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IDENTIFICACIÓN DE FUENTES DE RESISTENCIA A BEGOMOVIRUS EN INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE. DIANA MILENA RODRÍGUEZ MORA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA DE POSGRADOS Palmira 2012
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IDENTIFICACIÓN DE FUENTES DE RESISTENCIA A BEGOMOVIRUS EN
INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE.
DIANA MILENA RODRÍGUEZ MORA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE POSGRADOS
Palmira
2012
IDENTIFICACIÓN DE FUENTES DE RESISTENCIA A BEGOMOVIRUS EN
INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE.
DIANA MILENA RODRÍGUEZ MORA
Tesis de grado presentado para optar al título de Magíster en CIENCIAS
AGRARIAS línea de investigación Protección Vegetal.
DIRECCIÓN:
Franco Alirio Vallejo, Ph. D.
Karina López López, Ph. D.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE POSGRADOS
Palmira
2012
DEDICATORIA
A Dios por bendecirme en cada momento de mi vida, a mi esposo, mis padres y
hermanos por sus palabras de aliento y apoyo.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Juan Carlos Vaca Vaca y a la Dra. Karina López López por haberme hecho
parte del grupo de investigación Interacción Planta, Microorganismo, Ambiente
(IPMA) y de este proyecto. Además de constante apoyo en el transcurso de la
maestría y del trabajo de tesis.
Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, por la financiación de
este trabajo de investigación.
Al Dr. Franco Alirio Vallejo por la dirección de esta tesis y sus aportes para el
desarrollo de este trabajo.
A Dolly Maritza Ultengo y en general a todo el personal de Centro Experimental de
la Universidad Nacional de Colombia - sede Palmira, por su colaboración en el
montaje y control de los ensayos de campo para la multiplicación de semillas de
tomate silvestre.
A la empresa Defrescura S.A. y todo el personal de la Finca “La Esmeralda”, por
su colaboración en la realización de los ensayos de Campo e invernadero.
Al Dr. Mario Augusto García por sus aportes en el análisis estadístico de esta
investigación.
A mis compañeros de trabajo Fredy Betancur, Paula Uribe, Miguel Useche, Dorian
Otavo, Mónica Rodríguez, Diego Caetano, Cristiam Muñoz y Alexandra García.
A mis amigos Yuri Mena, Yeimy García, Miryam Rosero, Eliud García, Viviana
Cuarán, Juan Pablo Garzón, y Fernando Castillo.
A la Universidad Nacional de Colombia – Sede Palmira por la formación
profesional recibida.
CONTENIDO
Pag.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 17
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 20
1.1HIPÓTESIS ....................................................................................................... 21
1.1.1 GENERAL: .............................................................................................. 21
1.1.2 ALTERNATIVA: ........................................................................................ 21
2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 22
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 23
3.1 OBJETIVO GENERAL .................................................................................. 23
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 23
4. MARCO TEORICO ............................................................................................ 24
4.1 Tomate (Solanum lycopersicum). ................................................................. 24
4.1.1 Tomate variedad comercial Santa Clara. .................................................. 24
4.1.2 Especies relacionadas con el tomate cultivado (S. lycopersicum L.)........ 24
4.1.3 Producción de tomate en Colombia.......................................................... 25
4.2 Geminivirus. ................................................................................................. 26
4.2.1 Begomovirus. ............................................................................................ 28
4.2.1.1 Begomovirus en América Latina en el cultivo de tomate. ....................... 29
4.2.1.2 Begomovirus en Colombia y su importancia en el cultivo de tomate. ..... 32
4.3 Mosca Blanca (Bemisia tabaci Genn)........................................................... 34
4.4 Estrategias para controlar Begomovirus. ...................................................... 35
4.4.1 Control químico. ........................................................................................ 35
4.4.2 Control biológico. ....................................................................................... 36
4.2.3 Control cultural. ......................................................................................... 37
4.2.4 Resistencia. ............................................................................................... 38
4.5 Métodos de inoculación de Geminivirus ....................................................... 39
5. METODOLOGÍA ................................................................................................ 42
5.1 ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES IDEALES DE
INOCULACIÓN MECÁNICA (BIOBALÍSTICA) DEL BEGOMOVIRUS PYMV-
COL EN PLANTAS DE TOMATE COMERCIAL VARIEDAD SANTA CLARA Y
DE TABACO. ...................................................................................................... 42
5.1.1 Multiplicación del Begomovirus PYMV-Col. ............................................... 42
5.1.2 Preparación de microcarriers y cartuchos con DNA begomoviral.............. 42
5.1.3 Inoculación de PYMV-Col por biobalística. ................................................ 43
5.1.4 Estandarización de parámetros de inoculación. ........................................ 44
5.1.5 Detección del Begomovirus en las plantas inoculadas. ............................. 45
5.1.6 Incidencia y Severidad de los síntomas. ................................................... 46
5.1.7 Análisis estadístico. ................................................................................... 46
5.2 EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA EN INTRODUCCIONES
SILVESTRES DE TOMATE AL BEGOMOVIRUS PYMV-COL. ...................... 47
5.2.1 ENSAYO PRELIMINAR DE EVALUACIÓN DE RESISTENCIA EN
INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE AL BEGOMOVIRUS PYMV-
COL. ................................................................................................................... 47
5.2.1.1 Material Vegetal...................................................................................... 47
5.2.1.2 Inoculación. ............................................................................................ 48
5.2.1 EVALUACIÓN DE INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE
PROMISORIAS EN BÚSQUEDA DE RESISTENCIA AL BEGOMOVIRUS
PYMV-COL. ........................................................................................................ 49
5.2.2.1 Inoculación. ............................................................................................ 50
5.2.2.2 Variables a evaluar. ................................................................................ 50
5.2.2.2.1 Detección de DNA viral. ...................................................................... 50
5.2.2.2.2 Incidencia y severidad de los síntomas. .............................................. 51
5.2.2.2.3 Análisis de las unidades relativas de partículas virales a través del
tiempo................................................................................................................. 52
5.2.2.2.4 Análisis estadístico. ............................................................................. 52
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 53
6.1 ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES IDEALES DE INOCULACIÓN
MECÁNICA (BIOBALÍSTICA) DEL BEGOMOVIRUS PYMV-COL EN PLANTAS
DE TOMATE COMERCIAL VARIEDAD SANTA CLARA Y DE TABACO. ......... 53
6.2 ENSAYO PRELIMINAR DE EVALUACIÓN DE RESISTENCIA EN
INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE AL BEGOMOVIRUS PYMV-
COL. ................................................................................................................... 60
6.3 EVALUACIÓN DE INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE
PROMISORIAS EN BÚSQUEDA DE RESISTENCIA AL BEGOMOVIRUS
PYMV-COL. ........................................................................................................ 64
7. CONCLUSIONES .............................................................................................. 87
8. RECOMENDACIONES ...................................................................................... 88
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 89
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación actual de los miembros de la familia Geminiviridae*........... 27
Tabla 2. Introducciones silvestres de tomate para evaluación preliminar búsqueda
de fuentes de resistencia Begomovirus PYMV-Col. ............................................... 48
Tabla 3. Respuestas de las introducciones de tomate inoculadas con el virus
PYMV-Col, en condiciones de invernadero a través del tiempo. ........................... 67
Tabla 4. Respuestas de las introducciones de tomate inoculadas con el virus
PYMV-Col, en condiciones de campo a través del tiempo..................................... 73
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Daños ocasionados por la inoculación a distancias menores de 1.5 cm,
N. tabacum var. xanthi, a:45 días después de la inoculación (DDI) y b: 63 DDI. ... 54
Figura 2. Inoculación de virus a 10cm desde el ápice de la planta (ddap). ........... 54
Figura 3 .Plantas de tabaco y tomate con y sin síntomas virales inoculadas con 2
dos cartuchos a 320 psi. Las muestras 1 y 2 corresponden a tomate de la
variedad comercial Santa Clara y la 3 a N. benthamiana. La letra a corresponde
a: Plantas antes de inocular, b. Plantas de 47 DDI. Los controles negativos son
plantas que no se inocularon. ................................................................................ 55
Figura 4. Detección del virus en las plantas de tomate inoculadas a una presión
de helio de 220 y 320 psi, con uno y dos disparos, respectivamente. Partículas de
oro de 1.6 µm. M - Marcador de peso molecular 1kb, + es una muestra positiva
conocida................................................................................................................. 56
Figura 5. Porcentaje de plantas de tomate infectadas Vs número de cartuchos
por planta y presión de helio (psi). 1 y 2: Corresponde a 1 y 2 cartucho utilizados.
Medias seguidas por la misma letra en las barras no tienen diferencias
significativas con la prueba de Duncan (P ≤ 0,05). ................................................ 57
Figura 6. Efecto de las presiones de helio (psi) y el número de cartuchos por
planta sobre la expresión de síntomas en plantas de tomate. 1 y 2: Corresponde a
1 y 2 cartucho utilizados. Medias seguidas por la misma letra en las barras no
tienen diferencias significativas con la prueba de Duncan (P ≤ 0,05). ................... 58
Figura 7. Detección de DNA viral por hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot blot
(manchas oscuras) en introducciones de tomate, bajo condiciones de invernadero,
22 DDI. T: (Control negativo PNI (Plantas no inoculadas)) – (plásmido pUC 19), +
(Producto de PCR de donde se realizó la sonda). Cada una de las líneas de
colores agrupa las repeticiones de las introducciones de tomate evaluadas. ....... 62
Figura 8. Detección de DNA viral por hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot blot
(manchas oscuras) en introducciones de tomate, bajo condiciones de invernadero,
42 DDI. T: (Control negativo PNI (Plantas no inoculadas)) – (plásmido pUC 19), +
(Producto de PCR de donde se realizó la sonda). Cada una de las líneas de
colores agrupa las repeticiones de las introducciones de tomate evaluadas. ....... 63
Figura 9 Establecimiento del ensayo experimental en campo 33 DDI, en un lote
vecino de tomate Cherry. ....................................................................................... 65
Figura 10. .Panorama del ensayo experimental en invernadero, 33 DDI. ............ 65
Figura 11. Detección de DNA viral por hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot
blot (manchas oscuras) en introducciones de tomate, bajo condiciones de
invernadero. A: 30 DDI y B: 50 DDI. T* (Control negativo PNI (plantas no
inoculadas)) – (plásmido pUC 19), + (Producto de PCR de donde se realizó la
sonda). Flechas azules (plantas donde no hubo replicación viral), flechas zapotes
(plantas en donde disminuyeron las unidades relativas de partículas virales a los
50 DDI hasta llegar a cero). ................................................................................... 66
Figura 12. Escala de severidad de síntomas en introducciones de tomate
evaluadas, en condiciones de invernadero 30 y 50 DDI. ** Diferencia estadística
altamente significativa al 1% de probabilidad. Medias seguidas por la misma letra
en las barras no tienen diferencias significativas. .................................................. 68
Figura 13. Unidades relativas de partículas virales en las introducciones de
tomate evaluadas, en condiciones de invernadero 30 y 50 DDI. ** Diferencia
estadística altamente significativa al 1% de probabilidad, * Diferencia estadística
significativa al 5% de probabilidad. Medias seguidas por la misma letra en las
barras no tienen diferencias significativas.............................................................. 70
Figura 14. Porcentaje de plantas infectadas por virus, con base en la detección
por dot blot en las introducciones de tomate evaluadas, en condiciones de
invernadero 30 y 50 DDI. * Diferencia estadística significativa al 5% de
probabilidad. Medias seguidas por la misma letra en las barras no tienen
diferencias significativas. ....................................................................................... 71
Figura 15. Ensayo en condiciones de campo. Plantas de tomate con presencia de
mosca blanca. A: Tomate Cherry, B: LA 3864 y C: Santa Clara. ........................... 74
Figura 16. Tomate variedad comercial Santa Clara. A: 30 DDI, B: 50 DDI, C: NPI
(planta sin inocular), en condiciones de campo. .................................................... 75
Figura 17. Introducción S. pimpinellifolium LA1478, A: 30 DDI, B: 50 DDI, C: NPI
(planta sin inocular), en condiciones de campo. .................................................... 75
Figura 18. Severidad de la expresión de síntomas en las introducciones de tomate
evaluadas, en condiciones de campo 30 y 50 DDI. ** Diferencia estadística
altamente significativa al 1% de probabilidad. Medias seguidas por la misma letra
en las barras no tienen diferencias significativas. .................................................. 76
Figura 19. Detección de DNA viral por hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot
blot (manchas oscuras) en introducciones de tomate, bajo condiciones de Campo.
A: 30 DDI y B: 50 DDI. T* (Control negativo PNI (plantas no inoculadas)) –
(plásmido pUC 19), + (Producto de PCR de donde se realizó la sonda). Flechas
azules (plantas donde no hubo replicación viral), flechas rojas (PNI) con
replicación viral, recuadro verde (aumento de las unidades relativas de partículas
virales en Santa Clara)........................................................................................... 78
Figura 20. Unidades relativas de partículas virales en las introducciones en las
introducciones de tomate evaluadas, en condiciones de campo 30 y 50 DDI. *
Diferencia estadística significativa al 5% de probabilidad. ** Diferencia estadística
altamente significativa al 1% de probabilidad. Medias seguidas por la misma letra
en las barras no tienen diferencias significativas. .................................................. 79
Figura 21. Porcentaje de plantas infectadas por virus en las introducciones de
tomate evaluadas, en condiciones de campo 30 y 50 DDI. Medias seguidas por la
misma letra en las barras no tienen diferencias significativas con la prueba de
Duncan (P ≤ 0,05) .................................................................................................. 80
Figura 22. Comportamiento de las unidades relativa de partículas virales respecto
a la escala de severidad de síntomas en las introducciones silvestres de tomate.
A. LA 0094; B. LA1478; C. PI 134418; D. PI 134417; E. LA 2103; F. LA 3864; G.
LA 1777. H. Santa Clara. Los números en rojo representan las plantas sin
replicación viral. ..................................................................................................... 85
RESUMEN
Los Begomovirus (virus transmitidos por Bemisia tabaci, biotipo B) están causando
pérdidas significativas en el cultivo de tomate (Solanum lycopersicum) en
Colombia. Los métodos de control químico, biológico y cultural no parecen ser
eficaces, por lo que una alternativa es el uso de cultivares resistentes. Dado que
actualmente no se cuenta con variedades de tomate resistentes a begomovirus
endémicos de Colombia, es necesario realizar una búsqueda de fuentes de
resistencia en introducciones de tomate silvestre, para lo cual primero se
estandarizaron las condiciones ideales de inoculación por biobalística del Virus del
mosaico amarillo de la papa aislado de Colombia (PYMV-Col), utilizando la pistola
génica Helios Gene Gun System (BioRad®). La técnica se probó en tomate de la
de la variedad comercial Santa Clara (susceptible a este virus), en donde al utilizar
dos cartuchos de partículas de oro de 1.6 µm cubiertas de 1ug de DNA del virus
por planta, a una presión de helio de 320 psi y una distancia de 10 cm ddap se
logró un 100% de infección, con síntomas propios de la enfermedad. Segundo,
con estos resultados obtenidos se inocularon las introducciones de tomate
silvestre S. habrochaites PI 134417, PI 134418, PI 126449, LA 3864, LA 2864, LA
2103, LA 1777, 1378, LA 1223, LA 0094 y S. pimpinellifolium LA1478, con el fin de
hacer un escrutinio de estos genotipos. La presencia del virus PYMV-Col fue
confirmada realizando una hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot blot. Aunque
ningunas de las introducciones evaluadas fue inmune, se observó un
comportamiento de segregación de plantas con y sin replicación viral tanto en
condiciones de campo como de invernadero, el cual puede ser atribuido a la
heterogeneidad genética dentro de las introducciones. Las introducciones de
tomate silvestre en donde se encontraron fuentes de resistencia al virus PYMV-Col
fueron la LA 0094, LA1478, PI 134418, PI 134417, LA 3864, LA 1777, en las
cuales se realizó una selección individual por plantas que no presentaran
replicación del virus en ninguno de los tiempos evaluados, en condiciones de
campo.
Palabras claves: Solanum lycopersicum, Biobalística, Begomovirus, Bemisia
tabaci, resistencia.
SUMMARY
The Begomovirus (virus transmitted by Bemisia tabaci, biotype B) are causing
significant losses in the cultivation of tomato (Solanum lycopersicum) in Colombia.
The chemical, biological and cultural methods of control do not appear to be
effective, so an alternative is the use of resistant cultivars. Since currently there is
no tomato varieties resistant to begomovirus endemic to Colombia, it is necessary
to search for sources of resistance in wild tomato introductions, for which first
standardized the ideal conditions for biolistic inoculation of Yellow mosaic virus
potato isolated from Colombia (PYMV-Col), using the Helios gene gun Gene Gun
System (BioRad ®) in tomato commercial variety Santa Clara (susceptible to this
virus), where by using two rounds of gold particles of 1.6 µm covered by 1µg DNA
virus by plant, at pressure of 320 psi helium and a distance of 10 cm ddap was
achieved 100% infection, with sysmptons of the disease. Second, With these
results were inoculated introductions of wild tomato S. habrochaites PI 13447, PI
134418, PI 126449, LA 3864, LA 2864, LA 2103, LA 1777, 1378, LA 1223, LA
0094 and S. pimpinellifolium LA 1478, in order to scrutinize these genotypes. The
presence of PMYV-Col virus was confirmed performing a nucleic acid
hybridization, dot blot type. Although none of the evaluated introductions was
immune, a segregation behavior was observed of plants with and without viral
replication both in field and in greenhouse, which can be attributed to genetic
heterogeneity within the introductions. The introductions of wild tomatoes where
resistance source to virus-Col were PYMV LA 0094, LA1478, PI 134418, PI
134417, LA 3864, LA 1777 was gotten, in which an individual selection was made
by plants that showed no virus replication in any of the times evaluated, in field
conditions.
Keywords: Solanum lycopersicum, biolistic, Begomovirus, Bemisia tabaci,
resistance.
17
INTRODUCCIÓN
El tomate (Solanum lycopersicum L.) se cultiva en más de cien países, tanto para
consumo fresco como para industria; los diez principales productores concentran
más del 70 % del total mundial (Finagro, 2008). De los 20 países mayores
productores se destacan China, Estados Unidos, India, Turquía, y Egipto con una
producción de 41.8, 12.9, 8.9, 10.5 y 8.5 millones de toneladas de tomate. En sur
América tan solo se destaca Brasil con 3.6 millones de toneladas (Faostat, 2010).
Colombia por su parte, en el 2008 ocupó el puesto No. 36 (Faostat, 2008).
Según las estadísticas de Agronet, en el año 2010 en Colombia se produjeron
519.843 toneladas de tomate, en un área de 14.124 ha; destacándose los
departamentos de Boyacá, Norte de Santander, Caldas, Antioquia,
Cundinamarca, Valle del Cauca, Santander y Nariño (Agronet, 2010). Sin
embargo, la producción de tomate está seriamente afectada por la incidencia de
enfermedades virales, especialmente por aquellas causadas por virus del género
Begomovirus, pertenecientes a la familia Geminiviridae, transmitidos por mosca
blanca ,Bemisia tabaci Gennadius, biotipo B causando pérdidas altamente
significativas en cosecha (Morales et al., 2002; Vaca-Vaca et al., 2011).
En los últimos años, el Valle del Cauca ha sufrido la incidencia de estos virus en
plantaciones de tomate y habichuela, lo cual ha causado el abandono de muchas
áreas de cultivo (Morales et al., 2002). Análisis estadísticos realizados por
Agronet, durante el periodo comprendido entre el año 2007 y el año 2010, estiman
que la producción de tomate en el Valle del Cauca bajó considerablemente,
pasando de 43.359 toneladas (en 1.926 ha) a 37.138 toneladas (en 1.808 ha).
En el 2008, Martínez et al., reportaron la presencia de un Begomovirus bipartita
en cultivos de tomate de Rozo, Valle del Cauca; y recientes investigaciones
realizadas por Vaca-Vaca et al., (2011) en diferentes zonas productoras de tomate
18
de Colombia ubicadas entre los 655 a 2184 msnm, detectaron la presencia de
Begomovirus bipartitas afectando seriamente el cultivo de tomate en los
departamentos de Antioquia, Santander, Boyacá, Cundinamarca y Valle del
Cauca. Análisis moleculares y bioinformáticos realizados a estos Begomovirus
bipartitas determinaron los begomovirus que están actualmente afectando el
cultivo de tomate en Colombia están relacionados filogenéticamente con el Virus
del mosaico amarillo de la papa (Potato yellow mosaic virus -PYMV) y con el Virus
del tomate de Venezuela (Tomato venezuela virus -ToVEV) (Vaca-Vaca et al.,
2012).
Los métodos que se usan para tratar de disminuir el daño ocasionado por las
enfermedades virales en tomate son el control cultural, biológico y químico; los
cuales al parecer no son eficientes en cultivos a gran escala donde haya una alta
incidencia de mosca blanca virulíferas (Polston & Anderson, 1997; Zakay et al.,
1991) a menos que sean utilizados en combinación con genotipos de tomate
resistentes (Laterrot, 1999: Polston & Anderson, 1997).
Dado que actualmente no se cuenta con variedades de tomate resistentes a
begomovirus endémicos de Colombia, es necesario realizar una búsqueda de
fuentes de resistencia en introducciones silvestres de tomate, que servirán a los
programas de mejoramiento genético para introgresar genes de resistencia en
variedades de interés. Para esto, previamente se obtuvo la clona genómica
completa de un Begomovirus bipartita de una muestra de tomate recolectada en
Tuluá- Valle del Cauca (Betancur, 2012), la cual fue reportada con el nombre de
Potato yellow mosaic virus- [Colombia] (PYMV-Col) y cuyas secuencias fueron
depositadas en el banco de datos Genbank bajo los números de accesión:
JQ045705 para el componente A y JQ045706, para el componente B.
Adicionalmente, para identificar estos materiales de tomate se requiere
estandarizar las condiciones de inoculación del begomovirus PYMV-Col en plantas
19
de tomate, para lo cual se han reportado diferentes métodos: mecánico (abrasivo),
agroinoculación, transmisión directa del insecto vector, injerto y biobalística
(Ascencio & Settlage, 2007). Este último método de inoculación viral a diferencia
de los otros, ha reportado eficiencias hasta del 100% (Aebig et al., 2005), ha sido
utilizada con éxito no sólo para inocular Begomovirus (Hernández et al., 2001,
Morilla et al., 2005, Ariyo et al., 2006), sino también Potyvirus (Gal et al., 1995; Gal
et al., 1997), Luteovirus (Yamagishi et al., 2006), Nepovirus (Valat et al., 2003),
Cucumovirus (Aebig et al., 2005), Polerovirus (Hoffmann et al., 2001), entre otros.
En este trabajo se busca evaluar introducciones silvestres de tomate como
fuentes de resistencia al Begomovirus PYMV-Col, usando la pistola génica Helios
Gene Gun System (BioRad®) como método de inoculación. De esta forma
complementar y acelerar las técnicas de mejoramiento genético tradicional;
contribuir a la agricultura sostenible al reducir aplicaciones de insecticidas para el
control de la mosca blanca; disminuir costos de producción; aumentar el
rendimiento y calidad de las cosechas de tomate.
20
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El tomate es la hortaliza más importante en muchos países del mundo. Este
cultivo, presenta grandes problemas fitosanitarios limitantes, entre los cuales se
encuentra la aparición de nuevas enfermedades virales, en especial aquellas
causadas por virus del género Begomovirus (familia geminiviridae) transmitido por
mosca blanca (B. tabaci Genn), biotipo B, causando pérdidas altamente
significativas en cosecha (Morales et al., 2002).
El Valle del Cauca, ha sufrido la incidencia de estos virus en plantaciones de
tomate y habichuela, causando el abandono de muchas áreas de cultivo. El control
de las enfermedades virales está orientado a disminuir las poblaciones del vector,
y uno de los más utilizados es el químico, en donde el uso indiscriminado de estos
productos de síntesis ha ocasionado que B. tabaci se vuelva resistente a varios de
los insecticidas usados para su control generando nuevos biotipos (Cardona et al.
2001). Este método ha resultado ser excesivamente caro y dañino, tanto para la
salud humana como para el medio ambiente.
Es por eso, que la mejor alternativa para la protección de cultivos es el uso de
variedades resistentes a Begomovirus. Sin embargo, en América Latina, la
mayoría de las variedades comerciales son susceptibles a begomovirus y el
mejoramiento genético en búsqueda de resistencia a virus se ha llevado a cabo en
la zona templada, por lo tanto, las variedades comerciales no están adaptadas a
las condiciones y plagas del trópico (Morales, 2001). En Colombia se importa
semilla de tomate con resistencia a geminivirus, los cuáles es posible que no se
encuentren naturalmente afectando nuestros cultivos; es decir, que no se cuenta
con variedades de tomate resistentes a begomovirus endémicos de Colombia, por
eso es necesario realizar una búsqueda de fuentes de resistencia en poblaciones
21
silvestres de tomate, que servirán a los programas de mejoramiento genético para
introgresar genes de resistencia en variedades de interés.
1.1HIPÓTESIS
1.1.1 GENERAL: Al menos una de las introducciones silvestres de tomate
evaluadas presenta resistencia begomovirus.
1.1.2 ALTERNATIVA: Ninguna de las introducciones silvestres de tomate
evaluadas presenta resistencia begomovirus.
22
2. JUSTIFICACIÓN
Este trabajo se pretende identificar introducciones silvestres de tomate resistentes
al Begomovirus bipartita PYMV- Col endémico de Colombia, mediante inoculación
mecánica por el método de biobalística.
Este método ha tenido eficiencias de infección de hasta el 100% (Aebig et al.,
2005); requiere un mínimo equipo de laboratorio y de pocas técnicas de destreza,
representando en la actualidad una de los mejores métodos de inoculación usado
con geminivirus (Ascencio & Settlage, 2007). Además, el bombardeo de partículas
se puede utilizar para evitar la necesidad de mantener poblaciones virulíferas de
insectos vectores, permitiendo la introducción directa de los ácidos nucleicos de la
infección viral dentro de un rango de especies de plantas (Hoffmann et al., 2001) e
inocular un gran número de plantas en muy poco tiempo.
Con la búsqueda e identificación de introducciones silvestres de tomate
resistentes al begomovirus PYMV- Col se podrán implementar en el futuro
programas de mejoramiento genético tradicional a partir de materiales de interés.
Esto permitirá a futuro desarrollar estrategias viables tanto a nivel económico
como desde el punto de vista ambiental que permitan a la postre hacer un manejo
exitoso de este tipo de virus.
23
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Identificar fuentes de resistencia al begomovirus Virus del mosaico amarillo de la
papa [Colombia] (PYMV-Col) en introducciones silvestres de tomate
pertenecientes al banco de germoplasma de la UNAL-Palmira.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Establecer las condiciones ideales de inoculación mecánica (biobalística)
del begomovirus PYMV-Col en plantas de tomate de la variedad comercial
Santa Clara.
2. Evaluar en invernadero y campo la resistencia de las introducciones
silvestres de tomate pertenecientes al banco de germoplasma de la UNAL-
Palmira, inoculadas previamente con el PYMV-Col mediante biobalística.
3. Verificar la resistencia al begomovirus PYMV-Col en introducciones
silvestres de tomate empleando estrategias moleculares.
24
4. MARCO TEORICO
4.1 Tomate (Solanum lycopersicum).
El tomate es una planta dicotiledónea, perteneciente a la familia Solanácea y al
género Solanum. La especie S. lycopersicum es la especie cultivada y posee
nueve especies silvestres relacionadas; es nativo de Suramérica. Todas las
especies silvestres relacionadas con el tomate son originarias de la región de
Chile, Bolivia, Perú, Ecuador, Colombia, incluyendo las islas galápagos. Sin
embargo, la mayoría de las evidencias indican que la región de Veracruz y Puebla,
en México, es su centro de domesticación. Actualmente está ampliamente
distribuido en todas las áreas tropicales del mundo (Vallejo, 1999).
4.1.1 Tomate variedad comercial Santa Clara.
La variedad Santa Clara fue introducida del Brasil, tiene altos rendimientos y frutos
blocosos grandes y firmes con 2-3 lóculos. Este es un tomate tipo Chonto de
crecimiento indeterminado (Casseres, 1970).
4.1.2 Especies relacionadas con el tomate cultivado (S. lycopersicum L.)
S. pimpinellifolium: Es originaria de los Andes peruanos y ecuatorianos,
costa del Perú y nororiente de Ecuador y Perú. Está constituida por plantas
anuales o perennes, con pubescencia diminuta. Se pueden realizar
fácilmente cruzas con S. lycopersicum (Rick, 1978). Pese a que ésta
especie es autógama, presenta varios grados de alogamia facultativa, con
25
diferencias en las distintas regiones (Esquinas-Alcázar, 1981). En diferentes
estudios se han evaluado las introducciones de S. pimpinellifolium que han
presentado altos niveles de resistencia al cogollero (Tuta absoluta) (Parra et
al., 1993).
S. habrochaites: Es una planta anual, de tallos erectos con una alta
densidad de tricomas. Hojas con estípulas y bordes dentados. Racimos de
3 a 8 cm de largo, con brácteas en los pedicelos. Frutos con 1.5 a 2.5 cm
de diámetro y con muchos tricomas. Presenta abundante floración pero
poco cuajamiento (Muller, 1940). Se distribuye entre el centro del Perú y el
norte del Ecuador. Presenta dos formas botánicas: typicum y glabratum, la
primera es autoincompatible y la segunda es autocompatible (Sawant,
1958; Martin, 1967). Es una fuente importante de resistencia a insectos
plaga del tomate cultivado (Rick, 1978). En diversas observaciones e
investigaciones, se ha encontrado que S. habrochaites provee resistencia a
14 insectos plagas, siendo la única fuente de resistencia a nueve de ellas
(Rick, 1982). La forma botánica glabratum posee resistencia a la mayoría
de las plagas producidas por artrópodos en tomate (Barbosa & Maluf, 1996)
y en particular aT. absoluta (Franca et al. 1989, Parra et al., 1993).
4.1.3 Producción de tomate en Colombia
En Colombia el tomate es uno de los cultivos hortícolas de mayor importancia. Se
siembra en casi todas las regiones del país, tanto en plantaciones comerciales
como en huertos de tipo familiar. De los 32 departamentos que tiene Colombia, en
20 siembran tomate, destacándose Boyacá, Norte de Santander, Caldas,
Antioquia, Cundinamarca, Valle del Cauca, Santander y Nariño, como los
mayores productores, con una participación en la producción nacional de 18.48,
16.66, 12.70, 9.08, 8.49 y 7.14 % respectivamente (Agronet, 2010).
26
Aunque el cultivo de tomate es de período vegetativo corto, de alta demanda, y
puede llegar a ser muy rentable, su producción es una actividad agrícola muy
riesgosa, los cultivos son generalmente pequeños y atomizados, con altos costos
de producción, poca disponibilidad de crédito, mercado caótico, altas pérdidas de
postcosecha, escasa tecnificación en la producción y de bajos rendimientos
(Vallejo, 1999). Adicionalmente, presenta grandes problemas sanitarios, entre los
que se encuentran las enfermedades virales, especialmente por aquellas
causadas por virus del género begomovirus (Morales et al., 2009; Tamayo &
Jaramillo et al., 2006; Vaca-Vaca et al., 2012).
Ante la carencia de semillas nacionales, Colombia depende de la importación de
semilla para la producción de tomate, debiendo importar el 80% de la semilla
requerida (Vallejo, 1999) y lo más grave aún es que esta semilla es resistente a
geminivirus presentes en esas regiones del mundo (por ejemplo Virus del rizado
amarillo del tomate (Tomato yellow leaf curl virus -TYLCV), los cuáles es posible
que no se encuentren afectando este cultivo en los campos colombianos.
4.2 Geminivirus.
Los Geminivirus constituyen la segunda familia más extensa de virus de plantas
reportadas a la fecha (Fauquet et al., 2003). Desde la década de los 80 estos virus
han sido encontrados como agentes causales de enfermedades; en algunos casos
devastadoras en cultivos de maíz, caña de azúcar, tabaco, remolacha, tomate,
frijol, yuca, algodón, melón, chile, papa, calabaza, sandía, papaya, camote y soya
(Dhar & Singh, 1995); y en frutales (granadilla y maracuyá) localizados en las
zonas tropicales y subtropicales de América (Florida, el Caribe, México, América
Central, Venezuela y Brasil), causando por ende pérdidas económicas y
amenazando la producción general de éstos (Mansoor et al., 2008; Ramirez &
Rivera, 1996; Varma & Malathi, 2003;).
27
El genoma de los Geminivirus están compuesto de ADN circular de cadena simple
de 2.5- 3.0 kb que está encapsidado en subunidades proteicas semejantes a
icosaedros fusionados por una de sus caras (Palmer & Rybichi, 1997; Rojas et al.,
2005).
Los Geminivirus se clasifican en cuatro géneros basado en su organización
genómica, su insecto vector y la planta hospedera (Ascencio et al., 2000; Varma &
Malathi, 2003; Fauquet et al., 2003; Rojas et al., 2005) (Tabla 1).
Tabla 1. Clasificación actual de los miembros de la familia Geminiviridae*
Género Organización
genómica
Principales
plantas huésped Insecto vector
Mastrevirus
Virus del estriado del Maíz
(Virus del estriado del Maíz
(MSV - MSV)
Un componente
(monopartita) Monocotiledóneas
Cicadulina spp.
(Cicadélidos)
Curtovirus
Virus del Encrespado del
Betabel (Beet curly tpo
virus - BCTV)
Monopartita Dicotiledóneas Cicadélidos
Begomovirus
Virus del mosaico dorado
del fríjol (Bean golden
mosaic virus - BGMV)
Uno o dos
componentes
(monopartita ó
bipartita)
Dicotiledóneas
Mosca blanca (B.
tabaci
Gennadius)
Topocuvirus
Virus del seudorizado del
tomate (Tomato pseudo-
curly top virus -TPCTV)
Monopartita Dicotiledóneas
Micrutalis
malleifera Fowler
(Membracidae)
* Tomado de Rojas et al., (2005) con algunas modificaciones.
28
La creciente virulencia registrada por los geminivirus en años recientes, asociada
a un aumento en su capacidad de generar daño en los cultivos que afectan, está
íntimamente determinada por factores intrínsecos del propio virus así como a
factores extrínsecos a él. Dentro de los factores intrínsecos se debe considerar la
capacidad que tienen estos virus de formar pseudorecombinantes, los cuáles
pueden a su vez ser más virulentos que aquellos a partir de los cuáles se
originaron (Garrido et al., 2000; Fauquet et al., 2005). Entre los factores
extrínsecos, se encuentran cambios en el sistema de los cultivos y en los insectos
vectores, la circulación de materiales infectados, la introducción de cultivos o
genotipos susceptibles a virus endémicos en una región, etc. (Polston & Anderson,
1997; Varma & Malathi, 2003).
4.2.1 Begomovirus.
El género Begomovirus presenta un genoma bipartita o monopartita, es
transmitido por mosca blanca B. tabaci (Gennadius) e infecta a plantas
dicotiledóneas (Fauquet et al., 2003; Padidam et al., 1997; Rojas et al., 2005). La
transmisión de este virus por su insecto vector es del tipo circulativo no
propagativo.
Los Begomovirus, en su mayoría poseen genomas bipartitas (dos componentes),
con pocos ejemplos monopartitas (Ascencio et al., 2000). En este último se
destacan TYLCV (Navot et al., 1991) y Virus del rizado del tomate (Tomato Leaf
curl Virus-TLCV) (Fauquet et al., 2003).
Los genomas bipartitas se caracterizan por tener 2 componentes genómicos
llamados DNA A y DNA B. En el DNA A, se encuentran funciones necesarias para
replicación, transcripción y encapsidación del virus, mientras que en el genoma
DNA B son codificadas funciones de movimiento viral y pueden estar alojados
determinantes sintomáticos (Rojas et al., 2005; Sudarshana et al., 1998). Además,
29
ambos componentes virales son esenciales para el establecimiento de una
infección sistémica, los cuales son encapsidados de manera independiente (Rojas
et al., 2005).
Los Begomovirus han sido considerados como un grupo emergente de virus en
plantas por su severidad en las enfermedades causadas. En las últimas tres
décadas se ha observado una alta incidencia de estos virus en regiones tropicales
y subtropicales del mundo, causando pérdidas devastadoras en producción en
cultivos de frijol, yuca, algodón, cucurbitáceas y tomate (Morales & Anderson,
2001; Polston & Anderson, 1997). La sintomatología típica causada por los
begomovirus es: enanismo, mosaicos amarillos brillantes, moteados cloróticos,
clorosis foliar marginal, enrollamiento foliar, deformaciones foliares y
arrugamientos de las hojas (Nava et al., 2006; Polston & Anderson, 1997).
Uno de los principales factores que contribuyen a la emergencia de las nuevas
enfermedades de Begomovirus son la evolución de variantes de los virus, la
aparición del biotipo B de la mosca blanca, y el incremento en la población del
vector (Varma & Malathi, 2003).
4.2.1.1 Begomovirus en América Latina en el cultivo de tomate.
Desafortunadamente, los Begomovirus se constituyen en el grupo más importante
de patógenos que están causando pérdidas significativas en cultivos alimenticios e
industriales en agro-ecosistemas tropicales y subtropicales a nivel mundial
(Morales & Anderson, 2001; Polston & Anderson, 1999).
América Latina ha sido la región más afectada en términos del número total de
geminivirus transmitidos por mosca blanca, el número de cultivos afectados,
pérdidas de rendimiento y área devastada por éstos patógenos (Morales &
30
Anderson, 2001). En varios países, tales como México, se han detectado
enfermedades virales causadas por Begomovirus, entre los que se encuentran el
Virus chino del tomate (Chino del tomate virus - CdTV) (Brown & Nelson, 1988)
afectando tomate en Sinaloa; el Virus del mosaico dorado del pimiento (Pepper
golden mosaic virus - PepGMV), el cual fue reportado primero en Texas in 1987
(Stenger et al., 1990) y el Virus del enrollamiento de la hoja de tomate de Sinaloa
(Tomato leaf curl Sinaloa virus - ToLCSInV) (Brown et al., 1993), entre otros.
En América central, específicamente en Guatemala se aisló el PepGMV de plantas
de tomate afectadas (Mejía et al., 1998; Morales & Anderson, 2001) y el Virus del
rizo severo de la hoja de tomate (Tomato severe leaf curl virus - ToSLCV); este
último fue más tarde descrito en Honduras (Nakhla et al. 1994) y Nicaragua
(Rojas, 2005; Rojas et al. 2000). Otro Begomovirus, tales como el Virus del
moteado suave del tomate (Tomato mild mottle virus – TMMV), originalmente
detectado en América Central (Rojas et al. 2000; Maxwell et al. 2002), fue
encontrado más tarde en California y México (Holguin et al., 2005). Así mismo,
existen reportes de Begomovirus encontrados en el Salvador (Abouzid et al.
1992), Costa Rica (Castillo, 1997; Karkashian et al., 2002; Lotrakul et al., 2000),
Nicaragua (Ala-Poikela et al. 2005) y Panamá (Engel et al., 1998).
En la Región Caribe, la importancia de los Begomovirus perjudicando la
producción de tomate está asociada con la introducción del Begomovirus más
importante de tomate del Viejo mundo, TYLCV, en esta región y en las Américas
(Polston et al., 1996). Este virus se propagó rápidamente en República
Dominicana y Haiti (Morales & Anderson, 2001; Morales, 2006), Cuba, Puerto
Rico, Guadalupe y Jamaica (Bird et al., 2001; Gonzales & Valdes 1995;
McGlashan et al., 1994; Urbino & Tassius 1999), México (Ascencio et al., 1999;
Bellows et al., 1994), Sur de Georgia (Momol et al., 1999), sur de California (Ling
et al., 2006) y Venezuela (Zambrano et al., 2007).
31
En Sur América, el primer reporte de enfermedad viral trasmitida por mosca blanca
en tomate ocurrió en los años 50 en Brasil (Flores & Silberschmidt, 1967; Flores et
al., 1960). En 1975, se reportó el Virus del mosaico dorado el tomate (Tomato
golden mosaic virus -TGMV), primer Begomovirus caracterizado en las Américas
(Matys et al., 1975). Actualmente, hay al menos 8 Begomovirus afectando la
producción de tomate en 9 estados del Brasil (Andrade et al., 2006; Lima et al.,
2000; Ribeiro et al., 2003). Recientemente, se detectaron el Virus de la mancha
amarilla del tomate (Tomato yellow spot virus- ToYSV), el Virus de la deformación
amarilla de las hojas de tomate (Tomato crinkle leaf yellows virus - TCrLYV)
(Andrade et al., 2006) y el Virus rugoso severo de tomate (Tomato severe rugose
virus - ToSRV), que parce estar más adaptado a especies de Capsicum que a
tomate (Bezerra-Agasie et al., 2006; Nozaki et al., 2006).
El segundo reporte de enfermedades virales de tomate en Sur América fue
descrita en Venezuela en 1963, como el Virus del mosaico amarillo del tomate
(Tomato yellow mosaic virus - ToYMV) (Debrot et al., 1963), así mismo síntomas
de este virus fueron observados en los estados productores de tomate de
Venezuela: Aragua y Lara en 1975 (Lastra & Uzcátegui, 1975). Este Begomovirus
que originalmente fue descrito sobre tomate (Debrot et al., 1963, Lastra &
Uzcátegui, 1975), eventualmente fue encontrado en algunas plantas de papa
contiguas a campos de tomate infectados (Debrot & Centeno, 1985). Sin embargo,
cuando en 1986, Roberts et al., obtuvieron muestras de papa infectadas con
ToYMV, provenientes de Venezuela, lo señalaron como un nuevo Begomovirus
bajo el nombre de Virus del mosaico amarillo de la papa (PYMV, por su siglas en
inglés Potato yellow mosaic virus) y su secuencia completa fue reportada
posteriormente en la base de datos GenBank (Coutts et al., 1991) quedando como
referencia para este virus. No obstante, basados en el análisis de la secuencia de
un fragmento de 1698 pb obtenido a partir de muestras de plantas de tomate
infectadas por el ToYMV, preservadas en seco y refrigeradas desde principios de
la década de 1980 en el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC)
32
Caracas, Venezuela, Morales et al., (2001) demostraron que el PYMV era una
sinonimia del ToYMV debido a que estas tenían más de 95% de identidad en la
secuencia de nucleótidos comparada. Pero este nombre actualmente no está
aceptado por el Comité Internacional de Virus (ICTV).
El PYMV se ha convertido en el Begomovirus bipartita de tomate mayor expandido
en el Caribe (Urbino et al., 2004). Cepas de PYMV han sido reportadas en
Venezuela (Guzmán et al., 1997), Panamá (Engel et al., 1998), Trinidad y Tobago
(Umaharan et al., 1998), Guadalupe, Martinica y Puerto Rico (Polston et al., 1998).
Según Morales (2010), estas islas están lo suficientemente cerca para que actúen
como un puente natural de la mosca blanca en la región Caribe, aunque no se
puede descartar la posibilidad del transporte ilegal de plantas infectadas o material
vegetal infestado de individuos de B. tabaci virulíferos en esta región. Esta última
forma, es como posiblemente el PYMV llegó a Panamá sin afectar las
plantaciones de tomate que se encuentran en la costa norte de Colombia. Sin
embargo, finalmente el PYMV se difundió en Colombia, probablemente por el Valle
del Magdalena, transportado por la mosca blanca, o por los agricultores. También,
el departamento de Norte de Santander, pudo servir de puente de entrada de este
virus desde Venezuela (Morales, 2010). En este país ha continuado su
diseminación en nuevos estados de donde originalmente se encontró (Nava et al.,
2006).
4.2.1.2 Begomovirus en Colombia y su importancia en el cultivo de tomate.
Los primeros reportes sobre la presencia de Begomovirus transmitidos por mosca
blanca en Colombia fueron presentados por Galvez et al. (1975), cuando
encontraron en Espinal, Tolima plantas de fríjol común afectadas por el Virus del
mosaico dorado del fríjol (Bean golden mosaic virus – BGMV) y Virus del
mosaico enano del fríjol (Bean dwarf mosaic virus – BDMV). Morales & Anderson,
33
en el 2001 reportaron la presencia de B. tabaci biotipo B, en alturas que van entre
el nivel del mar hasta los 1000 msnm, especialmente donde el clima es cálido y
con períodos secos definidos, donde los cultivos como tomate, pimentón, chile,
tabaco y varias cucurbitáceas se afectaron seriamente por Begomovirus. Más
tarde, se reportaron nuevos brotes de enfermedades virales en habichuela y
tomate, siendo este último uno de los cultivos más intensificado y con un uso
exagerado de agroquímicos (Morales et al., 2002).
En el 2008, Martínez y colaboradores, reportaron la caracterización molecular de
un Begomovirus que estaba infectando cultivos de tomate en el corregimiento de
Rozo - Valle del Cauca, el cual fue identificado como una variante del ToYMV,
sinónimo de PYMV.
Recientes investigaciones realizadas en diferentes zonas geográficas de
Colombia, se detectó la presencia de Begomovirus bipartita afectando seriamente
el cultivo de tomate, en los departamentos de Antioquia, Santander, Boyacá,
Cundinamarca y Valle del Cauca (Vaca-Vaca, et al., 2011). En un trabajo de
distribución y diversidad genética de Begomovirus realizado por Vaca-Vaca et al.,
(2012) reportan que los geminivirus que están actualmente afectando el cultivo de
tomate en Colombia están relacionados filogenéticamente con PYMV y con
ToVEV, existiendo una distribución geográfica de variantes de begomovirus en el
país. En el departamento de Santander predominan Begomovirus relacionados
filogenéticamente con PYMV-Martinica y con ToVEV; en el departamento de
Cundinamarca hay Begomovirus emparentados con PYMV-Valle y con el ToVEV;
y en el departamento de Valle del Cauca predominan únicamente Begomovirus
relacionados con el PYMV-Valle. Adicionalmente, Vaca-Vaca et al., (artículo en
preparación) obtuvo la clona genómica completa de un Begomovirus bipartita de
una muestra de tomate recolectada en Tuluá - Valle del Cauca, el cuál fue
secuenciado y reportado con el nombre Virus del mosaico amarillo de la papa
[Colombia] (PYMV-Col).
34
La rápida diseminación de este Begomovirus en Colombia, está relacionada con la
presencia y alta actividad de B. tabaci biotipo B en más áreas de agricultura
(Rodríguez et al., 2005); en zonas agrícolas en las que anteriormente no se
encontraba presente (alturas superiores a 1500 m.s.n.m.) (Martínez, 2008;
Morales, 2010). Vaca-Vaca et al., (2011) encontraron muestras vegetales de
tomate infectadas por Begomovirus en el municipio de Silvania - Cundinamarca a
altitudes de 2.184 m.s.n.m, concluyendo que el cambio climático mundial
posiblemente está facilitando de alguna manera colonizar nuevos nichos por B.
tabaci, lo que conllevaría que los Begomovirus que esta mosca transmite, logren
afectar a nuevos cultivos ubicados en altos pisos latitudinales.
4.3 Mosca Blanca (Bemisia tabaci Genn).
La mosca blanca B. tabaci pertenece a la familia Aleyrodidae y al orden
Hemiptera, es una especie ampliamente distribuida en regiones tropicales y
subtropicales del mundo, donde se alimenta de más de 600 especies de plantas
cultivadas y silvestres (Greathead, 1986; Mound & Halsey, 1978; Secker et al.,
1998). Entre los hospederos atacados por este insecto se encuentran
comúnmente plantas que pertenecen a las familias Cruciferae, Cucurbitaceae,
Solanaceae, Leguminosae, entre otras (Brown, 1993).
El origen y tiempo de introducción de los primeros individuos de B. tabaci en
América Latina es incierto, aunque pudo haber sido introducida de África o Asia,
durante la esclavitud y comercio que tuvo lugar en la época colonial (siglo XVI-
XIX) entre las colonias españolas y portuguesas de América Latina, Asia (India), y
África Occidental (Morales, 2010). Actualmente, B. tabaci es considerada como un
complejo de especies o de biotipos, exhibiendo una variedad de comportamientos
con respecto a la preferencia de hospederos, fecundidad, adaptación y eficiencia
de transmisión de Begomovirus (De Barro et al., 2005; Perring, 2001, Pickergill,
35
1977), diferenciándose en 6 biotipos, donde el B es el más importante en América
latina (Morales et al., 2006), la cual es originaria del Viejo Mundo. En 1986
apareció en las Américas en el estado de Florida (USA) y en 1989 se reportó
como transmisor de un Geminivirus que luego fue identificado como Virus del
moteado del tomate (Tomato mottle virus - ToMoV).
El biotipo B, posee un rango más amplio de plantas hospedantes (Brown et al.,
1995), una fecundidad mayor que la raza A (Bethke et al., 1991) y además induce
desórdenes fisiológicos (McAuslane et al., 2004). Los virus más numerosos
transmitidos por B. tabaci son los Begomovirus, los cuales causan pérdidas entre
el 20 y el 100% en los cultivos afectados. Después de la adquisición por las
moscas blancas, los Begomovirus son persistentes y son retenidos por períodos
en un rango de unas pocas semanas a toda la vida (Jones, 2003). Uno de los
factores que ha incidido en el desarrollo de mayores poblaciones y diseminaciones
de moscas blancas en regiones agrícolas de América latina, es la diversificación
de los cultivos, lo cual proporciona una mayor disponibilidad de hospederos para
estas plagas, y contribuyen con un aumento notable en el uso de agroquímicos.
Adicionalmente, los cambios climáticos (sequías y calentamiento) y un mayor
intercambio internacional de material vegetal (Morales et al., 2006).
4.4 Estrategias para controlar Begomovirus.
4.4.1 Control químico.
Los insecticidas son la primera línea de defensa de los agricultores contra la
mosca blanca y los virus transmitidos por estos insectos. La mayoría de ellos
utilizan insecticidas de contacto de bajo costo y alta toxicidad aplicados de manera
preventiva por calendario, o cuando se nota la presencia del insecto, en un intento
por mejorar el problema de virus (Morales et al., 2006).
36
Los insecticidas de contacto reducen las poblaciones de adultos de mosca blanca
pero no afectan los huevos o estados inmaduros; esto hace que las poblaciones
de adultos se recupere en pocos días y la incidencia de virus aumente
progresivamente. Esto lleva a los agricultores a aplicar con mayor frecuencia,
inclusive diariamente, creando las condiciones necesarias para la aparición de
poblaciones de mosca blanca resistente a insecticidas y el aumento en la
contaminación ambiental (Morales, 2001; Morales et al., 2006). Las moscas
blancas ya han desarrollado resistencia a los insecticidas tradicionales
organofosforados, carbamatos y piretroides de contacto y de acción sistémica que
se han venido utilizando desde hace algunas décadas (Markham et al., 1994;
Morales et al., 2006).
4.4.2 Control biológico.
El control biológico de mosca blanca se ha realizado por:
o Depredadores de los géneros Coleóptera, Díptera, Neuróptera, Hemíptera
y Thysanóptera.
o Parasitóides del orden Himenóptera, entre los que se destacan avispas de
los géneros Amitus, Encarsia, Eretmocerus.
Sin embargo, tanto para los depredadores y los parasitoides, el uso
intensivo de insecticidas para el control de esta plaga hace que estos
organismos benéficos no sean efectivos.
o Hongos entomopatógenos pertenecientes a los géneros Beauveria,
Paecilomyces y Lecanicillium (sin. Verticillium). Estos organismos son muy
efectivos en condiciones experimentales, pero a menudo fallan en el tiempo
debido a la falta de humedad en los períodos secos, cuando las
poblaciones de mosca blanca alcanzan un máximo (Morales et al., 2006).
37
4.2.3 Control cultural.
Existen diferentes practicas de control cultural para disminuir el acceso de la
mosca blanca a los cultivos susceptibles, entre éstas se encuentran: Manejo de
época de siembra, rotación de cultivos, siembra de barreras vivas y cultivos
asociados, establecimientos de cultivos trampa o repelentes, uso de trampas
amarillas pegajosas, hacer un buen manejo del agua, protección física de
semilleros, protección física de los cultivos con tela sintética o túneles contra
insectos, películas plásticas que absorben luz ultravioleta, aunque este método
puede llegar a representar de un 15 a un 20% en los costos de producción
(Morales et al., 2006) y en algunos casos puede causar problemas de sombra,
sobrecalentamiento y mala ventilación (Freitas et al., 2002). También es
conveniente realizar un muy buen manejo de las malezas, las cuales pueden
servir de reservorio de mosca blanca y de virus (Otavo, 2011).
Adicionalmente, se puede realizar una erradicación inmediata de las plantas
individuales infectadas, esto con el fin de retrasar la propagación del virus y la
dispersión de la mosca blanca a otras plantas. Así mismo, se deben destruir las
plantas después de su última cosecha, ya que la enfermedad y su vector
continuarán desarrollándose en las plantas infectadas después que la cosecha ha
sido abandonada (Polston & Anderson, 1997).
Los métodos de control anteriormente mencionados para el control de
Begomovirus al parecer no son eficientes en cultivos de tomate a gran escala,
donde haya una alta incidencia de mosca blanca virulíferas (Zakay et al., 1991,
Polston & Anderson, 1997) a menos que sean utilizados en combinación con
materiales resistentes (Laterrot, 1999; Polston & Anderson, 1997).
38
4.2.4 Resistencia.
Los programas de mejoramiento para la producción de cultivares de tomate
resistentes a Geminivirus transmitidos por mosca blanca dieron inicio a finales de
los años 60's en Israel. Estos fueron dirigidos contra el Geminivirus del hemisferio
oriental TYLCV, el cual causa hasta un 100% de pérdidas. Debido a que no se ha
encontrado ninguna fuente de resistencia en la especie cultivada de tomate L.
esculentum (ahora llamado S. lycopersicum), todos estos programas se basan en
la introgresión de la resistencia de alguna de las especies silvestres de tomate
(Mejía, 1999).
Las especies silvestres de tomate han sido usadas desde 1940 como fuentes de
resistencia a enfermedades (Laterrot, 1999; Simmonds, 1986; Vallejo, 1999) y la
importancia de este tipo de búsquedas es simplificar el número de programas de
mejoramiento orientados hacia el desarrollo de líneas a través de la recuperación
de especies silvestres de tomate que se han establecido en diferentes partes del
mundo (Rampersad & Umaharan, 2003).
Desde entonces se han identificado muchas fuentes de resistencia a Geminivirus
(Friedmann et al., 1998; Giordano et al., 1999; Giordano et al., 1996; Kasrawi,
1989; Lapidot et al., 1997; Lapidot et al., 2001; Lapidot & Polston, 2006;
Muniyappa et al., 1991; Pilowsky et al., 1990; Zakay et al., 1991). En un estudio
realizado por Piven et al., (1995) realizado en condiciones de campo e invernadero
identificaron a las especies L. Chilense accesión LA 1963, L. hirsutum accesión LA
1353 y L. peruvianum var. glandulosum accesión LA1292 como tolerantes o con
altos grados de resistencia al Begomovirus PYMV, aislado en Venezuela. Así
mismo, se ha encontrado resistencia al PYMV - Trinidad y Tobago en las especies
L. hirsutum, L. peruvianum, y L. pimpinellifolium, en las líneas E790-1 (fuente de
resistencia LA 1968), EII 794-9 (fuente de resistencia LA-2779), y E 854-8 (fuente
de resistencia LA 1932), al igual que en las variedades de tomate F1 Fiona y F1
39
Tyking (Rampersad & Umaharan, 2003), presentado diferentes niveles de
resistencia en varios begomovirus de Cuba, Costa Rica, Martinica e Israel
(Langlais, 1995; Lapidot et al., 1997; Saborio et al. 1995). Infante y colaboradores
(1996) también encontraron como fuentes de resistencia al virus ToYMV en
especies de la familia Solanaceae: Lycium barbarum y S. lycopersicoides.
Adicionalmente de la resistencia presente en algunas especies silvestres de
tomate a Begomovirus en forma directa, también se ha reportado la resistencia a
B. tabaci (Baldin et al., 2005; Fancelli et al., 2003; Morales, 2001).
En Colombia hay un único trabajo relacionado con la búsqueda de resistencia a
Begomovirus. Martínez et al., (2008), realizó un trabajo donde caracterizó
parcialmente a un Begomovirus, cuyo nombre propuesto fue ToYMV, presente en
un cultivo de tomate en Rozo, Valle del Cauca, donde evaluó las líneas FLA 496-
11-6-1-0, FLA 478-6-3-1-11, y FLA 653-3-1-0, las cuales presentaron un buen
comportamiento agronómico y niveles de resistencia a este virus de un 70%.
Previamente, estas líneas habían sido seleccionadas en el año 2004 por su
resistencia a Begomovirus, en evaluaciones realizadas en el Salvador, México y
Yucatán (Pérez & Hanson, 2004). Pero a la fecha no se tienen reportes de
trabajos relacionados con búsqueda de resistencia a Begomovirus endémicos de
Colombia en tomate silvestre.
4.5 Métodos de inoculación de Geminivirus
Para esta búsqueda de fuentes de resistencia a Begomovirus, actualmente se
realizan diferentes métodos de inoculación de acuerdo a la combinación de virus-
hospedero (Ascencio & Settlage, 2007). Dentro de los métodos de inoculación de
virus se encuentran: la transmisión directa del insecto vector, el mecánico
(abrasivo), la agroinoculación, por injerto y biobalística (Ascencio & Settlage,
40
2007). Con el primer método, la transmisión directa del insecto vector, para que
haya un éxito en la inoculación se requiere un gran número de moscas blancas B.
tabaci biotipo B virulentas (Briddon et al., 1998, Ariyo et al., 2006). El uso de este
insecto en inoculación de virus requiere de varios detalles técnicos. En estudios
realizados por Czosnek et al., (2002), proponen algunas características
importantes que para que la inoculación sea efectiva: hembras de B. tabaci de una
a dos semanas desde eclosión y poblaciones sincronizadas de insectos del mismo
sexo. Asimismo, requiere de destreza, un sistema de contención para las moscas
(Ascencio & Settlage, 2007) y no permite el almacenamiento por largo tiempo del
cultivo de virus o la manipulación previa del DNA viral para las inoculaciones
(Guenoune et al., 2010; Lapidot et al., 2007), igualmente se dificulta una presión
de inoculación uniforme (Lapidot et al., 2007). Además, las moscas blancas
pueden llegar a ser problemáticas por sus hábitos preferenciales de alimentación
con algunas especies de plantas (Ariyo et al., 2005, Ascencio & Settlage, 2007),
es decir, que existe una incompatibilidad entre vectores y el tipo de las plantas
usadas (Berrie et al., 2001). En el método mecánico o abrasivo se tiene la dificulta
de que todos los virus pueden ser transmitidos mecánicamente; mientras que
otros virus pueden ser inoculados mecánicamente con baja eficiencia (Guenoune
et al., 2010; Stanley et al., 1986). Para emplear el método de agroinoculación, se
requiere la clonación del virus en un vector (plasmido) de Agrobacterium
tumefaciens antes de ser inoculado experimentalmente (Grimsley & Bisaro, 1987);
pero como éste es un fitopatógeno, puede contribuir a efectos fondo independiente
de la infección por el geminivirus (Ascencio & Settlage, 2007) y se ha encontrado
dificultad en la infección con algunos hospederos con este método (Buragohain et
al., 1994; Sung & Coutts, 1995); La transmisión por injerto requiere la presencia de
plantas infectadas vivas y no todas las plantas son fácilmente injertadas
(Guenoune et al. 2010).
Es por este tipo de inconvenientes que se utilizó la biobalística como herramienta
de inoculación de Begomovirus en tomate. Este es un método en donde partículas
41
de metales pesados biológicamente inertes (oro o tusgteno) son cubiertas con
DNA o RNA, aceleradas hacia un tejido blanco en el cual penetra y una vez allí, el
DNA o RNA que portan estas partículas se inserta directamente en el genoma de
las plantas (Gan, 1989). La biobalística se puede utilizar para evitar la necesidad
de mantener poblaciones virulíferas de insectos vectores, permitiendo la
introducción directa de los ácidos nucleicos de la infección viral dentro de un rango
de especies de plantas (Hoffmann et al., 2001) e inocular un gran número de
plantas en muy poco tiempo. Este método de inoculación viral a diferencia de los
otros, ha reportado eficiencias hasta del 100% (Aebig et al., 2005), ha sido
utilizada con éxito no sólo para inocular Begomovirus (Ariyo et al., 2006;
Hernández et al., 2001, Morilla et al,. 2005), sino también Potyvirus (Gal et al.,
1995; Gal et al.,1997), Luteovirus (Yamagishi et al., 2006), Nepovirus (Valat et al.,
2003), Cucumovirus (Aebig et al., 2005), Polerovirus (Hoffmann et al., 2001), entre
otros.
42
5. METODOLOGÍA
5.1 ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES IDEALES DE INOCULACIÓN
MECÁNICA (BIOBALÍSTICA) DEL BEGOMOVIRUS PYMV-COL EN PLANTAS
DE TOMATE COMERCIAL VARIEDAD SANTA CLARA Y DE TABACO.
Estos ensayos fueron desarrollados en los laboratorios de Fitopatología,
Microbiología Vegetal, Biología molecular y en las instalaciones del invernadero de
la Universidad Nacional de Colombia – Sede Palmira, departamento del Valle del
Cauca.
5.1.1 Multiplicación del Begomovirus PYMV-Col.
Se utilizaron los genomas virales completos del begomovirus bipartita PYMV-Col
desarrollados por Betancur (2012). Cada componente del Begomovirus (DNA A y
DNA B) fue clonado en el vector pUC19 y transformado en la bacteria Escherichia
coli, obteniéndose dos clonas: pBE-pal36 y pAH-pal18. Estos plásmidos fueron
multiplicados y purificados de E. coli utilizando el protocolo
de Birboin & Dolly (1979) y el Plasmid Midi Kit (Qiagen ®).
5.1.2 Preparación de microcarriers y cartuchos con DNA begomoviral.
La preparación de los microcarriers y cartuchos se realizó siguiendo las
instrucciones de la pistola Helios Gene Gun System (BioRad, Hercules, CA, USA),
con algunas modificaciones. Se pesaron 10 mg de microcarriers de oro (0.6 ó 1.6
µm, Biorad®), los cuales fueron depositados en un tubo eppendorf, al cual se le
adicionó 100 µl de espermidina 0.05M (Biorad®). Luego se adicionó el 100 µl de
DNA plasmídico y se homogenizó por medio de vortex. A esta mezcla se le
43
adicionó 100 ul de Cloruro de Calcio 1M en gotas lentamente haciendo vortex,
luego se sonicó. La mezcla se dejó a temperatura ambiente por 10 minutos. Se
centrifugó durante 10 segundos, para remover el sobrenadante, y lavar el pellet
con 1 ml de etanol al 100% (se sonicó 3 veces). Este paso de centrifugación y
lavado se repitió dos veces más. Finalmente, el pellet se resuspendió en 3 ml de
polivinil pirrolidona PVP (Biorad®) de 0.05 mg/ml disuelto en alcohol (99%) y se
almacenó a -20°C.
Para la preparación de los cartuchos, se insertó 75 cm de tubo Tefzel (Biorad®) en
la Tubing Prep Station (Biorad®), al cual se le extrajo la humedad pasando
nitrógeno por 30 minutos. El tubo se retiró para llenarlo con la solución de DNA
microcarriers (la cual se sonicó para agitar muy bien la suspensión) con una
jeringa de 10 ml. El tubo Tefzel se colocó nuevamente en la estación de
preparación de cartuchos, dejándolo reposar por 5 minutos, luego se removió el
etanol muy uniformemente a una velocidad de 4-5 ml/min. Se desconectó la
jeringa y se giró inmediatamente el tubo en una posición de 90° por 2 segundos
encendiendo el interruptor de la Tubing Prep Station (Biorad®), luego 180° por 2
segundos, 90° por 2 segundos y 5 segundos rotándolo completamente. El tubo
rotó durante 5 minutos más, pasando nitrógeno para secarlo. Terminado el
proceso se cortó el tubo a una medida uniforme. Los cartuchos se almacenaron a
4°C con desecante antes de la inoculación.
5.1.3 Inoculación de PYMV-Col por biobalística.
Para la inoculación de los cartuchos con DNA viral se utilizaron plantas de tomate
variedad Santa Clara susceptible a virus, de 30 a 45 días desde el momento de
siembra (dds) y tabaco Nicotiana tabacum var. xanthi y N. benthamiana de 40 a
55 días dds.
44
Por cada ensayo de inoculación, plantas de tabaco y tomate fueron bombardeadas
utilizando la pistola Helios Gene Gun System (BioRad ®) siguiendo las
instrucciones del fabricante con algunas modificaciones (ver estandarización de
parámetros). Luego del bombardeo, las plantas fueron llevadas a unas jaulas
cubiertas con malla antitrips, para evitar el ingreso de insectos, en especial del
vector biológico B. tabaci y también se realizaron aplicaciones de insecticidas
Engeo® (Tiametoxam) 247 SC y Confidor® (Imidacloprid) 350 SC (1 cc/l)
alternándolos para evitar el daño causado por estas moscas. Se realizó un
monitoreo diario para evaluar el porcentaje de plantas infectadas (incidencia) y la
expresión de los síntomas en el tiempo.
5.1.4 Estandarización de parámetros de inoculación.
Para estandarizar las condiciones de inoculación se evaluaron varios parámetros,
con el fin de identificar los que resulten en una sintomatología de mosaicos,
clorosis y deformaciones foliares típicas del virus. Los parámetros que no variaron
en los ensayos de inoculación fueron: concentración de espermidina, polivinil
pirrolidona (PVP) y DNA viral por cartucho. La concentración utilizada de
espermidina (0,05 M) fue la recomendada por el fabricante de la pistola génica
Helios Gene Gun System (Biorad®); la concentración de PVP (0,05 mg/ml) se
ajustó de acuerdo a un reporte previo para inocular por biobalística viroide de
RNA (Matousek et al. 2004); y la concentración de DNA viral (1µg DNA por
cartucho) se seleccionó de acuerdo a ensayos previos por biobalística (Vaca-
Vaca, 2003).
Los parámetros evaluados fueron los siguientes:
Presión de helio: 220, 250, 300, 320, 350, 400 y 600 libras por pulgada
cuadrada (psi, Pounds per Square Inch). La pistola génica Helios Gene Gun
System (Biorad®) utiliza helio como gas para disparar las partículas de oro.
45
Distancia de disparo: 0, 1.5, 3, 5, 10 y 15 cm de distancia desde el ápice
de la planta (ddap) al cañón de la pistola.
Tamaños de partícula de oro: 0.6 µm y 1.6 µm de diámetro.
Plantas evaluadas: tomate variedad santa Clara, N. tabacum var. xanthi y
N. benthamiana de 30, 45 y 55 días desde el momento de siembra,
respectivamente.
Cabe mencionar, que el tabaco es susceptible a una gran variedad de agentes
patogénicos, tales como bacterias, oomycetos, hongos y virus, por eso es
ampliamente usado en trabajos de investigación como hospedero (Goodin et al.,
2008) o control positivo interno de inoculación de estos patógenos.
A partir de los resultados obtenidos, se seleccionaron las variables que
presentaron mayor eficiencia para desarrollar nuevos ensayos. Se usó un diseño
de completamente al azar (CAA), donde se inocularon seis plantas de tomate
Santa Clara y de las 2 especies tabaco a 10 cm ddap, con presiones de helio a
220 y 320 psi. Se varió el número de inoculaciones (uno y dos cartuchos con DNA
viral), el tamaño de las partículas de oro fue de 1.6 µm y la edad de la planta de
tomate, N. tabacum var. xanthi y N. benthamiana fue de 30, 45 y 45 días desde el
momento de siembra, respectivamente.
Como paso final de estandarización, se evaluaron cinco plantas de tomate y N.
benthamiana, a las cuales se les realizó dos inoculaciones a 10cm ddap, con una
presión de helio de 320 psi, usando partículas de oro de 0.6 µm.
5.1.5 Detección del Begomovirus en las plantas inoculadas.
Con el fin de determinar la presencia del virus se realizó un ensayo de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando iniciadores (primers) específicos para
46
Begomovirus (Rojas et al,. 1993). Se tomaron hojas jóvenes de plantas inoculadas
y no inoculadas 18 ddi, para realizar una extracción de DNA genómico con la
metodología CTAB descrita por CIMMYT (2006). La identificación del componente
A begomoviral se realizó utilizando los primers PAL1v1978 / PAR1c496, los cuales
amplifican una región de 1,100 pb, utilizando las condiciones reportadas por Rojas
et al. (1993). El equipo que se usó para la amplificación fue un termociclador
ICycler® de BioRad®. Los productos amplificados fueron observados en geles de
agarosa al 1% (p/v) teñidos con bromuro de etidio (10 ng/μl), visualizados en un
transiluminador de luz ultravioleta (Molecular Imager Gel DocXR+ Systems
BIORAD ®) y analizados mediante el uso del software Quantity One – 4.6.5
provisto por el fabricante del equipo.
5.1.6 Incidencia y Severidad de los síntomas.
La incidencia se medió como el porcentaje de plantas infectadas basado en los
síntomas.
La severidad de síntomas se medió usando una escala tomada de Jawdah et al.,
(1999) con algunas modificaciones. La escala de síntomas ajustada fue: 1: no se
observan síntomas, 2: aparición de mosaicos en la hojas y 3: aparición de
amarillamiento en las hojas, hojas deformadas y más pequeñas que las normales.
5.1.7 Análisis estadístico.
Los datos obtenidos se analizaron realizando un análisis de varianza (ANOVA)
utilizando el paquete estadístico SAS, versión 9, 2002.
47
5.2 EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA EN INTRODUCCIONES SILVESTRES
DE TOMATE AL BEGOMOVIRUS PYMV-COL.
Para lograr la identificar posibles fuentes de resistencia al begomovirus PYMV-Col
endémico de Colombia en introducciones de tomate silvestre se realizaron dos
experimentos separados en el tiempo.
5.2.1 ENSAYO PRELIMINAR DE EVALUACIÓN DE RESISTENCIA EN
INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE AL BEGOMOVIRUS PYMV-
COL.
La evaluación preliminar de las introducciones silvestres de tomate fue
desarrollada en el laboratorio de Fitopatología, Microbiología Vegetal y en las
instalaciones del invernadero de la Universidad Nacional de Colombia – Sede
Palmira, departamento del Valle del Cauca.
5.2.1.1 Material Vegetal.
En esta evaluación preliminar se analizaron dos especies de tomate silvestre: S.
habrochaites, compuesta por 10 introducciones y S. pimpinellifolium por una. Las
introducciones de S. habrochaites evaluadas fueron S. habrochaites var.
glabratum PI 134417, PI 134418, PI 126449 (donadas por el Programa de
Investigación de Hortalizas de la Universidad Nacional de Colombia - Sede
Palmira), LA 3864, LA 2864, LA 1233 y LA 0094 (donada M. C. Rick (Centro de
Recursos Genéticos de Tomate-California)); la especie S. pimpinellifolium estuvo
representada por la introducción LA1478, también donada por M. C. Rick. Además
se utilizó la variedad de tomate comercial Santa Clara susceptible a begomovirus
y N. benthamiana como controles internos de inoculación.
48
5.2.1.2 Inoculación.
El experimento se realizó en condiciones de invernadero, bajo el diseño
experimental Completamente al azar (CAA), la unidad experimental se conformó
por una planta con ocho repeticiones. Los tratamientos se describen a
continuación en la Tabla 2.
Tabla 2. Introducciones silvestres de tomate para evaluación preliminar búsqueda
de fuentes de resistencia Begomovirus PYMV-Col.
Número Introducción
1 Solanum habrochaites var. grabatum PI 134417
2 S. habrochaites var. grabatum PI 134418
3 S. habrochaites var. grabatum PI 126449
4 S. habrochaites LA 3864
5 S. habrochaites LA 2864
6 S. habrochaites LA 2103
7 S. habrochaites LA 1777
8 S. habrochaites LA 1378
9 S. habrochaites LA 1223
10 S. habrochaites LA 0094
11 S. pimpinellifolium LA1478
12 Tomate susceptible variedad Santa Clara (control positivo)
13 Tabaco (N. benthamiana)
14 Controles negativos: Cada uno de los materiales evaluados
sin inoculación de virus.
La inoculación de PYMV-Col en las introducciones silvestres de tomate se realizó
empleando el equipo Helios Gene Gun System (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA),
49
con las condiciones previamente estandarizadas: se emplearon plantas de tomate
de 30 dds, dos cartuchos de partículas de oro de 1.6 µm cubiertas con 1ug de
DNA plasmídico viral por planta, a una presión de helio de 320 psi y una distancia
de 10 cm ddap. Nota: Las plantas de tomate de 30 dds, fueron multiplicadas bajo
condiciones de invernadero, cubierto con malla antitrips.
Luego del bombardeo, las plantas fueron llevadas a unas jaulas cubiertas con
malla antitrips, para evitar el ingreso de insectos y se realizaron aplicaciones de
insecticidas Engeo® 247 SC y Confidor® 350 SC (1 cc/l) alternándolos para evitar
el daño causado por estas moscas. Se realizó un monitoreo diario para evaluar el
porcentaje de plantas infectadas (incidencia) y la expresión de los síntomas en el
tiempo.
A partir de este ensayo se seleccionaron las introducciones que presentaron
mejores respuestas de defensa contra el Begomovirus, los cuales fueron
evaluados nuevamente en condiciones de invernadero y campo.
5.2.1 EVALUACIÓN DE INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE
PROMISORIAS EN BÚSQUEDA DE RESISTENCIA AL BEGOMOVIRUS PYMV-
COL.
La evaluación de las introducciones silvestres de tomate se realizó bajo
condiciones de campo e invernadero, en la finca “La esmeralda”, ubicada en el
corregimiento Herradura (Palmira), bajo el diseño de bloques completos al azar
(BCA), conformado por ocho tratamientos, 3 unidades experimentales con 4
repeticiones. Este diseño se realizó por duplicado, para evaluar un ensayo bajo
condiciones de campo y otro bajo condiciones de invernadero.
50
5.2.2.1 Inoculación.
Las condiciones de inoculación fueron similares a las previamente estandarizadas,
con excepción de que se utilizaron plantas de 26 dds.
Luego del bombardeo con el equipo Helios Gene Gun System (Bio-Rad®,
Hercules, CA, USA), un ensayo fue llevado a condiciones de campo y otro a
condiciones de invernadero; este último estaba forrado con malla antitrips para
evitar el ingreso de insectos y se realizaron aplicaciones de insecticidas Hengeo®
247 SC y Confidor® 350 SC (1 cc/l) alternándolos para evitar el daño causado por
estas moscas. Se realizó un monitoreo diario para evaluar el porcentaje de plantas
infectadas (incidencia) y la expresión de los síntomas en el tiempo.
5.2.2.2 Variables a evaluar.
Tanto para el ensayo preliminar como el ensayo de introducciones promisorias se
evaluaron las mismas variables:
5.2.2.2.1 Detección de DNA viral.
Las plantas inoculadas por Biobalística se analizaron con hibridaciones de ácidos
nucleicos, tipo Dot-blot, con el fin de detectar la presencia de partículas virales, a
los 22 y 42 días después de la inoculación (ddi) tiempo en el cual empezaron a
aparecer síntomas virales en las plantas de tomate Santa Clara (control positivo).
Se realizó una extracción de DNA de hojas jóvenes con el protocolo CTAB
descrito por CIMMYT (2006), usando tejido fresco, del cual se depositaron 10 ul de
cada muestra en una membrana de nylon (Hybond N+- Amersham) previamente
marcada. Se incluyó un control positivo y varios controles negativos (DNA de
51
planta no inoculada). El DNA se fijó a la membrana y se hibridó siguiendo las
instrucciones del Kit Amersham Gene Images AlkPhos Direct Labelling and
Detection System. La sonda utilizada para la detección fue un producto de PCR
purificado con el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System de Promega,
donde se amplificó el componente A del virus con los primers PAL1v1978 /
PAR1c496, de una planta previamente inoculada por biobalística en los ensayos
de estandarización de la técnica. El resultado de la hibridación se visualizó en un
transiluminador de luz ultravioleta (Molecular Imager Gel DocXR+ Systems
BIORAD ®) y analizados mediante el uso del software Quantity One – 4.6.5
provisto por el fabricante del equipo.
5.2.2.2.2 Incidencia y severidad de los síntomas.
Se realizaron con las condiciones mencionadas en el ensayo de estandarización
de la técnica de biobalística.
Adicionalmente, se evaluó las respuestas de las introducciones silvestres de
tomate a la inoculación del virus, teniendo en cuanta las siguientes observaciones:
1) Susceptible = Plantas que contienen DNA viral y desarrollo de síntomas de la
enfermedad.
2) Resistentes = Plantas que contienen DNA viral pero sin síntomas.
3) Resistentes = Plantas que presentan síntomas de la enfermedad, pero que no
contienen DNA viral.
4) Resistentes = Plantas que no muestran ninguna presencia de virus y tampoco
síntomas de la enfermedad.
52
5.2.2.2.3 Análisis de las unidades relativas de partículas virales a través del
tiempo.
La cuantificación del DNA viral presente en las introducciones silvestres de tomate
evaluadas se realizó con el software Molecular Imager Gel DocXR+ Systems
BIORAD ®) con el cual se determinó el área de la mancha generada por la
hibridación, tipo dot blot en cada muestra analizada. La resta entre el fondo de la
membrana y la mancha generada por la luminiscencia emitida (intensidad/mm2)
representa las unidades relativas de partículas virales presentes en las muestras.
5.2.2.2.4 Análisis estadístico.
Se realizaron con las condiciones mencionadas en el ensayo de estandarización
de la técnica de biobalística.
53
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES IDEALES DE INOCULACIÓN
MECÁNICA (BIOBALÍSTICA) DEL BEGOMOVIRUS PYMV-COL EN PLANTAS
DE TOMATE COMERCIAL VARIEDAD SANTA CLARA Y DE TABACO.
Teniendo en cuenta la relación virus-hospedero y los diferentes parámetros de
inoculación por biobalística reportados en la literatura hasta el momento, para
diferentes tipos de virus y hospederos, la estandarización de parámetros de
inoculación para tomate variedad Santa clara con el virus PYMV-Col era un
requisito para futuros trabajos de inoculación viral de material vegetal.
Los primeros parámetros que se evaluaron para estandarizar las condiciones de
inoculación con la pistola Helios Gene Gun System (Biorad®), fueron la presión de
helio y la distancia de disparo. Se utilizaron partículas de oro de 0.6 µm cubiertas
de DNA de PYMV-Col que fueron inoculadas en plantas de tomate y N. tabacum
var. xanthi de 45 días y 55 días después de siembra (dds), respectivamente. En
este ensayo se encontró que la inoculación a distancias menores de 5 cm ddap
producía daño mecánico del tejido vegetal inoculado e incluso la muerte de éste
(Figura 1). Presiones de helio mayores de 400 psi ocasionaban la caída de la hoja
inoculada. Por lo anterior, distancias menores de 10 cm y presiones mayores de
400 psi no son recomendables.
En los ensayos preliminares se logró determinar que las inoculaciones efectivas
fueron realizadas a 10 cm y una presión de helio de 220 y 320 psi (Figura 2). En
este caso las plantas inoculadas presentaron síntomas (mosaicos), y luego se
comprobó mediante PCR la presencia del componente A begomoviral.
54
Posteriormente y de acuerdo con los resultados preliminares, se inocularon seis
plantas de tomate, seis de N. benthamiana y seis de N. tabacum var. xanthi de 30,
45 y 45 dds, respectivamente, utilizando uno y dos cartuchos con DNA viral por
planta, a una distancia de 10 cm ddap, partículas de oro de 1.6 µm, con presiones
de helio de 220 y 320 psi. Las plantas de tomate inoculadas con dos cartuchos a
220 y 320 psi mostraron síntomas aproximadamente a los 18 DDI, donde se
empezaron a observar mosaicos; a los 30 DDI se presentaron clorosis y
Figura 1. Daños ocasionados por la inoculación a distancias menores de 1.5 cm, N.
tabacum var. xanthi, a:45 días después de la inoculación (DDI) y b: 63 DDI.
Figura 2. Inoculación de virus a 10cm desde el ápice de la planta (ddap).
55
deformaciones foliares en las plantas de tabaco y tomate, sintomatología que
aumentó a medida que pasaba el tiempo, aunque ésta fue más marcada en
plantas de tomate y N. benthamiana (Figura 3). En plantas de N. tabacum var.
xanthi no ocurrió lo mismo, por este motivo no se utilizó esta especie en
experimentos posteriores.
Las plantas de tomate y N. benthamiana inoculadas con un cartucho a 220 y 320
psi, presentaron mosaicos 25 ddi.
Figura 3 .Plantas de tabaco y tomate con y sin síntomas virales inoculadas con 2
dos cartuchos a 320 psi. Las muestras 1 y 2 corresponden a tomate de la variedad
comercial Santa Clara y la 3 a N. benthamiana. La letra a corresponde a: Plantas
antes de inocular, b. Plantas de 47 DDI. Los controles negativos son plantas que no
se inocularon.
56
Para determinar si la sintomatología observada en las plantas inoculadas
correspondía a una infección por el begomovirus inoculado, 18 ddi se colectaron
hojas jóvenes de plantas inoculadas y no inoculadas, y se les realizó una
extracción de DNA genómico, a partir del cual se hizo una PCR usando los juegos
de iniciadores PAL1v1978 / PAR1c496, donde se amplificó un fragmento del
componente A del begomovirus bipartita PYMV-Col de aproximadamente 1,100
pb, únicamente en las muestras inoculadas (Figura 4). El control negativo que
corresponden a las plantas no inoculadas no amplificó, demostrando que las
condiciones bajo las cuales se realizó el experimento fueron las ideales.
Al comparar las presiones empleadas 220 y 320 psi con el número de cartuchos
por inoculación en las plantas de tomate, se encontró que independientemente de
la presión, las mejores inoculaciones fueron logradas cuando se usaron dos
cartuchos por inoculación, logrando un 100% de plantas infectadas (determinado
Figura 4. Detección del virus en las plantas de tomate inoculadas a una presión de
helio de 220 y 320 psi, con uno y dos disparos, respectivamente. Partículas de oro
de 1.6 µm. M - Marcador de peso molecular 1kb, + es una muestra positiva
conocida.
57
por la detección de ADN viral, por PCR), posiblemente porque llega un mayor
número de partículas infectadas a los tejidos. En tabaco, se obtuvo una eficiencia
de inoculación del 75%.
En las muestras de tomate, no se encontraron diferencias significativas (p <
0.2061) entre el porcentaje de plantas infectadas en los diferentes tratamientos
(Figura 5) y tampoco entre la escala de severidad de los síntomas; sin embargo, la
severidad es mayor cuando la inoculación se realizó a 320 psi, utilizando dos
cartuchos (Figura 6) presentando los síntomas típicos de begomovirus: mosaicos,
clorosis y deformaciones foliares (Figura 3). Además se encontró una correlación
positiva (r=0.95, p<.0001) entre la incidencia y el porcentaje de plantas infectadas;
así como entre nivel los síntomas y los fragmentos amplificados por PCR, a
medida que los síntomas aumentaron, también aumentó la cantidad de partículas
virales amplificadas (PCR-semicuantitativa). Se determinó que los mejores
parámetros de inoculación fueron presión de helio a 320 psi, utilizando dos
cartuchos a 10 cm desde el ápice de la planta.
Figura 5. Porcentaje de plantas de tomate infectadas Vs número de
cartuchos por planta y presión de helio (psi). 1 y 2: Corresponde a 1 y 2
cartucho utilizados. Medias seguidas por la misma letra en las barras no
tienen diferencias significativas con la prueba de Duncan (P ≤ 0,05).
58
Mediante un ensayo posterior y con base en los resultados obtenidos, se tomaron
partículas de oro de 0.6 µm con partícula infecciosas de virus, y se inocularon en
plantas de tomate y N. benthamiana encontrándose un 83.3 y 91% de plantas
infectadas, respectivamente con una escala de síntomas de 2.
La alta eficiencia del método de inoculación por biobalística, se pudo evidenciar en
esta investigación. También ha sido reportado en inoculaciones de varios géneros
de virus en diversos hospederos. Gilbertson et al., (1991), realizaron una
introducción eficiente de ácidos nucleicos de varios aislamientos del Virus del
mosaico dorado del fríjol (Bean golden mosaic virus – BGMV-Begomovirus) en
plantas de fríjol y maíz; así mismo, Gal et al., (1995) pudo bombardear partículas
infectadas con el Virus del mosaico amarillo del calabacín (Zucchini yellow mosaic
virus – ZYMV-Potivirus) en plantas de calabacín, pepino, sandía y melón.
Matousek et al., (2004) utilizó el Viroide tubérculo fusiforme de la papa (Potato
Figura 6. Efecto de las presiones de helio (psi) y el número de cartuchos por
planta sobre la expresión de síntomas en plantas de tomate. 1 y 2: Corresponde a
1 y 2 cartucho utilizados. Medias seguidas por la misma letra en las barras no
tienen diferencias significativas con la prueba de Duncan (P ≤ 0,05).
59
spindle tuber viroid – PSTVd – Pospiviroide) para inocularlo con este método en
plantas de tomate y papa.
La biobalística también ha permitido con éxito la transmisión del Virus del mosaico
del pepino (Cucumber mosaic virus- CMV – Cucumovirus) en plantas de gladiolo
(Aebig et al., 2005). Recientes investigaciones han permitido identificar de
genotipos de yuca resistentes al mosaico de la yuca, causada por el Virus del
mosaico de la yuca africana (African cassava mosaic virus ACMV – Begomovirus),
utilizando la inoculación por biobalística (Ariyo et al., 2006).
La pistola génica Helios Gene Gun System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ha sido
usada comúnmente en sistemas de vacunación de animales y humanos, para
terapia génica y transfección (Matousek et al., 2004), como también en trabajos de
investigación para transformación de plantas e inoculación de virus,
proporcionando amplias posibilidades de transferir genes a tejidos de plantas in
vivo e in vitro, sin ser limitante el tamaño del blanco y el bombardeo no necesita
ser realizado al vacío (Kekarainen & Valkonen- notas técnicas de Biorad).
En este estudio se pudo determinar que es muy importante determinar la distancia
de la inoculación, la presión de helio óptima, el número de cartuchos a utilizar, la
edad del hospedero, y el tamaño de las partículas de oro, porque la variación en
estos parámetros generan diferencias en la infección viral. De acuerdo a los
resultados obtenidos se determinó que para tomate de la variedad comercial
Santa Clara, fueron plantas de aproximadamente 30 dds, inoculadas con dos
cartuchos de partículas de oro de 1.6 µm cubiertas de 1ug de DNA de PYMV-Col
por planta, a una presión de helio de 320 psi y una distancia de 10 cm ddap, lo
que permite que esta especie se pueda utilizar como control interno de inoculación
con este método, para realizar búsquedas de materiales resistentes a este virus.
60
6.2 ENSAYO PRELIMINAR DE EVALUACIÓN DE RESISTENCIA EN
INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE AL BEGOMOVIRUS PYMV-
COL.
Se realizó un ensayo preliminar de inoculación del virus PYMV-Col en las
introducciones silvestres de tomate S. habrochaites PI 134417, PI 134418, PI
126449, LA 3864, LA 2864, LA 2103, LA 1777, 1378, LA 1223, LA 0094 y S.
pimpinellifolium LA1478, con el fin de hacer un escrutinio de estos materiales y
determinar su comportamiento en condiciones de invernadero. La inoculación se
realizó con las condiciones previamente estandarizadas con la pistola génica.
Con evaluaciones realizadas a los 22 y 42 después de inoculación (DDI) se obtuvo
un 100% de plantas infectadas con virus, en tomate Santa Clara y N. benthamiana
(Figura 7 y 8), determinado por la detección de ADN viral, por hibridaciones de
ácidos nucleicos, tipo dot blot. Esta es una de las técnicas más empleadas en los
últimos años para la detección de patógenos, especialmente cuando se procesa
un gran número de muestras; es rápida, económico, sensible y específica (Rangel
et al., 2009).
Tabaco y tomate Santa Clara también presentaron un 100% de incidencia
(porcentaje de plantas infectadas basado en los síntomas), con una severidad de
la enfermedad en promedio de 2.5 y 2 para Santa Clara y tabaco,
respectivamente, comprobando que las inoculaciones fueron efectivas. En los
controles negativos PNI (plantas no inoculadas) no hubo replicación viral,
demostrando que las condiciones bajo las cuales se realizó el experimento fueron
las ideales (Figura 7 y 8).
Sin embargo, en las introducciones silvestres de tomate evaluadas aunque
también presentaron un 100% de plantas infectadas con virus, la incidencia fue del
cero %, con una severidad de 1, es decir que fueron asintomáticas, lo que puede
61
asociarse a un mecanismo de resistencia de la planta, a la expresión de síntomas
a pesar de la existencia de un título alto del virus (Van Den Boschet al., 2006;
Lecoq et al., 1982; Gray et al., 1986). Sin embargo, este tipo de resistencia debe
ser manejado con cuidado ya que estas introducciones también se convertirían en
una buena fuente de inoculo en el campo.
En la hibridación de ácidos nucleicos hecha 22 y 42 DDI (Figuras 7 y 8), se
encontró que en las introducciones de S. habrochaites LA 1378, PI 126449 y LA
2864 incrementaban o se mantenían las unidades relativas de partículas virales a
los 42 DDI (Figura 8), respecto a la cantidad encontrada a los 30 DDI (Figura 7) y
en las introducciones LA 2103, PI 134417, LA 1777, PI 134418, LA 0094 y S.
pimpinellifolium LA1478 disminuía (Figura 8). Las unidades relativas de partículas
virales fueron medidas con el software Molecular Imager Gel DocXR+ Systems
BIORAD (Datos no mostrados).
62
Figura 7. Detección de DNA viral por hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot
blot (manchas oscuras) en introducciones de tomate, bajo condiciones de
invernadero, 22 DDI. T: (Control negativo PNI (Plantas no inoculadas)) –
(plásmido pUC 19), + (Producto de PCR de donde se realizó la sonda). Cada
una de las líneas de colores agrupa las repeticiones de las introducciones de
tomate evaluadas.
63
Figura 8. Detección de DNA viral por hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot blot
(manchas oscuras) en introducciones de tomate, bajo condiciones de invernadero, 42
DDI. T: (Control negativo PNI (Plantas no inoculadas)) – (plásmido pUC 19), + (Producto
de PCR de donde se realizó la sonda). Cada una de las líneas de colores agrupa las
repeticiones de las introducciones de tomate evaluadas.
64
Con este ensayo preliminar, se seleccionaron las introducciones S. habrochaites
LA 2103, PI 134417, LA 1777, PI 134418, y LA 0094, como también la
introducción S. pimpinellifolium LA1478, las cuales presentaron una disminución
de las unidades relativas de partículas virales a través del tiempo, el cual puede
estar asociado a un mecanismo de defensa de la planta, conocido como
Silenciamiento génico, presente en la mayoría de los organismos eucariotas y
participa en la defensa contra virus y viroides (Baulcombe, 2004) desempeñando
un papel decisivo en la diferenciación celular, en la regulación del desarrollo y en
la defensa contra genes foráneos y elementos transponibles (Croce & Calin,
2005).
En posteriores ensayos, se aumentó el número de plantas de las introducciones
silvestres de tomate a evaluar, ya que estas introducciones son poblaciones
heterogéneas, con el fin de aumentar la probabilidad de encontrar plantas sin
replicación viral.
6.3 EVALUACIÓN DE INTRODUCCIONES SILVESTRES DE TOMATE
PROMISORIAS EN BÚSQUEDA DE RESISTENCIA AL BEGOMOVIRUS PYMV-
COL.
Las introducciones silvestres de tomate S. habrochaites LA 2103, PI 134417, LA
1777, PI 134418, LA 0094 y S. pimpinellifolium LA1478, se evaluaron en
condiciones de campo (Figura 9) e invernadero (Figura 10), para determinar su
comportamiento en ambas condiciones, bajo un diseño de bloques completos al
azar (BCA), conformado por ocho tratamientos , 3 unidades experimentales con 4
repeticiones.
65
A los 30 y 50 DDI se hizo una evaluación de síntomas presentados en cada uno
de los tratamientos y posteriormente una colecta de hojas jóvenes de plantas
inoculadas y no inoculadas, tanto en campo como invernadero, para realizar la
detección viral, por medio de hibridaciones de ácidos nucleicos, tipo dot blot. En
ambas condiciones se evaluaron 24 plantas por cada introducción (12 inoculadas
y 12 sin inocular), Sin embargo, para un mejor análisis se muestran 10 de las 24
plantas (5 inoculadas y 5 sin inocular, figura 11).
Figura 9 Establecimiento del ensayo experimental en campo 33 DDI, en un
lote vecino de tomate Cherry.
Figura 10. .Panorama del ensayo experimental en invernadero, 33 DDI.
66
Figura 11. Detección de DNA viral por hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot blot
(manchas oscuras) en introducciones de tomate, bajo condiciones de invernadero. A:
30 DDI y B: 50 DDI. T* (Control negativo PNI (plantas no inoculadas)) – (plásmido
pUC 19), + (Producto de PCR de donde se realizó la sonda). Flechas azules (plantas
donde no hubo replicación viral), flechas zapotes (plantas en donde disminuyeron las
unidades relativas de partículas virales a los 50 DDI hasta llegar a cero).
67
En condiciones de invernadero, se encontró que las introducciones silvestres de
tomate no presentaron síntomas virales en ninguno de los tiempo evaluados, con
una incidencia del cero (0) % (Tabla 3) y una severidad promedio de síntomas de
1 (Tabla 3, Figura 12).
Tabla 3. Respuestas de las introducciones de tomate inoculadas con el virus
PYMV-Col, en condiciones de invernadero a través del tiempo.
Genotipo 2
30 DDI 50 DDI
Incidencia 3
% Plantas
infectadas
por virus 4
Severidad 5 Incidencia
% Plantas
infectadas
por virus
Severidad
LA1478 0 58 1 0 58 1
Controles negativos1 0 0 1 0 0 1
LA 0094 0 75 1 0 75 1
Controles negativos 0 0 1 0 0 1
PI 134418 0 75 1 0 67 1
Controles negativos 0 0 1 0 0 1
PI 134417 0 58 1 0 75 1
Controles negativos 0 0 1 0 0 1
LA 2103 0 75 1 0 42 1
Controles negativos 0 0 1 0 0 1
LA 3864 0 58 1 0 75 1
Controles negativos 0 0 1 0 0 1
LA 1777 0 33 1 0 50 1
Controles negativos 0 0 1 0 0 1
Variedad Santa Clara 100 100 2,2 100 100 2,4
Controles negativos 0 0 1 0 0 1
1 NPI (Plantas no inoculadas)
2 El número de plantas evaluadas fue 12
68
3 Porcentaje de plantas infectadas basado en los síntomas
4 Basado en la hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot blot.
5 Valores promedio según la escala de evaluación.
La variedad de tomate Santa Clara (susceptible a virus) tuvo una incidencia del
100 %, alcanzando a los 50 DDI una severidad promedio de 2.4 (Tabla 1, Figura
12).
El análisis de varianza mostró que hay diferencias altamente significativas en la
severidad de síntomas (p <.0001) en las evaluaciones hechas 30 y 50 DDI; con la
prueba de medias hecha con Duncan se determinó que hay diferencias entre la
variedad de tomate Santa Clara y las introducciones silvestres de tomate, pero no
la hay entre éstas.
Figura 12. Escala de severidad de síntomas en introducciones de tomate
evaluadas, en condiciones de invernadero 30 y 50 DDI. ** Diferencia estadística
altamente significativa al 1% de probabilidad. Medias seguidas por la misma
letra en las barras no tienen diferencias significativas.
69
La detección del virus se realizó con la hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot
blot, la cual permitió la cuantificación de las unidades relativas de partículas
virales presentes en las muestras y determinar el comportamiento de las
introducciones silvestres de tomate ante la presencia del virus. En las
introducciones silvestres de tomate se observó un comportamiento similar al
ensayo preliminar, en el cual en algunas introducciones incrementaba o disminuía
(en algunos casos llegaba a cero (Figura 11, flechas zapotes) las unidades
relativas de partículas virales a través del tiempo. En Santa Clara aumentó las
unidades relativas de partículas virales (Figura 11, recuadro verde, Figura 13) a
los 50 DDI. En promedio, en las introducciones LA 1478, PI 134417, PI 134418,
LA 3864 aumentó, y en las introducciones LA 0094, LA 2103 y LA 1777 disminuyó
las unidades relativas de partículas virales (Figura 13). Sin embargo, con la prueba
de medias realizada con Duncan, no se encontraron diferencias significativas en
las unidades relativas de partículas virales entre las introducciones silvestres en
las evaluaciones hechas a los 30 y a los 50 DDI.
Igualmente, en esta evaluación se encontraron plantas dentro de cada una de las
introducciones silvestres de tomate donde no hubo replicación viral en ninguno de
los tiempos de evaluación (Figura 11, flechas azules). Resultados encontrados por
Zakay y colaboradores (1991), en donde evaluaron la resistencia de varios
genotipos de tomate silvestre al TYLCV en cámara de crecimiento, usando
inoculación con mosca blanca, también encontraron gran variabilidad en la
presencia de virus de varias introducciones silvestres de tomate. En la
introducción 1777 no se presentó sintomatología viral y solo en una de cinco
plantas evaluadas se detectó virus.
70
El porcentaje de plantas infectadas por virus fue determinado por la detección de
ADN viral, por la técnica dot blot. Este porcentaje de infección presentó diferentes
comportamientos en el tiempo: en las introducciones PI 134418 y LA 2103 el
porcentaje de plantas infectadas disminuyó de 75, a 67 y 50 % respectivamente.
Según Van Den Bosch y colaboradores (2006) puede existir una resistencia, en la
cual se reduce el título del virus (restringe la multiplicación), donde la acumulación
del virus es muy baja y no se desarrollan síntomas.
En las introducciones PI 134417, LA 3864 y LA 1777 aumentó el porcentaje de
plantas infectadas de 58, 58 y 33% a 75,75 y 50% ,respectivamente; y en LA 1478
y LA 0094 se mantuvo con un 58 y 75%, respectivamente. La variedad de tomate
Santa Clara alcanzó un porcentaje de 100% de infección desde los 30 DDI (Figura
Figura 13. Unidades relativas de partículas virales en las introducciones de
tomate evaluadas, en condiciones de invernadero 30 y 50 DDI. ** Diferencia
estadística altamente significativa al 1% de probabilidad, * Diferencia estadística
significativa al 5% de probabilidad. Medias seguidas por la misma letra en las
barras no tienen diferencias significativas.
71
14), demostrando su nivel de susceptibilidad, garantizando la eficiencia de la
técnica de la inoculación e indicando que el nivel de inóculo fue uniformemente en
el ensayo.
El análisis de varianza mostró diferencias significativas (p <0.0027) en el
porcentaje de plantas infectadas entre las introducciones evaluadas en 30 y 50
ddi, pero no hubo diferencias significativas (p <0.7463) entre estos dos tiempos de
evaluación.
Al analizar la detección viral, la correlación general entre el porcentaje de plantas
infectadas donde se detectó el DNA viral con la técnica de dot blot, con la
incidencia (porcentaje de plantas con síntomas) fue altamente significativa (p
<.0001) para solo para la variedad de tomate Santa Clara, explicada desde un
100%, pero no hubo correlación alguna en las introducciones silvestres de tomate.
Figura 14. Porcentaje de plantas infectadas por virus, con base en la
detección por dot blot en las introducciones de tomate evaluadas, en
condiciones de invernadero 30 y 50 DDI. * Diferencia estadística significativa
al 5% de probabilidad. Medias seguidas por la misma letra en las barras no
tienen diferencias significativas.
72
En contraste a lo encontrado en el ensayo en condiciones de invernadero, en
campo en las introducciones silvestres de tomate presentaron síntomas virales
con una incidencia entre 25 y 50% a los 30 DDI, las cuales incrementaron a los 50
DDI entre 42 y 100%. La variedad Santa Clara también presentó una incidencia
del 100%, siendo constante en los dos tiempos evaluados (Tabla 4).
Adicionalmente, los controles negativos PNI también presentaron síntomas entre
17 y 75% de incidencia a los 30 DDI, e incrementó a los 50 DDI entre 25 y 100%.
Estas expresiones de síntomas pudo ser debido a daños directos causados por
insectos chupadores, los cuales además de succionar la savia, introducen toxinas
en la planta que producen síntomas semejantes a las infecciones víricas. Dentro
de estos insectos se encuentra la mosca blanca, la cual produce daños directos
cuando se alimenta de los nutrientes de la planta y desórdenes fisiológicos,
causados por el biotipo B (Byrne et al. 1990; Perring 2001).
73
Tabla 4. Respuestas de las introducciones de tomate inoculadas con el virus
PYMV-Col, en condiciones de campo a través del tiempo.
Genotipo 2
30 DDI 50 DDI
Incidencia
3
% Plantas
infectadas
por virus 4
Severidad Incidencia
3
% Plantas
infectadas
por virus 4
Severidad
LA1478 50 83 1,5 100 75 2,6
Controles negativos1 75 83 1,8 100 50 2,5
LA 0094 25 67 1,2 50 58 1,5
Controles negativos 25 58 1,2 67 100 1,7
PI 134418 25 67 1,2 42 67 1,4
Controles negativos 42 83 1,4 58 83 1,6
PI 134417 25 75 1,2 42 83 1,4
Controles negativos 17 67 1,2 25 58 1,2
LA 2103 33 83 1,3 92 83 2
Controles negativos 17 83 1,2 17 83 1,2
LA 3864 42 92 1,4 75 67 1,7
Controles negativos 17 83 1,2 67 67 1,7
LA 1777 50 83 1,4 75 75 1,7
Controles negativos 17 75 1,2 50 67 1,5
Variedad Santa Clara 100 100 2,2 100 100 3
Controles negativos 100 100 2,1 100 100 2,5
1 NPI (Plantas no inoculadas)
2 El número de plantas evaluadas fue 12
3 Porcentaje de plantas infectadas basado en los síntomas
4 Basado en la hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot blot.
5 Valores promedio según la escala de evaluación.
74
A B C
El ensayo en condiciones de campo fue realizado en un lote vecino donde se
cultivaba tomate Cherry, en el cual se observó una sintomatología de infección por
Begomovirus. Mediante pruebas de detección (dot blot) se determinó la presencia
del virus PYMV-Col en este cultivo. Es posible que el tomate Cherry haya sido una
fuente adicional de infección para el ensayo de campo, aún más cuando se
observó presencia de mosca blanca, no solo en este cultivo, sino también en las
introducciones silvestres de tomate. (Figura 15).
En cuanto a la severidad de los síntomas, con la prueba de medias realizada por
Duncan a los 30 DDI, no se encontraron diferencias significativas entre las
introducciones silvestres de tomate; pero si se presentaron a los 50 DDI,
manifestando un comportamiento diferencial en las introducciones silvestres de
tomate evaluadas. La variedad de tomate Santa Clara, fue la que presentó una
sintomatología más acentuada, con clorosis y deformaciones foliares, alcanzando
una severidad de 3 (Figura 18, Figura 16). Los controles negativos PNI, también
presentaron escalas de severidad de síntomas que van desde 1.2 a 2.5.
En la introducción LA1478, se observó que todas las plantas evaluadas
presentaron síntomas virales, con un escala de severidad de 2.6 (Figura 18),
Figura 15. Ensayo en condiciones de campo. Plantas de tomate con
presencia de mosca blanca. A: Tomate Cherry, B: LA 3864 y C: Santa Clara.
75
presentando clorosis y deformaciones foliares (Figura 17); la introducción LA
2103, tuvo una incidencia del 92% con una severidad 2. Finalmente, las
introducciones LA 3864 y LA 1777 presentaron una incidencia del 75%, pero una
severidad de tan solo 1.7, y las introducciones LA 0094, PI 134418 y PI 134417,
manifestaron una incidencia menor del 50%, con valores de severidad entre 1.4 y
1.5 (Figura 18), encontrándose dentro de estas introducciones plantas
asintomáticas.
Figura 16. Tomate variedad comercial Santa Clara. A: 30 DDI, B:
50 DDI, C: NPI (planta sin inocular), en condiciones de campo.
Figura 17. Introducción S. pimpinellifolium LA1478, A: 30 DDI, B: 50
DDI, C: NPI (planta sin inocular), en condiciones de campo.
76
Respecto a la detección viral en campo, hubo un comportamiento similar al
ensayo de invernadero, en donde las unidades relativas de partículas virales en
algunas introducciones silvestres de tomate incrementó y en otras disminuyó, a
través del tiempo (Figura 19 y Figura 20).Sin embargo con la prueba de medias
hecha por Duncan no se encontraron diferencias entre las introducciones
silvestres de tomate en las unidades relativas de partículas virales a los 30 DDI y a
los 50 DDI (Figura 20). Sin embargo, el análisis de varianza mostró diferencias
altamente significativas (p <.0001) en esta variable entre campo e invernadero,
presentándose mayores unidades relativas de partículas virales condiciones de
campo, en los dos tiempos evaluados, tanto para las introducciones silvestres de
tomate, como también para la variedad de tomate Santa Clara (Figura 19,
Figura 18. Severidad de la expresión de síntomas en las introducciones de tomate
evaluadas, en condiciones de campo 30 y 50 DDI. ** Diferencia estadística
altamente significativa al 1% de probabilidad. Medias seguidas por la misma letra
en las barras no tienen diferencias significativas.
77
recuadro verde y Figura 20), alcanzando al final de la evaluación valores por
encima de 60.000 unidades relativas de partículas virales, hasta un tope máximo
alcanzado por Santa Clara de aproximadamente 250.000 (Figura 20).
Por otra parte, en algunos de los controles PNI en cada una de las introducciones
evaluadas no solo presentaron sintomatología propia de la enfermedad, sino
también replicación viral (Figura 19, flechas rojas), lo que corrobora la presencia
de B. tabaci en este ensayo, la cual pudo haber influido en la expresión, severidad
y transmisión adicional del Begomovirus PYMV-Col en las introducciones
silvestres de tomate evaluadas bajo estas condiciones de campo. Esta Mosca no
solo produce problemas fisiológicos, también causa daños indirectos como la
excreción de melaza donde crecen hongos, además de tener la habilidad de
transmitir virus (Byrne et al. 1990; Perring 2001), reconocidos en los géneros
Begomovirus (Geminiviridae), Crinivirus (Closteroviridae), Carlavirus ó Ipomovirus
(Potyviridae) (Jones, 2003). En observaciones hechas al microscopio también se
determinó la presencia de mosca blanca Trialeurodes spp., la cual también
produce daños fisiológicos y transmite virus del género Crinivirus y Closterovirus
(Jones, 2003).
Con lo anterior, no se descarta la posibilidad de infecciones secundarias por otros
virus, transmitidos por mosca blanca o por otros insectos vectores, haciendo
infecciones mixtas, lo que puede llegar a explicar la expresión de síntomas y las
altas concentraciones de unidades relativas de partículas virales encontrados en
campo.
En este ensayo, también se encontraron plantas en algunas de las introducciones
silvestres de tomate que pese al inóculo adicional de virus proporcionado por B.
tabaci y a las condiciones ambientales que favorecieron la infección de plantas
con virus hayan plantas capaces de resistir estas condiciones y no permitieran la
78
replicación viral, en ninguna de las observaciones hechas (Figura 19, flechas
azules).
Figura 19. Detección de DNA viral por hibridación de ácidos nucleicos, tipo dot blot
(manchas oscuras) en introducciones de tomate, bajo condiciones de Campo. A: 30
DDI y B: 50 DDI. T* (Control negativo PNI (plantas no inoculadas)) – (plásmido pUC
19), + (Producto de PCR de donde se realizó la sonda). Flechas azules (plantas
donde no hubo replicación viral), flechas rojas (PNI) con replicación viral, recuadro
verde (aumento de las unidades relativas de partículas virales en Santa Clara).
79
El porcentaje de plantas infectadas por virus también presentó un comportamiento
similar al ensayo de campo, en donde la infección aumentó o disminuyó a través
del tiempo. Así mismo, la variedad de tomate comercial Santa Clara también
alcanzó un porcentaje de 100% de infección desde los 30 DDI (Figura 21). El
análisis de varianza no mostró diferencias significativas en esta variable entre las
introducciones evaluadas a los 30 y 50 DDI, ni entre estos dos tiempos de
evaluación.
Figura 20. Unidades relativas de partículas virales en las introducciones en las
introducciones de tomate evaluadas, en condiciones de campo 30 y 50 DDI. *
Diferencia estadística significativa al 5% de probabilidad. ** Diferencia estadística
altamente significativa al 1% de probabilidad. Medias seguidas por la misma letra
en las barras no tienen diferencias significativas.
80
En la evaluación hecha a los 50 DDI, al comparar el ensayo de campo e
invernadero, se encontró que el porcentaje de plantas infectadas con virus, donde
se detectó el DNA viral con la técnica de dot blot, la incidencia y la severidad de
los síntomas, hubo diferencias altamente significativas (p <.0001), presentando los
mayores valores en campo (Tabla 4).
En campo, hubo un promedio general de 15.2% de plantas sin replicación viral y
en invernadero de un 27.8 %, en donde las introducciones LA1478, LA 0094, PI
134418, PI 134417, LA 3864 y LA 1777 no presentaron replicación viral en un 33,
17, 25, 17, 25 y 50% respectivamente, y en campo un 8, 33, 17, 8, 8 y 17,
respectivamente. La introducción LA 2103 en invernadero tuvo plantas sin
replicación; sin embargo, en campo fue completamente susceptible.
Figura 21. Porcentaje de plantas infectadas por virus en las introducciones de
tomate evaluadas, en condiciones de campo 30 y 50 DDI. Medias seguidas por
la misma letra en las barras no tienen diferencias significativas con la prueba de
Duncan (P ≤ 0,05)
81
Este comportamiento de segregación de plantas con y sin replicación viral tanto en
condiciones de campo como de invernadero puede ser atribuido a la
heterogeneidad genética dentro de las introducciones (Rampersad & Umaharan,
2003). La progenie derivada de poblaciones silvestres de tomate de polinización
cruzada no es genéticamente homogénea, y es posible que los genes que
confieren resistencia puedan segregar en estas poblaciones (Vidavsky & Czosnek,
1998). En un trabajo realizado por Kasrawi (1989) encontró que la introducción LA
1478 era completamente resistente a TYLCV; sin embargo, cuando se realizaron
experimentos un año más tarde en otra localidad, se observó síntomas en el 75%
de la población de plantas de la misma accesión, aunque se argumentó que pudo
haberse debido a una cepa diferente de TYLCV (Zakay et al., 1991).
Pese a que en invernadero se obtuvo un mayor número de plantas sin replicación
viral, la selección de estas plantas se realizó en condiciones de campo, las cuales
estuvieron en un ambiente con mayor presión de selección, simulando las
condiciones del cultivo comercial.
Al final de la evaluación (50 DDI), para determinar el comportamiento de las
introducciones silvestres de tomate ante la inoculación del virus, se realizó una
gráfica de dispersión de datos con la variable Unidades relativas de partículas
virales versus escala de severidad de síntomas, en la cual se trazó una línea en el
eje X en el número 1, que corresponde a plantas sin síntomas virales y una en el
eje Y, en 2.500 que corresponde al fondo de la membrana, cuando se hizo la
hibridación de ácidos nucleicos, donde no se presentó replicación viral. De esta
manera se seleccionaron las introducciones silvestres de tomate evaluadas, que
cumplieron éstas dos condiciones.
En la figura 22, claramente se aprecia el comportamiento diferencial entre las
introducciones silvestres de tomate y dentro de ellas, a la inoculación del
Begomovirus PYMV-Col, comparado con tomate Santa Clara encontrándose
82
plantas que presentan una alta altas unidades relativas de partículas virales, sin
presentar síntoma viral, tal como sucedió en plantas de las introducciones PI
134418 - C (plantas 1, 4, 2), PI 134417 – D (plantas 1, 9, 6), LA 3864 - F (planta 8)
y LA 1777- G (planta 1). Es por esto que es indispensable el uso de métodos
moleculares para apoyar la detección de geminivirus (Gilbertson et al., 1991,
McGovern et al., 1994, Polston et al., 1991), porque se puede incurrir en falsos
resultados si la detección solo se realiza a nivel visual.
Así mismo, también se encontraron casos inversos, en donde hubo plantas que
presentaron un nivel de severidad de 2 o superior, con pocas unidades relativas
de partículas virales en las introducciones LA 0094 – A (planta 1), LA1478 – B
(planta 1, 4, 8, 12), PI 134417 - D (planta 3, 12), LA 2103 –E (4, 6, 8, 8, 10) y LA
1777- G (4, 7).
Adicionalmente, se presentaron casos en donde 30 DDI después de haber
detectado replicación viral, a los 50 DDI éste desapareció en las introducciones
LA 0094 – A (planta 1), LA1478 – B (planta 1, 4), PI 134418 – C (planta 8, 9), PI
134417 – D (planta 7), LA 3864 – F (2, 7, 9), y LA 1777- G (planta 8).
Como se ha mencionado anteriormente, en este trabajo se encontraron diferentes
respuestas en las introducciones silvestres de tomate a la inoculación del virus,
encontrándose plantas con las siguientes condiciones:
1) Susceptible = Plantas que contienen DNA viral y desarrollo de síntomas de la
enfermedad.
2) Resistentes = Plantas que contienen DNA viral pero sin síntomas.
3) Resistentes = Plantas que presentan síntomas de la enfermedad, pero que no
contienen DNA viral.
4) Resistentes = Plantas que no muestran ninguna presencia de virus y tampoco
síntomas de la enfermedad.
83
Al encontrar esta gran variabilidad genética dentro de las introducciones se realizó
una selección individual de plantas, que no presentó síntomas y replicación viral
(cuadrante III, Figura 22, A, C, D, F,G, números en color rojo); sin embargo, en las
introducciones LA1478 y LA 1777 se encontró plantas que presentaron síntomas
de la enfermedad, pero que no contenía DNA viral (Figura 22, B y G).
84
85
Finalmente, las plantas que presentaron resistencia al begomovirus dentro de las
introducciones silvestres de tomate fueron: LA 0094 – 5* (*se refiere al número de
la planta), LA 0094 - 6, LA 0094 - 8, LA 0094 - 10, LA1478 – 7, PI 134418 – 5, PI
134418 – 7, PI 134417 – 12, LA 3864 – 5, LA 1777 – 5, LA 1777 – 10, de las
cuales se seleccionó semilla.
Figura 22. Comportamiento de las unidades relativa de partículas virales
respecto a la escala de severidad de síntomas en las introducciones silvestres
de tomate. A. LA 0094; B. LA1478; C. PI 134418; D. PI 134417; E. LA 2103; F.
LA 3864; G. LA 1777. H. Santa Clara. Los números en rojo representan las
plantas sin replicación viral.
86
Algunas de estas introducciones han sido reportadas como fuentes de resistencia
a otros virus, por ejemplo, en la PI 134417 y LA 1777 se ha identificado
resistencia al Virus del mosaico de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus - AMV) (Parrella
et al., 1997). En Sudan, se reportó la LA 1777 al Begomovirus monopartita
TYLCV (Fargette et al. 1996; Ioannou, 1985). Sin embargo, Momotaz & Scott
(2005) no encontraron un buen nivel de resistencia al TYLCV o Virus del moteado
del tomate (ToMoV) en las líneas recombinantes puras que se derivaron de LA
1777 (Monforte & Tanksley, 2000); así que esta líneas no parece ser una buena
fuente de la resistencia a TYLCV. También se ha encontrado resistencia en la PI
134417 y LA 1478 con resistencia al Virus del grabado del tomate (Tobacco etch
virus - TEV) (Alexander & Hoover 1955; Legnani et al., 1996).
En general, las especies S. pimpinellifolium y S. habrochaites han sido
ampliamente utilizadas en mejoramiento genético como fuentes de resistencia, no
solo a enfermedades (Boissot et al., 2008; Delatte et al., 2006; Rampersad &
Umaharan, 2003) sino también a plagas (Azevedo et al., 2003; Erb et al., 1993;
Kumar et al., 1995; Vallejo et al., 2008; Pérez, 2010; Snyder et al.,1998; Webb et
al.,1971).
87
7. CONCLUSIONES
Se estandarizaron las condiciones óptimas para la infección del
begomovirus bipartita Virus del mosaico amarillo de la papa aislado
Colombia (PYMV-Col), en plantas de tomate de la variedad comercial Santa
Clara, susceptible a este virus, inoculado por medio de biobalística con la
pistola génica Helios Gene Gun System (Biorad®).
Las mejores condiciones de inoculación que garantizaron un 100% de
infección, con síntomas propios de la enfermedad en la variedad comercial
de tomate Sana Clara fueron: inocular plantas de tomate de 30 dds,
utilizando dos cartuchos de partículas de oro de 1.6 µm cubiertas de 1ug de
DNA de PYMV-Col por planta, a una presión de helio de 320 psi y una
distancia de 10 cm ddap.
En condiciones de invernadero y campo hubo un comportamiento
diferencial en la expresión de los síntomas, incidencia y porcentaje de
plantas infectadas por virus, presentándose los mayores valores de estas
variables en condiciones de campo, en donde hubo una mayor presión de
selección y condiciones ambientales que favorecieron la infección.
En las introducciones silvestres de tomate evaluadas se encontraron
fuentes de resistencia al virus PYMV-Col, el cual permitió una selección
individual de plantas que no presentaran replicación del virus en ninguno de
los tiempos evaluados, en condiciones de campo. Las introducciones
seleccionadas fueron: LA 0094 – 5, LA 0094 - 6, LA 0094 - 8, LA 0094 - 10,
LA1478 – 7, PI 134418 – 5, PI 134418 – 7, PI 134417 – 12, LA 3864 – 5, LA
1777 – 5, LA 1777 – 10.
88
8. RECOMENDACIONES
La estandarización de inoculación de virus por biobalística, permitió la selección
preliminar de introducciones silvestres de tomate como fuentes de resistencia al
virus PYMV-Col, el cual se convierte en la base para futuros trabajos de
mejoramiento genético de plantas de tomate, con el fin de realizar un mejor
manejo de la enfermedad, integrándola con otros métodos de control.
Se recomienda en futuras investigaciones la implementación de la biobalística
como método de inoculación del PYMV-Col, para fin de seleccionar otras
introducciones de tomate con resistencia a este virus. Además de la evaluación de
las progenies de las introducciones estudiadas, con el fin de analizar el
mecanismo de resistencia y su heredabilidad.
89
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