de levaduras, permitiendo un ensayo masivo de alrededor de 5,600 genes

con mutaciones simples o dobles (Garay et al., 2014). Este ensayo automatizado para

CLS en la levadura permite analizar un gran número de muestras y producir miles de

datos, que pueden ser fácilmente extrapolados al rastreo masivo de extractos de plantas

medicinales para identificar candidatos de compuestos naturales anti-envejecimiento.

Este tipo de ensayo permitirá analizar un mayor número de genes relacionados con el

envejecimiento para dilucidar los mecanismos de acción de un extracto candidato.

17

3.0 Hipótesis

Existen extractos de plantas que son efectivos para el tratamiento de diversas

enfermedades típicas de la vejez. La acción de algunos de éstos está relacionada con un

efecto benéfico sobre la longevidad celular y, por lo tanto, extienden la longevidad de

células de Saccharomyces cerevisiae en el laboratorio.

18

4.0 Objetivo general

Identificar extractos de plantas que extienden la longevidad usando un método

automatizado para el análisis masivo del tiempo de la vida cronológica (CLS) de

Saccharomyces cerevisiae.

4.1 Objetivos específicos

1) Elaborar una base de datos que incluya los compuestos conocidos como

promotores de la longevidad y, por otra parte, cien plantas con efecto

documentado para tratar enfermedades.

2) Realizar un ensayo prueba para medir el efecto de siete compuestos previamente

identificados como promotores de longevidad sobre el tiempo de la vida

cronológica de Saccharomyces cerevisiae.

3) Determinar el efecto de al menos treinta extractos de plantas sobre el tiempo de

la vida cronológica de Saccharomyces cerevisiae.

4) Caracterizar el perfil de compuestos fenólicos y el efecto antioxidante de los

extractos que muestren efecto en la extensión del tiempo de la vida cronológica

de Saccharomyces cerevisiae.

5) Identificar el mecanismo de acción de al menos un extracto que haya mostrado

efecto en la extensión del tiempo de la vida cronológica de Saccharomyces

cerevisiae, usando mutantes en los genes relacionados al envejecimiento.

19

5.0 Materiales y métodos

5.1 Elaboración de las bases de datos

Para la elaboración de las bases de datos se hizo una búsqueda intensiva vía internet,

principalmente en los sitios de PubMed y Google Scholar, usando palabras clave como

“longevidad”, “envejecimiento”, “tiempo de vida”, los nombres de los compuestos, y los

nombres científicos de las plantas, entre otras. Para corroborar que toda la información

estuviera documentada, se hizo una revisión en artículos publicados en revistas

científicas que evaluaran las propiedades biológicas requeridas para cada base de datos.

Para la base de datos de compuestos promotores de la longevidad se corroboró el

nombre del compuesto, su procedencia, los organismos modelo donde se ha comprobado

el efecto y los mecanismos de acción identificados del compuesto. En el caso de la base

de datos de extractos crudos de plantas con efecto sobre la longevidad, los datos

corroborados fueron el nombre científico, el nombre común, la parte de la planta y el

tipo de extracto que se probó, el organismo modelo donde se observó el efecto y los

datos relevantes observados. Finalmente, para la base de datos de plantas medicinales se

verificó el nombre científico, nombre común y la familia, la parte de la planta, el tipo de

extracto y el efecto documentado de la o las enfermedades relacionadas a la vejez que

contrarresta.

5.2 Cepas de Saccharomyces cerevisiae y medios

Se trabajó con tres cepas de referencia: S288c diploide proveniente de aislados naturales

de la colección de Liti et al. (2009); S288c (Mat ura3::KanMX ho::mCherry-Nat) y

YEG01 (Mat PDC1-mCherry-CaURA3MX4 can1::STE2pr-SpHIS5 lyp1 his31

ura30 LEU2), esta última cepa además tiene ho::NatMX para usarse como

referencia con mutantes simples o ho::NatMX his3::KanMX para usarse como

referencia con mutantes dobles. Se trabajó con catorce mutantes simples: ald6,

atg21, cyb5, gis1, hap3, his1, ras2, rim15,rps14A, ste12,

swr1, tor1, msn2, msn4 (x::NatMX) y la doble mutante msn2msn4

20

(x::NatMX y::KanMX); todas ellas provenientes de nuestro laboratorio y con fondo

genético YEG01.

Para los experimentos de determinación de las cinéticas de crecimiento y el

ensayo de longevidad se usó el medio SC-Aging (Longo et al., 2012). Como medio de

salida en el ensayo de longevidad se usó el medio YNB-lf (DeLuna et al., 2008).

5.3 Compuestos promotores de la longevidad

En este proyecto se probaron siete compuestos previamente descritos como promotores

de la longevidad: la cafeína, la curcumina, la espermidina, la rapamicina, el resveratrol,

la metformina y la dapsona. Las primeras cinco fueron obtenidas de la casa comercial

Sigma, mientras la metformina (clohidrato de metformina, 850 g, Genexx) y la dapsona

(100 g, Depsoderm-X) fueron obtenidas como pastillas de uso médico.

De cada compuesto se hizo una solución stock con una concentración molar

definida disolviendo los compuestos en medio SC-Aging; las soluciones stock se

esterilizaron por filtración en filtros Millipore de 0.22 m de poro. Se hicieron

diluciones a partir de la solución stock para tener cinco concentraciones molares de cada

compuesto.

5.4 Plantas medicinales y preparación de extractos

Las 30 especies de plantas medicinales probadas en este proyecto fueron colectadas

entre los años 2014-2015; 18 especies fueron colectadas en el Jardín Botánico Regional

“Roger Orellana”-Vivero de plantas nativas del CICY; 11 especies fueron colectadas del

Jardín Botánico del Instituto de Biología de la UNAM; una especie fue germinada y

creció en los invernaderos del LANGEBIO, Cinvestav con semillas proporcionadas por

el Jardín Botánico del Instituto de Biología de la UNAM. Todas las plantas se secaron

en prensa o en sílica.

21

En total se trabajaron 36 muestras debido a que en algunas especies se tenían

varias partes de la planta. En la Figura 1 se muestra el nombre científico de la planta, la

parte de la planta usada y el tipo de extracto.

Se trabajó con cuatro tipos de extracciones: infusión, decocción, etanólica y

metanólica. Para todas las muestras se pesó un gramo de muestra seca y se trituró con

mortero y pistilo. La extracción en cada caso se hizo de la siguiente manera:

- Infusión: a la muestra se agregaron 10 mL de agua destilada a 90ºC,

manteniendo la temperatura por un periodo de 30 min. Posteriormente se dejó enfriar

hasta 25ºC y se tomó sólo el extracto líquido.

- Decocción: a la muestra se agregaron 15 mL de agua destilada, se elevó la

temperatura hasta 150ºC y se dejó hirviendo por 10 min. Posteriormente se dejó enfriar

hasta 25ºC y se tomó sólo el extracto líquido.

- Extracto con etanol: las muestras se empaquetaron en papel filtro. Para la

extracción se usó etanol 96º (Karal); y el programa de extracción en el aparato Soxhlet

fue el siguiente: 2:00 h de extracción, 15 min de lavado y 1:30 h de evaporación. Para

eliminar todo el etanol, las muestras se secaron en un rotavapor múltiple y

posteriormente con nitrógeno gaseoso. Los extractos se resuspendieron en 1.5 mL de

agua destilada.

- Extracto con metanol: las muestras se empaquetaron en papel filtro. Para la

extracción se usó metanol absoluto grado HPLC (Karal); y el programa de extracción en

el aparato Soxhlet fue el siguiente: 2:00 h de extracción, 15 min de lavado y 25 min de

evaporación. Para eliminar todo el metanol, las muestras se secaron en un rotavapor

múltiple y posteriormente con nitrógeno gaseoso. Los extractos se resuspendieron en 1.5

mL de agua destilada.

Al finalizar la preparación, los extractos se esterilizaron por filtración a través de

filtros Thermo Scientific de 0.2 m de poro, y se almacenaron a 4ºC hasta su uso. La

concentración porcentaje masa/volumen se calculó con el peso inicial de la muestra y el

volumen final del extracto; a partir de esta concentración final se hicieron diluciones en

22

medio SC-Aging para obtener los porcentajes de concentración usados en los

experimentos posteriores.

Figura 1. Especies de plantas medicinales ensayadas. 36 muestras para la elaboración de extractos

provenientes de 30 especies de plantas medicinales. Partes de la planta donde procedían las 36 muestras:

22 de hojas, tres de flores, una de cogollos, tres de partes aéreas, cuatro de corteza y tres de raíz. Con las

36 muestras se prepararon 14 infusiones, 10 decocciones, 8 extracciones con etanol y 4 extracciones con

metanol.

Etanol (8)

23

5.5 Cinéticas de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae

Previo al ensayo se cultivaron las cepas en medio SC-Aging hasta la fase estacionaria.

Usando un sistema robotizado (Freedom Evoware 2000), se inocularon placas de 96

pozos con 10 l del cultivo. Las placas de 96 pozos se llenaron previamente a un

volumen final de 150 L, este volumen corresponde al tratamiento (compuesto o

extracto) disuelto en medio SC-Aging. Los arreglos para cada experimento se muestran

en la Figura 2. Las placas se mantuvieron a 30ºC en agitación (750 rpm); al momento de

la inoculación y posteriormente cada hora y media se midió la OD600 (Densidad óptica

a 600 nm) en el lector TECAN M-1000 por un periodo de 12 h.

Los datos obtenidos de OD se normalizaron restando la primera lectura a las

consecutivas para eliminar el fondo de la medición; posteriormente se graficaron los

datos de OD resultantes para obtener las cinéticas de crecimiento. Se calculó la tasa de

duplicación (T) de las poblaciones con y sin tratamiento usando la fórmula de T = [In

(N – No) / In 2t], donde No corresponde a la OD600 inicial de 0.3 y N corresponde a una

OD600 final de 0.4. Para ambos valores de OD se cercioró que estuvieran en la fase

exponencial. Por su parte, t corresponde al tiempo transcurrido entre las dos

determinaciones de OD. La T se calculó individualmente para cada una de las diez

réplicas técnicas y posteriormente se calculó su promedio. La tasa de duplicación de la

población sin tratamiento (0 mM/0%) se comparó con las tasas de duplicación de las

poblaciones de cada una de las concentraciones probadas por tratamiento por medio del

modelo estadístico ANOVA para el análisis multivariable de Tukey-Kramer (=0.05).

Para el procesamiento de la información se usó el programa Matlab R2010a.

5.6 Ensayo de longevidad – Envejecimiento cronológico de Saccharomyces cerevisiae

Previo al ensayo del efecto de compuestos y extractos sobre la longevidad, se cultivaron

las cepas en medio SC-Aging hasta la fase estacionaria. Se inocularon cajas de 96 pozos

profundos con 1 L del cultivo. Las cajas se llenaron previamente con un volumen final

de 700 L, este volumen corresponde al tratamiento (compuesto o extracto) disuelto en

medio SC-Aging. Los arreglos para cada experimento se muestran en la Figura 2.

24

Figura 2. Arreglos de las placas para cada experimento. Los arreglos de las placas se usaron para el

experimento de la determinación de la cinética de crecimiento y el ensayo de longevidad. A) Distribución

de gradiente: cinco concentraciones por placa, una placa por compuesto. Arreglo para ensayar los siete

compuestos promotores de longevidad. B) Distribución aleatoria: en una sola placa hay tres

concentraciones por extracto y dos extractos por placa. Arreglo para la determinación del efecto de los 36

extractos de plantas medicinales. C) Distribución de tablero de ajedrez: dos cepas mutantes y una cepa

silvestre (WT) por placa, con o sin tratamiento. Arreglo para probar el efecto de un extracto en un set de

cepas mutantes.

Posterior a las 96 horas de incubación (30ºC, 45-75% de humedad relativa), de

las cajas de pozo profundo se tomó un inóculo de 10 L con el sistema robotizado

(Freedom Evoware 2000) para inocular placas de 96 pozos con 150 L de medio YNB-

lf (Día 1 de lectura). Las cajas de pozo profundo se regresaron a incubar (30ºC, 45-75%

de humedad relativa). A las placas de 96 pozos se midió la OD600 al momento de la

inoculación, 4 h posteriores a la inoculación y posteriormente cada hora en el lector

TECAN M-1000 por un periodo de 15 h. Las placas de 96 pozos se mantuvieron en las

mismas condiciones de incubación que las cajas de pozo profundo.

A B

C

Medio SC

Medio SC

25

El procedimiento de inoculación de muestras provenientes de cajas de pozo

profundo a medio nuevo de salida YNB-lf, y las posteriores mediciones de OD600 de las

placas de 96 pozos se realizaron por cinco días seguidos y posteriormente cada dos días

por un periodo total de 20 días.

Los datos obtenidos de OD se normalizaron restando la primera lectura del día a

las consecutivas para eliminar el fondo de la medición. Se graficaron los datos de OD

resultantes para obtener las cinéticas de crecimiento por día. Para calcular el porcentaje

de supervivencia se utilizó la fórmula %S = [1/2(t/T)

], donde la diferencia del tiempo

(t) es con respecto al día 1 para alcanzar una absorbancia fija de 0.35, y „T‟ es el

tiempo de duplicación. Para el análisis estadístico se empleó el modelo ANOVA del

análisis multivariable de la prueba de Tukey-Kramer (=0.05) a los valores del

crecimiento de la tasa exponencial. La tasa de duplicación, el porcentaje de

supervivencia y la tasa de crecimiento exponencial se calcularon individualmente para

cada réplica técnica y posteriormente fueron promediadas. Se usó el programa Matlab

R2010a para el procesamiento de toda la información. En la Figura 3 se resume el

ensayo de longevidad.

5.7 Cromatografía en capa fina

Para identificar los compuestos fenólicos (incluidos flavonoides) y el efecto antioxidante

de siete extractos acuosos se usaron placas HPTLC de 10x10 cm. Se aplicaron 2 L de

la solución de cada muestra por placa y se sometieron a elución por 40 min con un

sistema de solventes. Los equipos CAMAG se usaron para la aplicación de las muestras,

el desarrollo de la placa y su visualización. Se usó el programa visionCATS para el

registro de las placas posteriores a la cromatografía y a la derivatización. Para ello se

usaron cinco tipos de luz: blanca de remisión, blanca de transmisión, combinación de

ambas luces blancas, de 366 nm y de 254 nm.

Para la identificación de compuestos fenólicos el sistema de solventes para la

separación cromatográfica fue acetato de etilo : ácido fórmico : ácido acético : agua

(100:11:11:13 por volumen); posteriormente, la placa se derivatizó por inmersión en una

26

mezcla del reactivo de Productos Naturales (1% de éster de ácido–etanolamida

difenilbórico en metanol) y polietilenglicol (5%). Para identificar el efecto antioxidante

de los compuestos separados, el sistema de solventes usado fue acetato de etilo : ácido

fórmico : ácido acético : agua (100:11:11:13 por volumen); posteriormente, la placa se

derivatizó por inmersión en DPPH (1,1-Difenil-2-picril-hidrazilo).

Los extractos evaluados fueron de Bidens pilosa, Lavandula angustifolia,

Calendula officinalis, Acrocomia mexicana, Sedum dendroideum y dos muestras de

Eriobotrya japonica; así como una mezcla de estándares de compuestos fenólicos:

narinina, rutina, ácido 3,4 dimetoxicinámico, ácido p-cumárico, ácido gálico, ácido T

cinámico y ácido clorogénico.

Figura 3. Ensayo de la longevidad. Esquema que resume el ensayo automatizado usado para caracterizar

el envejecimiento cronológico de la levadura Saccharomyces cerevisae.

Inóculo Fase estacionaria

S. cerevisiae

Medio SC-Aging

Medio SC-Aging + Tratamiento

Medio YNB-lf fresco

0.35

27

6.0 Resultados

6.1 Bases de datos

Con el fin de recabar la mayor información sobre compuestos promotores de longevidad

previamente descritos, se decidió hacer una base de datos, enfocándose en incorporar

principalmente aquellos compuestos extraídos de plantas. Se recopiló información de 40

compuestos que se enlistan en la Anexo 1, de los cuales 35 provienen de plantas. En la

mayoría de los compuestos ya se ha descrito el mecanismo de acción de cómo estos

compuestos actúan, los diversos organismos modelo donde se han probado, así como

información relacionada con su efecto sobre el envejecimiento. Un ejemplo ampliamente

estudiado es el resveratrol proveniente de la uva (Vitis vinifera), mismo que ha sido

probado en organismos modelo como Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis

elegans, Drosophila melanogaster, Mus musculus, Nothobranchius furseri y fibroblastos

humanos; se ha demostrado que sus mecanismos de acción son: inhibir a TORC1,

reducir IGF-1, incrementar la actividad catalítica de Sir2 y activar AMPK. Además, el

resveratrol incrementa la duración de la vida al modular procesos relacionados con la

longevidad al incrementar la sensibilidad a la insulina, incrementar el número de

mitocondrias, acelerar el metabolismo de almacenamiento de grasas y activar la

autofagia (Baur et al., 2006).

Durante la búsqueda se encontró que existen extractos sin purificar que han

mostrado un efecto en la longevidad. Se hizo una base de datos con más de 30 extractos

crudos de plantas promotores de la longevidad. Sólo en algunos casos se conoce el

mecanismo de acción del extracto. En la mayoría de los casos se desconoce si el efecto

de un extracto crudo es debido a un solo compuesto o a la acción sinérgica de más de

uno de sus componentes. En el Anexo 2 se detalla la información sobre la especie y la

parte de la planta que se usó para la elaboración del extracto, que en su mayoría fueron

hojas y frutos; el tipo de extracto, que principalmente fueron decocciones; los

organismos modelo donde se probaron; así como la información que se tienen del efecto

del extracto en el envejecimiento. Un ejemplo de ello es el mate (Ilex paraguariensis)

que se dio a ratones en forma de infusión a partir de un sobre de té comercial (Yerba

Mate toasted), que mostró un efecto en la disminución de los niveles de ROS y de

28

nitrito, y un incremento en la duración de la vida y de la salud pulmonar en los ratones

viejos (Lanzetti et al., 2013).

Para la base de datos de plantas medicinales se hizo una búsqueda de las especies

usadas en la cultura popular mexicana y las más usadas en general para tratar

enfermedades relacionadas con la vejez, tales como diabetes, diversos tipos de cáncer y

enfermedades neurodegenerativas, entre otras. De esta lista se eligieron 100 plantas que

tuvieran un efecto documentado para contrarrestar la enfermedad. En el Anexo 3 se

muestran las especies de plantas medicinales seleccionadas. En su mayoría se usan hojas

y partes aéreas para hacer el extracto que mayoritariamente son infusiones y

decocciones. Se observa que aproximadamente el 60% de estas plantas han sido usadas

para combatir más de una enfermedad; también que de una misma especie se pueden

usar diversas partes de la planta para elaborar variados tipos de extractos.

6.2 Ensayo prueba usando siete compuestos identificados como promotores de

longevidad

Los siete compuestos promotores de la longevidad se probaron en un ensayo

automatizado para caracterizar el envejecimiento cronológico de S. cerevisiae. Por

compuesto (tratamiento) se probaron cinco concentraciones, enlistados en la Tabla 1,

que se compararon contra una muestra sin tratamiento. La cepa de referencia donde se

caracterizó el envejecimiento cronológico fue S288c diploide.

Tabla 1. Concentraciones de compuestos promotores de longevidad.

Compuesto promotor

de longevidad Concentraciones

Cafeína 0 M 100 M 1 mM 2 mM 5 mM 10 mM

Curcumina 0 M 5 M 10 M 50 M 100 M 1 mM

Dapsona 0 M 10M 100 M 1 mM 5 mM 10 mM

Espermidina 0 M 10 M 100 M 1 mM 5 mM 10 mM

Metformina 0 M 10 M 100 M 1 mM 5 mM 10 mM

Rapamicina 0 M 0.01M 0.05M 0.1 M 0.5 M 1 M

Resveratrol 0 M 10 M 100 M 1 mM 5 mM 10 mM

29

Primeramente se midió el crecimiento y se calculó la tasa de duplicación (T) de

las poblaciones con y sin tratamiento para cada uno de los compuestos promotores de

longevidad con la finalidad de asegurar que no había una diferencia significativa que

pudiera estar influyendo en el efecto de los compuestos para la CLS de la levadura.

En la Figura 4A se muestran las gráficas de las cinéticas de crecimiento y el

análisis multivariable de la tasa de duplicación para el tratamiento de la metformina. Las

cinco concentraciones de metformina (10 M, 100 M, 1 mM, 5mM y 10 mM) y el

medio SC-Aging sin metformina (0 mM) que se evaluaron no muestran una diferencia a

simple vista en las cinéticas de crecimiento de las poblaciones. La gráfica del ANOVA

de las tasas de duplicación en la prueba multivariable tampoco muestra una diferencia

estadística significativa entre poblaciones.

Este comportamiento también fue observado para el caso de las poblaciones que

crecieron en los compuestos curcumina, dapsona y resveratrol, donde ninguna de las

cinco concentraciones probadas por tratamiento mostró una diferencia en las cinéticas de

crecimiento, ni una diferencia significativa estadísticamente en sus tasas de duplicación

cuando se comparaba con la población sin tratamiento. Por su parte las poblaciones con

espermidina tampoco mostraron una diferencia en las cinéticas de crecimiento o en sus

tasas de duplicación, excepto para la concentración mayor de 10 mM, donde la

población crecía más lentamente y mostraba una diferencia significativa en su tasa de

duplicación comparada con la población sin tratamiento.

Para la población que creció en la concentración mayor de cafeína (10 mM) no

fue posible calcular su tasa de duplicación, ya que no se alcanzó la OD600 de 0.4 para

ninguna de sus réplicas técnicas después de 11 h de crecimiento; en la gráfica de las

cinéticas de crecimiento se observa que la concentración mayor (10 mM) tiene un

crecimiento más lento en comparación con las poblaciones que crecieron en las

concentraciones de 100 M, 1 mM y 2 mM, así como la no tratada (0 mM). Por su parte,

la población que creció en presencia de una concentración de cafeína 5 mM se observa

que tiene un crecimiento más lento que las poblaciones que crecieron en las

concentraciones menores, sin embargo, su tasa de crecimiento no presenta una diferencia

significativa al compararse con la población no tratada (Figura 4B).

30

En las poblaciones que crecieron en presencia de las concentraciones de 0.5 M

y 1 M de rapamicina no fue posible calcular su tasa de duplicación, ya que para ambos

casos la OD600 después de 11 h de crecimiento no era superior a 0.3; en la gráfica de las

cinéticas de crecimiento para las poblaciones en estas concentraciones se observa una

velocidad de crecimiento menor en comparación con las poblaciones correspondientes a

las concentraciones de 0.1 M, 0.05 M y 0.01 M, y con la que no tiene tratamiento.

Sin embargo, se observó que para las tres concentraciones menores de rapamicina no

hay diferencias significativas en la tasa de duplicación de sus poblaciones si era

comparado con la población sin tratamiento (Figura 4C).

Metformina

Cafeína

A

B

31

Figura 4. Cinéticas de crecimiento y análisis multivariable de la tasa de duplicación (T) para

poblaciones tratadas con compuestos promotores de longevidad. A) Poblaciones que crecieron en

presencia de metformina. B) Poblaciones que crecieron en presencia de cafeína. C) Poblaciones que

crecieron en presencia de rapamicina.

Posterior a la evaluación del crecimiento de las poblaciones con y sin

tratamiento, se pasó a caracterizar el efecto de los compuestos promotores de longevidad

en el envejecimiento cronológico de la cepa S288c diploide.

Para el ensayo de longevidad, primeramente se compararon las cinéticas de

crecimiento diarias para cada concentración de cada tratamiento. En la Figura 5A se

muestran por separado las cinéticas de crecimiento de la levadura en presencia de cada

una de las concentraciones probadas de metformina. Las cinéticas que representan los

primeros días de medición tardan menos tiempo para alcanzar una absorbancia de 0.35,

sin embargo, conforme pasan los días el tiempo para alcanzar esta absorbancia va en

aumento. Esto se traduce como un menor número de células viables y por ende menor

supervivencia que se aprecia en la gráfica de porcentaje de decaimiento (Figura 5B).

Por otro lado se observó que las concentraciones de 5 mM y 10 mM de

metformina fueron capaces de mejorar la supervivencia de S. cerevisiae. Fue así que se

observó un mayor porcentaje de supervivencia en estas poblaciones de la levadura al ser

Rapamicina

C

32

comparadas con el control, teniendo una diferencia significativa en el crecimiento de la

tasa exponencial para ambas concentraciones. Para las concentraciones menores de este

compuesto (100 M, 10 M, 1 mM) no se observó efecto benéfico en la supervivencia,

ya que al ser comparado con la población control no muestran diferencias significativas

(Figura 5B).

Por su parte, las concentraciones de 5 mM y 10 mM de espermidina causaron

una mayor supervivencia en la población de levaduras que es observable desde el quinto

día, y el efecto de la concentración 1 mM es notoria a partir del décimo día,

concluyéndose que todas presentan una diferencia significativa comparada con la

supervivencia de la población sin tratamiento. Las poblaciones incubadas con las dos

concentraciones menores de espermidina (100 M, 10 M) no mostraron diferencia en

la supervivencia comparadas con la población sin tratamiento (Figura 5C).

Debido al crecimiento lento de las poblaciones en presencia de concentraciones

de 0.1 M, 0.5 M y 1 M de rapamicina, no fue posible evaluar su supervivencia. La

supervivencia de la población en la concentración menor (0.01 M) comparada con la

población que creció sólo en medio SC-Aging no muestra diferencia significativa, pero

para la población que se encontraba en la concentración de 0.05M es observable un

aumento en la supervivencia desde el día seis que es significativo cuando se compara

con la población sin tratamiento (Figura 5D).

Sin embargo, para los compuestos cafeína, curcumina, dapsona y resveratrol no

se observa un efecto significativo para promover la CLS de la levadura en ninguna de

sus concentraciones. La Figura 6 muestra las gráficas del porcentaje de supervivencia

para cada compuesto, con sus cinco concentraciones, donde no hay una diferencia entre

las poblaciones tratadas y la no tratada.

Los resultados obtenidos para los siete compuestos probados en este ensayo

inicial concuerdan con los reportados previamente por otros grupos, los cuales se

discutirán posteriormente, mostrando que el ensayo automatizado empleado en este

trabajo es capaz de identificar compuestos o extractos que extienden la longevidad en el

modelo del envejecimiento cronológico de la levadura S. cerevisiae,

33

Tratamientos

SC – 0mM 10M 100M 1 mM 5 mM 10 mM

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0

Tasa

de

dec

aim

ien

to

A

B

34

Figura 5. Curvas del porcentaje de la supervivencia de las poblaciones con los compuestos que

tienen efecto en la CLS de S. cerevisiae, y su análisis estadístico. A) Cinéticas de crecimiento de las

poblaciones en las diferentes concentraciones de metformina y sin tratamiento, que se usaron para calcular

posteriormente sus curvas de supervivencia. B) Comparación de las curvas de supervivencia de las

poblaciones con metformina y sin tratamiento. C) Comparación de las curvas de supervivencia de las

poblaciones con espermidina y sin tratamiento. D) Comparación de las curvas de supervivencia de las

poblaciones con rapamicina y sin tratamiento. Análisis estadístico de los valores de crecimiento de la tasa

exponencial (tasa de decaimiento); a menor tamaño de la barra, representan una mayor supervivencia de la

población.

Tratamientos

SC – 0mM 10M 100M 1 mM 5 mM 10 mM

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0

Tasa

de

dec

aim

ien

to

0.06

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0

Ta

sa d

e d

eca

imie

nto

Tratamientos

SC – 0mM 0.01M 0.05M

C

D

35

Figura 6. Curvas del porcentaje de la supervivencia de las poblaciones con los compuestos que no

presentan efecto en la CLS de S. cerevisiae. A) Curvas de decaimiento de las poblaciones con cafeína y

sin tratamiento. B) Curvas de decaimiento de las poblaciones con curcumina y sin tratamiento. C) Curvas

de decaimiento de las poblaciones con dapsona y sin tratamiento. D) Curvas de supervivencia de las

poblaciones con resveratrol y sin tratamiento.

C D

A B

36

6.3 Efecto de treinta extractos de plantas medicinales en la supervivencia de

Saccharomyces cerevisiae

La base de datos de plantas medicinales se usó como referencia para la recolección de 36

muestras de 30 especies; así como para la preparación del extracto, la parte de la planta y

el tipo de preparación, que se sugería en estudios previos para probar el efecto de éstos

en diversas enfermedades relacionadas con la vejez.

Usando el ensayo automatizado (ver Métodos), se probaron 24 extractos acuosos

para caracterizar su efecto en el envejecimiento cronológico de S. cerevisiae, de los

cuales 14 corresponden a infusiones y 10 a decocciones. Se probaron tres

concentraciones (0.05%, 0.5% y 5% m/v) por extracto (tratamiento), sin embargo, para

aquellas muestras con las que se contaban pocos gramos, se usaron concentraciones de

0.01%, 0.1% y 1%. El efecto de los tratamientos en las distintas concentraciones se

comparó contra un control no tratado. La cepa de referencia donde se caracterizó el

envejecimiento cronológico fue la diploide S288c.

De igual forma, se siguió el crecimiento, se calculó y comparó la tasa de

duplicación (T) de las poblaciones para cada concentración de cada extracto contra la

que no tenía tratamiento para asegurar que no hubiera una diferencia significativa que

pudiera influir en el efecto de los extractos en la CLS de la levadura.

La comparación de la T entre las poblaciones incubadas en presencia de los

extractos acuosos y las poblaciones sin tratamiento no mostró diferencia significativa.

Sólo en algunos casos muy específicos la T fue mayor y significativamente diferente a la

de las población sin tratamiento, por ejemplo, en las poblaciones incubadas con 0.1% del

extracto de Byrsonima bucidaefolia, 5% del extracto de corteza de Guazuma ulmifolia y

0.5% ó 5% del extracto de Rosa sp; lo que indicaría que estas poblaciones crecen más

lento que la población que sólo tiene el medio SC-Aging. También hay casos específicos

donde la T fue significativamente menor que la de la población sin extracto, como las

incubadas con los siguientes extractos: 5% de cogollos de Annona muricata, 5% de

Calendula officinalis, 0.05% de Crataegus mexicana, 1% de Emilia sonchifolia, 5% de

Equisetum hyemale, 0.5% ó 5% de hojas de Parmentiera acuelata y 5% de Tecoma

37

stans; lo que sugeriría que las correspondientes poblaciones crecen más rápido que la

población que no tiene tratamiento.

En el ensayo de longevidad por determinación de la CLS, para la mayoría de los

24 extractos acuosos probados, a partir del octavo día ya no se observaba un decaimiento

en la supervivencia de las poblaciones. En las Figuras 7 y 8 correspondientes a las

curvas de porcentaje de supervivencia de la levadura incubada con extractos de infusión

o extractos de decocción respectivamente, se aprecia que la supervivencia se mantuvo

constante en un mismo porcentaje durante los días siguientes, incluso en algunos casos

pudo observarse un aumento en la supervivencia por un posible crecimiento adaptativo

de la población.

Por lo anterior, el efecto de los extractos acuosos se consideró sólo para los

primeros cinco días de medición. Para las infusiones de hojas de Bidens pilosa (aceitilla,

Figura 7B), flores de Calendula officinalis (caléndula, Figura 7E) y hojas de Lavandula

angustifolia (lavanda inglesa, Figura 7I) se observó que la concentración 5% produjo

una mayor supervivencia en la población de levaduras comparado con la que tiene sólo

medio SC-Aging (0%). Esta diferencia es significativa para los tres casos, considerando

a los tres como extractos con un efecto benéfico en la supervivencia de la levadura.

A pesar de que se encontró un aumento de la supervivencia de las poblaciones

incubadas con extracto de la infusión de cogollos de Annona muricata (guanábana) al

5% (Figura 7A), hojas de Emilia sonchifolia (botón rosado) al 1% (Figura 7F), hojas de

Parmentiera aculeata (cuajilote) al 5% (Figura 7K), hojas de Plumeria rubra (flor de

mayo) al 0.5% y 5% (Figura 7L), flores de Rosa sp (rosa de castillo) al 5% (Figura 7M)

y hojas de Tecoma stans (histoncle) al 5% (Figura 7N) en comparación con el control

(0%), este aumento fue mínimo y no significativo, por lo que estos extractos no se

consideraron con efecto en la supervivencia de la levadura.

Para el caso de las infusiones de hojas de Bixa orellana (achiote, Figura 7C),

hojas de Byrsonima bucidaefolia (nance agrio, Figura 7D), hojas de Hylocereus undatus

(pitahaya, Figura 7G), hojas de Laurus nobilis (laurel, Figura 7H) y hojas de Marrubium

vulgare (mestranzo, Figura 7J) no se observó alguna diferencia significativa en la

38

supervivencia de las poblaciones en ninguna de sus tres concentraciones comparadas con

la supervivencia de la población que no tenía extracto (0%), por lo que se concluyó que

estos extractos no muestran efecto en la supervivencia de la levadura.

Para la decocción de hojas de Eribotrya japonica (níspero) al 5% (Figura 8C) se

observa un aumento de la supervivencia de la población de la levadura comparada con la

que no tiene extracto (0%), siendo ésta una diferencia significativa, haciendo que el

extracto de níspero sea considerado con efecto en la supervivencia de S. cerevisie.

A B

C D

39

E

G

I

F

H

J

40

Figura 7. Curvas del porcentaje de la supervivencia de las poblaciones de levadura incubadas con

los extractos de infusiones acuosas. A) Extracto de cogollos de A. muricata. B) Extracto de hojas de B.

pilosa. C) Extracto de hojas de B. orellana. D) Extracto de hojas de B. bucidaefolia. E) Extracto de flores

de C. officinalis. F) Extracto de hojas de E. sonchifolia. G) Extracto de hojas de H. undatus. H) Extracto

de hojas de L. nobilis. I) Extracto de hojas de L. angustifolia. J) Extracto de hojas de M. vulgare. K)

Extracto de hojas de P. aculeata. L) Extracto de hojas de P. rubra. M) Extracto de flores de Rosa sp. N)

Extracto de hojas de T. stans.

K

M

L

N

41

Por otro lado, no se observó alguna diferencia en la supervivencia de las

poblaciones de levadura para ninguna concentración de las decocciones de las hojas de

Crataegus mexicana (tejocote, Figura 8B) ni de las partes aéreas de Equisetum hyemale

(cola de caballo, Figura 8D) comparada con el control, por lo que se concluyó que estos

extractos no tienen efecto en la supervivencia de la levadura.

Para algunas decocciones se observó que disminuía la supervivencia de las

poblaciones de levadura en comparación con la población que sólo tenía medio SC-

Aging (0%). El caso más notorio fue el de los extractos de Guazuma ulmifolia

(guacima), donde 5% de la decocción de hojas (Figura 8E) causó una disminución de

más del 50% de la población de levaduras el primer día; y la decocción de corteza al 5%

que causó una disminución de la supervivencia a partir del tercer día (Figura 8F),

mostrando una diferencia significativa para ambos casos. Se observó un efecto

dependiente de la concentración para los casos de la decocción de la raíz de Parmentiera

acuelata (cuajilote, Figura 8H) y de las flores de Plumeria rubra (flor de mayo, Figura

8I), donde se observó que entre mayor era la concentración, menor era la supervivencia

de la población de levadura. Otras decocciones que causaron una disminución en la

supervivencia de las poblaciones de levadura en comparación con la incubada sin

extracto (0%) fueron: la corteza de Cordia sebestena (anacahuite) al 0.5% y 5% (Figura

8A), las partes aéreas de Lepechinia caulescens (salvia) en sus tres concentraciones

(Figura 8G) y la corteza de Rizophora mangle (Mangle) principalmente al 0.5 y 5%

(Figura 8J). Por ello se concluyó que todas estas decocciones tienen un efecto negativo

en la supervivencia de la levadura.

Debido a los problemas con el crecimiento adaptativo de las poblaciones que

presentó la cepa diploide S288c en las pruebas con los extractos acuosos, se cambió por

la cepa haploide S288c (Mat ) para probar el efecto de los extractos alcohólicos.

42

A B

C

E F

D

43


los extractos de decocciones acuosas. A) Extracto de corteza de C. sebestena. B) Extracto de hojas de C.

mexicana. C) Extracto de hojas de E. japonica. D) Extracto de partes aéreas de E. hyemale. E) Extracto de

corteza de G. ulmifolia. F) Extracto de hojas de G. ulmifolia. G) Extracto de partes aéreas de L.

caulescens. H) Extracto de raíz de P. aculeata. I) Extracto de flor de P. rubra. J) Extracto de corteza de R.

mangle.

G H

I J

44

Por el ensayo automatizado se probaron doce extractos alcohólicos para

caracterizar el efecto de éstos en la CLS de la levadura. Ocho extractos etanólicos se

probaron en tres concentraciones por tratamiento, 1%, 3% y 5%; para las especies con

las que se contaba con pocos gramos de muestras se trabajó con las concentraciones de

0.5%, 3% y 5%. Los cuatro restantes fueron extractos metanólicos donde se probaron

tres concentraciones 1%, 3% y 5%, sin embargo, para dos especies con las que se

contaba con menos cantidad de muestra las concentraciones probadas fueron de 0.5%,

1% y 5% ó 0.1%, 0.5% y 1%. El efecto de los tratamientos en las diferentes

concentraciones se comparó contra una muestra que sólo tenía medio SC-Aging (0%).

Primeramente se siguió el crecimiento de las poblaciones en las diferentes

concentraciones de los diferentes extractos que se probaron, además, se calculó y

comparó la tasa de duplicación (T) de las poblaciones con la de la población sin

extracto, para asegurar que no hubiera una diferencia significativa que pudiera influir en

el efecto de los extractos en la CLS de la levadura. Sin embargo, para la mayoría de las

poblaciones con extracto alcohólico su T era menor y significativamente diferente a la

de la población sin tratamiento; un resultado que mostró que la levadura incubada con

extracto crecía a mayor velocidad que la que no tenía tratamiento. Por su parte, la

levadura incubada con 3% ó 5% de extracto de Sedum dendroideum mostraron una T

mayor y significativamente diferente que la de la población sin extracto, sugiriendo que

estas poblaciones crecen más lento que la que sólo tiene medio SC-Aging. Sólo en

algunos casos particulares no hubo diferencia significativa en la T de las poblaciones

con o sin extracto, por ejemplo, las incubada con los siguientes extractos: 0.1% de

Costus spicatus, 0.5% de Justicia spicigera, 1% de Sedum dendroideum y, 0.5% y 3%

de Ziziphus mauritiana.

Para el ensayo de longevidad por determinación de la CLS, en la Figura 9 se

muestran las curvas del porcentaje de supervivencia de las poblaciones incubadas con

extractos etanólicos comparadas con la población sin tratamiento (0%). Para los

extractos etanólicos de hojas de Annona muricata (guanábana, Figura 9A), corteza de

Byrsonima bucidaefolia (nance negro, Figura 9C) y hojas de Ziziphus mauritiana

(ciruela babosa, Figura 9H) no se observa alguna diferencia en la supervivencia de las

45

poblaciones incubadas con alguna de sus tres concentraciones comparas con la

población control, por lo que se concluyó que estos tres extractos no tienen efecto en la

supervivencia de la levadura.

Para el resto de los extractos etanólicos, se observó que la supervivencia de las

poblaciones incubadas en su presencia, disminuía en comparación con la población que

sólo tenía medio SC-Aging (0%). Para los extractos etanólicos de hojas de Annona

squamosa (chirimoyo, Figura 9B) y raíz de Cissampelos pareira (guaco, Figura 9D) fue

notorio el efecto dependiente de la concentración; otro extracto que mostró ese efecto

fue el de hojas de Cnidoscolus aconitifolius (chaya), aunque no es tan contundente como

el caso de los dos anteriores (Figura 9E); en estos tres extractos se observó que entre

mayor fue la concentración del extracto, menor era la supervivencia de la población. El

extracto etanólico de hojas de Cordia sebestena (anacahuite) tuvo un efecto en sus tres

concentraciones, observándose una disminución del 50% de la población desde el cuarto

día (Figura 9F). Por su parte el extracto etanólico de hojas de Justicia spicigera (muicle)

en concentraciones de 3% y 5% causó la disminución de la población en más del 40% en

el sexto día (Figura 9G). Es por ello que se concluyó que todos estos extractos tienen un

efecto negativo en la supervivencia de la levadura.

Las curvas del porcentaje de la supervivencia de las poblaciones con extractos

metanólicos comparadas con las poblaciones sin extracto (0%) se presentan en la Figura

10. El extracto metanólico de las hojas de Costus spicatus (costus) no tuvo efecto en la

CLS de la levadura, ya que la supervivencia de las poblaciones incubadas con sus tres

concentraciones fue similar a la de la población sin tratamiento (Figura 10B). El extracto

metanólico de hojas de Tabebulia rosea (maculis rosa) tuvo un efecto dependiente de la

dosis, donde a mayor concentración menor supervivencia de la población,

concluyéndose que este extracto tiene un efecto negativo en la CLS de la levadura

(Figura 10D). Los extractos metanólicos de la raíz de Acrocomia mexicana (coyul) y de

las partes aéreas de Sedum dendroideum (siempreviva) aumentaron la supervivencia de

la levadura comparada con la población sin extracto (0%), teniendo una diferencia

significativa en el incremento de la supervivencia; en A. mexicana el aumento en la

supervivencia se presentó con las tres concentraciones del extracto (Figura 10A); el

46

extracto de S. dendroideum al 3% y 5%, aumentó la supervivencia de la levadura

mostrando un efecto dependiente de la dosis (Figura 10 C). Estos datos muestran que los

dos últimos extractos tienen un efecto positivo en la CLS de la levadura.

A

C

B

D

47


los extractos etanólicos. A) Extracto de hojas de A. muricata. B) Extracto de hojas de A. squamosa. C)

Extracto de corteza de B. bucidaefolia. D) Extracto de raíz de C. pareira. E) Extracto de hojas de C.

aconitifolius. F) Extracto de hojas de C. sebestena. G) Extracto de hojas de J. spicigera. H) Extracto de

hojas de Z. mauritiana.

F E

H G

48


los extractos metanólicos. A) Extracto de raíz de A. mexicana. B) Extracto de hojas de C. spicatus. C)

Extracto de partes aéreas de S. dendroideum. D) Extracto de hojas de T. rosea.

C D

A B

49

6.4 Efecto de seis extractos candidatos sobre la CLS de tres cepas de referencia de

Saccharomyces cervisiae

A partir de los resultados obtenidos en el ensayo de longevidad, se seleccionaron

aquellos extractos que incrementaron significativamente la supervivencia de la levadura.

Se identificaron seis extractos que se propusieron como candidatos para probar su efecto

en tres cepas de referencia de S. cerevisiae. Los candidatos fueron las infusiones de

hojas de B. pilosa, flores de C. officinalis y hojas de L. angustifolia; los extractos

metanólicos de raíz de A. mexicana y de partes aéreas de S. dendroideum; y la decocción

de las hojas de E. japonica. Además se probaron dos muestras biológicas de esta última

especie, una proveniente del jardín botánico de la UNAM y otra de un parque público de

Irapuato, Gto.

De igual forma se compararon las tasas de duplicación (T) de las poblaciones de

levaduras incubadas sin tratamiento con las de las poblaciones incubadas con diferentes

concentraciones de los extractos, para descartar diferencias significativas entre ellas que

pudieran influir en el efecto de los extractos en la CLS de las diferentes cepas de

levadura.

Para el caso de la cepa diploide S288c incubada con o sin extracto, no hubo

alguna diferencia significativa en la T, excepto cuando se usó el extracto acuoso al 5%

de C. officinalis o el extracto metanólico al 1% de A. mexicana cuya T mostró un valor

significativamente menor que el de la población sin tratamiento.

Las poblaciones de la cepa haploide S288c (Mat ) incubadas sin tratamiento

mostraron una T mayor que las poblaciones incubadas con los extractos candidatos,

siendo esta diferencia significativa; excepto el caso antes mencionado de la levadura

incubada con 3% ó 5% del extracto de S. dendroideum, que mostraron una T

significativamente mayor a la de la población sin tratamiento, y con 1% del extracto que

no mostró diferencia significativa.

La T de las poblaciones de la cepa YEG01 (Mat ) incubada con y sin extracto

no mostraron diferencia significativa; sin embargo, se presentaron tres casos específicos

donde la T de las poblaciones incubadas con un extracto fue significativamente mayor

50

que la T de la población sin tratamiento, éstos fueron las poblaciones incubadas con 3%,

4% y 5% de infusión de C. officinalis, 5% de infusión de L. angustifolia o 1% de la

decocción de E. japonica de la UNAM.

En los ensayos de determinación de la CLS de la cepa diploide S288c, se observó

un efecto positivo de los cuatro extractos acuosos, mismo que también se observó para la

cepa haploide YEG01 (Mat ). Sin embargo, en el caso de la cepa haploide S288c no se

presentó algún aumento en su supervivencia.

En las Figuras 11 a la 15 se muestran los porcentajes de supervivencia de las tres

cepas de referencia probadas con los tres extractos de infusión, así como las dos

muestras biológicas de la decocción del níspero.

El extracto de B. pilosa al 5% causó un aumento en la supervivencia de la

población de la cepa diploide S288c, sin embargo, debido a que a partir del octavo día

ya no hubo decaimiento, el efecto sólo pudo observarse hasta ese día (Figura 11A). Para

la CLS de la cepa YEG01 (Mat ) se observó un efecto dependiente de la dosis; la

concentración menor causó una mayor supervivencia (Figura 11C), pero las cinco

concentraciones probadas (1%, 2%, 3%, 4% y 5%) tuvieron un efecto benéfico. Sin

embargo, en el caso de la cepa haploide S288c (Mat ) se observó un efecto contrario,

donde a mayor concentración, menor supervivencia de la cepa con respecto a la que no

tenía tratamiento (Figura 11B).

El extracto de C. officinalis al 5% aumentó la supervivencia de la cepa diploide

S288c hasta el sexto día, ya que los siguientes no se observó decaimiento (Figura 12A).

Para la cepa YEG01 (Mat ) se observó un efecto dependiente de la dosis; a mayor

concentración, mayor supervivencia de la población en comparación con la población

sin tratamiento. Este efecto se observó en las cuatro concentraciones probadas: 1%, 2%,

3% y 4% (Figura 12B). La supervivencia de la cepa haploide S288c (Mat ) no fue

probada con este extracto.

El efecto del extracto de L. angustifolia sobre la cepa diploide S288c se probó

dos veces. En la primera prueba se tuvo el problema del crecimiento adaptativo, por lo

que su efecto sobre la supervivencia de la levadura sólo pudo observarse en los primeros

51

ocho días, con la concentración mayor (5%) (Figura 13A). En la segunda prueba, la

infusión aumentó la supervivencia de la levadura al usar concentraciones de 0.5%, 1% ó

5% (Figura 13B). Al probar el extracto en la cepa YEG01 (Mat ), se observó que todas

las concentraciones (1%, 2%, 3%, 4% y 5%) aumentaron la supervivencia de la

levadura; este aumento fue dependiente de la dosis: a mayor concentración, mayor fue la

supervivencia (Figura 13D). Sin embargo, para la cepa haploide S288c (Mat ), el

extracto tuvo un efecto contrario, ya que las tres concentraciones probadas (1%, 3% y

4%) disminuyeron la supervivencia de S. cerevisiae (Figura 13C).

Bidens pilosa

Figura 11. Curvas del porcentaje de supervivencia de tres cepas de referencia incubadas con la

infusión de hojas de Bidens pilosa, y su análisis estadístico multivariable. A) Cepa diploide S288c. B)

Cepa haploide S288c (Mat ). C) Cepa haploide YEG01 (Mat ). Análisis estadístico multivariable de los

valores de crecimiento de la tasa exponencial (tasa de decaimiento); las barras con valores más pequeños

(izquierda del gráfico) representan una mayor supervivencia de la población.

A B C

52

Calendula officinalis

Figura 12. Curvas del porcentaje de supervivencia de dos cepas de referencia incubadas con la

infusión de flores de Calendula officinalis, y su análisis estadístico multivariable. A) Cepa diploide

S288c. B) Cepa haploide YEG01 (Mat ). Análisis estadístico multivariable de los valores de crecimiento

de la tasa exponencial (tasa de decaimiento); las barras con valores más pequeños (izquierda del gráfico)

representan una mayor supervivencia de la población.

Se probaron dos decocciones de hojas de E. japonica. El extracto de la muestra

proveniente de la UNAM se probó dos veces con la cepa diploide S288c. En la primera,

debido al crecimiento adaptativo, el aumento en la supervivencia se observó hasta el

octavo día en la población incubada con 5% de extracto (Figura 14A). Para la segunda

prueba con la cepa, sólo el extracto al 5% incrementó la supervivencia de la población

(Figura 14B). El efecto del extracto sobre la cepa YEG01 (Mat ) fue dependiente de la

dosis, pero el incremento de la supervivencia fue significativo sólo con las

concentraciones de 3%, 4% y 5% (Figura 14D). Con la cepa haploide S288c (Mat ), no

se observó efecto de los extractos sobre la supervivencia de las poblaciones, para

ninguna de sus cinco concentraciones: 1%, 2%, 3%, 4% y 5% (Figura 14C). Por otro

lado, el extracto de la muestra obtenida del parque tuvo un patrón similar al de la

A B

53

UNAM. En el caso de la cepa diploide S288c, debido al crecimiento adaptativo, sólo en

los primeros cuatro días y sólo con el extracto al 5% se observó una mayor

supervivencia de la población (Figura 15A). En la cepa YEG01 (Mat ) se observó un

efecto dependiente de la dosis: mayor concentración, mayor supervivencia; aunque todas

las concentraciones (1%, 2%, 3%, 4% y 5%) incrementaron la supervivencia (Figura

15C). De igual forma que con el extracto de la muestra de la UNAM, para la cepa

haploide S288c (Mat ), el extracto de la muestra del parque no tuvo efecto significativo

en la supervivencia de la levadura (Figura 15B).

En la Figura 16 se muestran los porcentajes de supervivencia de las tres cepas de

referencia probadas con los dos extractos metanólicos. El extracto de A. mexicana se

probó inicialmente en la cepa haploide S288c (Mat ), teniendo un efecto al aumentar la

supervivencia de la población en sus tres concentraciones: 1%, 3% ó 5% (Figura 16B).

En la cepa diploide S288c, el efecto del extracto fue dependiente de la dosis: mayor

concentración, mayor supervivencia (Figura 16A). Sin embargo, cuando este mismo

extracto se probó sobre la cepa YEG01 (Mat ) tuvo un efecto negativo en cualquiera de

sus concentraciones: 1%, 3% ó 5% (Figura 16C).

Finalmente, el extracto de S. dendroideum se probó primeramente en la cepa

haploide S288c (Mat ), mostrando un efecto dependiente de la dosis en sus

concentraciones de 3% y 5%, donde a mayor concentración del extracto causó una

mayor supervivencia de la población (Figura 16E). Cuando este extracto se probó con la

cepa diploide S288c, sólo se observó un aumento en la supervivencia de la población

con una concentración del 3% (Figura 16D). Sin embargo, cuando este extracto se probó

en la cepa YEG01 (Mat ) no tuvo efecto en la supervivencia (Figura 16F).

54

Lavandula angustifolia


infusión de hojas de Lavandula angustifolia, y su análisis estadístico multivariable. A) Cepa diploide

S288c para el ensayo 1. B) Cepa diploide S288c para el ensayo 2. C) Cepa haploide S288c (Mat ). D)

Cepa haploide YEG01 (Mat ). Análisis estadístico multivariable de los valores de crecimiento de la tasa

exponencial (tasa de decaimiento); las barras con valores más pequeños (izquierda del gráfico) representan

una mayor supervivencia de la población.

A B

D C

55

Eriobotrya japonica (UNAM)


decocción de hojas de Eriobotrya japonica (UNAM), y su análisis estadístico multivariable. A) Cepa

diploide S288c para el ensayo 1. B) Cepa diploide S288c para el ensayo 2. C) Cepa haploide S288c (Mat

). D) Cepa haploide YEG01 (Mat ). Análisis estadístico multivariable de los valores de crecimiento de

la tasa exponencial (tasa de decaimiento); las barras con valores más pequeños (izquierda del gráfico)

representan una mayor supervivencia de la población.

D C

B A

56

Eriobotrya japonica (parque)


decocción de hojas de Eriobotrya japonica (parque), y su análisis estadístico multivariable. A) Cepa

diploide S288c. B) Cepa haploide S288c (Mat ). C) Cepa haploide YEG01 (Mat ). Análisis estadístico

multivariable de los valores de crecimiento de la tasa exponencial (tasa de decaimiento); las barras con

valores más pequeños (izquierda del gráfico) representan una mayor supervivencia de la población.

B A C

57

Acrocomia mexicana

Sedum dendroideum

Figura 16. Curvas del porcentaje de supervivencia de tres cepas de referencia incubadas con

extractos metanólicos, y su análisis estadístico multivariable. A) Cepa diploide S288c incubada con

extracto de A. mexicana. B) Cepa haploide S288c (Mat ) incubada con extracto de A. mexicana. C) Cepa

haploide YEG01 (Mat ) incubada con extracto de A. mexicana. D) Cepa diploide S288c incubada con

extracto de S. dendroideum. E) Cepa haploide S288c (Mat ) incubada con extracto de S. dendroideum. F)

Cepa haploide YEG01 (Mat ) incubada con extracto de S. dendroideum. Análisis estadístico

multivariable de los valores de crecimiento de la tasa exponencial (tasa de decaimiento); las barras con

valores más pequeños (izquierda del gráfico) representan una mayor supervivencia de la población.

B A C

D E F

58

6.5 Perfil químico de los extractos que muestran efecto sobre la supervivencia de


Para los seis extractos candidatos como promotores de longevidad de la levadura se

dispuso complementar la información buscando en la literatura compuestos ya

identificados en estos extractos crudos. En la Tabla 2 se enlista la composición química

general que se conoce hasta el momento de cada uno de ellos.

Se observó que los flavonoides, que forman parte de los compuestos fenólicos,

eran las moléculas que se encontraban en la mayoría de los extractos. Por lo que se

hicieron análisis de cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) para

identificar los patrones de estos compuestos para cada extracto candidato que se probó.

Los extractos candidatos probados fueron las infusiones de B. pilosa, C. officinalis y L.

angustifolia; los extractos metanólicos de A. mexicana y S. dendroideum; y dos muestras

biológicas (UNAM y parque) de la decocción de E. japonica.

La Figura 17 muestra los resultados del análisis por HPTLC de las siete muestras

probadas, donde aparecen los patrones de los compuestos fenólicos presentes en cada

uno de ellos. Se presenta únicamente la placa que fue iluminada con luz de 366 nm, ya

que en las otras longitudes de onda no se apreciaron las bandas nítidamente.

Para la muestra de B. pilosa (1) se aprecian al menos cuatro bandas que sólo

aparecen en la placa sin derivatizar (Figura 17A) y que no aparecen en la derivatizada

(Figura 17B). De igual forma, el extracto de A. mexicana (6) muestra una banda difusa

en la placa sin derivatizar, pero en la placa derivatizada desaparece. Por su parte, los

extractos de L. angustifolia (2), C. officinalis (3) y S. dendroideum (7) presentan un

patrón con más bandas en la placa sin derivatizar, pero en la derivatizada las bandas que

se muestran tienen mayor nitidez. Finalmente, los patrones de compuestos fenólicos para

las dos muestras biológicas de E. japonica en la placa sin derivatizar son iguales, sin

embargo, en la placa derivatizada la muestra de la UNAM (4) presenta dos bandas extras

en comparación de la del parque (5). No obstante, los patrones para estas dos muestras

tienen una mayor similitud entre sí que con las otras cinco muestras probadas.

59

Con estos resultados se logró identificar algunos compuestos fenólicos presentes

en los extractos. Por ejemplo, el ácido 3,4 dimetoxicinámico (RF > 0.9) en el extracto de

L. angustifolia en la placa sin derivatizar; la rutina (RF = 0.45) que se observó como una

banda naranja en el extracto de C. officinalis en la placa derivatizada; y el ácido

clorogénico (RF = 0.55) que se observó como una banda azul celeste en las dos muestras

biológicas de E. japonica y en C. officinalis tanto en la placa sin derivatizar como en la

derivatizada.

Otra de las características que se determinó en los extractos candidatos fue su

capacidad antioxidante. La Figura 18 muestra una placa de HPTLC derivatizada con

DPPH e iluminada con luz blanca de transmisión; las bandas claras que se observaron

representan a los compuestos que tienen capacidad antioxidante. El extracto de L.

angustifolia (2) muestra al menos tres bandas nítidas y anchas, siendo el extracto que

tiene los compuestos con capacidad antioxidante más notorios de los probados. Las dos

muestras de E. japonica presentan el mismo patrón de bandas, siendo la de la UNAM (4)

la que muestra las bandas más nítidas en comparación con la muestra del parque (5). Sin

embargo, los otros cuatro extractos candidatos, B. pilosa (1), C. officinalis (3), A.

mexicana (6) y S. dendroideum (7), no mostraron compuestos con capacidad

antioxidante en esta prueba.

60

Tabla 2. Composición química reportada previamente para los extractos candidatos

Especie Composición Referencias

Acrocomia

mexicana - Raíz: Coyolosa; Tetrahydropirano Pérez et al., 1997

Bidens pilosa

- Hojas: Flavonoides (Quercetina, Iso-okanina)

- Partes aéreas: Flavonoides (Calconas, Aurenas); Taninos; Saponinas

- Planta completa: Productos alifáticos naturales (Hidrocarbones saturados sin

ramificar, Alcoholes saturados no ramificados, Ácidos carboxílicos saturados no

ramificados, Esteres no ramificados alifáticos, Hidrocarbonos acetilenicos);

Hidrocarbonos aromáticos simples (Fenoles simples, Aril aldehidos simples,

Ácidos benzóicos simples); Fenilpropanoides (Fenilpropanoides simples, Esteres

coumaricos y cafeoilos, Coumarinas); Flavonoides (Aurones, Calcones,

Flavononas, Flavonas, Flavonolas); Terpenoides (Sesquiterpenos, Diterpenos,

Esteroides, Triterpenos, Tetraterpenos); Porfirinas

Fotso et al., 2014

Silva et al., 2011

Souza et al., 2013

Calendula

officinalis

- Hojas: Fenilpropanoides (Ácido caféico, Ácido mono y di-O-cafeoilquinico);

Flavonoides (Calendoflavosida, Isoquercitina, Quercetina-3-O-(6''-acetil)--D-

glucopiranosida, Isorhamnetina-3-O--D-glucopiranosida, Isorhamnetina-3-O-(6''-

acetil)--D-glucopiranosida); Quinonas; Carotenoides; Lípidos

- Flores: Ácido caféico; Faradiol; Ácido clorogénico; Rutina; Terpenoides; Aceites

volátiles; Lípidos; Aminoácidos libres

- Inflorescencias: Flavonoides; Coumarinas; Carbohidratos

Loescher et al., 2014

Muley et al., 2009

Olennikov et al., 2014

Eriobotrya

japonica

- Hojas: Triterpenos; Sesquiterpenos; Flavonoides; Taninos; Glicosidas

megastigmana

- Frutos: Azúcares (Fructosa, Glucosa, Sorbitol y Sucrosa); Fenólicos;

Flavonoides; Carotenoides; Vitamina C

- Flores: Flavonoides (Hespertina, Ácido gálico); Fenólicos

Cha et al., 2011

Esmaeili et al., 2014

Xu et al., 2011

Lavandula

angustifolia

- Hojas y flores: Fenoles (Ácido ferulico, Glucosida kaemferol malonil, Ácido

rosmarinico)

- Aceites esenciales: Linalool; Antranilato linalil; 1-terpineno-4-ol, p-ment-1-en-8-

ol; 1,8-cineola; Linalool; Bomeol; Beta-fellandreno; Camfor

Adaszynska et al.,

2013

Lakusic et al., 2014

Spiridon et al., 2011

Sedum

dendroideum

- Jugo de hojas: Flavonoides (Kaempferitrina, Kaempferol 3-O--

glucopyranosida-7-O--rhamnopyranosida, Kaempferol 3-O-neohesperidosida-7-

O--rhamnopyranosida; -rhamnoisorobina; Kaempferol 3-O-neohesperidosida-7-

O--glucopyranosida; Afzelina; Kaempferol)

De Melo et al., 2009

61

Figura 17. Resultados del análisis por HPTLC de los extractos candidatos para identificar patrones

de sus compuestos fenólicos. A) Placa desarrollada con acetato de etilo : ácido fórmico : ácido acético :

agua (100:11:11:13 por volumen) e iluminada con luz de 366 nm. B) Placa derivatizada con reactivo de

Productos Naturales y polietilenglicol e iluminada con luz de 366 nm. 1) Extracto de B. pilosa, 2) Extracto

de L. angustifolia, 3) Extracto de C. officinalis, 4) Extracto de E. japonica (UNAM), 5) Extracto de E.

japonica (parque), 6) Extracto de A. mexicana, 7) Extracto de S. dendroideum, 8) Estándares de

compuestos fenólicos.

Figura 18. Resultado del análisis por HPTLC de los extractos candidatos para identificar patrones

de actividad antioxidante. Placa desarrollada con acetato de etilo : ácido fórmico : ácido acético : agua

(100:11:11:13 por volumen), derivatizada con DPPH e iluminada con luz blanca de transmisión. 1)

Extracto de B. pilosa, 2) Extracto de L. angustifolia, 3) Extracto de C. officinalis, 4) Extracto de E.

japonica (UNAM), 5) Extracto de E. japonica (parque), 6) Extracto de A. mexicana, 7) Extracto de S.

dendroideum, 8) Estándares de compuestos fenólicos.

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

A B

62

6.6 Efecto del extracto de Eriobotrya japonica (níspero) en cepas mutantes de genes

relacionados al envejecimiento para identificar sus mecanismos de acción

Se eligió E. japonica entre las seis especies candidatas propuestas en este trabajo para

identificar su mecanismo de acción, debido a la facilidad con la que se obtenía la

muestra. El extracto de la decocción de hojas del níspero se probó en quince mutantes de

genes relacionados al envejecimiento para identificar posibles interacciones de los

componentes del extracto con estos genes. Para ello se usó el ensayo automatizado para

caracterizar el envejecimiento cronológico de 15 cepas mutantes de S. cerevisiae, así

como la cepa de referencia YEG01 (Mat ), tratadas con 5% del extracto de níspero y

un control sin tratamiento.

Asimismo, se midió la cinética de crecimiento para calcular la tasa de

duplicación (T) de las poblaciones, con la finalidad de asegurar que no había diferencia

significativa que pudiera influir en el efecto del extracto en la CLS de la levadura.

Se observó que la T de las poblaciones de la cepa de referencia (WT) con y sin

extracto de níspero no mostraba diferencia significativa. Cuando se comparó la T de

cada una de las poblaciones de cepas mutantes con y sin extracto de níspero tampoco se

observó diferencia significativa; excepto para la cepa mutante ras2, donde la T de la

población con el extracto de níspero fue menor que la T de la población control, siendo

esta diferencia significativa.

Posteriormente, cuando se realizaron los ensayos de determinación de la CLS

con las cepas mutantes de atg21 (proteína de unión a fosfoinositida, relacionada a

autofagia), cyb5 (citocromo B), gis1 (factor de transcripción, dimetilasa de

histonas) y tor1 (cinasa blanco de rapamicina) se tuvieron problemas técnicos, por lo

que los resultados obtenidos no fue posible interpretarlos adecuadamente. Los resultados

del ensayo de CLS de las demás cepas mutantes se muestran a continuación.

En todas las gráficas de supervivencia se puede apreciar que la cepa de referencia

YEG01 (Mat ) con el extracto de níspero al 5%, representada por una línea sólida

negra, tiene una mayor supervivencia si se compara con la población que no tiene

63

extracto (Medio SC – 0%), representada con la línea punteada negra, siendo esta

diferencia significativa.

Se usó como control interno la cepa mutante his1, por ser una mutación que no

tiene efecto en el envejecimiento. En la Figura 19A se observa que la cepa de referencia

(línea punteada negra) y la cepa mutante (línea punteada magenta) tienen el mismo

porcentaje de supervivencia y no existe una diferencia significativa entre ellas, tal como

se esperaba. Para ambas cepas incubadas con el extracto de níspero al 5% hubo un igual

incremento en la supervivencia, sin mostrar diferencia significativa entre ellas. El

aumento en la supervivencia de las poblaciones con el extracto de níspero fue

significativo.

En este ensayo se trabajó con cuatro cepas mutantes de genes relacionados al

envejecimiento porque su ausencia incrementa la supervivencia de la levadura; su efecto

fue identificado en ensayos previos. Estas mutantes son: ald6 (acetaldehido

deshidrogenasa), ras2 (regulador de la respuesta a carencia de nitrógeno), rps14A

(proteína ribosomal de la unidad pequeña) y swr1 (remodelador de la cromatina). En

los cuatro casos se observó que la cepa mutante (línea punteada magenta) tuvo una

mayor supervivencia comparada con la cepa de referencia (línea punteada negra).

La cepa mutante ald6 (Figura 19B), línea punteada magenta, mostró una

mayor supervivencia que la cepa de referencia (línea punteada negra); esta diferencia fue

significativa. Por otro lado, la cepa de referencia incubada con extracto de níspero al 5%

(línea sólida negra) mostró un incremento significativo en la supervivencia con respecto

a la cepa de referencia sin extracto (línea punteada negra). El incremento en la

supervivencia por el efecto del extracto de níspero es similar al causado por el efecto de

la mutación, siendo la supervivencia de ambas poblaciones de alrededor del 40%, y entre

ellas no hay diferencia significativa. Sin embargo, la cepa mutante ald6 incubada con

extracto de níspero al 5% (línea sólida magenta) mostró un incremento sobre la

supervivencia aún mayor, siendo de casi el doble de los antes mencionados, y

significativamente diferente a todos los anteriores.

64

En la Figura 19C, la cepa mutante ras2 (línea punteada magenta) tuvo una

mayor supervivencia (casi un 80%) con respecto a la de la cepa de referencia (línea

punteada negra), siendo significativa esta diferencia. Sin embargo, no hubo una

diferencia significativa en la supervivencia de la cepa mutante incubada con extracto de

níspero (línea sólida magenta) o sin el extracto (línea punteada magenta).

Por su parte, la mutante rps14A (Figura 19D, línea punteada magenta), mostró

un ligero aumento en su supervivencia comparado con la cepa de referencia (línea

punteada negra), aunque esta diferencia no es significativa. La supervivencia de la cepa

mutante incubada con el extracto de níspero (línea sólida magenta) fue mayor que la de

la cepa mutante sin tratamiento (línea punteada magenta), siendo significativa esta

diferencia; además de ser ligeramente mayor que la supervivencia de la cepa de

referencia con tratamiento (línea sólida negra), aunque entre ellas no hay diferencia

significativa.

Finalmente, la supervivencia de la cepa swr1 (Figura 19E) sin tratamiento

(línea punteada magenta), incubada con el extracto de níspero (línea sólida magenta) y la

de la cepa de referencia con tratamiento (línea sólida negra) no mostraron una diferencia

significativa entre ellas; sin embargo, su supervivencia fue mayor que la de la cepa de

referencia sin tratamiento (línea punteada negra), siendo esta diferencia significativa.

Por su parte, se probaron seis cepas mutantes de genes relacionados al

envejecimiento porque su ausencia disminuye la supervivencia de la levadura; su efecto

fue identificado en ensayos previos. Estas mutantes son: hap3 (factor de transcripción

y regulador global de la expresión de genes respiratorios), rim15 (proteína cinasa

involucrada en la proliferación), ste12 (factor de transcripción que es activado por

señalización de MAPK), msn2 (activador transcripcional en respuesta a estrés),

msn4 (activador transcripcional en respuesta a estrés) ymsn2msn4. Todas las

mutantes (línea punteada magenta) tuvieron una menor supervivencia comparada con la

cepa de referencia (línea punteada negra).

65

Figura 19. Curvas del porcentaje de decaimiento de las cepas mutadas en genes relacionados con el

envejecimiento por aumentar la supervivencia, tratadas con extracto de níspero al 5%, y su análisis

estadístico multivariable. A) Cepa mutante his. B) Cepa mutante ald6. C) Cepa mutante ras2. D)

Cepa mutante rps14A. E) Cepa mutante swr1. Análisis estadístico multivariable de los valores de

crecimiento de la tasa exponencial (tasa de decaimiento); las barras con valores más pequeños (izquierda

del gráfico) representan una mayor supervivencia de la población.

A B C

D E

66

En el caso de las cepas mutantes msn2 (Figura 20D), msn4 (Figura 20E)

ymsn2msn4 (Figura 20F) incubados con el extracto de níspero (línea sólida

magenta) se observa un aumento en su supervivencia cuando se compara con la de las

cepas mutantes sin tratamiento (línea punteada magenta), siendo en los tres casos una

diferencia significativa. El aumento en la supervivencia de las cepas mutantes incubas en

el extractos es el mismo que se observó en la cepa de referencia incubada con el

extracto.

La supervivencia de la cepa mutante rim15 (Figura 20B) con tratamiento

(línea sólida magenta) fue significativamente mayor que la supervivencia de la cepa

mutante sin tratamiento (línea punteada magenta); sin embargo, la mutante incubada con

el extracto no logró recuperarse por completo para alcanzar la misma supervivencia que

la cepa de referencia sin tratamiento (línea punteada negra). Además, el aumento en la

supervivencia de las cepas de referencia y mutante incubadas con el extracto de níspero,

fue muy similar.

Por su parte, la cepa ste12 (Figura 20C) incubada con el extracto (línea sólida

magenta), se recuperó hasta alcanzar el porcentaje de supervivencia de la cepa de

referencia sin tratamiento (línea punteada negra); sin embargo, la cepa de referencia con

tratamiento (línea sólida negra) tuvo una mayor supervivencia en comparación de las

antes mencionadas, siendo significativamente diferentes.

La mutante hap3 (Figura 20A) incubada con extracto de níspero (línea sólida

magenta) no sólo se recuperó si se compara con su supervivencia sin tratamiento (línea

punteada magenta), sino que mostró una supervivencia mayor que la cepa de referencia

sin tratamiento (línea punteada negra) y con tratamiento (línea sólida negra), siendo

todas estas diferencias significativas.

67

Figura 20. Curvas del porcentaje de decaimiento de las cepas mutadas en genes relacionados con el

envejecimiento por disminuir la supervivencia, tratadas con extracto de níspero al 5%, y su análisis

estadístico multivariable. A) Cepa mutante hap3. B) Cepa mutante rim15. C) Cepa mutante ste12.

D) Cepa mutante msn2. E) Cepa mutante msn4. F) Cepa mutante msn2 msn4. Análisis

estadístico multivariable de los valores de crecimiento de la tasa exponencial (tasa de decaimiento); las

barras con valores más pequeños (izquierda del gráfico) representan una mayor supervivencia de la

población.

A B C

D E F

68

7.0 Discusión

Para cumplir con los objetivos de este trabajo, se implementó un ensayo automatizado

de prueba usando compuestos identificados previamente como promotores de la

longevidad. El ensayo confirmó que tres compuestos (metformina, espermidina y

rapamicina) incrementan significativamente la CLS de la levadura. Posteriormente se

realizó un rastreo a gran escala de extractos de plantas medicinales para identificar

aquellos capaces de extender la longevidad durante el envejecimiento cronológico de la

levadura S. cerevisiae. Este trabajo reveló que seis extractos (Acrocomia mexicana,

Bidens pilosa, Calendula officinalis, Eriobotrya japonica, Lavandula angustifolia,

Sedum dendroideum) incrementan significativamente la CLS de la levadura. También se

probaron los seis extractos en tres diferentes cepas de S. cerevisiae para determinar si el

efecto sobre la CLS era independiente de la cepa usada. Además se caracterizó el perfil

de compuestos fenólicos y el efecto antioxidante de los seis extractos candidatos.

Finalmente se identificó que el extracto de E. japonica interactúa funcionalmente con al

menos dos genes que están relacionados al envejecimiento.

7.1 Los compuestos metformina, espermidina y rapamicina aumentan la CLS de


De los siete compuestos identificados como promotores de la longevidad, en mi ensayo

cuatro de ellos fueron inefectivos para extender la CLS de la levadura en las

concentraciones probadas. Los efectos en la extensión de la duración de la vida de la

dapsona y la curcumina anteriormente fueron demostrados en otros organismos modelo

como gusanos, moscas y roedores, pero dicho efecto no se observó en levaduras (Choi et

al., 2013). Las diferencias naturales de la complejidad de tener sistemas multicelulares y

unicelulares, o simplemente porque estos compuestos actúan a nivel sistémico, pueden

ser la razón por la cual estos dos compuestos no extendieron la CLS de la levadura. Por

su parte, el resveratrol primeramente fue descrito como un potencial promotor de la

longevidad por extender la RLS de la levadura e incrementar la actividad de Sir2

(Howitz et al., 2003). Es importante mencionar que para medir la duración de vida en las

69

levaduras se han usado los dos modelos de envejecimiento, la CLS y la RLS, sin

embargo, estos dos métodos tienen características biológicas diferentes (Longo et al.,

2012). La CLS refleja la supervivencia cuando un medio se ha agotado, planteando un

envejecimiento celular, mientras que la RLS es el número de progenie que una célula

produce hasta perder su fecundidad, planteando un parámetro de reproducción. Hasta el

momento no se ha encontrado una correlación fuerte entre ambos modelos de

envejecimiento; en mi ensayo esta falta de correlación fue evidente, ya que a pesar de lo

descrito para la RLS, el resveratrol fue inefectivo para extender la CLS de la levadura.

Otro punto importante es que el resveratrol aumenta la longevidad a través del

incremento de la actividad de Sir2, sin embargo, este mecanismo se ha reportado que

extiende la RLS pero que no incrementa la CLS (Kaeberlyn, 2010). Finalmente, la

cafeína se menciona que incrementa la CLS de la levadura con un tratamiento de 400

M en un ensayo de UFC (Unidades Formadoras de Colonia), pero que este incremento

era muy pequeño, sólo a las 20 h incrementaba la supervivencia media de la levadura

(Wanke et al., 2008). Es posible que el ensayo que se empleó en este trabajo fuera

incapaz de detectar un cambio tan minúsculo en la CLS de la levadura a pesar de haber

usado concentraciones de hasta 10 mM de este compuesto. Sin embargo, mis resultados

son consistentes con los de Choi et al. (2013), donde ninguno de los cuatros compuestos,

cafeína, curcumina, dapsona y resveratrol, tuvieron efecto en la CLS de la levadura, a

pesar de que fueron probados en dos medios, YPD y SC, y por dos ensayos distintos al

mío, citometría de flujo por tinción de viabilidad con PI (propidium iodide = yoduro de

propidio) y UFC (Choi et al., 2013).

Los compuestos que en este ensayo incrementaron significativamente la CLS de

la levadura fueron la metformina, la espermidina y la rapamicina. De la metformina ya

se había demostrado su efecto en extender la duración de la vida en otros organismos

modelo como C. elegans y Mus musculus (Anisimov et al., 2008), pero no había sido

probado su efecto en la levadura. Choi et al., 2013 realizaron un ensayo con

concentraciones de hasta 1 mM de metformina sin obtener un incremento en la CLS de

S. cerevisiae. A diferencia de estos ensayos, en mi trabajo se probaron concentraciones

mayores, observándose que las concentraciones 5 mM y 10 mM extendían la CLS de la

levadura. Esto demuestra que la concentración 1 mM de metformina es insuficiente para

70

aumentar la CLS de la levadura y que se requieren concentraciones mayores a ésta,

siendo su efecto dependiente de la dosis. Las sólidas pruebas del efecto de la metformina

para aumentar la duración de la vida en los diversos organismos a través de mecanismos

básicos del envejecimiento, la ha convertido en la primera droga que se ensayará en

humanos, en un estudio aprobado por la FDA, para avalar su efecto en la longevidad

(TAME Study, 2015). El efecto de la espermidina para retrasar el envejecimiento se ha

descrito en levaduras, gusanos, moscas, cultivos de células de ratón y células humanas.

En las levaduras, la concentración 4 mM se describió que extendía la CLS en el ensayo

de clonogenicidad (Eisenberg et al., 2009). Al igual que en ese estudio, nosotros

observamos que la espermidina extendía la CLS de la levadura en concentraciones desde

1 mM, corroborando que el efecto es consistente aún usando dos ensayos diferentes. El

efecto de la rapamicina para retrasar el envejecimiento se ha descrito en la mayoría de

los organismos modelo. Para S. cerevisiae, se observó que desde una concentración

100 nM, la rapamicina incrementa la CLS hasta en un 87%, en dos diferentes medios,

YPD y SC, y por dos ensayos, UFC y citometría de flujo por tinción de viabilidad con PI

(Choi et al., 2013). Al igual que en este estudio, mis resultados mostraron que la

rapamicina aumenta la CLS, a pesar de usar una concentración menor, 50 nM, y un

ensayo de densidad óptica.

El ensayo automatizado de densidad óptica para el análisis masivo de muestras,

propuesto en este trabajo, es efectivo para identificar compuestos o extractos que son

capaces de extender la longevidad en el modelo del envejecimiento cronológico de S.

cerevisiae. Este ensayo, a pesar de ser indirecto, muestra resultados consistentes al

compararse con los descritos en otros estudios que usaron ensayos directos como

citometría de flujo, UFC y clonogenicidad, para los siete compuestos identificados como

promotores de longevidad (cafeína, curcumina, dapsona, espermidina, metformina,

rapamicina y resveratrol).

71

7.2 Seis extractos de plantas medicinales incrementan significativamente la CLS de


Como ya se señaló, S. cerevisiae se ha usado como organismo modelo para identificar

extractos de plantas que aumentan la CLS en rastreos a gran escala, permitiendo

proponer extractos candidatos para obtener más información de ellos y su relación con la

longevidad (Lutchman et al., 2016; Wu et al., 2014). En mi estudio se probaron 36

extractos de plantas correspondientes a 30 especies, encontrando que seis de ellas eran

eficientes para extender la CLS de la levadura; éstas fueron: A. mexicana, B. pilosa, C.

officinalis, E. japonica, L. angustifolia y S. dendroideum.

La aceitilla (B. pilosa) es originaria de América; el extracto de sus partes aéreas

tiene efecto hipoglucémico, antiinflamatorio, antioxidante y antitumoral contra el

carcinoma de Ehrlich (Alarcon-Aguilar et al., 2002; Fotso et al., 2014; Kviecinski et al.,

2008; Liu et al., 2013). El extracto probado en fibroblastos humanos mostró habilidad

para estimular la matriz extracelular, incrementar factores de crecimiento y modular

receptores de retinol, probando ser un agente reparador antienvejecimiento (Dieamant et

al., 2015). Demostramos que el extracto de aceitilla también tiene efecto

antienvejecimiento en levaduras, ya que incrementa significativamente su CLS. Cabe

esperar que en estudios siguientes se muestre el efecto antienvejecimiento en otros

organismos.

El níspero (E. japonica) es ampliamente cultivado por el valor de su fruto y por

ser una planta ornamental. En la medicina tradicional china se usan sus hojas para

combatir diversas enfermedades; el efecto hipoglucémico, antioxidante y

antiinflamatorio del extracto de las hojas y tallos ha sido probado de manera fehaciente

(Cha et al., 2011; Chen et al., 2008; Rashed et al., 2014). Además, el extracto de las

semillas, probado en cultivos de fibroblastos de ratas, retarda y protege del

envejecimiento celular porque asemeja la homeostasis del calcio intracelular de células

senescentes al de las células jóvenes (Muramoto et al., 2011). En mi estudio, las dos

muestras biológicas de E. japonica fueron capaces de aumentar significativamente la

CLS de la levadura, corroborando que el níspero tiene efectos en la longevidad y

apoyando el efecto en el retraso del envejecimiento descrito por Muramoto et al. (2011).

72

Al igual que la aceitilla y el níspero, los extractos de coyul (A. mexicana),

caléndula (C. officinalis), lavanda inglesa (L. angustifolia) y siempreviva (S.

dendroideum) tienen efecto para combatir diversas enfermedades relacionadas con la

edad. Por ejemplo, el extracto de raíz de coyul tiene efecto hipoglucémico (Andrade-

Cetto et al., 2005); e, incluso, se ha demostrado que estos extractos contrarrestan más de

una enfermedad. El extracto de siempreviva tiene efecto antiinflamatorio e

hipoglucémico (Da Silva et al., 2014; De Melo et al., 2009), la infusión de flor de

caléndula tiene efecto antiinflamatorio, antioxidante y antitumoral (Jiménez-Medina et

al., 2006; Preethi et al., 2009), y el extracto de hojas y de flor de lavanda inglesa se

comprobó su efecto antiinflamatorio, antioxidante y su capacidad de mejorar del

rendimiento espacial en el Alzheimer (Hajhashemi et al., 2003; Kashani et al., 2011;

Spiridon et al., 2011). En este estudio, se demostró que estos extractos tienen efecto en

la longevidad porque incrementan significativamente la CLS de la levadura. Para estas

seis especies se probó que hay una conexión entre su efecto para combatir una o varias

enfermedades que se desarrollan en la vejez y su efecto en el retraso del envejecimiento.

Esto aterriza la idea propuesta recientemente por Argyropoulou et al. (2013), que el

efecto del extracto para combatir una enfermedad es sólo la consecuencia y que su

efecto directo es retrasando el envejecimiento e incrementando la salud.

Esta idea, también, ha llevado a la propuesta del estudio TAME (Targeting

Aging with Metformin = Dirigido contra el envejecimiento con metformina), donde se

plantea que demorar el envejecimiento con el uso de compuestos naturales es una

manera efectiva de postergar el desarrollo de las enfermedades relacionadas con la edad.

En este año, 2016, se probará en humanos el efecto de la metformina, compuesto

originario de la planta Galega officinalis, para evaluar sus efectos sobre el

envejecimiento; siendo un punto de partida para probar más compuestos naturales anti-

envejecimiento en el humano (TAME Study, 2015). Este gran avance nos reitera la

importancia de haber identificado seis nuevos extractos de plantas con efecto sobre la

longevidad, motivándonos a realizar más ensayos para obtener más información sobre

ellos. Esto con el fin de comprobar si son una promesa futura para retrasar el

envejecimiento en el humano, trayendo más salud a sus años y previniendo o retrasando

al mismo tiempo muchas enfermedades relacionadas con la vejez.

73

Una séptima especie mostró un efecto interesante en mi estudio, guacima

(Guazuma ulmifolia). Dos extractos de esta especie fueron probados, la decocción de

hojas y la decocción de corteza; ambos mostraron un efecto adverso en la supervivencia

de la levadura. La disminución de la supervivencia de la levadura es consistente en los

dos tratamientos con guacima, a pesar de que los extractos provenían de dos partes

diferentes de la planta, lo que nos lleva a creer que tiene compuestos tóxicos para el

organismo. Se ha descrito que el uso de dosis elevadas ingeridas por humanos produce

náuseas, vómitos y diarreas, atribuyéndolo a la posible presencia de sustancias activas

(Patiño, 1963). El efecto tóxico de los extractos de la guacima, principalmente el

observado en la levadura, nos lleva a pensar que puede presentarse con otros

organismos, como los fúngicos. Es por esto que proponemos al extracto de G. ulmifolia

para futuros estudios, confrontándolo con organismos fúngicos patógenos para probar su

efecto fungicida.

Por otro lado, cabe mencionar que la decisión de usar cepas de referencia

diferentes para identificar el efecto de los extractos acuosos y los extractos alcohólicos

surgió a partir de los problemas con el decaimiento de la cepa diploide S288c; ya que el

porcentaje de supervivencia muestra un fenómeno estacionario. Una alternativa para

explicarlo es la evaporación del cultivo; ésta se da a través del experimento causando un

efecto aparente de tener más células vivas conforme pasa el tiempo, que es visible en las

gráficas de decaimiento por mantener o aumentar la supervivencia de las poblaciones a

través del tiempo. En mi ensayo, la evaporación del medio pudo propiciarse debido a

uno o la combinación de varios de estos factores: poco volumen del cultivo, la alta

temperatura (30 ºC) o las variaciones de humedad del ambiente. Sin embargo, en nuestro

laboratorio seguimos realizando experimentos para descartar esta posibilidad. Otra

explicación de este fenómeno es el crecimiento adaptativo, éste ocurre cuando un grupo

de células deja su estado quiescente y reingresa al ciclo celular, aparentando un

incremento en la supervivencia (Longo et al., 2012). Esto puede ser posible ya que

aproximadamente 50% de los cultivos silvestres de levadura que se usan en estudios de

envejecimiento cronológico presentan este fenotipo. A pesar de los estudios extensivos

para aclarar el crecimiento adaptativo, las características principales que se han descrito

es que depende de mutaciones en el ADN que se acumulan durante el envejecimiento, y

74

que sus requerimientos nutrimentales son tomados de las células muertas del cultivo

(Fabrizio & Longo, 2008).

7.3 El efecto de los extractos candidatos sobre la CLS difiere de acuerdo a la cepa de

referencia donde se prueba

Los seis extractos que se propusieron como candidatos para promover la longevidad se

probaron en tres cepas de referencia provenientes de nuestro laboratorio: la cepa

diploide S288c, la cepa haploide S288c y la cepa haploide YEG01; observándose una

variación del efecto del extracto sobre la CLS de las distintas cepas de referencia.

Los extractos que mostraron primeramente aumentar la CLS de la cepa diploide

S288c, también fueron capaces de aumentar la CLS de la cepa haploide YEG01, aunque

no la de la cepa haploide S288c; tales extractos fueron obtenidos de B. pilosa, C.

officinalis, E. japonica y L. angustifolia. Por otra parte, los extractos de A. mexicana y S.

dendroideum mostraron primeramente aumentar la CLS de la cepa haploide S288c, y su

efecto también se observó en la cepa diploide S288c, pero no en la cepa haploide

YEG01. Es interesante ver que el efecto de los seis extractos se mantuvo para la cepa

diploide, pero su efecto varió en las cepas haploides. Creemos que esta variación de su

efecto es debido a las variaciones genéticas que hay entre las cepas haploides, ya que se

ha observado que en otros compuestos promotores de la longevidad hay una variación de

su efecto, dependiendo del sistema. La metformina, por ejemplo, tiene un efecto en la

duración de la vida con rango de variación dependiendo de la edad, el género y las

condiciones de salud de los roedores (Berstein, 2012). Incluso se ha observado en otras

intervenciones, como la restricción calórica, que tiene un efecto variable aún entre cepas

de una misma especie (Narasimhan et al., 2009). Es por ello que existe un interés

creciente por la farmacogenética, ya que incluso en el humano, la variación genética de

los blancos farmacológicos produce una respuesta distinta a pesar de que los pacientes se

tratan con un mismo medicamento (Genetic Alliance, 2009). Por lo tanto, proponemos

identificar el efecto de nuestros seis extractos en diversas cepas, provenientes de aislados

naturales, para corroborar si se presentan variaciones en el efecto sobre la CLS.

75

Una razón adicional para explicar las diferencias del efecto de los extractos en

las cepas haploides puede darse por los marcadores que éstas tienen. Para la selección de

cepas, éstas tienen mutaciones como marcadores de auxotrofía; por ejemplo, nuestra

cepa de referencia haploide S288c tiene una mutación por sustitución en el gen URA3.

Se sabe que en algunas mutaciones de auxotrofía influyen diversos parámetros

fisiológicos, a pesar de compensar el medio con el o los nutrientes faltantes. Se ha visto

que las auxotrofías tienen efectos importantes en la CLS de la levadura, por lo que es

posible que éstas también estén influyendo en el efecto de los extractos, propiciando su

variación dependiendo del extracto y las auxotrofías de la cepa haploide (Mülleder et al.,

2012).

7.4 El extracto de Eriobotrya japonica interactúa con dos genes que están relacionados

al envejecimiento en Saccharomyces cerevisiae

En mi estudio se probó el extracto de níspero en 15 mutantes de genes involucrados con

el envejecimiento. Para determinar si existía una relación entre el gen y el efecto del

extracto de níspero en la CLS de la levadura se usaron los parámetros básicos de la

epistasis. En el caso de las cepas con mutaciones que aumentan la CLS probadas con el

extracto de níspero se tienen dos posibles panoramas: no incrementa la CLS al

compararse con la de la mutación por sí sola, y hay incremento en la CLS si se compara

con la de la mutación por sí sola. En el primero se considera que el efecto del extracto

depende de este gen o que el extracto está interactuando con este gen faltante para

incrementar la longevidad de la levadura. En el segundo se considera que el extracto de

níspero es independiente o no interactúa con este gen para aumentar la CLS de la

levadura. Por otro lado, para las mutaciones que disminuyen la CLS, si al combinar la

mutación con el extracto el incremento en la CLS es el mismo que el observado en la

cepa silvestre cuando se le agrega el extracto, se identifica que el extracto es

independiente o que no interactúa con este gen para aumentar la CLS de la levadura.

Las vías involucradas en aumentar la duración de la vida cronológica de la

levadura son principalmente Tor/Sch9, Sch9 y Ras/AC/PKA, las cuales controlan el

76

censado de nutrientes. Estas vías convergen en Rim15, que es el encargado de activar

factores de transcripción de respuesta a estrés tales como Gis1 y Msn2/4. Estos últimos

inducen SOD, HSP‟s (heat shock proteins = proteínas de choque de calor), autofagia y

otros procesos que aumentan la longevidad (Figura 21; Longo et al., 2012). En mi

estudio trabajé con seis mutantes de los genes involucrados en estas vías e identifiqué

que el extracto de níspero depende de Ras2 para incrementar la CLS en la levadura; y,

por otro lado, mis resultados revelan que es independiente de Rim15, Msn2 y Msn4 que

se encuentran río abajo. Como se sabe que Msn2 y Msn4 actúan paralelamente,

confirmamos con la doble mutante msn2msn4 que el efecto del extracto de níspero

es independiente de dicha vía. Desafortunadamente no fue posible interpretar los

resultados para Tor1 y Gis1 por problemas técnicos, esto nos hubiese permitido ampliar

el panorama de cómo el extracto de níspero está involucrado en estas vías principales. Es

por ello que se propone probar nuevamente el extracto en estas cepas e incluso probarlo

en cepas mutantes de los genes faltantes que completan las vías.

Swr1 forma parte del complejo Swr1, el cual se encarga de reclutar la histona

Htz1 (H2A.Z, homólogo en mamíferos) y promover la expresión de la heterocromatina

silenciada (Krogan et al., 2003). Se conoce que durante el proceso de envejecimiento

hay un cambio dinámico en la estructura de la cromatina, de tal manera, que al suprimir

genes para proteínas remodeladoras de la cromatina da como resultado la extensión de la

duración de la vida en la levadura (Das & Tyler, 2013). Anteriormente, en nuestro

laboratorio, se identificó que el complejo Swr1 es un factor en el envejecimiento

cronológico de la levadura; siendo su papel específico como regulador de la CLS en la

restricción calórica (Garay et al., 2014). En mi estudio, el extracto de níspero mostró el

mismo efecto en la longevidad que la mutante para Swr1, sugiriendo que el efecto del

níspero depende de Swr1. El efecto del extracto de níspero dependiente de Swr1 y de

Ras2 nos podría sugerir que éste actúa como un mimetizador de la restricción calórica.

Sin embargo, aún queda probar con las otras proteínas del complejo Swr1, Arp6 y Swc3,

para identificar si el efecto del extracto de níspero también depende de ellas, así como

probarlo directamente en condiciones de restricción calórica, para aseverar que dicho

extracto es un mimetizador. También desconocemos si el extracto de níspero está

activando una vía alterna donde interactúen directamente Ras2 con Swr1, esto por su

77

independencia con Rim15 y Msn2/4, por lo que son necesarias más pruebas con el

extracto.

Ald6 (acetaldehido deshidrogenasa) cataliza la conversión de acetaldehido a

acetato, la enzima es importante en el crecimiento en etanol, e importante en la

producción de acetil-CoA. Se demostró que Ald6 se degrada preferentemente por

autofagia y que al existir falta de nitrógeno, la reducción de Ald6, mejora la tasa de

viabilidad en S. cerevisiae (Onodera & Ohsumi, 2004). En nuestro laboratorio, se

confirmó que la falta de Ald6 permitía incrementar la CLS de la levadura (Garay et al.,

2014). En mi ensayo, identificamos que el efecto del extracto de níspero es

independiente de Ald6, sin embargo, al combinar la supresión del gen con el extracto de

níspero se muestra un efecto sinérgico, lo cual sugiere que el extracto de níspero

potencía el efecto de aumentar la CLS al no estar la proteína Ald6, pero que no depende

directamente de ésta. Este efecto sinérgico también sugiere que la vía donde actúa el

extracto de níspero y la vía que actúa cuando falta de la proteína Ald6 en algún punto se

compensan.

Figura 21. Vías regulatorias involucradas en incrementar la

duración de la vida cronológica en la levadura (Longo et al.,

2012).

78

Rps14A es una proteína ribosomal de la subunidad pequeña (40S) de levadura,

involucrada en la maduración de la subunidad y su ensamblaje, que presenta un

homólogo en mamíferos (S14) y en bacterias (S11). En el ensayo masivo realizado

anteriormente en nuestro laboratorio se identificó que al suprimir RPS14A, la CLS de la

levadura incrementa sutilmente (Garay et al., 2014). Este efecto se corroboró en el

presente ensayo, donde el incremento en la CLS de la levadura fue observable pero no

estadísticamente significativo. Por otro parte, al combinar la mutación con el extracto de

níspero se observó que el efecto del incremento en la CLS se suma, lo cual nos sugiere

que el mecanismo de acción del extracto de níspero es independiente de la proteína

ribosomal Rps14A.

Ste12 es un factor de transcripción, activado por MAPK (mitogen-activated

protein kinases = proteína cinasa activada por mitógenos), que activa genes involucrados

en el apareamiento. Mutaciones en genes STE se probaron en nuestro laboratorio para

identificar el efecto en la CLS de la levadura, mostrando siempre una disminución de la

misma (Campos et al., en preparación). En mi ensayo, la mutación en STE12 también

disminuyó la CLS de S. cerevisiae; y fue interesante que al probar el extracto de níspero

en la cepa mutante se presentó un efecto compensatorio, siendo recuperada la

supervivencia hasta la mostrada en la cepa silvestre. Esto nos hace proponer que el

extracto de níspero compensa la falta del gen, ya sea porque hace la función del gen, o

porque activa otro compuesto para sustituir al gen faltante. Por su parte, el efecto que se

mostró cuando se combinaba la mutación en HAP3 con el extracto de níspero fue aún

más sorprendente que el antes mencionado. La mutación por sí sola, en mi ensayo,

mostraba una disminución hasta del 10% de la supervivencia de la levadura [la

disminución en la CLS de la levadura por esta mutación ya había sido identificada

anteriormente por otros grupos (Garay et al., 2014; Laschober et al., 2010)], pero al

incubar con el extracto de níspero, el efecto en la supervivencia no sólo se vio

compensado, sino que la supervivencia se vio incrementada, incluso superando la

mostrada por la cepa silvestre incubada con el extracto. Hap3 es una subunidad del

complejo Hap2p/3p/4p/5p, un activador transcripcional y regulador global de la

expresión de genes de la respiración. Por ello suponemos que el efecto que observamos

para este caso tan particular se deba a que el efecto del níspero es activar otro factor

79

transcripcional que esté supliendo a Hap3 en el complejo, o incluso activar otro

complejo transcripcional que devuelve y mejora la supervivencia de la levadura. Sin

embargo, aún quedan por hacer más ensayos para poder dilucidar el mecanismo de

acción del extracto de níspero.

Para finalizar es importante mencionar que la implementación de un ensayo

automatizado eficiente para identificar compuestos y extractos que sean capaces de

incrementar significativamente la CLS de S. cerevisiae nos permitirá seguir realizando

estudios a gran escala para descubrir nuevos compuestos naturales con efecto inhibidor

del envejecimiento. Aún nos resta seguir probando los seis extractos de plantas,

identificados en este estudio, que incrementan significativamente la CLS de la levadura,

tanto en diversos aislados naturales de la misma, como en otros organismos modelo;

además de identificar los compuestos individuales de cada extracto, que son los

responsables del efecto. También identificamos que dos genes interactúan directamente

con el extracto de E. japonica, sin embargo, para ampliar la información sobre el

mecanismo de acción de este extracto se sugiere probar más genes que ya han sido

relacionados al envejecimiento.

80

8.0 Conclusiones

Comprobamos que el ensayo automatizado de Densidad Óptica es capaz de identificar

compuestos y/o extractos crudos que extienden la duración de la vida cronológica de la

levadura Saccharomyces cerevisiae.

En nuestro ensayo prueba, corroboramos que la espermidina y la rapamicina son

compuestos promotores de la longevidad que extienden la CLS de Saccharomyces

cerevisiae, y por primera vez comprobamos que la metformina en concentraciones

mayores a 5 mM es capaz de incrementar la CLS de la levadura.

En el rastreo a gran escala de las 30 especies de plantas medicinales se identificó

que extractos de seis de ellas: Acrocomia mexicana, Bidens pilosa, Calendula officinalis,

Eriobotrya japonica (dos muestras biológicas), Lavandula angustifolia y Sedum

dendroideum, son capaces de extender significativamente la CLS de la levadura.

El efecto de los extractos en la extensión de la CLS de la levadura difiere de

acuerdo a la cepa de referencia donde se prueben, mostrando que seis extractos son

capaces de extender la CLS de la cepa diploide S288c, pero su efecto difiere cuando se

prueba en las cepas de referencia haploides S288c y YEG01; posiblemente esto último

se deba a las auxotrofías presentes en las cepas haploides.

Finalmente, se identificó que el efecto del extracto de Eriobotrya japonica para

incrementar la CLS de la levadura depende de Ras2 y Swr1; que el extracto potencía el

efecto de la ausencia de Ald6, pero sin interactuar directamente con ella; que compensa

la falta del gen STE12; y que además de compensar, mejora la CLS de la levadura

cuando está carente el gen HAP3.

81

9.0 Perspectivas

Las conclusiones propuestas en base al trabajo desarrollado nos permiten plantearnos

nuevas perspectivas para este proyecto, permitiendo enriquecer el estudio de las plantas

medicinales con efecto sobre la longevidad.

Primeramente para los seis extractos de plantas que ya han sido identificados

como promotores de la longevidad en la cepa diploide S288c, aún resta probarlos en

diversos aislados naturales de S. cerevisiae para identificar su efecto sobre la CLS de

éstos y dilucidar si hay variación en el efecto de los extractos debido a sus variaciones

genéticas, como la observada en las cepas haploides YEG01 y S288c.

Además, identificar los mecanismos a través de los cuales los cinco extractos

candidatos que restan retrasan el envejecimiento biológico. Así como proponer una red

de interacciones de los genes que ya han sido identificados que interactúan con el

extracto de Eriobotrya japonica.

Aún queda identificar los compuestos individuales responsables de los efectos

que retrasan el envejecimiento cronológico de la levadura en los seis extractos

medicinales propuestos. Es concebible que sólo algunas combinaciones de ciertos

compuestos de los extractos, y no sólo compuestos individuales, puedan ser los

responsables de su eficacia, o incluso que tengan una eficacia mayor.

También resta probar las 70 especies de plantas medicinales que están propuestas

en la base de datos, con la finalidad de identificar su efecto en la extensión de la CLS de

S. cerevisiae.

A mediano plazo, sería importante probar los extractos candidatos en otros

organismos eucarióticos modelo: C. elegans, D. melanogaster, Mus musculus, para

identificar su efecto en el envejecimiento, esperando que el efecto de estos extractos

pueda generalizarse en otras especies eucarióticas, incluyendo la especie humana.

Finalmente, una dirección alternativa de esta investigación es probar el extracto

de Guazuma ulmifolia en organismos fúngicos patógenos para evaluar su efecto

fungicida, ésto con la finalidad de tener nuevas alternativas para combatir plagas.

82

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Anexo 1. Base de datos de compuestos promotores de la longevidad. (ND) Información no disponible.

Nombre del compuesto Procedencia del

compuesto

Organismo modelo donde

muestra efecto

Mecanismo de acción del

compuesto Observaciones Referencias

Ácido valproico Droga sintética Caenorhabditis elegans Modula la señalización de la

vía insulina/IFG-1

Extiende la duración de la vida máxima y media;

retrasa los cambios degenerativos del movimiento

relacionados al envejecimiento

Evason et al., 2008

Dapsona Sulfona sintética Caenorhabditis elegans Inhibe la piruvato cinasa Incrementa significativamente la duración de la

vida media y máxima Cho et al.,2010

Espermidina Poliamida natural


Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster

Mus musculus

PBMC

Inhibe HAT Inhibe el estrés oxidativo y aumenta la autofagia Eisenberg et al.,

2009

Rapamicina Streptomyces

hygroscipicus


Schizosaccharomyces pombe

Caenorhabditis elegans Mus musculus

Inhibe TORC1 Incrementa la duración de la vida mediante la

activación de la autofagia; inhibe la traducción de

proteínas; incrementa la resistencia al estrés

Rallis et al., 2013

Trolox Hidrosoluble derivado de

la proteína E Caenorhabditis elegans Brachionus manjavacas

Reduce el daño oxidativo Incrementa el promedio de la duración de la vida

media y máxima

Benedetti et al.,

2008

Snell et al.,2012

Ácido ferulsinaico Género Ferula Caenorhabditis elegans ND

Alarga significativamente la duración de la vida media; mejora significativamente la resistencia al

estrés calórico y oxidativo; atenúa la peroxidación

lipídica y la formación de glicatión

Sayed, 2011

Ácido

nordihidroguairatico

Larrea tridentata

(Gobernadora)

Drosophila melanogaster

Familia Culicidae

Mus musculus Género Rattus

ND

En mosquito incrementa la duración de la vida

media en adultos de ambos sexos; incrementa la

duración de la salud en rata y mosca; en ratón incrementa la duración de la vida media en machos

Argyropoulou et al., 2013

Strong et al., 2008

Ácido tánico Café, té, vino tinto,

espinacas Caenorhabditis elegans

Se relaciona con la SAPK/ERK cinasa

Aumenta la resistencia al estrés termal; reduce el

crecimiento; incrementa ligeramente la resistencia

al estrés oxidativo

Saul et al., 2010

Acteosida Incarvillea younghusbandii Drosophila melanogaster ND Prolonga la duración de la vida significativa Pan et al., 2008

Aldehído protocatéquico Sasa senanensis

(Bambú) Drosophila melanogaster Inhibe la histona demetilasa

Extiende significativamente la duración de la vida en hembras de mosca

Nakagawa-Yagi et al., 2012

Aspalatina Aspalathus linearis

(Rooibos) Caenorhabditis elegans

Regula DAF-16/FOXO Incrementa significativamente

la expresión de las enzimas

antioxidantes (sod-3)

Disminuye el daño oxidativo agudo; mejora la tasa

de supervivencia Chen et al., 2013

90

Continuación del Anexo 1.


compuesto


muestra efecto



Baicaleína Scutellaria baicalensis

(Huáng qín)

Caenorhabditis elegans

Células de carcinoma

humano de colon

Activa la vía de señalización Nrf2/SKN-1

Extiende la duración de la vida media y máxima Havermann et al.,

2013

Buteína Toxicodendron vernicifluum

(Árbol de la laca)

Saccharomyces cerevisiae Activa las sirtuinas Incrementa la duración de la vida promedio e

incrementa significativamente la duración de vida

máxima

Howitz et al., 2003

Cafeína Coffea arabica

(Café)


Schizosaccharomyces pombe Caenorhabditis elegans

Inhibe TORC1 Relacionado a procesos de la longevidad y la

respuesta al estrés oxidativo Rallis et al., 2013

Catequina

(EGCG)

Camelia sinensis (Té verde)

Drosophila melanogaster Caenorhabditis elegans

Mus musculus

Inhibe la expresión de NTF-

Induce la alta expresión de

SOD y CAT Activa la vía de señalización

DAF-16/FOXO

Atenúa el estrés oxidativo intracelular; disminuye

la formación de la lipofuscina; efectos preventivos

en enfermedades inflamatorias crónicas, cardiovaculares y cáncer

Kitani et al.,2007

Celastrol Tripterygium wilfordii

(Trueno dios de la vid)

Mus musculus

(transgénicos a SOD1 con ALS)

Reduce TNF- e iNOS

Induce HSP70 y HSF1

Mejora la pérdida del peso y el rendimiento motor;

retrasa el inicio de ALS; efecto protector en médula Kiaei et al., 2005

Cianidina Frutos morados Fibroblastos humanos

Disminuye la expresión del

factor nuclear-, la

ciclooxigenasa-2 y la óxido nítrico sintasa inducible

Atenúa el estrés oxidativo; incrementa la viabilidad

celular; inhibe la peroxidación lipídica Choi et al., 2010

Crocina Crocus sativus

(Azafrán) Mus musculus ND

Presenta una actividad anti-tumoral significativa en

ratones con linfoma de Dalton incrementando la

duración de la vida

Bakshi et al., 2009

Curcumina

(Tetrahidrocurcumina)

Curcuma longa

(Cúrcuma)

Drosophila melanogaster Caenorhabditis elegans

Mus musculus

Cultivo celular NIH3T3

Regula la localización nuclear

de FOXO Interactúa con Sir2

Regula la respuesta al estrés oxidativo y al

envejecimiento; duración de la vida promedio significativamente mayor

Kitani et al., 2007

DHR-5 + Salidrosida Rhodiola rosea (Raíz de oro)




Induce la translocación del

factor de transcripción DAF-16

al núcleo

Incrementa la duración de la vida, la resistencia a

estrés por calor, a la exposición UV y al estrés

oxidativo

Wiegant et al., 2009

EGb761 Ginkgo biloba

(Ginkgo) Caenorhabditis elegans

Suprime la expresión de la

proteína de choque térmico hsp-16-2

Incrementa la resistencia al estrés térmico; atenúa

los niveles intracelulares del H2O2; incrementa la tasa de supervivencia

Strayer et al., 2003

Fisetina Plantas comestibles Saccharomyces cerevisiae

Caenorhabditis elegans Trasloca el factor de

transcripción DAF-16 al núcleo

Protege contra el estrés oxidativo y termal;

incrementa la duración de la vida máxima y

promedio

Howitz et al., 2003

Kampkötter et al.,

2007

91



compuesto


muestra efecto



Glaucarubinona Familia Simaroubaceae

(Simarubáceas) Caenorhabditis elegans ND

Induce el metabolismo mitocondrial; reduce el contenido de las grasas

Zarse et al., 2011

Glucosa Pentagalóila

(PGG)

Eucalyptus grandis x Eucaliptus urophylla

(Eucalipto)

Caenorhabditis elegans Relacionado con los genes DAF-16, AGE-1, EAT-2,

SIR-2.1 e ISP-1

Incrementa la duración de vida media; incrementa

la resistencia a estrés térmico Chen et al., 2014

HDTIC1/HDTIC2

Astragalus membranaceus

var. mongol (Huáng qí/Bèi qí)

Fibroblastos humanos ND

Retrasan la senescencia replicativa; mejoran la

proliferación; inhiben la formación de productos finales de glicación; tienen actividad antioxidante

Wang et al., 2003

Icariin

(Icarisida II) Género Epimedium Caenorhabditis elegans

Depende de INS/IGF-1

y DAF-2/FOXO

Incrementa la tolerancia al estrés oxidativo y

térmico; alenta la disminución de la locomoción en

la edad adulta tardía; retrasa el inicio de la parálisis mediada por proteotóxicos

Cai et al., 2011

Kaempferol Hammamelis virginiana

(Avellano de bruja) Caenorhabditis elegans

Transloca el factor de transcripción DAF-16 al núcleo

Protección contra el estrés termal; suprime la acumulación de ROS intracelular y de lipofuscina

Kampkötter et al., 2007

Luteína Plantas verdes Drosophila melanogaster Induce la alta expresión de

SOD y CAT

Prolonga la duración de la vida media; reducción

significativa de los niveles de malonildialdehido;

incrementa la actividad enzimática de antioxidantes

Zhang et al., 2014

Metformina Galega officinalis

(Galega) Caenorhabditis elegans

Mus musculus Activa AMPK

Asemeja una restricción calórica; incrementa la

duración de la vida significativa y disminuye la

tasa de mortalidad

Anisimov et al., 2008

Miricetina Uvas, bayas, frutas,

vegetales, hierbas Caenorhabditis elegans

Causa la translocación nuclear

de DAF-16

Prolonga la duración de la vida media en adultos; disminuye la acumulación de ROS y la formación

de lipofuscina

Büchter et al., 2013

Oleuropeína Olea europea

(Olivo) Fibroblastos humanos ND

Aumenta la actividad del proteosoma; disminuye

los niveles intracelulares de ROS; reduce la cantidad de las proteínas oxidativas; mantiene la

función del proteosoma durante la senescencia

replicativa; retrasa la apariencia de senescencia morfológica

Katsiki et al., 2007

Proantocianidina Vaccinium angustifolium

(Arándano Lowbush) Caenorhabditis elegans

Retrasa el incremento de los

niveles de mRNA de las proteínas de choque térmico

(hsp)

Incrementa la duración de la vida media y máxima; mejora la termotolerancia

Wilson et al., 2006

Quercetina Allium cepa

(Cebolla)



Requiere del sensor de

nutrientes daf-2

Incrementa la resistencia al estrés oxidativo y

térmico

Belinha et al., 2007

Kampkötter et al., 2008

92



compuesto


muestra efecto



Reserpina Rauwolfia serpentine

(Shégèn mù/Yindù shémù) Caenorhabditis elegans

Asociado con vía de señalización a serotonina thp-1

Promueve la termotolerancia; gusanos de vida larga son activos (prolonga la motilidad)

Srivastava et al., 2008

Resveratrol Vitis vinifera

(Uva)

Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans


Mus musculus Nothobranchius furseri

Fibroblastos humanos

Inhibe TORC1

Reduce IGF-1 Incrementa la actividad

catalítica de SIR2

Activa AMPK

Incrementa la duración de la vida al modular

procesos relacionados con la longevidad (incrementa la sensibilidad a insulina, el número de

mitocondrias, acelera el metabolismo de

almacenamiento de grasas y activa autofagia)

Baur et al., 2006

Sesamina Sesamum indicum

(Ajonjolí) Drosophila melanogaster

Induce la sobrerregulación de

SOD1, SOD2, CAT y Rpn11

Prolonga la duración de la vida media; alivia

neurodegeneración Zuo et al., 2013

SHE-3 + Eleuterosida Eleutherococcus senticosus

(Eleuterococo) Caenorhabditis elegans

Induce la translocación del

factor de transcripción DAF-16

al núcleo

Incrementa la duración de la vida, la resistencia al

estrés por calor, a la exposición de UV y al estrés

oxidativo

Wiegant et al., 2009

Tanshinonas

(Criptotanshiona)

Salvia miltiorrhiza

(Salvia china) Saccharomyces cerevisiae

Relacionado con la regulación

de Tor1, Sch9, Gcn2 y Sod2

No muestra interrupción en el crecimiento celular;

media resistencia a estrés por ROS Wu et al., 2014

Teflavonoides Theae nigraefolium

(Té negro) Drosophila melanogaster

Induce la alta expresión de

SOD y CAT Extiende la duración de la vida media y máxima Peng et al., 2009

Tirosol Olea europea

(Olivo) Caenorhabditis elegans

Implicaca a HSF-1 y las vías de

la insulina (DAF-2 y DAF-16)

Induce una resistencia elevada al estrés oxidativo y

termal; atrasa la apariencia de un biomarcador de la

edad; no induce cambios en el desarrollo, tamaño o reproducción

Cañuelo et al.,

2012

Trisulfida de diallilo Allium sativum

(Ajo) Caenorhabditis elegans

Aumenta la función del factor de transcripción skn-1

Incrementa la duración de la vida media Powolny et al.,

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96

Anexo 2. Base de datos de extractos crudos de plantas con efecto en la longevidad. (ND) Información no disponible.

Nombre de la especie Parte de la planta Tipo de

extracto


muestra efecto Observaciones Referencias

Aloe vera (Aloe)

Hojas Extracción de

jugo Drosophila melanogaster

Cambio significativo en la duración de la vida máxima; no afecta la

fecundidad; incrementa la actividad de enzimas detoxificantes como

SOD y CAT

Chandrashekara et al., 2011

Brassica oleracea

(Brócoli) Cabeza floral

Extracción de

jugo Drosophila melanogaster Prolongación de la duración de la vida en dietas muy calóricas Li et al., 2008

Cinnamomum cassia

(Canela china) Corteza Decocción Caenorhabditis elegans

Extiende significativamente la duración de la vida; atenua niveles de

H2O2; aumenta la expresión de proteínas de choque térmico pequeñas (sHSP16); no tiene efecto en mutates daf-16, ser-1 y mev-1

Yu et al., 2010

Cynomorium songaricum

(Cipote de lobo)

Concentrado en polvo (Ko Da

Pharmaceutical)

Disuelto en

agua Drosophila melanogaster

Aumenta el comportamiento cognitivo; incrementa la resistencia al estrés oxidativo; incrementa la fecundidad; extiende la duración de la

vida media y máxima en hembras

Liu et al., 2012

Damnacanthus officinarum Raíz Decocción Caenorhabditis elegans Efecto de neuroprotección y extensión de la duración de la vida Yang et al., 2012

Emblica officinalis (Amla/Amalaki)

Fruto Fruto completo Drosophila melanogaster Incremento significativo en la duración de la vida; incremento de la

actividad de SOD y CAT Rawal et al., 2014

Euterpe oleracea

(Palmera de asaí) Fruto

Extracción de

pulpa Drosophila melanogaster

Incrementa la duración de la vida en hembras con dietas altamente

grasa a través de la activación de rutas de estrés (Sod1) Sun et al., 2010

Hedera hélix (Hiedra)

Hojas Extracto acuoso Caenorhabditis elegans Prolongan la duración de la vida media Ergen et al., 2012

Ilex paraguariensis

(Matte)

Concentrado en polvo (Yerba Mate

toasted)

Infusión Mus musculus Disminuye los niveles de ROS y de nitrito; incrementa la duración de la

vida y la salud pulmonar en ratones viejos

Lanzetti et al.,

2013

Lobaria pulmonaria

(Líquen Epífita) ND ND Drosophila melanogaster Incrementa la longevidad Kim et al., 2011

Lycium barbarum (Arto)

Fruto Extracción de polisacáridos

Drosophila melanogaster Incrementa significativamente la duración de la vida máxima y

promedio en los machos Chang et al., 2008

Malus domestica

(Manzana) Fruto

Extracto con

etanol Drosophila melanogaster Extiende la duración de la vida media Peng et al., 2011

97



extracto



Morus nigra (Morera negra)

ND ND Drosophila melanogaster Prolonga la duración de la vida Kim et al., 2011

Myrtus communis

(Mirto) Hojas Extracto acuoso Caenorhabditis elegans Prolongan la duración de la vida media Ergen et al., 2012

Ocimum sanctum

(Albahaca sagrada tailandesa)

Partes aéreas

Infusión

temperatura ambiente

Caenorhabditis elegans Extiende significativamente la duración de la vida; fuerte inactivador

de radicales libres; incrementa la resistencia contra el estrés térmico Pandey et al., 2013

Origanum vulgare

(Orégano) Hojas Extracto acuoso Anastrepha ludens Extiende la duración de la vida y promueve la reproducción Zou et al., 2012

Panax ginseng

(Ginseng radix) Raíz Decocción Caenorhabditis elegans

Extiende la duración de la vida significativamente; atenúa los niveles

de H2O2; incrementa la expresión de las proteínas de choque térmico Yu et al., 2010

Phaseolus vulgaris (Frijol)

Semilla

Extracto con

cloroformo,

metanol y agua

Caenorhabditis elegans La fracción hidrofílica incrementa la duración de la vida, mientras que

la fracción hidrofóbica induce la reducción de la longevidad

Mensack et al., 2010

Platycladus orientalis

(Tuya) Semilla

Extracto con n-

butanol Caenorhabditis elegans

Inactiva ROS; reduce la cantidad de lipofuscina; incrementa la

expresión de los genes asociados al estrés Liu et al., 2012

Psoralea corylifolia (Psoralea)

Fruto Extracto con

metanol Caenorhabditis elegans

Dosis bajas incrementa la duración de la vida y decrece los niveles de ROS

Pun et al., 2010

Pronus pérsica

(Nectarina) Fruto Fruto completo Drosophila melanogaster

Reduce el daño oxidativo en hembras con dieta altamente grasa y mutantes de sod1; incrementa la fecundidad; promueve la longevidad y

la duración de la salud por modulación del metabolismo de la glucosa

Boyd et al., 2011

Radix ginseng

(Ginseng chino) Raíz ND Mus musculus

Retarda el proceso del envejecimiento asociándolo con la protección

contra alteraciones asociadas con la edad en el estado antioxidante mitocondrial y la capacidad funcional en diversos tejidos

Ko et al., 2010

Rosa damascena (Rosa de Damasco)

Pétalos Infusión Drosophila melanogaster Decremento en la tasa de mortalidad estadísticamente significativo Jafari et al., 2008

Rosmarinus officinalis

(Romero) Hojas

Extracto de

metanol Drosophila melanogaster

Mejora la actividad de las enzimas antioxidantes; inhibe la

peroxidación lipídica; retraso del envejecimiento prolongando la duración de la vida

Zhang et al., 2012

98



extracto



Rubus sanctus (Zarzamora)

Hojas Extracto acuoso Caenorhabditis elegans Prolongan la duración de la vida media Ergen et al., 2012

Spinaca oleracea

(Espinaca) Hojas

Extracto con


Incrementa significativamente la supervivencia en condiciones de

estrés oxidativo y de altas temperaturas Fan et al., 2011

Stachys lavandulifolia

(Madera de Betony) Flores/Hojas Infusión Drosophila melanogaster Extiende la duración de la vida máxima Altun et al., 2010

Theobroma cacao

(Cacao) Fruto

Disuelto en


Efectos antioxidativos, pro-oxidativos y quelante de metales;

incrementa la duración de la vida promedio

Bahandorani et al.,

2008

Usnea longissima

(Líquen Ule) ND Infusión Drosophila melanogaster Aumenta la duración de la vida y la fecundidad en dosis bajas Kim et al., 2011

Vaccinium angustifolium

Vaccinium corymbosum

Vaccinium myrtillus (Arándanos)

Extracto comercial

(Tianjin Jianfeng

Natural Product)

Disuelto en


Extiende la duración de la vida media; incrementa la expresión de los

genes SOD, CAT y Rpn11 Peng et al., 2012

Vaccinium corymbasum (Arándano azul)

Fruto Extracto con


Incrementa la duración de la vida en presencia de la vía CaMKII; incrementa la termotolerancia

Wilson et al., 2006

Vaccinium oxycoccos

(Pequeño arándano agrio) Fruto

Extracción de

jugo

Anastrepha ludens


Contribuyen al incremento de la duración de la salud y la longevidad;

correlacionado con el incremento de la actividad de DAF-16/FOXO

Argyropoulou et al., 2013

Zou et al., 2012

Viscum album coloratum

(Múerdago coreano) Hojas Decocción


Caenorhabditis elegans Extiende la duración de la vida media Lee et al., 2014

Withania somnífera (Bufera)

Raíz Extracto con

etanol Caenorhabditis elegans

Aumenta la duración de la vida en mutantes para nAchR y acr-16, pero no en silvestre

Kumar et al., 2013

99


Altun, D., Ayar, A., Uysal, H., Kara, A.A., Ünal, E.L. 2010. Extended longevity of Drosophila melanogaster by water and ethanol

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101

Anexo 3. Base de datos de plantas medicinales. [] Otros nombres científicos con los que se conoce a la especie; (/) Simboliza “y”;

(ND) No disponible.

Nombre de la especie Familia Parte de la planta Tipo de extracto Enfermedades que contrarresta Referencias

Abelmoschus esculentus

[Hibiscus esculentus]

(Okra)

Malvaceae Semilla/Cáscara Extracto con hexano

Antioxidante

Antihiperlipidémico

Hipoglucémico

Khomsug et al., 2010

Sabitha et al., 2011

Acosmium panamense

[Sweetia panamensis]

(Bálsamo amarillo/guayacán)

Fabaceae Corteza Infusión Hipoglucémico Andrade-Cetto et al., 2005

Acrocomia mexicana (Coyul)

Arecaceae Raíz Extracto con metanol Hipoglucémico Andrade-Cetto et al., 2005

Aesculus hippocastanum

(Castaño de las indias) Sapindaceae Corteza ND

Antioxidante

Inactivador de radicales libres Antiinflamatorio

Braga et al., 2012

Agarista mexicana

(Palo santo) Ericaceae

Hojas

Corteza

Infusión

Extracto con cloroformo Hipoglucémico

Andrade-Cetto et al., 2005

Perez-G et al., 1996

Alpinia galanga

(Galanga) Zingiberaceae Rizoma

Extracto con etanol/

Extracto con metanol

Analgésico

Hipoglucémico

Acharya et al., 2011

Akhtar et al., 2002

Alpinia purpurata

(Alpinia) Zingiberaceae Hojas

Solventes (petróleo éter-Cloroformo-

Acetato éter-Etanol-Agua)

Antibacterial Anticancerígeno contra células de cáncer de

ovario

Arul-Raj et al., 2012

Annona glabra (Corcho)

Annonaceae Semilla Extracto con etanol Anticancerígeno contra células leucémicas Cochrane et al., 2008

Annona muricata

(Guanábana) Annonaceae

Cogollos

Hojas Fruto

Infusión

Extracto con etanol Liofilización

Aniconvulsionante

Antioxidante

Hipoglucémico Antiinflamatorio

Confiere protección contra cáncer de próstata

N‟Gouemo et al., 1997 Ngueguim et al., 2014

Ishola et al., 2014

Yang et al., 2015

Annona squamosa

(Chirimoyo) Annonaceae Partes aéreas Extracto con etanol

Antioxidante Hipoglucémico

Antitumoral contra linfoma de Dalton

Ganesan et al., 2011

Ruiz-Terán et al., 2008

Arbutus unedo

(Madroño) Ericaceae Hojas maduras Infusión

Antiinflamatorio

Antioxidante Inactivador de radicales libres

Mariotto et al., 2008

Mendes et al., 2011

Argania spinosa

(Aragán) Sapotaceae Semilla Macerado en agua

Antihipertensivo

Hipoglucémico Bellahcen et al., 2013

Astronium graveolens

(Gateado) Anacardiaceae Hojas Extracto con metanol Inactivador de radicales libres Hernández et al., 2014

102



Averrhoa carambola

(Carambola) Oxalidaceae Raíz Extracto con etanol Hipoglucémico Xu et al., 2014

Baccharis coridifolia

(Mío-Mío/Romerillo) Asteraceae Partes aéreas Infusión Antioxidante Mongelli et al., 1997

Bidens pilosa

(Aceitilla) Asteraceae

Partes aéreas

Néctar de flor

Infusión/Extracto con etanol/


Antitumoral contra carcinoma de Ehrlich Hipoglucémico

Antiinflamatorio

Antioxidante

Alarcon-Aguilar et al., 2002 Fotso et al., 2014

Kviecinski et al., 2008

Liu et al., 2013

Bixa Orellana

(Achiote) Bixaceae Hojas Infusión

Antimicrobiano Antiinflamatorio

Antioxidante

Hipoglucémico

Stohs, 2013

Brickellia veronicaefolia

(Orégano del monte) Asteraceae Partes aéreas Decocción

Antioxidante

Hipoglucémico Andrade-Cetto et al., 2005

Bunchosia canescens (Nanche de perro)

Malpighiaceae Partes aéreas Extracto con etanol Antioxidante Ruiz-Terán et al., 2008

Bursera grandifolia

(Palo mulato) Burseraceae Partes aéreas Extracto con etanol

Inactivador de radicales libres

Antipirético

Ruiz-Terán et al., 2008

Velázquez et al., 2009

Bursera simaruba

(Chakah) Burseraceae Hojas Extracto con hexano Antiinflamatorio Carretero et al., 2008

Byrsonima bucidaefolia (Nance agrio)

Malpighiaceae Hojas

Corteza ND

Extracto con etanol Antioxidante Castillo-Ávila et al., 2009

Calendula officinalis

(Caléndula) Asteraceae Flor Infusión

Antiinflamatorio

Antioxidante Antitumoral contra cáncer de mama, próstata,

cérvix, pulmón, páncreas, colonocrectal,

melanoma y fibrosarcoma

Jiménez-Medina et al., 2006

Preethi et al., 2009

Capparis spinosa

(Alcaparra) Capparaceae

Fruto

Brote

Decocción

Infusión con metanol

Hipoglucémico

Antiobesidad

Antioxidante

Germanó et al., 2002

Kumar et al., 2005

Carthamus tinctorius (Cártamo)

Asteraceae Flor Extracto con etanol Antiinflamatorio Hipoglucémico

Qazi et al., 2014 Wang et al., 2014

Carum carvi

(Alcaravea) Apiaceae Semilla Decocción

Hipolipidémico

Antihiperglicémico Haidari et al., 2011

103



Caryota urens

(Cola de pescado) Arecaceae Hojas Extracto con metanol

Antioxidante

Antibacterial Arul Ananth et al., 2013

Cecropia obtusifolia

(Chan cario/Guarumbo) Cecropieceae Hojas Decocción/Infusión Hipoglucémico Andrade-Cetto et al., 2005

Ceiba aesculifolia (Pochote)

Bombacaceae Corteza Extracto con metanol Antioxidante Antibacterial

Orozco et al., 2013

Centaurea ainetensis Asteraceae Flor Decocción Antiinflamatorio Talhouk et al., 2008

Centaurea aspera

(Centaurea) Asteraceae Flor Infusión

Hipoglucémico

(ratones con diabetes y normales) Massó et al., 1976

Chamaemelum nobile (Manzanilla)

Asteraceae Capítulos florales

Fruto Infusión

Hipoglucémico Antiobesidad

Lemhadri et al., 2007

Cichorium intybus

(Achicoria) Asteraceae Hojas

Extracto con etanol/


Hipoglucémico

Antioxidante

D‟evoli et al., 2013

Pushparaj et al., 2007

Cinchona sp

(Copalquin) Rubiaceae Corteza Infusión

Antioxidante

Combate la malaria VanderJagt et al., 2002

Cirsium pazcuarense Asteraceae Hojas Extracto con hexano Hipoglucémico Andrade-Cetto et al., 2005

Cissampelos pareira

(Guaco) Menispermaceae Raíz Extracto con etanol Antiinflamatorio Amresh et al., 2007

Cnidoscolus aconitifolius

(Chaya) Euphorbiaceae Hojas Extracto con etanol Hipoglucémico Oyagbemi et al., 2010

Coix lachryma-jobi (Lágrima de San Pedro)

Gramineae Hojas Decocción Antiobesidad

Hipoglucémico Kim et al., 2007 Yeh et al., 2006

Comocladia engleriana

(Teclate) Anacardiaceae Partes aéreas Extracto con etanol Inactivador de radicales libres Ruiz-Terán et al., 2008

Cordia sebestena

(Anacahuite) Boraginaceae

Corteza

Hojas

Hidroestilación

Extracto con etanol


Hipoglucémico

Adeosun et al., 2013

Sarathchandiran et al., 2013

Costus spicatus (Costus)

Costaceae Hojas Extracto con metanol Antiinflamatorio Quintas Júnior et al., 2010

Crataegus mexicana

(Tejocote) Rosaceae

Raíz

Hojas

Decocción

Extracto con hexano Efecto relajante Arrieta et al., 2010

104



Crithmum maritimum

(Hinojo marino/Perejil marino) Apiaceae Partes aéreas Extracto con acetona

Antioxidante

Antibacterial Jallali et al., 2014

Cucurbita ficifolia

(Chilacayote) Cucurbitaceae Fruto Macerado en agua

Hipoglucémico

Antioxidante

Antiinflamatorio

Andrade-Cetto et al., 2005

Roman-Ramos et al., 2012

Cuminum cyminum

(Comino) Apiaceae Semilla Extracto con metanol

Antihiperglicémico

Control del estrés oxidativo Jagtap et al., 2010

Cuscuta reflexa

(Akashabela) Convolvulaceae Partes aéreas Infusión temperatura ambiente

Antiinflamatorio

Anticancerígeno en células de carcinoma hepatocelular

Suresh et al., 2011

Cynara dactylon

(Grama) Asteraceae Hojas Decocción/Extracto con etanol

Hipoglucémico

Antioxidante Karthik et al., 2011

Cynara scolymus

(Alcachofa) Asteraceae Hojas Decocción

Hipoglucémico

Antioxidante Heidarian et al., 2011

Emilia sonchifolia

(Botón rosado/Hierba socialista) Asteraceae Hojas Infusión/Extracto con metanol

Antiinflamatorio Antioxidante

Antitumoral contra linfoma de Dalton

y carcinoma de Ehrlich

Muko et al., 2000

Shylesh et al., 2000

Equisetum myriochaetum

(Cola de caballo) Equisetaceae Partes aéreas Decocción Hipoglucémico Andrade-Cetto et al., 2005

Eriobotrya japonica

(Níspero) Rosaceae

Hojas

Tallo

Decocción/Extracto con etanol


Hipoglucémico Antioxidante

Antimicrobiano

Antiinflamatorio

Cha et al., 2011

Chen et al., 2008 Rashed et al., 2014

Eucalyptus globulus (Eucalipto)

Myrtaceae Hojas Extracto con etanol Antioxidante

Hipoglucémico Ahlem et al., 2009

Garcinia kola

(Cola amarga/Orobó) Clusiaceae Semilla Extracto con metanol

Hipoglucémico

Antioxidante Resistencia a inflamación

Adaramoye, 2012

Ayepola et al., 2014

Globularia alypum

(Coronilla de fraile) Plantaginaceae Hojas Infusión

Antioxidante

Hipoglucémico Antiegnotóxico

Harzallah et al., 2010

Skim et al., 1999

Guazuma ulmifolia

(Akeichta/guacima) Sterculaceae

Corteza

Hojas

Decocción/


Hipoglucémico


Alarcon-Aguilara et al., 1998

Maldini et al., 2013

Hylocereus undatus (Pitahaya)

Cactaceae Fruto Macerado en agua

(pulpa) Controla el daño oxidativo Anand Swarup et al., 2010

105



Inula crithmoïdes Asteraceae Partes aéreas Extracto con acetona Antioxidante

Antibacterial Jallali et al., 2014

Justicia spicigera

(Muicle) Acanthaceae Hojas Extracto con etanol Antitumoral contra cáncer cérvico-uterino Alonso-Castro et al., 2012

Laurus nobilis [Laurel nobilis]

(Laurel)

Lauraceae Hojas Decocción Antiinflamatorio

Antioxidante Orlando et al., 2010

Lavandula angustifolia (Lavanda inglesa)

Lamiaceae Hojas Flor

Extracto hidroalcohólico Infusión

Antiinflamatorio

Analgésico Antioxidante

Mejora el rendimiento espacial en Alzheimer

Hajhashemi et al., 2003

Kashani et al., 2011

Spiridon et al., 2011

Lepechinia caulescens (Salvia)

Lamiaceae Flor Decocción Hipoglucémico Alarcon-Aguilara et al., 1998

Lepidium meyenii (Maca)

Brassicaceae Hipocotiledones Decocción

Revierte la hiperplasia beningna de próstata

Reduce presión Antidepresivo

Previene la osteoporosis

Gonzales et al., 2014 Stojanovska et al., 2014

Licania arborea (Cacahuate)

Chrysobalanaceae Partes aéreas Extracto con etanol Antioxidante Ruiz-Terán et al., 2008

Mahonia fortunei

(Mahonia china/Uva sagrada) Berberidaceae Hojas Decocción Antiinflamatorio Zhang et al., 2011

Malvastrum coromandelianum

(Malvavisco) Malvaceae Hojas Decocción

Hipoglucémico

Antiinflamatorio Khonsung et al., 2006

Marrubium vulgare (Mestranzo)

Lamiaceae Hojas Infusión Antioxidante Hipotensivo

VanderJagt et al., 2002

Melissa officinalis

(Melisa) Lamiaceae Hojas Infusión

Antitumoral en cáncer de mama

Mejora funciones cognitivas en el Alzheimer Antioxidante

Akhondzadeh et al., 2003

Saraydin et al., 2012

Murraya koenigii

(Árbol de hojas del curry) Rutaceae Hojas Infusión temperatura ambiente

Hipoglucémico

Antioxidante

El-Amin et al., 2013

Gill et al., 2014

Musa x paradisiaca [Musa x sapientum]

(Flor de plátano)

Musaceae Raíz

Flor

Macerada

Decocción Hipoglucémico Alarcon-Aguilara et al., 1998

Oenothera biennis

(Onagra/Primrosa) Onagraceae

Partes aéreas

Semillas


Extracto con etanol

Antioxidante Antiinflamatorio

Antitumoral contra carcinoma de Ehrlich

Arimura et al., 2004

Granica et al., 2013

106



Oenothera paradoxa (Primavera de tarde)

Onagraceae Partes aéreas Extracto con metanol

Antioxidante

Antiinflamatorio Anticancerígeno contra cáncer de próstata

y de mama

Granica et al., 2013 Lewandowska et al., 2014

Parmentiera aculeata

[Parmentiera edulis] (Cuajilote)

Pinaceae Raíz

Corteza Decocción Hipoglucémico Andrade-Cetto et al., 2005

Paullinia cupana

(Guaraná) Sapindaceae Semilla Extracto con etanol

Antibacteriano

Antioxidante Basile et al., 2005

Piper nigrum

(Pimienta negra) Piperaceae Fruto Extracto con metanol

Antioxidante

Mejora la memoria en el Alzheimer Hritcu et al., 2014

Plumeria rubra

[Plumeria acutifolia] (Cacaloxóchitl/Flor de mayo)

Apocynaceae Flor

Corteza de raíz

Decocción


Antianafiláctico Antiinflamatorio

Antioxidante

Hipolipidémico

Alakshmi et al., 2011

Merina et al., 2010

Prunus armeniaca

(Chabacano) Rosaceae

Raíz

Grano

Decocción

Infusión

Antioxidante

Antimicrobiano Yigit et al., 2009

Prunus spinosa (Endrino)

Rosaceae Fruto Jugo fresco de fruto Antioxidante Fraternale et al., 2009

Psacalium peltatum

(Matarique) Asteraceae Raíz (Rizoma) Extracto con etanol

Antiinflamatorio

Antioxidante Hipoglucémico

Alarcon-Aguilar et al., 2002

Alarcon-Aguilar et al., 2010

Psittacanthus calyculatus

(Injerto) Loranthaceae Partes aéreas Decocción

Vasodilatador

Antioxidante Ibarra-Alvarado et al., 2010

Quassia amara (Cuasia)

Simaroubaceae Partes aéreas Decocción

Extracto con metanol Hipoglucémico

Combate la malaria Husain et al., 2011

Rheum officinale

(Ruibarbo) Polygonaceae Rizoma Decocción

Antioxidante

Inactivador de radicales libres Zhang et al., 2011

Rhizophora mangle (Mangle)

Rhizophoraceae Corteza Decocción

Antioxidante


Hipoglucémico

Alarcon-Aguilara et al., 1998 Sánchez et al., 2010

Rosa sp.

(Rosa de castillo) Rosaceae Flor Infusión

Antioxidante

Antiinflamatorio

Orlando et al., 2010

VanderJagt et al., 2002

Rumex hymenosepalus (Cana agria)

Polygonaceae Raíz Infusión Antioxidante

Antitumoral contra sarcoma VanderJagt et al., 2002

107



Santalum álbum (Sándalo)

Santalaceae Madera Extracto con metanol

Antioxidante

Analgésico Antiinflamatorio

Antihiperglucémico

Kulkarni et al., 2012 Saneja et al., 2009

Sapium macrocarpum (Palo verde)

Euphorbiaceae Partes aéreas Extracto con etanol Antioxidante Ruiz-Terán et al., 2008

Sedum dendroideum

(Siempreviva) Crassulaceae Jugo de hojas Extracto con etanol

Antiinflamatorio

Hipoglucémico

Da Silva et al., 2014

De Melo et al., 2009

Sedum praealtum

(Siempreviva) Crassulaceae Flor Extracto de metanol Antioxidante Beltrán-Orozco et al., 2013

Sophora flavescens (Ku shen)

Fabaceae Raíz Decocción Antiinflamatorio Zhang et al., 2011

Styphnolobium japonicum

[Sophora japonica]

(Haui hua)

Fabaceae Flor Decocción

Antioxidante


Antiinflamatorio

Zhang et al., 2011

Swertia chirata

[Swertia chirayita]

(Chireta)

Gentianaceae Planta completa Extracto con etanol Antioxidante

Hipoglucémico Baipai et al., 1991 Chen et al., 2011

Syzygium caryophyllatum

(Ciruela negra salvaje) Myrtaceae Hojas

Extracto con metanol/

Extracto con etil acetato

Antimicrobiano Antioxidante

Hipoglucémico Anticancerígeno contra cáncer cérvico-uterino

Annaduria et al., 2012

Savitha-Rrabeque et al., 2013

Tabebuia rosea

(Maculis rosa) Bignoniaceae Hojas Extracto con metano

Antioxidante

Anticancerígeno contra linfoma de Dalton Hemamalini et al., 2012

Taxillus chinensis

(Sang ji sheng) Loranthaceae Partes aéreas Decocción

Antioxidante Inactivador de radicales libres

Antiinflamatorio

Zhang et al., 2011

Tecoma stans (Histoncle)

Bignoniaceae Hojas Infusión Hipoglucémico Aguilar-Santamaría

et al., 2009

Trigonella foenum-graecum

(Alholva) Fabaceae Semilla Infusión

Anticancerígeno contra cáncer de mama

Hipoglucémico Amin et al., 2005

Kumar et al., 2005

Uncaria tomentosa

[Nuclea tomentosa]

(Uña de gato)

Rubiaceae Corteza Extracto con cloroformo Antiinflamatorio Rojas-Duran et al., 2012

Verbesina persicifolia (Huachín)

Asteraceae Hojas Extracto con cloroformo Hipoglucémico Andrade-Cetto et al., 2005

Perez-G et al., 1996

108



Ziziphus mauritiana

(Ciruela babosa) Rhamnaceae

Hojas

Semilla Extracto con etanol

Antioxidante

Hipoglucémico

Adeyemo, 2011

Bhatia et al., 2012

Zygophyllum gaetulum

(Zigofila) Zygophyllaceae Partes aéras Infusión

Antiinflamatorio

Hipoglucémico

Ait El Cadi et al., 2012

Skim et al., 1999

109


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Apéndice. Lista de medios.

Medio SC-Aging g/L Medio YNB-lf g/L

YNB sin aminoácidos 6.7 (NH4)2SO4 5

Glucosa 20 KH2PO4 1

Aminoácidos 2 MgSO4 0.5

Cold spring harbor NaCl 0.1

CaCl2 0.1

Glucosa 20

Aminoácidos - Complete

Supplement Mixture 0.79

Stock de vitaminas 1000X 1 mL/L

Stock de elementos traza

1000X

1 mL/L

Stock de elementos traza

1000X mg/100 mL Stock de vitaminas 1000X mg/100 mL

H3BO4 50 Biotina 0.2

CuSO4 4 Pantotenato de calcio 40

KI 10 Inositol 200

FeCl3 20 Niacina 40

MnSO4 40 Ácido para-amino benzoico 20

Na2MoO4 20 Pyroxidina – HCl 40

ZnSO4 40 Thiamina – HCl 40

Identificación de extractos de plantas con efectos en la ...

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