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Identificación y caracterización de levaduras no-Saccharomycesde distintas regiones vitivinícolas

españolas

Subprograma Nacional de Conservación de Recursos Genéticos de Interés Agroalimentario-

Recursos Microbianos

RM2006-00012

Madrid/19-01-10 Jornada de presentación de resultados Proyecto RM2006-00012

http://web.micinn.es/contenido.asp

http://www.irnase.csic.es/users/interbos/Logo INIA.jpg

ENTIDAD: IMIDRAPROYECTO Nº RM2006-00012-00-00TITULO DEL PROYECTO: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS NO-SACCHAROMYCES DE DISTINTAS REGIONES ESPAÑOLAS


EQUIPO PARTICIPANTE

SITUACIÓN ADMINIST. (*)

DEDICACIÓN APROBADA

(UNICA O COMPARTIDA)

CENTRO

INVESTIGADOR PRINCIPAL: TERESA ARROYO CASADO

CONTRATADA COMPARTIDA [email protected]

PERSONAL INVESTIGADOR:

EVA Mª VALERO BLANCO

GUSTAVO CORDERO BUESO

CONTRATADA

BECARIO

COMPARTIDA

COMPARTIDA

UNIV. PABLO DE OLAVIDE, SEVILLA

IMIDRA

OBJETIVO: Identificación, caracterización y ampliación de la colección de levaduras vínicas no-Saccharomyces del

IMIDRA

• Estudio de la viabilidad de la colección de cepas de levaduras autóctonas y de colección no-Saccharomyces presentes en el IMIDRA.

• Aislamiento de nuevas cepas de levaduras no-Saccharomycesprocedentes de viñedo y de bodega de elaboración.

• Utilización de técnicas moleculares para la identificación a nivel de especie de estas cepas de levaduras no-Saccharomyces.

• Utilización de técnicas moleculares para la identificación a nivel de cepa de levaduras no-Saccharomyces.

• Recopilación, análisis de datos y creación de una base de datos en el IMIDRA de cepas de levaduras no-Saccharomyces.


Material de partida• Colección de levaduras del IMIDRA (CLI) ~ 1200

cepas (Saccharomyces RM2007-00008 y no-Saccharomyces) conservadas en YM a 4ºC.

• Recopilación de 118 cepas de levaduras no-Saccharomyces, conservadas en la colección delevaduras del IMIDRA

• 38 cepas proceden de aislados asociados a levadurasde flor de diferentes regiones españolas, recogidas amediados de los años 50

• 80 cepas autóctonas de Arganda, Nalvalcarnero y SanMartín de Valdeiglesias, año 1991. Primeros estudiosde la microbiota de mostos y vinos en la D.O. “Vinosde Madrid”.



Tareas realizadas

• Test de viabilidad y pureza

• Ajuste de condiciones óptimas de liofilización, primera vez que se aplica este sistema de conservación al mantenimiento de la colección

• Conservación de las cepas en leche descremada (200 g/l)

Nueva catalogación (CLIXX) y mantenimiento bajo dos sistemas de conservación, LIOFILIZACIÓN y CONGELACIÓN -80ºC





CLI liofilizada y conservada a 4ºC y a temperatura ambiente


Rhodotorula

mucilaginosa

Ampliación de la colección

• 834 aislados de cepas no-Saccharomyces procedentes delviñedo

• Estudios de biodiversidad de levaduras sobre diferentesvariedades de vid cultivadas en la D.O. “Vinos de Madrid”

• Viñedos bajo diferentes sistemas de mantenimiento delsuelo y de defensa biológica (ecológica y convencional)


Las colonias fueron seleccionadas en función de su capacidad para crecer

en medio con lisina como única fuente de carbono

YNB Lys - YNB Lys +

Saccharomyces

Non Saccharomyces

Detección de las cepas de levaduras no-Saccharomyces

Identificación genética


• RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic

DNA-Polymerase Chain Reaction) desarrollada

por Williams et al. (1990).

• Se utilizó el primer OPB-15 MWG Biotech AG

(Ebersberg, Alemania) secuencia:

• 5’-GGAGGGTGTT-3’

• Se tomó como referencia las cepas tipo de la

CECT.

• Identificación genética de las cepas de

levaduras no-Saccharomyces método

basado en PCR-RFLP de la región ITS

del ADN ribosómico desarrollado por

Granchi y col. (1999)


Identificación molecular por

PCR/RFLP de la región ITS

ribosómica

Referencias para la identificación


• Comparación de los productos amplificados y el tamaño de los fragmentos de restricción descritos previamente por Guillamón et al. (1998), Esteve-Zarzoso et al. (1999) y Fernández-Espinar et al.(2000). http://motor.edinfo.es/iata

• Base de datos yeast-id.com

• En cada reacción de amplificación y restricción, se utilizaron como referencia cepas tipo procedentes de la Colección Española de Cultivos Tipos (CECT)

Cepas utilizadas como referencia


Cepa Referencia

Candida glabrata CECT 1448

Candida stellata CECT 11918

Candida vini CECT 11905

Dekkera bruxellensis CECT 1010

Debaryomyces hansenii var. hansenii CECT 10353

Hanseniaspora uvarum CECT11105

Kluyveromyces thermotolerans CECT 1962

Metschnikowia pulcherrima CECT 10071

Pichia carsonii CECT10227

Pichia membranaefaciens CECT 10037

Rhodotorula mucilaginosa CECT 10359

Schyzosaccharomyces pombe CECT 10685

Torulaspora delbruekii CECT 1015

Zygosaccharomyces bailii CECT1898

Resultado de clasificación de cepas de diferentes regiones


CLI Género y especie Zona Compatibilidad

ITS-RFLP(%) yeast-id.com

906 Candida micoderma Galicia Candida vini (39)

944 Torulaspora colliculosa Valladolid Torulaspora delbrueckii (35)

966 Candida stellatoidea Madrid -

968 Hansenula subpelliculosa Toledo -

985 Candida guillermondii Murcia Candida guillermondii (40)

991 Kloeckera africana Extremadura Kloechera sp (400X)

995 Candida parasilopsis Extremadura -

996 Candida tropicalis Extremadura -

1003 Pichia farinosa Extremadura Candida stellata (100)



1007 Torulopsis famata Extremadura -

1008 Torulopsis famata Extremadrua -





1041 Candida stellatoidea Extremadura -

1050 Torulopsis colliculosa Jérez -

1056 Candida clausenii Montilla -

1057 Torulopsis holmi Cádiz ¿Saccharomyces exiguus ?

1058 Candida tropicalis Jérez -

1060 Candida clausenii Montilla -

1061 Torulopsis colliculosa Montilla Torulaspora delbrueckii (35)

1062 Torulopsis colliculosa Montilla Torulaspora delbrueckii (40)

1063 Candida melibiosis Montilla -

1078 Schyzosaccharomyces pombe Burdeos RAPD (400X)

1079 Schyzosaccharomyces pombe - RAPD (400X)



1093 Saccharomycodes ludwigii - -

Cultivos de levaduras muy antiguos (1956).Mantenidos en mosto peptonado rejuvenecimiento cada 2 meses durante 25 años; y en medio sólido (YM) cada 6 meses.

Resultados ¿ ? no coinciden con base de datos CECTse hace necesario recurrir a:

Base de datos CBS (http://www.cbs.knaw.nl)

Secuenciación de regiones ribosomalesDominios D1/D2 del extremo 5’del gen 26S (Cadez et al.2003)

http://www.cbs.knaw.nl/

Resultado de identificación de las 80 cepas autóctonas de la colección (ITS-RFLP)


Género y especie Número de cepas, amplificado y fragmentos

Candida sp.(cantarelli, dattila, lambica, intermedia, stellata, vini.)

23 ITS: 490-590

Hanseniaspora uvarum 1 CfoI: 490 HaeIII: 600 HinfI: 300

Kloeckera apiculata 11 ITS:750 CfoI: 650+100 HaeIII: 700 HinfI:

300+200+190

Metschnicowia pulcherrima 11 ITS:400 CfoI: 200+75 HaeIII: 250+100 HinfI:

190

Pichia membranaefaciens 3 ITS:650 CfoI: 550 HaeIII: 600 HinfI: 300+300

Rhodotorula mucilaginosa (rubra) 3 ITS:600 CfoI: 275+225+75 HaeIII: 400+200 HinfI:

350+200

Torulaspora delbrueckii 25 ITS:800, CfoI: 325 HaeIII: 800, HinfI:

350+200+175

Fragmentos de restricción y número de aislados cepas (834 aislados para ampliación de colección)


Especie ITS RFLP_HaeIII RFLP_CfoI RFLP_HinfI Total aislados

Metschnicowia pulcherrima 400 280 + 95 210 + 80 190 153

Candida apicola 490 385+88 210+184 228+133 2

Candida stellata 500 490 210+115+70 230 +230 60

Candida sorbosa 600 600 560 315 4

Pichia guilliermondii 625 298+261 368+115+90 309+285 30

Pichia anomala 630 620 550 310+310 152

Hanseniaspora guilliermondii 775 775 340+320+105 360+200+160 115

Kluyveromyces thermotolerans 700 300+210+85 305+280 355 303

Pichia toletana 700 600 625 375 4

Torulaspora delbrueckii 800 750 320+210+140+100 410+375 11

Saccharomyces cerevisiae 850 325+250+185+150 375+325+150 375+365+110 156

Cepas de levaduras aisladas en el viñedo

• Las cepas se han agrupado bajo 6 géneros y

11 especies diferentes: Candida apícola,

Candida sorbosa, Candida stellata,

Hanseniaspora guilliermondii,

Kluyveromyces thermotolerans,

Metschnicowia pulcherrima, Pichia

anomala, Pichia guilliermondii, Pichia

toletana y Torulaspora delbrueckii


Perfiles electroforéticos de las especies de levaduras no-

Saccharomyces obtenidos por la técnica RAPD-PCR


Gestión de la colección


• Software Bionumerics http://www.biosystematica.comAnálisis de gelesTratamiento de datos y agrupamientosBase de datos

http://www.biosystematica.com/

Propiedades enzimáticas


• Sobre 156 cepas no-Saccharomyces (83 del viñedo y 73 de la colección CLI)

• Actividades: proteasa (40%), pectinasa (35%), glucanasa (50%), y sulfito reductasa (100%)

• Actividad β-glucosidasa (29%)

• Hansenula > Metschnicowia > Hanseniaspora > Kloeckera• Candida y Pichia (-)

• Levaduras aisladas en viñedo presentan mayor actividad β-glucosidasa

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Información científica generadaCongresos:

• SEM. Sociedad española de microbiología. Sevilla 17-20 de Septiembre de 2007. Biodiversidad de lamicrobiota de levaduras asociada a la uva en viñedos con diferentes sistemas de defensa biológica. A. Serrano,T. Arroyo, R. González, E. Valero.

• XIII CONGRESO ANUAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS, CYTALIA 2008. Madrid, 9,10 y 11 de Abril de 2008. Biodiversidad de la microbiota de levaduras de la uva en viñedos con distintossistemas de manejo del suelo. Serrano, A., Arroyo, T., Cordero, G., González, R., Pedrosa, R., Lissarrague R.,Valero, E.

• XXXI Congreso Mundial de la Viña y el Vino, OIV. Verona, 15-20 de Junio de 2008. Influencia de losparámetros agronómicos del viñedo en la Biodiversidad de levaduras fermentativas asociadas a la uva. A.Serrano, T. Arroyo, G. Cordero,González, R. Pedrosa, R. Lissarrague, E. Valero.

• XII WEURMAN FLAVOUR RESEARCH SYMPOSIUM. Interlaken (Switzerland) 1-4 de Julio de 2008.Glycosidase production by non-Saccharomyces yeast isolated from vineyard. T. Arroyo, G. Cordero, A.Serrano, E. Valero.

• XVI CONGRESO NACIONAL DE MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS. Córdoba (Spain) 14-17 deseptiembre de 2008. Evolución de las levaduras comerciales en el ambiente. Primer año de estudio. A.Serrano, T. Arroyo, G. Cordero, E. Valero. ISBN: 978-84-691-5094-8. Pg: 327

• XXIV Reunión anual del grupo de trabajo de Experimentación en Viticultura y Enología. Madrid, 5-6 de Mayode 2009 en el IMIDRA. Resultados preliminares agronómicos sobre la microbiota del viñedo en la CM. G.Cordero, E. Valero, A. Serrano y T. Arroyo.

• 27th ISSY Pasteur’s Legacy “ Yeasts for Health and Biotechnologies” Paris 25-29 de Agosto de 2009. Effectof agronomic parameters on the microbiote of the vineyeard. First year of study. T. Arroyo, G. Cordero-Bueso, A. Serrano y E. Valero.

Diploma de Estudios Avanzados (DEA). Gustavo Cordero Bueso, Universidad Autónoma de Madrid. Departamentode Química Física Aplicada. Área de Tecnología de los Alimentos. Septiembre 2009. Efecto de los factoresagronómicos sobre la microbiota del viñedo. Estudios preliminares.


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