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Implantes de FibroquelMRaceleran la formacin de huesonuevo en defectos seosinducidos experimentalmente encrneos de rata: un estudiohistolgico.

seas bien definidas, mientras que con los implan-tes de colgena, este proceso slo se iniciaba. Alos 15 das post operacin, los implantes deFibroquelMR mostraron mejor osificacin que losimplantes de colgena. Finalmente, a los 45 daspost operacin la formacin de hueso nuevo quese llevo a cabo con FibroquelMR y colgena fue casiidntica.Discusin. Se conoce bien la capacidad deosteoconduccin de las matrices colagnicas sobrela regeneracin sea. Sin embargo, el FibroquelMRestimula la regeneracin sea a niveles superioresque los obtenidos con colgena. Esto sugiere queel PVP puede modificar las propiedadesfisicoqumicas y biolgicas de la colgena, lo quefavorecera la formacin de una matriz con mejorcapacidad para la invasividad y migracin de clulas

Jess Chimal-Monroy, Teresa Bravo-Ruiz, Fernando E. Krtzsch-Gmez, Lino Diaz de Len.

Departamento de Biologa Celular, Instituto de Investigaciones Biomdicas, UNAM. Mxico D.F.Mxico.

RESUMEN.Introduccin. Los transplantes de hueso usual-mente se aplican en defectos seos. Sin embargo,debido a problemas ticos, clnicos oinmunolgicos, es necesario el desarrollo apropia-do de teraputicas para inducir la reparacin sea.En este estudio evaluamos el efecto del FibroquelMRsobre la regeneracin de hueso en defectos seosen crneos de ratas adultas y se compar concolgena liofilizada como control. El FibroquelMRes un biomaterial compuesto de colgena tipo I ypolivinilpirrolidona (PVP).Resultados. Los mostraron que la formacin dehueso nuevo se llev a cabo de una manera msrpida con los implantes de FibroquelMR, que conlos de colgena. A los 5 das post operacin, losimplantes de FibroquelMR presentaron trabculas

Solicitud de sobretiros: Dr. Lino Daz de Len Hernndez. Departamento de Biologa Celular. Instituto de Investigaciones Biomdicas, UNAM. CiudadUniversitaria, Apartado postal 70228 . C.P. 04510 Mxico D.F. Mxico. Tel. 622-3819. Fax 622-3897Recibido el 18/Octubre/1996. Aceptado para publicacin el 7/Febrero/1997.

Rev Biomed 1997; 8:81-88.

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osteoprogenitoras. Con base en estos resultados,sugerimos la aplicacin teraputica de los implantesde FibroquelMR en la resolucin de defectos seos.

Palabras Clave: Regeneracin sea, defectosseos, biomateriales, colgena, matriz extracelular.

SUMMARY.FibroquelMR implants accelerate new boneformation of experimentally induced bonedefects in rat skull: a histological study.Introduction. Bone grafts are usually applied tobone defects. However, due to ethical, clinical, orimmunological problems suitable alternatives toinduce bone repair are required. The aim of thiswork was to compare the effect of lyophilizedcollagen and FibroquelMR on bone defectssurgically created in the skull of adult male rats.Results. Results showed that ossificationstimulated with FibroquelMR implants ocurred morerapidly than with collagen implants. At 5 dayspostsurgery, FibroquelMR implants presented well-formed bone trabeculae, while with collagenimplants, this process had just begun. At 15 dayspostsurgery FibroquelMR implants showed betterossification than collagen implants. Finally, by 45days postsurgery new bone formation with collagenand FibroquelMR implants was almost identical.Discussion. The osteoconduction capacity ofcollagenous matrices for bone regeneration is wellknown, however, FibroquelMR enhances boneregeneration to higher levels than collagen alone,suggesting that PVP can modify thephysicochemical and biological properties ofcollagen, allowing the formation of a better matrixfor the invasion and migration of osteoprogenitorcells. On the basis of these results, we recommendthe therapeutical application of FibroquelMRimplants on bone defects.

Key words: Bone regeneration, bone defects,collagen, extracellular matrix, biomaterials.

INTRODUCION.Los transplantes seos usualmente se apli-

can en defectos seos, independientemente de quesean autlogos, homlogos o heterlogos. Sinembargo, debido a problemas ticos, clnicos oinmunolgicos, es necesario el desarrollo apropia-do de teraputicas para inducir la reparacin sea.Urist (1) demostr que las biomatrices de huesosdesmineralizados tienen la capacidad de inducir laformacin de hueso nuevo en sitios ectpicos. Elaislamiento, la identificacin y la clonacin de loscomponentes de la matriz sea con potencialosteoinductivo, han mostrado que pertenecen a lasuperfamilia del TGF-b. Estos componentes lla-mados protenas morfogneticas de hueso (BMP),implantados en sitios ectpicos inducen la forma-cin de hueso, a travs de los procesos que ocu-rren durante la osificacin endocondral (2).

La capacidad de induccin de cartlago yhueso en sitios ectpicos ha sugerido la aplicacinteraputica de las BMP en la regeneracin de huesoen defectos seos y en la reparacin de fracturas.Sin embargo, no obstante la aplicacin teraputicade las BMP en ortopedia, se han desarrollado otrasalternativas teraputicas. La hidroxiapatita es unode los biomateriales de mayor uso como materialde implantacin en defectos seos (3, 4). Aunquedebido a diferencias con las apatitas seas suaplicacin en ortopedia se ha reducido en aosrecientes. La coralina, obtenida de calcita de coral,es otra hidroxiapatita que sirve para el tratamientode defectos seos (5, 6). De igual forma lahidroxiapatita se ha usado como un substratoacarreador de la BMP-3 en la induccin delfenotipo ostegnico en clulas mesenquimticas (7,8) o en la regeneracin de defectos seos encalvaria (9) o en defectos en huesos de la mandbula(10). Por otro lado, la implantacin de colchonesde colgena en defectos de huesos de mandbulade conejo mostraron una osificacin ms rpidacomparada con los controles (11), lo que sugiereque los implantes a base de colgena permiten lareparacin de defectos seos. Por otro lado,Constantz y col (12) obtuvieron un biomaterial

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compuesto a base de fosfatos y calcio inorgnicoy una solucin de fosfato de sodio. Este biomaterialse prepara como una pasta y se inyectaquirrgicamente en sitios de fracturas, se endureceen pocos minutos permitiendo que los osteoblastoscrezcan e invadan esa pasta y la reemplacen porhueso nuevo. Sin embargo, no se ha reportado suuso en defectos seos.

Recientemente, en nuestro laboratorio hemostrabajado con un biomaterial llamado FibroquelMRque consiste de colgena tipo I de cerdo ypolivinilpirrolidona (PVP). Este biomaterial se hausado para el tratamiento de cicatrices queloides ehipertrficas, en donde acta como un fibrolticoal inhibir la expresin de molculas de ELAM-1,VCAM-1, TGF- y PDGF-AB (13; 14; Krtzsch-Gmez et al., sometido a publicacin in WoundRepair and Regeneration). De igual manera el tra-tamiento de fracturas con FibroquelMR acelera elproceso de la reparacin de fracturas, al promoverel reemplazamiento del callo fibroso, por callocartilaginoso y ste por callo seo en menos tiem-po que los controles. Asimismo, este fenmeno seve asociado a un incremento en la produccin dela osteopontina y la osteonectina, molculas de lamatriz sea relacionadas con la formacin ymineralizacin del hueso (15, 16, Chimal-Monroyy cols, manuscrito en preparacin).

El objetivo del presente trabajo fue compa-rar el efecto de implantes de FibroquelMR y decolgena en la regeneracin sea en defectos seoscreados quirrgicamente en los huesos parietalesde ratas adultas. Este modelo experimental se usporque los defectos seos no se resuelven espon-tneamente, por lo tanto, se podra evaluar lafuncionalidad de implantes de FibroquelMR y decolgena en la regeneracin sea. Los resultadosdemuestran que tanto los implantes del FibroquelMR

como de la colgena son capaces de permitir laregeneracin de los defectos seos. Sin embargo,la formacin de hueso nuevo fue ms rpida du-rante los primeros das de implantacin delFibroquelMR. Con base en los resultados obtenidosen el presente estudio sugerimos que el FibroquelMR

participa como un substrato que favorece la mi-gracin de clulas que participan en la reparacinsea, tales como las clulas de tejido de granula-cin y las clulas precursoras del linajeosteognico.

METODOLOGIA.El FibroquelMR y la colgena fueron sumi-

nistrados por spid S.A. de C.V. El FibroquelMRes una esponja compuesta de colgena tipo I decerdo y polivinilpirrolidona (PVP) de bajo pesomolecular, esterilizado por radiacin gamma.

Un total de 54 ratas Wistar de 200 g de pesose usaron en el presente estudio. Despus deanestesiar a las ratas se crearon defectos circularesde 5 mm de dimetro en ambos huesos parietalescon un taladro dental y solucin salina fra. Losdefectos se hicieron sin afectar las meninges. Enel experimento A, 18 ratas fueron implantadas conFibroquelMR en los defectos de los huesos derechos,al tiempo que la colgena se implant en el ladoderecho de otros 18 animales. Los defectos del ladoizquierdo sirvieron como controles y no fueronllenados artificialmente. En el experimento B, otras18 ratas fueron implantadas en los huesosizquierdos con colgena liofilizada y conFibroquelMR en los huesos derechos. Los animalesde ambos experimentos se sacrificaron porduplicado a los das 1, 3, 5, 7, 10, 15, 30, 45 y 60post implantacin de la colgena y el FibroquelMR.Las muestras de tejidos de las ratas del experimentoA se fijaron en 2.5% de paraformaldehido yprocesados para cortes en parafina. Los cortes setieron de acuerdo la tincin tricrmica de Masson.Los huesos de las ratas del experimento B seprocesaron para microscopa de alta resolucin,los tejidos se incluyeron en resina epxica y seobtuvieron cortes semifinos para su tincin conazul de Toluidina. La formacin de hueso nuevose evalu por invasin hacia el defecto de clulasformadoras de hueso y por la formacin detrabculas seas.

FibroquelMR en la formacin de hueso nuevo.

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Para la electroforesis de la colgena, lacolgena ms PVP y el FibroquelMR se cargaroniguales cantidades de protena en un gel depoliacrilamida-SDS al 7.5% (17).

RESULTADOS.La colgena y el FibroquelMR presentaron

diferentes geometras en la matriz que se formdespus de ser liofilizados, donde la colgenapresent una geometra ms regular que elFibroquelMR (fig. 1). El anlisis electroforticomostr un ligero cambio en las movilidadesrelativas de los componentes colagnicos delFibroquel MR, ya que las cadenas a1 (I) y a2 (I)migraron ligeramente ms arriba que las mismascadenas de la colgena tipo I de cerdo (compararen la fig. 2 el carril 1 con el carril 3). Por otrolado, la cantidad de protena del FibroquelMR quese resuelve en la electroforesis es distinta a la quese resuelve con la colgena tipo I, ya que la mismacantidad de protena se carg en el gel. Asimismo,al mezclarse la colgena y el PVP sin ningntratamiento con radiacin gama, no se observaroncambios en las movilidades relativas y en lacantidad de protena resuelta en la electroforesisen comparacin con la colgena (comparar en lafig. 2 el carril 1 con el carril 2).

Las observaciones macroscpicas de losdefectos seos, en las ratas controles, desde el da1 al da 60 post operacin, no revelaron evidenciade regeneracin sea espontnea. Esto confirmala validez del modelo para evaluar la regeneracinsea como consecuencia de la accin de diferentesbiomateriales (fig. 3). De igual manera, observamosque el proceso de regeneracin sea en los gruposde experimentacin A y B es idntica en amboscasos. La presencia del FibroquelMR en el hueso

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Figura 2.- Electroforesis de protenas al 7.5% depoliacrilamida. En el carril 1 colgena, carril 2 colgenams PVP y carril 3 FibroquelMR.

Figura 1.- Observacin microscpica de las esponjas de colgena y FibroquelMR. Amplificacin 30X.

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derecho no afect el desarrollo del hueso izquierdoimplantado con colgena del experimento B, o biencon los controles en el experimento A. Seobservaron los mismos resultados con los implantesde la colgena.Por lo que se describirnindistintamente los resultados de los experimentosA y B.

Todos los animales de los experimentos A yB llevaron a cabo una regeneracin sea completa.Sin embargo, basados en las observacioneshistolgicas, encontramos diferencias significativasen la velocidad de regeneracin del hueso en ambostratamientos. En los animales de los experimentosA y B se observ que desde los 5 hasta los 15 daspost operacin el 100% de las ratas con defectosseos implantados con FibroquelMR presentaronmejor grado de regeneracin sea que los animalesimplantados con colgena (p 0.05). Asimismo, alos 45 das post operacin, en todos los defectosseos analizados por histologa, encontramos queel 100% de ambos tratamientos, en los dosexperimentos, presentan regeneracin sea

completa sin encontrar diferencias significativasentre los tratamientos.

En los huesos parietales implantados concolgena se observ la presencia de clulasmesenquimticas en la zona del defecto seo, alda 1 post operacin (fig 4A). A los 5 das postoperacin las primeras clulas osteoprogenitoras

Figura 3.- Representacin esquemtica del modelo experimental (A). Se hicieron defectos seos de 5 mm en amboshuesos parietales. Los defectos fueron llenados con FibroquelMR en los huesos derechos y con colgena en los hueso

izquierdos (B) representa 1 da postoperacin y (C) 15 das postoperacin. La barra representa 5 mm.

Figura 4.- Regeneracin sea despus de la implantacinde colgena a los das 1 (A), 5 (B), 15 (C) y 45 (D) postoperacin. Cortes semifinos de 1 m de grosor teidos conazul de Toluidina.

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se agregaron para formar las incipientes trabculasseas y los vasos sanguneos fueron evidentes (fig.4B). A los 10 das post operacin la presenciade osteoblastos alrededor de las trabculasseas fue ms pronunciada y a los 15 das elarreglo trabecular del hueso fue evidente y, losespacios entre las trabculas fueron llenadospor tejido conjuntivo y vasos sanguneos (fig.4C). Finalmente, a los 45 das post operacinla osificacin se complet (fig. 4D).

Las ratas implantadas con el FibroquelMRliofilizado mostraron, al da 1 post operacin,la presencia de clulas mesenquimticas entodas las zonas del defecto seo (fig. 5A). Alos 5 das post operacin (fig. 5B) la formacinde las trabculas seas fue mayor cuando secompar con los implantes de colgena (fig.4B), ya que estos ltimos mostraron unaformacin incipiente de las trabculas seas.Al da 15 post operacin las trabculas seasmostraron menor tejido conjuntivo entre ellas(fig. 5C). Al finalizar el perodo experimentallas histologa del hueso en los implantes deFibroquelMR (fig. 5D) fue muy similar a la quese obtuvo con los implantes de colgena(comparar fig. 4D y D).

DISCUSION.La regeneracin es un proceso biolgico

durante el cual ocurren una serie de procesos ensecuencia que dan lugar a la formacin completade estructuras complejas (18). El trmino induccinse refiere al proceso por el cual la ruta de desarrollode una poblacin celular cambia en su direccin dediferenciacin por seales emitidas de otra poblacin(19, 20). Por consiguiente, la induccin de laregeneracin significa que diferentes sealesinductoras son capaces de organizar a una poblacincelular para formar estructuras complejas de maneramuy semejante a la estructura original como ocurredurante el desarrollo embrionario. En el caso delhueso, las seales particulares que participan en suregeneracin son las BMP, ya que estas molculascuando son implantadas intramuscularmente danlugar a una secuencia de procesos biolgicos, enforma similar a como ocurre durante el desarrolloembrionario, que culmina con la formacin local dehueso (1, 21).

Esos trminos son importantes debido a quela colgena y el FibroquelMR no son inductores dela regeneracin sea, pues su implantacin ectpicano promueve la formacin de hueso. Por lo tanto,en este estudio la colgena y el FibroquelMR sonconsiderados como biomateriales con capacidadosteoconductiva, esto es, son biomateriales quepermiten el establecimiento de todas las condicio-nes ambientales para la regeneracin sea, talescomo la presencia de una matriz extracelular ade-cuada que favorezca la invasin y migracin declulas osteoprogenitoras que surgen de los mr-genes de los defectos seos.

En este estudio no se observaron diferen-cias significativas en el resultado final entre losimplantes de colgena y FibroquelMR, pues huboformacin total de hueso con ambos tratamientos.Sin embargo, en los primeros 15 das de la rege-neracin sea , el FibroquelMR aceler la forma-cin de hueso en comparacin con lo obtenido concolgena (p 0.05). Estos resultados apoyan losobtenidos con el FibroquelMR en la reparacin defracturas, donde el biomaterial fue capaz de acele-

Figura 5.- Regeneracin sea despus de la implantacinde FibroquelMR a los das 1 (A), 5 (B), 15 (C) y 45 (D) postoperacin. Cortes semifinos de 1 m de grosor teidos conazul de Toluidina.

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rar la consolidacin sea, al estimular la expresinde molculas que favorecen la osificacin (15, 16,Chimal-Monroy y col, manuscrito en preparacin).

Es interesante hacer notar que la mezcla dela colgena con un qumico como el PVP provocauna aceleracin en la osificacin en comparacincon la obtenida con la colgena sola. Lo que su-giere que los implantes de FibroquelMR podran for-mar una matriz ms adecuada que favorezca la in-vasin y migracin de las clulas osteoprogenitoras,que la obtenida con los implantes de colgena. Estadiferencia podra deberse al entrecruzamiento dela colgena con el PVP despus de ser esteriliza-dos con radiacin gama. Aunque no tenemos evi-dencia de que los componentes del FibroquelMR seentrecruzan entre ellos, hemos observado que al-gunas propiedades fisicoqumicas se modifican. Porejemplo, se sabe que la colgena forma un gel a37C. En cambio, el FibroquelMR en estado lqui-do, no es capaz de formar un gel a la misma tem-peratura. Por electroforesis de protenas, observa-mos que las movilidades relativas y la cantidad deprotena que entra al gel cambia en el FibroquelMRy no en la mezcla de colgena con PVP sin irra-diar. Esto sugiere que la presencia de PVP modifi-ca las propiedades fisicoqumicas y biolgicas dela colgena, lo que poda generar que la geometrade la matriz entre los implantes de colgena yFibroquelMR sea diferente, como se observamacroscpicamente en los liofilizados de ambosbiomateriales. Esta sugerencia que se hace para elFibroquelMR podra ser apoyada por Anselme y cols(22), quienes demostraron que el entrecruzamien-to entre la colgena y los glicosaminoglicanos 4-sulfato de condroitina y sulfato de heparn mues-tra diferentes tendencias para calcificar en lugaressubcutneos dependiendo del mtodo de entrecru-zamiento. Un pretratamiento de las esponjas decolgena-glicosaminoglicanos con glutaraldehidogenera calcificacin distrfica, mientras que elmtodo de acil azida incrementa la persistencia delas esponjas in vivo hasta por 90 das sin generarcalcificacin distrfica. De igual manera Ripamontiy Reddi (9), reportaron que la geometra del

substrato tiene un efecto importante sobre la in-duccin sea por las BMP. Ellos demostraron quelas BMP implantadas con hidroxiapatita con unaconfiguracin discoidal permiten la expresin delfenotipo osteognico, mientras que no son capa-ces de hacerlo cuando se implantan con unsubstrato de hidroxiapataita con igual tamao enlos poros.

Con base en los resultados obtenidos de esteestudio y que la geometra de la matriz es un fac-tor importante, sugerimos la aplicacin teraputi-ca del FibroquelMR para el tratamiento de defectosseos.

AGRADECIMIENTOS.Los autores agradecen a los Drs. Len Cintra

McGlone y Agustn Galvn por su ayuda en elestablecimiento del modelo experimental; la asistenciatcnica a la Dra. Margarita Garca Garduo y a Isabel Prez-Monfort por su asistencia editorial. Este estudio fuefinanciado parcialmente por spid. S.A. de C.V.

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