UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS CARRERA DE BIOQUMICA CLNICA

TEMA: IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

INTEGRANTESNOEM CHANCUSICRISTINA GANCHALAANDREA MEDINAPATRICIA SILVA.

FECHA: 12-02-15

1. CARACTERSTICAS GENERALES Este gran grupo de bacilos Gram Negativos No Fermentadores incluyen grmenes pertenecientes a diferentes familias:Pseudomonas

Flavobacterium

Alcalgenes

Acinetobacter

Acidovorax

Agrobacterium

Bordetella

Burkholderia

Chryseomonas

Empedobacter

Flavimonas

Moraxella

Roseomonas

Shewanella

Stenotrophomonas

Pero los gneros ms importantes son: Pseudomonas

Acinetobacter

Stenotrophomonas

Burkholderia

Algunos de ellos desprovistos de grandes atributos de virulencia demostrables, no producen enfermedad en el individuo sano pero pueden comportarse como oportunistas en enfermos inmunodeprimidos.Los bacilos Gram negativos Nofermentadores son un grupo de microorganismos aerobios estrictos, con flagelos polares, no son esporulados, no utilizan hidratos de carbono como fuente de energa o los degradan a travs de vas metablicas diferentes dela fermentacin, son generalmente oxidasa positiva. Se encuentran en el agua, fango, suelo, plantas, alimentos y material patolgico.

2. CARACTERSTICAS PARA SU IDENTIFICACIN

Crecen en la mayora de agares En agar sangre y chocolate crecen como colonias grandes y brillantes En agar MacConkey, SS crecen como colonias grandes, transparentes, porque no fermentan los carbohidratos presentes. Crecen en TSI y LIA, pero no producen ningn cambio de color, no se desarrollan ni acidifican la profundidad de estos medios

IDENTIFICACIN DE LAS ESPECIES MAS FRECUENTES 1. Pseudomonas2. Acinetobacter3. Burkholderia4. Stenotrophomonas

CARACTERSTICAS ESPECFICAS

GNERO PSEUDOMONAS Bacilos Gram negativos. Ligeramente curvos. Aerobios estrictos. Cepas mviles (flagelos polares) Citocromo Oxidasa positivo. Utiliza la glucosa y otros hidratos de carbono. Debido a que Pseudomonas tienen unos requerimientos nutricionales sencillos pueden crecer fcilmente en los medios comunes de aislamiento, como el agar sangre y el agar MacConkey.

a) PSEUDOMONA AERUGINOSA

Se desarrolla en todos los medios de cultivo. Colonias grandes, olor a humedad y brillo metlico o azul-verdoso. Coloracin de Gram: Bacilos Gram negativos, alargados Produccin de Oxidasa: ( positivo). Coloracin azul Siembra en agar hierro de Kligler: Imagen alcalina de color rojo en todo el tubo SH2 (-), gas (-). Motilidad: Crecimiento alrededor del sitio de inoculacin En agar MacConkey: Colonias redondas, incoloras por no utilizacin de la lactosa. Siembra en medios King A y King B para la produccin de pigmentos: Produccin de pigmentos (piocianina y pioverdina). Siembra en agar Cetrimide : Colonias redondas, lisas, de bordes regulares. Produccin de pigmento verde (pioverdina) En Agar sangre las colonias son de color gris y son beta hemolisis (Halo transparente verdoso alrededor de las colonias). OF Glucosa: Oxidativa Produce pigmentacin verde relacionada con la sntesis de piocianina azul y fluorescena amarilla, y un olor dulce caracterstico semejante al de las uvas.

GNERO ACINETOBACTER Son bacilos o cocobacilos Gram negativos. Son aerobios estrictos inmviles . Crecen bien en todos los medios de cultivo , siendo su temperatura ptima de crecimiento de 33 a 35 C. Citocromo oxidasa negativo. Catalasa positivo. Son no fermentadores de glucosa Utilizan una amplia variedad de compuestos orgnicos como fuente de carbono.

b) ACINETOBACTER BAUMANNII

Es el no fermentador encontrado en segundo orden de frecuencia en los laboratorios clnicos. Es un patgeno oportunista. Muestran una utilizacin rpida de la glucosa con produccin de cido. Son multiresistentes a los antimicrobianos Cocos o cocobacilos Gram negativo. En agar MacConkey las colonias pueden tener un tinte ligeramente rosado. Producen hemlisis en Agar sangre No crecen en TSI. Catalasa (positivo) No reducen los nitratos a nitritos No descarboxilan la lisina Citocromo Oxidasa ( negativo).

GNERO STENOTROPHOMONAS Es un gnero que consta solo de una especie S. Maltophilia anteriormente Xanthomona Maltophilia. Buen desarrollo en Agar sangre y MacConkey. Citocromo Oxidasa Negativa. microorganismo de baja patogenicidad. Su hbitat natural es el ambiente acutico. Bacteria aerobia. Metabolismo oxidativo. Se desarrolla en forma rpida en los medios de cultivo

c) STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA

El diagnstico de laboratorio se determina en base al Gram. Bacilos Gram negativos. Otras pruebas adicionales incluyen la oxidacin de la glucosa y maltosa en medio OF, decarboxilacin de la lisina, licuefaccin de la gelatina y produccin de H2S, evidenciada con papel de acetato de plomo. Lisina descarboxilasa positiva. Algunas cepas producen pigmentos amarillos. Citocromo Oxidasa negativa. ADNasa positiva (prueba clave debe incubarse 72 horas para evitar falsos negativos) Colonia caf verdosa en Agar sangre, generalmente no hemoltica. Colonia amarilla verdosa en MacConkey. Agar sangre ADNasa

Tincin de Gram

ADNasa

GNERO BURKHOLDERIA Antes pertenecan al gnero Pseudomonas cepacea. Pueden sobrevivir en ambientes hmedos. Patgeno aislado en infecciones respiratorias en pacientes con enfermedad fibroqustica.

d) BURKHOLDERIA CEPACIA

Bacilo Gram negativo no fermentador de crecimiento muy lento. Oxidasa: positivo dbil (93% de las cepas, el otro 7% es oxidasa negativo). Mvil. Pigmento: amarillo claro. Causa septicemias nosocomiales y otras infecciones

3. IMPORTANCIA CLNICA Pseudomona aeruginosa , se trata de un grupo de bacilos aerbicos Gram negativos , no fermentativos, cuyo papel patgeno se encuentra bien establecido . Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, en el agua, en el suelo e inclusive en el jabn, adems de ser parte de la flora saprolitica de piel e intestinos en seres humanos y animales de diversas especies.Son mviles debido a la presencia de un flagelo polar. Poseen cilios que probablemente jueguen un papel importante en la resistencia a la fagocitosis y les permite adherirse a las superficies celulares, han recibido el nombre de bacilos piocianicos por su capacidad de producir pigmentos, no afecta a individuos sanos se comportan como oportunistas en pacientes inmunodeprimidos La importancia clnica Pseudomonas aeruginosa, es bien conocida ya que es agente causal de otitis media. Oftalmitis, infeccin de heridas, bacteriuria, neumona y bactermia . Causa una alta mortalidad en los pacientes con compromiso inmunolgico, quemado, oncolgico o aquellos que son cometidos a instrumentacin o manipulaciones. En los hospitales, la transmisin de pacientes a pacientes por las manos del personal es ms importante que la diseminacin area.Pseudomona no aeruginosa consideradas como un solo grupo ( especies=sp ), solo ocasionalmente causan infecciones oportunistas aunque puedan observarse con heridas , ulceras delos pies y bacteriuria . Estas especies aunque se aslan con frecuencia, solo ocasionalmente estn implicadas en enfermedades, su susceptibilidad los antibiticos es mayor que las cepas aeuriginosa es superior a las de otras Pseudomonas sp es conveniente considerar:a) Que existe una relacin directa entre la relacin de piocianina y el potencial patgeno y el potencial patgeno ya , que este pigmento afecta la utilizacin del oxgeno no por parte de las clulas infectadas incluidos los leucocitos, los cuales como consecuencia fagocitan inadecuadamente.b) Que Pseudomona aeuriginosa son considerablemente ms resistentes a los antibiticos y por lo tanto pueden comportarse como oportunistas con mayor facilidad

4. MEDIOS DE CULTIVO PARA NO FERMENTADORES

AGAR CETRIMIDA USO: Es un medio utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del gnero.FUNDAMENTO:Su formulacin permite el crecimiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y estimula la produccin de pigmentos. En este medio muy semejante al King A, en el cual la peptona de gelatina aporta los nutrientes para el desarrollo microbiano. El cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formacin de piocianina, pioverdina, piomelina y fluorescena de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catinico que acta como agente inhibidor, libera el nitrgeno y el fosforo de las clulas de casi toda la flora acompaante, aunque inhibe tambin algunas especie Pseudomonas. El agar es el agente gelificante.INSTRUCCIONESSuspender 45.3 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Agregar 10ml de glicerina. Dejar reposar 5 minutos. Calentar agitando frecuentemente hervir durante 1 minuto para disolucin total.Distribuir en tubo u otros recipientes apropiaos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.CARACTERSTICAS Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogneo, libre deslizamiento.Medio de cultivo preparado: color mbar claro.PROCEDIMIENTO SiembraEn superficie, por inoculacin directa de la muestra estriando a partir de un caldo de enriquecimiento por ejemplo cerebro corazn Infusin o Triptena Soya Caldo.Incubacin:En anaerobiosis, a 35-37C durante 24-48 horas.INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Observa el crecimiento microbiano, las caractersticas de las colonias y la produccin de pigmentos.La presencia de un color verde azulado corresponde a produccin de piocianina, mientras que un color verde corresponde a la produccin de pioverdina y color rosa claro, rojizo marrn oscuro corresponde a la produccin de piorrubina.Examinar las placas bajo luz ultravioleta, ya que la produccin de fluorescena se observa de color amarillo verdoso brillante que difunde en el agar a partir del crecimiento microbiano.

PSEUDOMONA AGAR FUSO: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de Pseudomonas en base a la produccin de fluorescena. Conocido tambin como medio King B y Flo AgarFUNDAMENTO: En el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de pigmentos, la concentracin de fosfato dipotsico estimula la produccin de fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y piorrubina. El sulfato de magnesio provee los cationes necesarios que incrementan la produccin de fluorescena y e agar es el agente solidificante.

CARACTERSTICAS DEL MEDIO:Medio de cultivo color mbar claro.

PROCEDIMIENTO:Siembra:A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospecha la presencia de Pseudomona spp, tomar una colonia y estriar la superficie del medio.Incubacin: En anaerobiosis, a 35-37C durante 24-48horas.Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30C, o dejar a 22C y observar diariamente hasta 7 das.INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS:Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260nm.Se considera un resultado positivo la observacin de fluorescena, que es un pigmento de color amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a fenmenos de difusin.

PSEUDOMONA AGAR P

USO: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de Pseudomonas en base a la produccin de piocianina. Conocido tambin como medio King A y Tech Agar.FUNDAMENTO:En el medio de cultivo, la peptona de la gelatina aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de pigmentos, las sales de magnesio y potasio estimulan la produccin de piocianina y piorrubina e inhiben la produccin de fluorescena. El agar es el agente solidificante.

INSTRUCCIONES Suspender 46.4g del polvo en 1 litro de agua purificada. Agregar 10ml de glicerina. Calentar con agitacin constante para homogenizar el producto. Llevar a ebullicin para que se disuelva por completo.Distribuir en tubos u otros recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.Colocar los tubos en posicin inclinada para solidificar el medio de cultivo (pico de flauta). Tambin puede distribuirse en cajas Petri estriles.CARACTERTICAS DEL PRODUCTO:Medio de cultivo deshidratado: color beige, homogneo, libre deslizamiento.Medio de cultivo preparado: color mbar claro.PROCEDIMIENTO:Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas spp, tomar una colonia y estriar la superficie del medio.

5. PRUEBAS BIOQUMICAS

OXIDASALos citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como ltimo eslabn de la cadena de la respiracin aerobia, transfiriendo electrones (H2) al oxgeno. El sistema Citocromo oxidasa se encuentra en microorganismos aerobios o microorganismos aerfilos y anaerobios facultativos. La prueba para detectar la presencia de oxidasa puede realizar cubriendo las colonias bacterianas en la superficie del agar con el reactivo clorhidrato de tetrametil p- fenilendiamina al 1%. Una alternativa es frotar una muestra de la colonia bacteriana sobre un papel filtro impregnado con el reactivo. En estado reducido es incoloro pero cuando se oxida vira a purpura.

OF Glucosa Para la mayora de las bacterias de importancia clnica implica la utilizacin de sustratos como hidratos de carbono. Para la identificacin de diversas bacterias es importante determinar si la utilizacin del sustrato es oxidativo o fermentativo. El proceso oxidativo requiere oxigeno el fermentador no.El proceso oxidativo fermentativo se logra con el medio O-F que contiene concentraciones bajas de peptona y un sustrato con un nico hidrato de carbono como glucosa. El microorganismo que se desea identificar se siembra en dos tubos O-F con glucosa uno de los cuales se cubre luego con aceite mineral para impedir el ingreso de Oxigeno. El indicador de pH para la prueba O-F y los cambios de color que sufren en condiciones acidas son azul de bromo timol (que cambia de verde a amarillo). Cuando se determina la produccin de cido en ambos tubos el microorganismo se identifica como fermentadores de la glucosa Porque la fermentacin puede producirse con oxgeno o sin l. Si el cido solo se detecta en el tubo en aerobiosis (abierto) se considera que el microorganismo oxida la glucosa.Algunos microorganismos no utilizan la glucosa como sustrato y no se observa la presencia de cido en ninguno de los tubos.

Reduccin de Nitratos a Nitritos

La capacidad de un microorganismo para reducir los nitratos a nitritos es una caracterstica importante para identificar y diferenciar especies de muchos microorganismos. Los microorganismos que reducen los nitratos pueden extraer oxigeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reduccin. La presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta por el agregado - naftilamina y cido sulfanilico con formacin de un color rojo de diazonio p- sulfobenzenoazo- - naftilamina.

Hidrolisis esculina

El medio de esculina sin bilis es til para diferenciar especies de bacilos no fermentadores. La esculina es un glcido sustituido que puede ser hidrolizado por ciertas bacterias para producir glucosa y esculetina. La esculina es un compuesto fluorescente bajo la luz UV a 360 nm. Cuando hidrolisa la esculina la fluorescencia se pierde y el medio vira a negro debido a la reaccin de esculetina con iones frricos presentes en el medio. Composicin: Esculina 1gCitrato frrico 0,5gAgar infusin corazn 4gAgua destilada 1L

PRUEBA DE LICUEFACCION DE LA GELATINAPRINCIPIODeterminar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan/ hidrolizan la gelatina o muestran cambios caractersticos debido a los productos de degradacin.BIOQUMICALa gelatina, una protena derivada del colgeno animal, se incorpora a diferentes medios de cultivo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolticas (proteinasas), detectadas por gestin o licuefaccin de la gelatina. Las enzimas capaces de producir gelatinosis se denominan gelatinasas.Estas enzimas proteolticas a menudo son importantes factores de virulencia de algunos microorganismos.Las protenas naturales son demasiado grandes para entrar en una clula bacteriana; por ende; para que una clula pueda usar las protenas, estas primero deben ser catabolizadas a componentes ms pequeos.Ciertas bacterias segregan gelatinasas exocelulares para degradar las protenas y esta capacidad ayuda a la identificacin bacteriana.Este catabolismo de las protenas por parte de las gelatinasas es un proceso de dos pasos, el resultado final es una mezcla de aminocidos aislados.Gelatinasas

Protena + H2OPolipptidosProteasas

Gelatinasas

Polipptidos + H2O Aminocidos individualesProteasas

Medio de Cultivo: Gelatina nutritiva.Composicin: a) Extracto de carne.b) Peptona.c) Gelatina.d) Agua Destilada.Consistencia del medio: Semislido.Inoculacin:Picadura en posicin vertical hasta una profundidad de 2.5 cm, inculo densoCondiciones de incubacin:Tiempo: 18-24 horas.Temperatura: 35-37CAl trmino de la incubacin se coloca el tubo en un refrigerador o bao de hielo durante dos horas para determinar si se ha producido o no la digestin de la gelatina (licuefaccin).

Resultados:

Interpretacin:Positivo: Medio licuado (estado lquido)Negativo: Medio slido.El medio de gelatina nutritiva para puncin no es conveniente para las pruebas de rutina de la actividad gelatinasa, dado que muchas especies requieren de una incubacin prolongada antes de que aparezcan muestras de licuefaccin.En los mtodos diagnsticos de rutina para identificar bacterias, la duracin de la incubacin deber alcanzar un perodo razonable.Reporte de resultados: Positivo: (+)Negativo: (-)

BIBLIOGRAFA: AMPMPM, 1981, Microbiologa mdica, UNAM, Mxico, pp 190-548. Bailey and Scots, 1985, Diagnostic microbiology, Mosby, fouredition, Espaa, pp 118-446. Baker, F. J. Breach M. R, 1990, Manual de tcnicas demicrobiologa mdica, tercera edicin. Acribia, Espaa, pp 69-215. Balows A, Hausler W. J. Hermann K. L. Isenberg H. D, ShadomyH. J, 1991, Manual of clinical microbiology, quinta edicin,American society for microbiology, USA, pp 67-73. Bernard D. D, Renato D., Herman N. E., 1985, Tratado demicrobiologa, Tercera edicin, Salvat, Espaa, pp 201. Black J. G, 1996, Microbiology, principles and applications.Tercera edicin, Prentice Hall, USA, 790 pp.Brock D. T, 1996, Microbiologa, Sexta edicin,Hispanoamericana, Mxico, pp 100-135 Mac Faddin F.J, 1993, Pruebas bioqumicas para la identificacinde bacterias de importancia clnica, Panamericana, Argentina, pp301.

ESQUEMA DE IDENTIFICACIN