Incidencia de Contaminantes en Las Truchas

7/30/2019 Incidencia de Contaminantes en Las Truchas

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CC. BIOLGICASDepartamento de Ecologa

INCIDENCIA DE LOS CONTAMINATES AMBIENTALESGENOTXICOS EN CLULAS DE TRUCHA ARCOIRIS

(ONCORHYNCHUS MYKISS)

MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DEDOCTOR POR Concepcin Becerril Moral

Bajo la direccin de la Doctora:Argelia Castao Calvo

Madrid, 2002

ISBN: 84-669-1679-2


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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

IINNCCIIDDEENNCCIIAADDEELLOOSSCCOONNTTAAMMIINNAANNTTEESS

AAMMBBIIEENNTTAALLEESSGGEENNOOTTXXIICCOOSSEENN

CCLLUULLAASSDDEETTRRUUCCHHAAAARRCCOOIIRRIISS

((OOnnccoorrhhyynncchhuussmmyykkiissss))

Concepcin Becerril Moral.

Marzo, 2002


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Este trabajo ha sido realizado en

el Servicio de Toxicologa del

Centro Nacional de Alimentacin

perteneciente al Instituto de

Salud Carlos III y financiado

CYCIT (proyectos AMB1994-0655-

CO2 y AMB1997-0431-CO2).

V B

Fdo.: Argelia Castao Calvo

Tesis dirigida por la Dra. Argelia

Castao Calvo y presentada por

Concepcin Becerril Moral para optar

al grado de Doctor en Ciencias

Biolgicas por la Universidad

Complutense de Madrid.

Fdo.: Concepcin Becerril Moral


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A mis padres

A Antonio, Elena y Miguel


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AGRADECIMIENTOS

Quisiera expresar mi mas sincero agradecimiento a todas aquellas

personas que de una manera u otra me ayudaron en la realizacin de este

trabajo:

En primer lugar y de forma muy especial a mi directora de tesis Dra.

Argelia Castao por darme su amistad a lo largo de tantos aos. Su

constante animo, ayuda y dedicacin ha hecho posible lo que en

muchos momentos considere imposible: la finalizacin de esta tesis.

Al Dr. Flix Sanz, Jefe de Servicio de Toxicologa Alimentara por las

facilidades que me ha concedido a lo largo de estos aos y que hanpermitido la realizacin de este trabajo.

Al Dr. Francisco Daz Pineda por su confianza al aceptar la ponencia

de esta tesis.

A Mar Ferrero que en todo momento ha estado a mi lado

ofrecindome su desinteresada ayuda y colaboracin. Esta tambin es

su tesis.

A Helda Acevedo que en este tiempo ha conseguido contagiarme de

su constancia y sentido practico. Adems, su colaboracin ha

permitido la finalizacin de esta tesis, de la que nunca dud.


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A mis compaeras, Irene, Mercedes, ngela, Thea, y Olga que gracias

a los buenos ratos compartidos han hecho que todo me pareciese ms

sencillo.

A M Luz por el cario e inters que mostr en la traduccin de

algunos de estos trabajos.

A Angelita del Pino por sus frases y refranes tan oportunos y por su

buen hacer en las tareas administrativas del servicio.

A Vicente Caldern y Henny Hooghuis que siempre han estado

dispuestos a ayudarme desinteresadamente cuando por una causa u

otra les he necesitado.

A Maria Bravo que siempre con palabras amables a mostrado su

inters y buena disposicin a colaborar.

A Carmen Rodrguez por su buen hacer en el mantenimiento de las

clulas y todos mis compaeros del Servicio porque de una forma u

otra han colaborado.

Por ltimo quiero agradecer a mi madre, a Antonio, Elena y Miguel por

haber estado siempre a mi lado mostrndome su constante

colaboracin, cario y apoyo.


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ndice i

INDICE

I. MEMORIA

1. INTRODUCCIN 1

1.1. Conceptos generales de la valoracin del riesgo

medioambiental 2

1.2. Medio Acutico: valoracin de efectos en poblaciones 10

1.3. Antecedentes metodolgicos de la tcnica de RAPD 23

2. JUSTIFICACIN Y OBJETIVOS 30

3. PLANTEAMIENTO Y RESULTADOS 33

3.1. Optimizacin de la Tcnica 33

3.1.1. Integridad del ADN 34

3.1.2. Ajuste de los parmetros de la reaccin 36

3.2. Capacidad para la Deteccin de Dao al ADN 38

3.2.1. Patrn de bandas especfico y reproducible 38

3.2.2. Condiciones ptimas de deteccin de dao al ADN 39

3.2.3. Sistema de anlisis para la deteccin de

alteraciones en el patrn de bandas42

3.3. Capacidad de Predecir el Dao in vivo 44

3.3.1. Similitud gentica entre los sistemas in vivo e in

vitro 45

3.3.2. Similitud de los efectos in vivo e in vitro 46


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ndice ii

4. DISCUSIN 48

5. CONCLUSIONES 62

6. BIBLIOGRAFA 67

II. ANEXOS.

ANEXO 1. PROTOCOLO DEL ENSAYO 89

ANEXO 2. PUBLICACIONES

ANEXO 2.1. Characterization of RTG-2 Fish Cell

Line by Random Amplified Polymorphic DNA. (1998)

Ecotoxicology and Environmental Safety Vol. 40, pp

56-64 108

ANEXO 2.2. Detection of Mitomycin C-Induced

Genetic Damage in Fish Cells by use of RAPD. (1999).

Mutagenesis Vol. 14, n 5 pp. 449-456 120

ANEXO 2.3. DNA Fingerprint Comparison of Rainbow

Trout and RTG-2 cell line using Random Amplified

Polymorphic DNA. (2001). Ecotoxicology, Vol. 10 n 2

pp. 115-125 131

ANEXO 2.4. Detection by RAPD of Genetic

Alterations in vitro Amplification and conservation

conditions of DNA Extract. (2002) Toxicology Methods.


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ndice iii

Vol. 12, n 1 (en prensa) 144

ANEXO 3. PUBLICACIONES (en proceso de aceptacin)

ANEXO 3.1. In Vitro Assessment of DNA Damage

after Chronic Exposure to B(a)P using RAPD and

RTG-2 Fish Cell Line.ATLA. 169

ANEXO 3.2. In vitro Detection of Alterations in the

DNA after Acute Exposure to B(a)P Using the RAPDTechnique. Chemosphere. 198

ANEXO 4. PUBLICACIONES (en preparacin)

ANEXO 4.1. Deteccin de Alteraciones Genticas

en Truchas Arcoiris Expuestas a Benzo(a)Pireno. 230


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I. MEMORIA


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Introduccin 1

1. INTRODUCCIN

El desarrollo econmico producido en el ultimo siglo ha estado

ntimamente ligado a la utilizacin de una gran cantidad de productos qumicos

en todos los campos de la actividad humana. La liberacin continuada de los

mismos, o sus derivados, al ambiente ha generado problemas de

contaminacin a escala mundial que afectan tanto a la salud humana como al

mantenimiento de los ecosistemas.

El alcance global del deterioro ambiental fue puesto en evidencia ya en

los aos sesenta. Poco a poco se fue tomando conciencia de que los recursos

del planeta son limitados, y que era necesario controlar la actividad industrial

mundial y aunar esfuerzos para minimizar los efectos adversos de la

contaminacin. Estos dos objetivos se plantearon como retos sin precedentes

asumiendo que en cualquier actividad humana no existe el riesgo cero.

Consecuencia de ello fue la creacin de una estrategia mundial para la

conservacin de la naturaleza como pieza clave en la consecucin de un

desarrollo sostenible establecindose de forma explicita, por primera vez, la

existencia de una interrelacin dinmica entre economa y medioambiente.


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Introduccin 2

La respuesta institucional a esta nueva concepcin se recogi en el

Convenio sobre la Diversidad Biolgica firmado en la Conferencia de las

Naciones Unidas de Medio Ambiente y Desarrollo, celebrada en Ro de Janeiro

en 1992. Despus de la cumbre de Ro quedaron establecidos los principios

que deben regir las actuaciones medioambientales en materia de

contaminacin, y que pueden resumirse en: el Principio de precaucin, el

Principio de quien contamina paga, y el compromiso de todos los Estados de

aplicar las mejores tcnicas disponibles y las mejores prcticas

medioambientales, tomando las medidas necesarias para conseguir un

ambiente saludable en el marco de un desarrollo sostenible.

La gestin y conservacin de los sistemas naturales se ha incorporado a

las polticas de los diferentes pases de la OCDE (Organizacin para la

Cooperacin y Desarrollo Econmico), establecindose el desarrollo conjunto

de programas de investigacin y la elaboracin de normativas de gestin

medioambiental.

1.1 CONCEPTOS GENERALES DE LA VALORACIN DE RIESGO

MEDIOAMBIENTAL.

El concepto de riesgo medioambiental se puede definir como la

probabilidad de que el uso de una sustancia qumica o actividad humana pueda

producir efectos adversos sobre la estructura y funcin de los ecosistemas,

entendiendo stos como unidades discretas formadas por un conjunto de

factores abiticos y biticos que interactan para formar un sistema estable.


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Introduccin 3

(Smrchek and Zimamm 1998).

Los procedimientos de valoracin de riesgo se realizan mediante la

identificacin y cuantificacin de estos efectos adversos, y constituyen una

poderosa herramienta para la toma de decisiones en el proceso de gestin

medioambiental. Dichos procedimientos se encuentran en evolucin constante,

incorporando herramientas o metodologas cada vez mas precisas.

Bsicamente se realizan siguiendo las siguientes fases:

Evaluacin de la exposicin,

Identificacin del peligro,

Caracterizacin del riesgo,

Gestin del riesgo.

Las tres primeras estn basadas en la aplicacin de herramientas

cientfico-tcnicas, mientras que la ltima, la gestin del riesgo, implica una

toma de decisiones considerando factores socio-econmicos. En este contexto,

la ecotoxicologa, - rama de la toxicologa que trata de entender los efectos

txicos que los agentes fsicos y qumicos ejercen sobre el medio -, se ha

convertido en una herramienta muy valiosa en el binomio desarrollo econmico

/ medioambiente

La evaluacin de la exposicin consiste en determinar la

concentracin que previsiblemente puede alcanzar un xenobitico en un

determinado medio receptor.


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Introduccin 4

Cuando un xenobitico llega a un compartimento medioambiental, en

funcin de sus caractersticas y de las del medio receptor, puede ser

incorporado o absorbido por los organismos, puede formar complejos con la

materia orgnica o inorgnica del medio, o puede movilizarse rpidamente a

otros compartimentos (suelo - agua subterrnea, etc.) Todo ello determina la

concentracin final que alcanzar dicho contaminante y por tanto, la magnitud

de la exposicin.

La evaluacin de la exposicin, se calcula con modelos matemticos

mas o menos complejos, considerando las caractersticas fisicoqumicas del

compuesto -punto de fusin, solubilidad en agua, productos de degradacin,

persistencia, bioacumulacin etc-, su uso -frecuencia y duracin de la

exposicin, vas de exposicin, compartimentos afectados, etc- y las

caractersticas del medio receptor dureza, temperatura, pH, etc-.

El resultado se conoce como Concentracin Medioambiental Prevista

(PEC - Predicted Environmental Concentration) y es un valor numrico que

representa los niveles de exposicin a los que estn sometidos los organismos

que viven en el compartimento estudiado.

La identificacin del peligro se realiza mediante estudios de

ecotoxicidad, encaminados a identificar la naturaleza de los efectos producidos

por el contaminante y a establecer la relacin dosis (concentracin) - respuesta

(efecto).


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Introduccin 5

El objetivo de esta fase es estimar la concentracin por debajo de la

cual una sustancia no es capaz de producir efectos adversos. Para ello se

determinan los efectos del contaminante sobre las especies representativas del

compartimento estudiado, a travs de todas las posibles rutas de acceso,

mediante estudios de ecotoxicidad. El resultado se expresa mediante un valor

numrico llamado Concentracin que Previsiblemente No producir Efectos

(PNEC - Predicted No Effect Concentration)

Los ensayos de toxicidad que se requieren para la identificacin del

peligro con fines de clasificacin en la Unin Europea o en la OCDE, son

siempre mtodos estandarizados por organismos de normalizacin nacionales

o internacionales. Metodolgicamente, los procedimientos bsicos utilizados en

la evaluacin de la toxicidad para sustancias industriales, existentes y de nueva

sntesis, biocidas etc., estn recogidos en el anexo V de la directiva

67/548/EEC de clasificacin, embalado y etiquetado y sus posteriores

adaptaciones al progreso tcnico.

En la fase de identificacin del peligro, cuando se trata de muestras

complejas, como vertidos o mezclas de contaminantes, o cuando se realiza una

valoracin de riesgo de un proceso industrial o cualquier otro procedimiento no

enmarcado en la normativa anteriormente citada, la gama de herramientas para

la valoracin de efectos ecotoxicolgicos se ampla considerablemente,

utilizando bioensayos o test de ecotoxicidad mucho ms verstiles y

sensibles.


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Introduccin 6

Un ensayo o test de toxicidad, en definitiva, no es mas que un

procedimiento que utiliza un sistema vivo (uno o varios organismos o clulas)

en presencia de la sustancia, compuesto o mezcla a estudiar y sobre el que se

valora el efecto que produce en unas condiciones previamente fijadas. Estos

resultados obtenidos en el laboratorio, deben ser capaces de predecir los

efectos de la sustancia estudiada en situaciones reales. La valoracin de

efectos se realiza mediante un sistema escalonado. En las primeras etapas se

utilizan modelos sencillos, como parmetros agudos de mortalidad (CL50) o de

efecto (CE50). Posteriormente, y en funcin de estos resultados iniciales, se

valoran efectos fisiolgicos crnicos o ms especficos (alteraciones en la

reproduccin, teratognesis, carcingenesis etc).

Los ensayos de ecotoxicidad pueden realizarse a cualquier nivel de

organizacin biolgica, desde molculas hasta ecosistemas completos. No

obstante, y en mayor medida que en la toxicologa humana, los ensayos de

laboratorio en ecotoxicologa conllevan un alto grado de incertidumbre, debido

a las complejas relaciones entre materia y seres vivos que existen en un

ecosistema.

La eleccin del organismo biolgico de ensayo determinar,

obviamente, el valor predictivo del mismo. De esta forma, y teniendo en cuenta

que existe una relacin directa entre el grado de representatividad y la

complejidad del sistema elegido, los estudios de campo seran los sistemas de

valoracin que ms se asemejan a la realidad, y por tanto, con mayor valor

predictivo. Sin embargo, su coste y la gran cantidad de variables a considerar,


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Introduccin 7

los convierten en inapropiados, sobre todo en las primeras fases de

identificacin del peligro. Por esta razn solo se utilizan en ensayos

confirmatorios, en casos de diagnstico, o en aquellos casos donde el

resultado de la valoracin de riesgo necesite una confirmacin in situ,

considerando factores climticos y especies autctonas, como es el caso de

algunos productos fitosanitarios.

En la prctica, el procedimiento que ms se utiliza en ecotoxicologa,

consiste en la aplicacin de una batera de ensayos agudos o subagudos

utilizando especies representativas de distintos niveles trficos para un mismo

compartimento; normalmente, productores primarios, consumidores primarios y

secundarios y descomponedores.

Los ensayos con especies de pequeo tamao, (bacterias, algas o

microcrustceos) son relativamente baratos y no requieren grandes

instalaciones de laboratorio. Por el contrario, la aplicacin de ensayos sobre

vertebrados, como los bioensayos de peces, incluso en sus estados ms

tempranos requiere de instalaciones y personal cualificado en el mantenimiento

de las especies, adems de un gran volumen de muestra y del sacrificio de un

alto nmero de animales, lo que plantea problemas ticos.

Los ensayos in vitro que utilizan rganos aislados, cultivos primarios

de tejidos o clulas derivadas de vertebrados, permiten obtener informacin

acerca de la toxicidad de un compuesto qumico o de cualquier tipo de muestra

ambiental, evitando el sacrificio masivo de animales y reduciendo los


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Introduccin 8

problemas tcnicos y econmicos. Es ms, desde un punto vista mecanicista,

los ensayos in vitro resultan idneos, pues permiten abarcar un amplio

numero de respuestas (mortalidad, efectos sobre el sistema inmune,

teratognicidad, mutagenicidad etc) eliminando las interferencias debidas a los

efectos sistmicos.

No obstante, la aplicacin de sistemas in vitro requiere un importante

esfuerzo en el desarrollo del ensayo para conseguir que sus resultados

adquieran precisin, sensibilidad, y lo que es ms importante, que demuestren

una buena correlacin con el ensayo in vivo que pretenden sustituir. Todo ello

es determinante para que el grado de prediccin sea aceptable desde un punto

de vista cientfico.

La caracterizacin del riesgo se lleva a cabo mediante la relacin de

los parmetros mencionados anteriormente, es decir, el nivel de exposicin de

un txico, y el efecto que produce sobre las especies seleccionadas como

representativas.

La caracterizacin del riesgo es el resultado, por tanto, de la relacin

entre la PEC y la PNEC para la especie que resulte ms sensible en cada

compartimento ambiental estudiado.

Si el cociente PEC/PNEC es menor o igual que la unidad, se considerar

que el riesgo es bajo y, por tanto, que no se requiere una mayor informacin

toxicolgica, es decir, ms ensayos. Si el cociente es mayor que uno, la

probabilidad de que se produzca un dao sobre el compartimiento considerado


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Introduccin 9

ser grande, y, por tanto, se asumir que el compuesto tiene un alto riesgo

ambiental. En ese caso se decidir si son necesarios ms ensayos, y de que

tipo, o si se ha de reducir el riesgo adoptando medidas de mitigacin.

La caracterizacin del riesgo no es una tarea fcil, ya que la

vulnerabilidad de los sistemas biolgicos frente a la polucin por sustancias

qumicas depende de mltiples y complejos factores. La cuantificacin de los

parmetros analizados mediante ensayos ecotoxicolgicos adecuados, es la

nica manera de realizar de forma objetiva la caracterizacin del riesgo. Por

todo ello, es necesario incorporar metodologas cada vez ms especficas y

sensibles, que permitan reducir los niveles de incertidumbre que toda

estimacin de riesgo lleva asociada.

Por ltimo, la gestin del riesgo implica una toma de decisiones tras

realizar un balance coste / beneficio, considerando factores tales como la

posibilidad real de control, la preocupacin pblica, razones polticas, ticas,

intereses de los sectores de produccin, mantenimiento o mejora de la calidad

de vida, etc. De esta forma, la gestin del riesgo adquiere una gran importancia

y sus repercusiones afectan al conjunto de la sociedad.

Un eficaz sistema de gestin medioambiental debe disponer de los

conocimientos cientfico-tcnicos necesarios para predecir el riesgo que implica

la liberacin de contaminantes fsicos y qumicos, y su valoracin ltima debe

realizarse considerando el medio ambiente como un todo.

En la actualidad, este concepto globalizador ya ha sido recogido en


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Introduccin 10

algunas normativas. As la Directiva Europea del Control y Prevencin

Integrado de la Contaminacin (96/61/CE) (IPPC- Integrated Prevention and

Control), que acaba de entrar en vigor en nuestro pas, exige a los organismos

responsables de la gestin medioambiental una valoracin integrada de los

riesgos inherentes a una determinada actividad industrial, y aunque por motivos

metodolgicos los anlisis de riesgo se aborden por compartimentos (acutico,

areo y terrestre), la valoracin final siempre debe ser realizada conjuntamente.

1.2 MEDIO ACUTICO: VALORACIN DE EFECTOS EN POBLACIONES

Actualmente la contaminacin se extiende a una buena parte de las redes

hidrogrficas, lagos y costas. Las causas de ello se deben en gran medida al

incremento del nmero de industrias que vierten sus residuos, en muchas

ocasiones sin depurar, al medio acutico, bien sean ros o zonas costeras.

Aunque tradicionalmente se ha tenido la tendencia a considerar que el medio

acutico, por un principio de simple dilucin y autodepuracin, era capaz de

asimilar cantidades ilimitadas de residuos; la deteccin de concentraciones

crecientes de diferentes contaminantes qumicos, metales pesados,

organoclorados etc., en organismos acuticos, ha puesto de manifiesto la poca

proteccin que supone el principio basado en la dilucin.

El compartimento acutico es sin duda el ms estudiado, tanto en lo que

se refiere al destino y comportamiento de los contaminantes, como en el

desarrollo de metodologas para la valoracin de los efectos en poblaciones

acuticas. Todo ello facilita los procedimientos de valoracin de riesgo, que en

ste compartimento ambiental estn muy bien definidos. De hecho, el inters


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Introduccin 11

cientfico en la actualidad se ha desplazado desde la valoracin de los efectos

agudos, a considerar los efectos transgeneracionales que ejercen ciertos

compuestos qumicos sobre las poblaciones naturales. (Colborn et al., 1996;

Anderson et al., 1994).

Estos efectos pueden manifestarse de forma indirecta dando lugar a un

decrecimiento de la supervivencia, de la tasa de reproduccin, edad de

maduracin etc., de los individuos pertenecientes a las poblaciones afectadas. De

esta manera se provoca un proceso de seleccin o cuello de botella dirigido por la

accin del txico (Theodorakis et al., 2001) En consecuencia, la diversidad

gentica puede verse disminuida, e incidir negativamente sobre la capacidad de

adaptacin, viabilidad y persistencia de la poblacin expuesta. (Bickham and

Smolen, 1994; Bickham et al., 2000) (Figura 1)

Tambin los efectos transgeneracionales pueden manifestarse de manera

directa por la accin de los denominados agentes genotxicos, contaminantes

capaces de interaccionar y modificar la molcula de ADN. La alteracin del ADN

de las clulas somticas incrementa la incidencia de determinados tipos de

tumores, mientras que la alteracin del ADN de las clulas germinales de los

individuos expuestos se transmite a la descendencia. De esta forma, las

alteraciones a escala celular pueden modificar, finalmente, y tras periodos ms o

menos largos de tiempo, la estructura gentica de estas poblaciones (Bickham et

al., 2000) (Figura 2)


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Introduccin 12

Las especies pisccolas estn directamente afectadas por ambos

procesos, pero los estudios a escala poblacional plantean graves problemas

prcticos, como disponer de poblaciones control, e incluso de metodologas

sensibles y especficas que permitan predecir de manera inequvoca, si un

contaminante es capaz de producir alteraciones en la dotacin gentica en una

poblacin. Sin embargo son numerosos los trabajos que asocian la presencia de

neoplasias en una gran variedad de especies pisccolas, con la presencia en el

agua de xenobiticos. (Harshbarger and Clark, 1990; Leblanc and Bain., 1997;

Malins et al., 1996; Dawe, 1969; Al-Sabti and Metcalfe, 1995) Por tanto, y

aunque en ecotoxicologa el centro de inters se establece a escala poblacional

mas que individual, la posibilidad de detectar a priori alteraciones genticas en

clulas somticas adquiere una gran importancia, permitiendo identificar

compuestos de relevancia ambiental (Shugart, 2000; Weinstein, 1988).

Tiempo

Diversidad

Gentica

Tamao de la Poblacin

Tamaode

laPoblacin

Diversidad Gentica

Figura 1. Relacin entre diversidad gentica y tamao de la poblacin.

( Bickham et al., 2000)


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Introduccin 13

Mutgenos Ambientales

Mutaciones en Lnea GerminalMutaciones Somticas

Sustancias ToxicasMedioambientales

no mutagnicos

Dao en Clulas

Somticas y TejidosAlteraciones en

el Desarrollo

Disminucin de la

Diversidad Gentica de

la Poblacin

Alteracin de la Viabilidad

o Salud de los Individuos

Alteracin de los ProcesosReproductivos de los Individuos

Efectos Demogrficos:Declive de la Poblacin,

Cuellos de botella

Seleccin de Loci crticospara la Supervivencia en

un Medio Especficamente Contaminado Reduccin de la media de los parmetros de adapta

Adaptacin a un Medio Ambiente Contaminado: Perdida del Potencial deAdaptacin, Frecuencia alelica alterada .

Extincin o Extirpacinde poblaciones

Figura 2. Relacin entre los distintos efectos causados por la contaminacin

ambiental (compuestos mutagnicos o no mutagnicos) y la prdida de diversidad

biolgica. (Bickham et al., 2000)


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Introduccin 14

En este sentido, y al igual que en los estudios de genotoxicidad en

mamferos, resultan de gran utilidad los ensayos in vitro. La utilizacin de

lneas celulares derivadas de especies pisccolas representativas constituye

una alternativa real a los bioensayos de peces, y presenta grandes ventajas

tcnicas como, por ejemplo, la capacidad de abordar un gran numero de

muestras con instalaciones de laboratorio poco sofisticadas, lo que se traduce

en una reduccin de los costes. En el mbito metodolgico, la homogeneidad

gentica de las clulas y su ciclo celular, permite simular estudios

transgeneracionales en periodos relativamente cortos de tiempo y con

volmenes de muestra reducidos (Tabla I) (Rachlin and Perlmuter 1968, Babich

and Borenfreund 1991; Castao et al., 1994; 1996; 2000; Segner, 1998, Fent

2001).

Concretamente, la lnea celular RTG-2 derivada de tejido gonadal de

trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss), es una de las mejor caracterizadas

(Figura 3) Se estableci a principios de los aos sesenta por Wolf y Kimby y

est incluida en la coleccin de cultivos celulares americana (ATCC) y europea

(ETCC). Es una lnea de morfologa fibroblstica, con una dotacin

cromosmica de 2n = 60, que retiene capacidad para metabolizar xenobiticos

(Clark, and Diamond, 1970; Thornton, et al., 1982) y que es viable en un

amplio rango de temperaturas (4 a 23 C), lo que permite investigar mltiples

variables cinticas, y adems resulta extremadamente til en la prctica diaria

de laboratorio.


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Introduccin 15

ENSAYO COMPUESTO LNEA ESTABLECIDA CULTIVO PRIMARIO BIBLIOGRAFAB(a)P, DMBA BF-2, RTG-2, BB Smolarek et al, 1987, 1988

Aflatoxina B1Hepatocitos de trucha

arcoirisBailey et al, 1982Aductos de

ADN

B(a)PHepatocitos de trucha

arcoirisMasfaraud et al, 1992

Alkaline

Unwinding

Assay

MND, PQ BB Hasspieler et al, 1996

MNNG, H2O2 R1, RTG-2 Braunbeck and Neumller, 1996Extractos orgnicos de sedimentos

marinosEPC Kamman et al, 2000; 2001

Cadmio Hepatocitos de trucha Risso-de Faverney et al, 2001

B(a)P, 4NQO RTG-2, RTL-W1 Nehls and Segner, 1998Muestras ambientales RTG-2, RTL-W1 Nehls and Segner, 2001Muestras de agua Hepatocitos de pez cebra Schnurstein and Braunbeck,

2001

Muestras de aguaPez cebra clulas

branquiales

Schnurstein and Braunbeck,2001

H2O2, B(a)PHepatocitos de trucha

arcoirisDevaux et al, 1997

H2O2, furanona, B(a)P, 1-

nitropirenoHepatocitos/sangre trucha Mitchelmore et al, 1998

H2O2 Clulas rojas Pleuronectes Nacci et al, 1996

Metil mercurio Linfocitos de T. Truncatus Betti et al, 1996

Ensayo

Cometa

Ciclofosfamida Eritrocitos carpa Pandrangi et al, 1995

Tabla 1: Estudios de genotoxicidad in vitro con clulas de peces. BB: Tejido de tronco posteriorde Brown Bullhead (Ameiurus nebulosus); BF-2: tronco caudal de Bluegill fry (Lepomismacrochirus); EPC: Epitelio de Carpa comn (Cyprinus carpio); R1: Hgado de trucha arco iris;RTG-2: Tejido gonadal de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss); RTL-W1: Hgado de truchaarco iris; Ul-h: Corazn de Umbra limi;; ULF-23HU: Aleta de Umbra limi.AA: Aminoacridina; BA: 1,2-benzoantraceno; B(a)P: Benzo(a)pireno; BP: 3,4-Benzopireno; BS:1,4-butanosultona; DBA: 1,2,5,6- dibenzoantraceno; DMBA: Dimetilbenzo(a)ntraceno; DP:dicromato potsico; EMS: etilmetilsulfonato; 3-MC: 3-metilcolantreno; MNNG: N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidiana; MMC: Mitomicina-C; MMS: metilmetanosulfonato; MND: menadodiona;4NQO: 1-oxido- 4-nitroquinolina; PQ: 9,10- fenantrenoquinona; PY: pireno; VS: sulfato devincristina.


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Introduccin 16

COMPUESTO LNEA ESTABLECIDA CULTIVO PRIMARIO BIBLIOGRAFA

Kocan et al, 1982, 1985B(a)P, MNNG, MMC, AA, 3-MC RTG-2

Kocan and Powell, 1985

Kocan et al, 1985

Landolt and Kocan, 1984Sedimentos marinos RTG-2Ahne and Schweitzer, 1993

Atrazina, meturxoron,4-ClA, HCH,PCP,alacloro,carbofurano

R1 Ahne and Schweitzer, 1993

N-nitroso-N-methylurea ULF-23 Park et al, 1989

Aberraciones

Cromosmicas

(AC)

3,4-BP, 1,2,5,6-DBA, 1,2-BA,

pyrene (PY).Ul-h Walton et al, 1988

MMC, MNNG, MMS Lnea celular A. splendens Barker and Rackham, 1979

MNNG ULF-23 Suyamah and Etoh, 1988

N-nitroso-N-methylurea ULF-23 Park et al, 1989

Leucocitos en cultivo Ellingham et al, 1986

Leucocitos en cultivo Zakour et al, 1984

ntercambio de

Cromatidas

Hermanas

(SCE

EMS, MMS Leucocitos Maddock and Kelly, 1980

Fenil-, etil-, metil-

organomercuriados BG/F Babich et al, 1990

MNNG, 4NQO Ul-h Walton et al, 1984

B(a)P, DP, EMS RTG-2 Kolpoth et al, 1999MMC, B(a)P, VS RTG-2 Sanchez et al, 2000

Induccin de

Microncleos

Mezclas complejas RTG-2 Castao et al, 2000MNNG, 4NQO, aflatoxin B1 RTG-2 Walton et al, 1983MNNG, 4NQO Ul-h Walton et al, 1984

B(a)P, Aflatoxina B1 RTG-2 + S9 Walton et al, 1987Sedimentos BB Ali et al, 1993

Hepatocitos de peces Klaunig, 1984

Hepatocitos de peces Kelly and Maddock, 1985

Hepatocitos de peces Miller et al, 1989

Irradiacin UV CAF-MM1 Mano et al, 1980

Mitani et al, 1982

Sntesis no

programada

de ADN (UDS)

Irradiacin Gamma CAF-MM1 Mitani and Egami, 1982


27/250

Introduccin 17

Esta lnea celular se ha utilizado para la valoracin de la toxicidad aguda

de compuestos representativos de casi la totalidad de los grupos de

contaminantes ambientales, mostrando una muy buena correlacin con los

resultados obtenidos in vivo (Babich and Borenfreund, 1991; Segner 1998;

Castao et al., 1996; 2000), en estudios citogenticos (Kohlpott, et al., 1997;

Snchez et al., 2000) as como, ms recientemente, para la deteccin de

compuestos que modifican el comportamiento hormonal o disruptores

endocrinos (Fent, 2001)

Figura 3. Lnea celular RTG-2 derivada de tejido gonadal de trucha arcoiris(Oncorhynchus mykiss),

En los estudios de genotoxicidad, los sistemas in vitro constituyen el

primer paso para la identificacin de efectos. Una vez que el mutgeno

interacciona con la molcula de ADN, se producen en ella, tras cortos periodos


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Introduccin 18

de tiempo (minutos e incluso segundos), daos estructurales cuya naturaleza

est en funcin de las caractersticas fsico-qumicas del compuesto (Tabla II)

Existe un importante grupo de sustancias con capacidad genotxica

(algunas de ellas tras ser metabolizadas), que forman enlaces covalentes con

la molcula de ADN, dando lugar a los llamados aductos (Figura 4). En los

ltimos aos se han desarrollado diferentes metodologas capaces de

cuantificarlos, aplicando tcnicas inmunolgicas con anticuerpos especficos

(Poirier, 1984; Santella, 1988), HPLC combinado con espectroscopia

fluorescente (Dunn, 1991; Krahn et al., 1993), cromatografa de gases acoplada

a espectrometra de masas (Krahn et al., 1993) o marcaje con 32P tambin

llamado 32P-postlabeling.

PAH-N7 aducto

Sntesis de ADN

Lu ar abasico

Sntesis de ADN

Mutante

Figura 4. Formacin de mutaciones a partir del aducto formado entre unhidrocarburo policclico aromtico (PAH) y el N - 7 de la adenina.


29/250

Introduccin 19

Esta ltima, es quizs la ms utilizada debido a su gran especificidad y

sensibilidad ya que es capaz de detectar un aducto entre 1010 nucletidos

normales. (Gupta et al., 1982; 1985; 1988; Liu et al., 1988; Halbrook et al.,

1992; Lloyd-Jones, 1995; Jones and Parry, 1992; Pfau 1997; Qu et al., 1997)

La formacin de aductos, est considerada como un elemento clave en

la iniciacin de procesos carcinognicos, ya que pueden desestabilizar las

uniones glucosdicas y dar lugar a lugares apurnicos con posterior rotura de la

cadena de ADN, o pueden dar lugar a la insercin de bases incorrectas, que

tras el proceso de replicacin pueden comprometer la fidelidad de la copia.

(Weinstein, 1978; Wogan and Goreling, 1985).

Los daos sobre el ADN, adems de por la formacin de aductos,

pueden producirse por otros procesos diferentes, como son la generacin de

especies de oxgeno altamente reactivas, (Kuchino et al., 1987; White et al.,

1996; Park et al., 1996; Sugg et al., 1996) o dando lugar a mutaciones por

formacin de dmeros de pirimidina, desaminacin de bases, o interfiriendo con

los procesos de replicacin, metilacin o reparacin (Shugart, 2000). La

hipometilacin, consecuencia, por ejemplo, de la oxidacin de las bases por

radicales libres, puede medirse mediante la hidrlisis enzimtica del ADN

(Rosiello et al., 1994; Count and Goodman ,1995) o mediante la sntesis no

programada de ADN (Selden et al., 1994).

En cuanto a la deteccin de capacidad mutagnica la, los ensayos

bacterianos tradicionales de mutagenicidad, como el test de Ames (Ames et


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Introduccin 20

al., 1975; Stepanova et al., 1999), estn siendo sustituidos por ensayos de

activacin de oncogenes (Deveraux, 1994; Abshire et al., 1996), o la utilizacin

de modelos con animales transgnicos (Jowett et al., 1991; Murti et al., 1994;

Ryskova et al., 1997)

La deteccin de roturas en las cadenas de ADN puede realizarse

mediante los ensayos de desnaturalizacin en medio alcalino, (Shugart, 1988;

1998; 1996b; Meyers-Schone et al., 1993; Everaart et al., 1998), electroforesis

en geles alcalinos o neutros (Theodorakis et al., 1994) o el ensayo Comet

(Ostling and Johanson 1984; Michelmore and Chipman 1998; Singh et al.,

1988; Olive et al., 1992; Fairbairn et al., 1995), todos ellos basados en la

desnaturalizacin in vitro de la doble hlice a determinado pH. La proporcin

de ADN de cadena sencilla detectada se considera que est relacionada con el

nmero de roturas.

Los daos estructurales son reparados la mayor parte de las veces por

los mecanismos celulares, pero cuando no es as y persisten o son reparados

errneamente, pueden interferir en la fidelidad de la replicacin y producir

cambios irreversibles en el genoma. Estos efectos tardos e irreversibles, tales

como el intercambio de cromtidas, las aberraciones cromosmicas o el

incremento en la frecuencia de microncleos, se denominan efectos

citogenticos y para la deteccin de los mismos se han incorporado

recientemente tcnicas de anlisis automtico de imagen y de citometra de

flujo. (Gordon et al., 1989;Custer et al., 1994; 1997;Lamb et al., 1995;Grawe


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Introduccin 21

et al., 1997; Bikham et al., 1998; Carrano et al., 1978; Kohlpoth et al., 1999;

Snchez et al., 2000)

En funcin de la magnitud del dao producido al ADN, sus efectos

pueden no ser fcilmente observables, siendo necesarios meses o aos para

hacerse patentes, a veces incluso, despus de que la fuente de contaminacin

haya sido eliminada. Son precisamente estos eventos tardos, los que a escala

poblacional adquieren mayor importancia (Saava, 1998; Anderson et al., 1994)

(Tabla II) Por tanto, el desarrollo de metodologas capaces de detectar el dao

al ADN en estados tempranos adquiere una gran importancia.


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Introduccin 22

Tabla II. Secuencia de efectos de la exposicin a genotxicos.

Efectos biolgicos al nivel de indiv iduoEfectos a escala

poblacionalTemprano

Temprano-Medio-Tarde

Medio /Tarde Tarde

3.ADN anormal 4. Condicionespatolgicas

5.Efectos genticos1.Detoxificacin

Induccin delsistemaenzimtico P450

Aberracionescromosmicas.

Microncleos

Neoplasias

Tumores

Alteracin de ladiversidadgenotpica

Variaciones en la

frecuencia allica2.Alteracionesestructurales

Agentes fsicos Dmeros de

Timidina Rotura de cadena

Agentes qumicos Aductos

Alteraciones debases

Rotura decadenas

Modificacin debases

Hipometilacin

Interferencias conla reparacin yreplicacin delADN

Mutaciones

Aneuploidas

Apoptosis

Disfuncinde protenas

Declive dela fertilidad

Letalidad

6. Efectos fenotpicos

Rasgos fenotpicosalterados.

Modificaciones en laestructura de lasclases de edad.

Decrecimiento de laabundancia ydistribucin de lapoblacin

Extincin de lapoblacin

El tiempo de aparicin de estos efectos depender de las especies y tipo degenotxico. (Temprano: horas o das. Medio: das, semanas o meses. Tarde:

semanas, meses o aos.) Modificada a partir de Thomson et al., 1999


33/250

Introduccin 23

1.3 ANTECEDENTES METODOLGICOS DE LA TCNICA DE RAPD

En la ltima dcada, los avances en biologa molecular han permitido el

desarrollo de tcnicas tales como el anlisis de polimorfismos obtenidos

mediante enzimas de restriccin(RFLP), y la amplificacin de genes mediante

la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), abriendo nuevas posibilidades

en la deteccin del dao al ADN. (Botstein et al., 1980; Saiki et al., 1988; Nirmal

et al., 1999)

La tcnica de PCR, fue desarrollada por Mullis a finales de los aos

ochenta y con ella se consigue la amplificacin enzimtica de un fragmento de

ADN o ARN hasta millones de veces, de un modo rpido y fiable. Su gran

sensibilidad, sencillez y eficacia para amplificar especficamente determinados

segmentos de cidos nucleicos, ha permitido afrontar problemas

experimentales que antes eran irresolubles. En ella se imita, bajo condiciones

controladas de laboratorio, el proceso de replicacin del ADN que tiene lugar

en los organismos vivos (Figura 6)

La complejidad del ciclo biolgico, se simplifica in vitro utilizando una

ADN polimerasa y ciclos de temperatura para desnaturalizar e hibridar

alternativamente, la parte de ADN que se desee obtener. El resultado es la

amplificacin exponencial de determinados fragmentos de ADN seleccionados

mediante cebadores o primers diseados por el analista. El principal

inconveniente de la PCR, es que requiere el conocimiento previo de las


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Introduccin 24

ADN moldeee

Nuevo ADN

Cebador

ADN +

Cebador +dNTPs +ADN polimerasa +Bufer

1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo

Figura 6. Esquema de la tcnica de PCR. Despus de 30 ciclos se obtienen

1 billn de copias idnticas de un fragmento determinado de ADN.


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Introduccin 25

secuencias que flanquean el fragmento a amplificar, cosa que no siempre es

posible.

Para solventar este problema se desarrollaron una serie de variantes

conocidas con el nombre de MAAP (Multiple Arbitrary Amplificon Profiling o

Tcnicas de Obtencin de Perfiles Mltiples y Arbitrarios de Amplificacin), que

utilizan cebadores de secuencia arbitraria y generan una huella gentica del

ADN molde estudiado. Este grupo est formado por la tcnica de RAPD

(Random Amplified Polimorphic ADN o ADN Polimrfico Amplificado al Azar)

(Williams et al., 1990), AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR o Reaccin en Cadena

de la Polimerasa Usando Cebadores al Azar) (Welsh and McClelland 1990) y

DAF (ADN Amplification Fingerprinting o Huella Gentica Mediante

Amplificacin del ADN) (Caetano-Anolles et al., 1991) Las diferencias entre

ellas, consisten en la longitud del cebador utilizado y en la forma de visualizar

los fragmentos amplificados (Tabla III)

La tcnica de RAPD, desarrollada por Williams y col., en 1990 utiliza

cebadores cortos (entre 9-14 bases) de secuencia arbitraria, y la reaccin de

amplificacin se realiza a una temperatura de hibridacin o anillamiento poco

selectiva, alrededor de 36C. Con estas condiciones la especificidad del

cebador disminuye, aumentando la probabilidad de hibridacin, aunque en

muchos casos de forma imperfecta. Las diferencias entre PCR y RAPD

aparecen en la tabla IV.


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Introduccin 26

Tabla III. Principales diferencias entre las Tcnicas de Obtencin de

Perfiles Mltiples y Arbitrarios de Amplificacin.

RAPD AP-PCR DAF

Cebadores 10-12 pb 20 pb 5 pb

Ciclo detemperaturas

Baja t dehibridacin entodos sus ciclos(30-39C)

Baja t dehibridacin en losprimeros 2-5ciclos alta en elresto (45-50C)

Baja t dehibridacin entodos sus ciclos(30C)

N de ciclos 40-45 40-45 30-35

Visualizacinde losproductos

Electroforesis engeles de agarosa +bromuro de etdio

Incorporacin de32P-dATP en losprimeros ciclos.Electroforesis engeles depoliacrilamida +autoradiografa

Electroforesis enpoliacrilamida +tincin con plata

Tamao de losproductos

Entre 300 y 2000pb

Por encima de500 pb

Por encima de500 pb

(pb = pares de bases) Datos tomados de Menier y Grimont (1993)

Tabla IV. Diferencias bsicas entre la tcnica de PCR y RAPD.

PCR RAPD

Secuencia del cebadorcomplementaria al DNAmolde conocido.

Secuencia del cebador al azar, norequiere del conocimiento del ADNmolde.

En ausencia de la secuenciano se produce amplificacin.

Por lo general, se encuentransecuencias complementarias.

No exige integridad al ADNmolde.

Es fundamental la integridad delADN molde

Ciclo de temperaturas (t dehibridacin: 50 - 55C)

Ciclo de temperaturas (t dehibridacin : 30 - 39C)

N de ciclos: 30 N de ciclos: 45


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Introduccin 27

Durante los primeros ciclos el proceso es competitivo, es decir,

inicialmente un numero elevado de fragmentos son co-amplificados, pero solo

aquellos que presentan una mayor estabilidad cebador-ADN molde sern los

productos finales de la reaccin.

El resultado, es un amplio espectro de fragmentos amplificados que

conforman un patrn de bandas o huella gentica caracterstica del ADN molde

utilizado. Los fragmentos o bandas, generalmente entre 300 y 2000 pares de

bases, son separados electroforeticamente en geles de agarosa y visualizados

mediante una tincin con bromuro de etdio. La tcnica presenta grandes

ventajas ya que:

No necesita conocimiento previo de la secuencia a amplificar.

Utiliza pequeas cantidades de ADN molde (entre 5-50 ng)

Utiliza los mismos cebadores para distintos sistemas biolgicos.

Puede analizar un nmero elevado de muestras en poco tiempo.

No necesita marcaje radiactivo ni grandes equipos de laboratorio.

Todas ellas, han hecho que esta tcnica se aplique con xito en una

gran variedad de campos: en epidemiologa molecularpara la identificacin de

cepas patgenas causantes de infecciones bacterianas (Allerberger et al.,

1997; De Vos et al., 1997), en el sector alimentario permitiendo la deteccin de

brotes de intoxicacin (Loudon, et al., 1996) o el seguimiento de las vas de

diseminacin de patgenos durante el procesamiento de alimentos


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Introduccin 28

(Niederhauser, et al., 1994); en estudios taxonmicos estableciendo relaciones

de proximidad evolutiva en especies animales y vegetales (Rothmanier, et al.,

1997; Rout et al. 1998; Hoey et al., 1996); en la elaboracin de mapas

genticos (Williams, et al., 1993), etc.

Tambin, aunque ms tmidamente, se ha utilizado en estudios de

genotoxicidad humana y animal. Peinado y colaboradores la aplicaron para la

deteccin de mutaciones en clulas tumorales de colon, tras comparar sus

patrones de bandas con los de las clulas sanas (Peinado et al., 1992). En

ecotoxicologa, Kubota y colaboradores irradiaron machos del pez medaka

(Oryzias latipes), con el objetivo de detectar alteraciones en el ADN de los

individuos irradiados y en su progenie. Los resultados confirmaron la alteracin

del patrn mediante la perdida y ganancia de bandas, as como diferencias en

la intensidad de amplificacin. Verificaron el carcter hereditario de alguna de

las bandas de nueva aparicin, sin que ello afectara a la viabilidad de la

progenie (Kubota et al., 1995). Adems, demostraron una relacin directa entre

las alteraciones en el patrn y la intensidad de irradiacin (Kubota et al., 1992).

No obstante, esta tcnica ha sido criticada por la aparicin de bandaserrticas de difcil interpretacin y, en general, por la falta de reproducibilidad

de sus resultados, aspectos muy estudiados aunque no bien entendidos.

La naturaleza e intensidad de las bandas, est en funcin de mltiples

parmetros, tales como la integridad del ADN molde utilizado y/o de cada una

de las condiciones que intervienen en la reaccin, desde la eleccin de la ADN


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Introduccin 29

polimerasa hasta el ciclo de temperaturas establecido. (Davin-Regli et al., 1995;

Abed et al., 1995; Bassam et al., 1992; Ellsmorth et al., 1993; Meunir and

Grimont 1993; Park and Kohel, 1994; Penner et al., 1993; Williams et al., 1990).

A su vez, la integridad del ADN molde est en funcin de las

condiciones iniciales de la muestra, del mtodo de extraccin utilizado, as

como de la conservacin posterior del extracto genmico obtenido. (Black,

1993; Cheng et al., 1995). En cuanto a la unin cebadorADN molde, es

directamente dependiente de la temperatura de hibridacin y pequeas

variaciones en ella pueden modificar los lugares de anillamiento y, por tanto,

los productos finalmente amplificados.


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Justificacin y Objetivos 30

2. JUSTIFICACIN Y OBJETIVOS

La presencia continuada de sustancias qumicas de naturaleza

genotxica, provoca daos estructurales en el material hereditario de las

poblaciones pisccolas expuestas. La posibilidad de evaluarlo tempranamente,

representa un avance metodolgico en los procedimientos de valoracin de

riesgo.

En los ltimos aos, y gracias al incipiente auge de la genmica, se han

desarrollado tcnicas sensibles y especficas que abren nuevas posibilidades

en disciplinas cientficas muy dispares.

An as, la aplicacin de dichas metodologas en estudios poblacionales

de peces, plantea dificultades tcnicas, econmicas y ticas, debido al alto

nmero de animales, a las instalaciones de laboratorio que requieren y a la

larga duracin de los estudios. Estas dificultades pueden en parte solventarse

mediante la utilizacin de sistemas in vitro, particularmente en las primeras

fases de valoracin de riesgo.

Nuestros estudios han ido dirigidos a conseguir un modelo sencillo y

suficientemente representativo del medio acutico, que permita detectar una

amplia gama de alteraciones en la molcula de ADN, asociadas a la accin de

sustancias genotxicas medioambientalmente relevantes.

El sistema biolgico elegido ha sido la lnea celular RTG-2, derivada de


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trucha arcoiris, y, que como se ha mencionado anteriormente, ha presentado

una buena correlacin en multitud de estudios de citotoxicidad con el sistema

in vivo del que procede.

La tcnica de RAPD, de reciente desarrollo, ha sido elegida para la

deteccin de efectos sobre dicho sistema. Teniendo en cuenta su fundamento

terico, es posible detectar alteraciones inespecficas en el ADN procedente de

clulas que posean una dotacin gentica idntica, como es el caso de las

lneas celulares establecidas, mediante la comparacin del patrn de bandas

de las clulas expuestas a la accin de genotxicos y el patrn de bandas de

clulas no expuestas o controles. El hecho de no requerir informacin de la

secuencia genmica representa una gran ventaja en estudios ecotoxicolgicos,

donde el conocimiento de la gentica de las especies silvestres es muy

reducido, y donde el inters se centra en la deteccin del dao, y sus posibles

consecuencias, ms que en la naturaleza del dao en s mismo, objeto de otras

disciplinas como la gentica molecular o la bioqumica.

Adems de lo anterior, la tcnica de RAPD es simple y no necesita

marcaje radiactivo, lo que permite que pueda realizarse prcticamente en

cualquier laboratorio. Por lo tanto, considerando la gran cantidad de ventajas

que presenta tericamente esta tcnica en estudios de ecotoxicologa gentica,

y aunque ha sido criticada por la falta de reproducibilidad de sus resultados,

nos hemos planteado esta tesis marcndonos dos objetivos concretos:


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1. Conseguir resultados fiables y reproducibles, optimizando todos y

cada uno de los diferentes parmetros que intervienen en la

reaccin RAPD.

2. Desarrollar un sistema in vitro sensible y verstil, que permita

valorar a priori el carcter genotxico de compuestos qumicos y

muestras ambientales.


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Planteamiento y resultados. 33

3. PLANTEAMIENTO Y RESULTADOS

El desarrollo metodolgico ha ido dirigido a conseguir un sistema

sensible y cuyos resultados in vitro sean capaces de predecir los resultados

in vivo. Como las variaciones, incluso muy pequeas, en el patrn de bandas

de clulas control y clulas expuestas son asumidas como resultado de la

accin del txico sobre el ADN, es imprescindible que dicho patrn sea

especfico y altamente reproducible.

Por tanto, este trabajo se ha estructurado de la siguiente manera:

1. OPTIMIZACIN DE LA TCNICA (Reproducibi lidad y

Especificidad)2. CAPACIDAD PARA LA DETECCIN DE DAO AL ADN

(Sensibilidad)

3. CAPACIDAD PARA PREDECIR EL DAO IN VIVO

3.1 OPTIMIZACIN DE LA TCNICA. (Reproducibi lidad y Especificidad)

(Anexos 2.1 y 2.4)

Como ya se ha mencionado, uno de los aspectos mas criticados a la

tcnica de RAPD, ha sido la falta de reproducibilidad de sus resultados, dando

lugar a patrones de bandas variables. Los factores que intervienen en esta falta

de reproducibilidad se pueden agrupar en:


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1. Integridad del ADN.

2. Ajus te de los Parmetros de la Reaccin.

3.1.1. La Integridad del ADN,a su vez, est determinada por el mtodo

de extraccin seleccionado y por el estado de conservacin de los

extractos.

Para seleccionar el mtodo de extraccin mas adecuado, se

ensayaron tres tcnicas diferentes: (Anexo 2.1)

Precipitacin de protenas en un medio con alto contenido

en sales (Salting out) (Miller et al., 1988; Cheng et al., 1995). Ebullicin en presencia de Chelex como resina quelante

de metales divalentes. (Walsh et al., 1991).

Extraccin con Fenol-cloroformo basado en la extraccin

diferencial, de la molcula de ADN (Sambrook et al., 1988).

La idoneidad del mtodo de extraccin se valor analizando la

concentracin, pureza e integridad de cada uno de los extractos

geonmicos.

La concentracin se determin midiendo la absorbancia que presenta a

260 nm; y la pureza, mediante la relacin de absorbancias a 260/280 nm.

Adicionalmente se introdujo una medida a 320 nm para sustraer el fondo


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inespecfico, tras comprobar la distorsin que ste produca en un estudio

realizado con 18 extractos genmicos.

La integridad se determin realizando una electroforesis en gel de

agarosa (al 0,8%) de una alcuota del extracto. La presencia en el gel de una

sola banda de aproximadamente 23.000 Kb indica el buen estado del ADN

extrado. En caso contrario, se observa la presencia de varias bandas de pesos

moleculares significativamente mas bajos, o bien una fluorescencia difusa a lo

largo de toda la calle.

Los resultados mostraron que el mtodo ms adecuado para la tcnica

de RAPD era la extraccin con Fenol-Cloroformo.

La conservacin de los extractos de ADN (anexo 2.4) es determinante

para mantener el tamao y el nmero de fragmentos en el patrn de

amplificacin.

Generalmente, bien por conveniencia o por el propio diseo del ensayo,

el proceso de extraccin del ADN se realiza simultneamente en un nmero

elevado de muestras, almacenando los extractos hasta el momento de su

anlisis, en algunos casos despus de semanas o meses. En muchas

ocasiones, el almacenamiento conlleva un deterioro del extracto y, por tanto es

fundamental determinar los mrgenes dentro de los cuales se puede realizar un

ensayo en condiciones de seguridad.


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Se valoraron, a intervalos regulares de 3, 6, 9, 15 y 21 meses, la

integridad y concentracin del ADN de 18 extractos genmicos almacenados a

4 C durante un periodo de casi 2 aos.

Los resultados mostraron que los extractos pueden ser utilizados

durante un periodo mximo de 9 meses. Pasado este tiempo, y aunque la

concentracin de ADN permanece prcticamente constante, su integridad se ve

alterada significativamente.

3.1.2. Ajus te de los parmetros de la reaccin. (Anexo 2.1)

Con respecto a la enzima el Fragmento Stoffel de la Taq polimerasa,

existe acuerdo unnime en que esta enzima, obtenida a partir de la Taq

polimerasa por modificacin gentica, mejora la reproducibilidad en la reaccin,

y, aunque no se conoce la causa concreta, se apunta a una mayor estabilidad

trmica, menor velocidad de procesamiento (10 veces menor que la Taq

polimerasa) y / o el amplio rango de iones magnesio (2 -10 mM) en el cual

trabaja. (Lawyer et al., 1988; 1993). El resto de los componentes de la

reaccin, aunque se estudiaron diferentes concentraciones de Mg y dNTPs, se

fijaron finalmente dentro de los rangos recomendados: 4 mM de Mg y 0,2 mM

de cada dNTPs y 2 U del enzima.

En relacin a las concentraciones optimas de ADN y primerutilizadas

en la reaccin, existen opiniones contradictorias. Nosotros hemos estudiado un

amplio rango de concentraciones, desde 1 a 100 ng/25 ul de ADN y desde 1 a

8,5 pM de primer. Los resultados nos indujeron a elegir, inicialmente, 15 ng/25


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ul y 5 pM de ADN y primer respectivamente, como las proporciones mas

adecuadas. Se observ que cada cebador, en funcin del nmero de bandas

que amplifica, presenta sus propias concentraciones ptimas, lo que nos

llevara a ajustar las concentraciones en futuros trabajos.

La unin cebadorADN molde es directamente dependiente de la

temperatura de hibridacin, y pequeas variaciones en ella pueden modificar

los lugares de unin y, por tanto, los productos finales amplificados. (Penner et

al., 1993; Roehrdanz et al., 1993). En ste sentido se estudiaron, un rango de

temperaturas de hibridacin (entre 34 a 39 C), tiempos y numero de ciclos.

Los resultados obtenidos permitieron establecer la temperatura idnea en 36

C durante 75 seg. y 50 ciclos.

En lo referente a la visualizacin de los fragmentos amplificados, sta

se realiza mediante electroforesis en geles de agarosa y tincin con bromuro

de etdio. Tras estudiar diferentes voltajes, tiempos (de 1 a 4h) y

concentraciones, se determin una tensin de 115 V durante 4 h y 2.1% de

agarosa como condiciones ptimas para conseguir una buena separacin entre

los fragmentos o bandas. La incorporacin del bromuro de etdio (0,5 g/ml) se

realiza durante la preparacin del gel, antes de que se solidifique, lo que

permite la comparacin fluorimtrica de las bandas, a la vez que se minimiza el

manejo de este compuesto.

Para evitar la subjetividad en la interpretacin de los resultados por parte

del operador, la imagen del gel es capturada y analizada por densitometra


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mediante soporte informtico.

3.2. CAPACIDAD PARA LADETECCIN DE DAO AL ADN (Sensibil idad)

(Anexos 2.1, 2.2, 2.4, 3.1, 3.2)

La deteccin de alteraciones en el ADN de las clulas expuestas es

tericamente sencilla, ya que las variaciones observadas en los patrones de

bandas de clulas controles y expuestas son interpretadas como resultado de

la accin del compuesto genotxico sobre el ADN. Por ello es importante

obtener:

1. Un Patrn de Bandas Especfico y Reproducib le.

2. Unas Condiciones ptimas para Deteccin de Dao al ADN.

3. Un Sistema de Anlis is suficientemente sensible para detectar

alteraciones en el patrn de bandas.

3.2.1 Patrn de Bandas Especfico y Reproducib le. (Anexo 2.1, 2.2)

Una vez fijadas las condiciones de la reaccin, dicho patrn de bandas

se consigui mediante una adecuada seleccin de primers.

Se probaron 26 primers. Algunos no generaron bandas, otros

proporcionaron productos de amplificacin difusa o bandas poco definidas y en

otros casos, aunque se obtuvieron bandas definidas, no presentaban

reproducibilidad intra y/o inter extractos, por lo que se seleccionaron solo

aquellos que presentaban bandas claras y altamente reproducibles. Tambin


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se estudiaron combinaciones binarias de cebadores, ninguna de las cuales

present resultados satisfactorios, bien por fallos en la amplificacin, bien por

prdida de reproducibilidad intergenmica, o bien por la aparicin de bandas

con iguales pesos moleculares que los utilizados individualmente, por lo que la

combinacin de primers no aportaba ninguna ventaja.

Finalmente, la huella gentica de las clulas pertenecientes a la lnea

celular RTG-2 qued establecida con 8 cebadores que generaban un total de

56 bandas, con una reproducibilidad superior al 80% en todas las

amplificaciones y dentro de un amplio rango de pesos moleculares

(aproximadamente entre 2000 y 300 pares de bases)

La reproducibilidad de los patrones se comprob amplificando

extractos procedentes de diferentes pases celulares (entre el pase 100 y el

135).

La especificidad de la huella obtenida se constat comparando los

patrones de bandas de otras lneas celulares derivadas de carpa (EPC) y de

hmster (CHO-K1)

3.2.2 Condiciones ptimas para la Deteccin de Dao al ADN.

(Anexos 2.2, 2.4, 3.1 y 3.2)

Despus de obtener un patrn constante y especfico, se procedi a

comprobar la capacidad de esta tcnica para detectar dao en el ADN tras


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exposiciones agudas y crnicas. En este proceso hubo que optimizar las

concentraciones de ADN molde y cebador mas adecuadas para incrementar la

sensibilidad del ensayo y evitar la presencia de falsos positivos.

Se utilizaron dos compuestos genotxicos de referencia, la Mitomicina C

(MMC) como mutgeno directo, (Anexo 2.2 y 2.4) y el Benzo(a)Pireno (BaP)

como mutgeno indirecto (Anexos 3.1 y 3.2).

MMC es un mutgeno de accin directa, ampliamente conocido por su

accin mutagnica y clastognica. En funcin de la dosis y del periodo de

exposicin, ste compuesto provoca, tanto in vivo como in vitro, sustitucin

de bases, incremento en el intercambio de cromtidas hermanas, aberraciones

cromosmicas y formacin de microncleos. (IARC)

Los estudios de exposiciones agudas realizadas con MMC, (1 y 0,5 g/ml

durante 4 y 4, 6 y 8 h respectivamente) nos condujeron a ajustar tanto las

concentraciones de ADN molde, (de 15 a 5 ng / 25 l) como las de cebador (de

5 a 4 pM). Las condiciones finalmente fijadas resultaron ptimas en la

deteccin de mutaciones, incluso para primers que generan un nmero muy

diferente de productos finales (de una a seis bandas).

El BaP, se seleccion como compuesto de referencia, en estudios

agudos y en exposiciones prolongadas. La eleccin de dicho compuesto,

adems de por su relevancia ambiental, se bas en que es un mutgeno de

accin indirecta, es decir, los productos activos son sus metabolitos.


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El BaP pertenece al grupo de los hidrocarburos aromticos policclicos

(PAHs) que se producen a partir de la ignicin de combustibles fsiles. Est

clasificado por la EPA como polucionante prioritario debido a su persistencia,

carcinogenicidad y alta capacidad de acumulacin a lo largo de la cadena

trfica (Kanaly et al., 2001).Este compuesto, despus de ser metabolizado se

transforma y da lugar a formas altamente reactivas, capaces de formar enlaces

covalentes con el ADN. En este tipo de estudios, donde los productos activos

son los metabolitos, la lnea celular RTG-2 presenta la ventaja de retener cierta

capacidad metablica, lo que le permite transformar el BaP en sus

intermediarios activos (Thornton et al.,1982).

El BaP se utiliz para establecer la sensibilidad de la tcnica en las

condiciones anteriormente fijadas, comparndola con la induccin de

microncleos, utilizando para ello la misma lnea celular, y las mismas

concentraciones y periodos de exposicin. Los resultados, adems de

confirmar que sus efectos son dependientes del tiempo y de la dosis, mostraron

que la tcnica de RAPD presentaba una mayor sensibilidad. La concentracin

mnima de compuesto genotxico necesario para la induccin de microncleos,

era prcticamente el doble de la requerida para detectar alteraciones en el

patrn de bandas previamente establecido. No obstante, la sensibilidad estaba

en funcin del primer utilizado.

Las variaciones observadas en el patrn de bandas del ADN de las

clulas expuestas, tanto a MMC como a BaP, respecto a clulas control,


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consistieron en diferencias en la intensidad y / o en la ausencia y / o presencia

de nuevas bandas.

La valoracin de estas diferencias requiri el desarrollo de una

metodologa de anlisis precisa y objetiva, para minimizar la variabilidad del

mtodo y facilitar la interpretacin de resultados.

3.2.3. Sistema de Anlisis para la Deteccin de Alteraciones en el Patrn

de Bandas. (Anexo 2.2)

Como prctica habitual, y para evitar errores a lo largo del proceso, en

cada gel se corrieron conjuntamente controles y expuestos (cada uno de ellos

al menos por triplicado), un patrn de pesos moleculares y un blanco

consistente en todos los reactivos excepto ADN molde. Adems, para cada

ensayo, los geles se realizan, al menos, por duplicado y en diferentes das. El

anlisis de las diferencias entre controles y expuestos se objetiv mediante un

proceso de captacin de imagen computerizado.

En el anlisis del perfil fluorimtrico de cada gel, se estudiaron las

diferencias cualitativas y cuantitativas. Las primeras, desaparicin de bandas o

la aparicin de otras nuevas, se expresaron como porcentajes respecto al

nmero de repeticiones realizadas.

Los anlisis cuantitativos se llevaron a cabo mediante un software

especfico, considerando inicialmente tres parmetros: altura, volumen y


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porcentaje de amplificacin de cada una de las bandas. Las diferencias entre

controles y expuestos de cada uno de estos parmetros, se establecieron

mediante el anlisis de la t-Student, confirmando los resultados mediante el

test de U-Mann-Whitney. Todos los parmetros analizados mostraron

diferencias estadsticamente significativas (p


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gran ayuda en los estudios en donde las observaciones de los efectos sobre la

dotacin gentica deben realizarse tras varias generaciones.

Se expusieron clulas RTG-2 a una baja concentracin de BaP (0,05

g/ml) y tras 3, 15 y 30 das de exposicin, se extrajo y analiz el ADN. Los

resultados, al igual que los obtenidos en la exposicin aguda realizada con este

mismo compuesto, presentaron una relacin tiempo y dosis dependiente,

confirmndose tambin la sensibilidad selectiva de los primers utilizados.

Particularmente interesante fue la observacin de la aparicin de nuevas

bandas altamente repetitivas, tanto en el 100% de las amplificaciones como en

la totalidad de los extractos analizados, tras el mayor periodo de exposicin.

3.3. CAPACIDAD PARA PREDECIR EL DAO IN VIVO .

(Anexos 2.3 y 4.1)

Los sistemas in vitro presentan grandes ventajas cientficas tcnicas,

econmicas y ticas, pero deben ser capaces de predecir los efectos que se

observaran en la especie in vivo. Por lo tanto, la capacidad de extrapolacin

de los resultados es requisito fundamental, por razones obvias, para su

aplicacin.

En el caso concreto de la deteccin de alteraciones en el ADN mediante

la tcnica de RAPD, la capacidad predictiva del ensayo vendra determinada

por:


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1. La Simili tud Gentica entre los Sistemas in vivo e in vitro,

que se manifiesta en el grado de semejanza de sus respectivos

patrones de bandas y

2. La Simil itud de los Efectos in vivo e in vitro producidos por

un mismo agente txico.

3.3.1. Simili tud Gentica entre los Sistemas in vivo e in vitro .(Anexo 2.3)

Se compar el patrn de bandas de la lnea RTG-2 con el de los

individuos de trucha arcoiris, especie de la que procede. Para ello, se utilizaron

33 individuos procedentes de 3 piscifactoras distintas. El ADN se extrajo a

partir de clulas de sangre perifrica, y las amplificaciones se realizaron

mediante los cebadores inicialmente seleccionados para la caracterizacin de

la lnea celular RTG-2. Para comparar el patrn de bandas de cada uno de los

individuos con la lnea celular, se amplificaron los resultados conjuntamente y

por duplicado en un mismo gel.

Finalizado este proceso, se constat que los extractos genmicos de

todos los individuos generaban un total de 73 fragmentos frente a los 56

obtenidos en la lnea celular. Este menor nmero de bandas est relacionado

con el carcter homocigtico de la lnea celular. El anlisis comparativo de los

patrones mostr una gran concordancia, ya que casi un 75% de las bandas se

encontraron en ambos sistemas. Las restantes se debieron a la presencia de


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polimorfismos.

Las amplificaciones de todos los cebadores mostraron in vivo bandas

polimrficas, consecuencia de su diversidad gentica, pero su nmero estuvo

en funcin del cebador utilizado. La similitud observada en los patrones de

bandas es una consecuencia de la homogeneidad que presentan ambos

sistemas. As, el ndice de similaridad inter-poblacional in vivo / in vitro

obtenido (0,931) est muy prximo al valor mximo 1.

Igualmente, en el dendrograma de distancias genticas construido entre

todos los individuos analizados y la lnea RTG-2, se observaron dos brazos

indistintamente formados por individuos pertenecientes a todas las poblaciones

y la lnea celular RTG-2. Como conclusin de este trabajo y para estudios

posteriores, se seleccionaron de entre los primers inicialmente ensayados,

aquellos cuyo patrn de bandas presentaba una mayor concordancia in vivo

e in vitro.

3.3.2. Simi litud de Efectos in vivo e in vitro. (Anexo 4.1)

Una vez constatada la similitud gentica de ambos sistemas, se realiz un

ensayo in vivo con el mismo agente (BaP), que permitiera comprobar si los

efectos observados in vitro se confirmaban in vivo.

Se realiz una exposicin subletal, mediante una inyeccin

intraperitoneal, y se valoraron sus efectos a diferentes tiempos (1 - 4 meses),


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comparando el patrn de bandas obtenido a partir del ADN de clulas de

sangre perifrica.

Los anlisis cualitativos y cuantitativos confirmaron los resultados in

vitro, mostrando la aparicin de nuevas bandas y alteraciones en su

intensidad. No obstante, la presencia de bandas polimrficas dificult el anlisis

entre los grupos de individuos tratados y no tratados, de manera que las

comparaciones solamente se pudieron realizar en un mismo individuo antes y

despus del tratamiento. Esta es la mayor limitacin que presenta la tcnica de

RAPD en los estudios in vivo. El sistema de agrupacin de bandas se mostr

especialmente adecuado para evidenciar los efectos del contaminante. No

obstante, y debido al pequeo nmero de individuos analizados en este

estudio, no es posible extraer conclusiones determinantes, ya que la propia

susceptibilidad individual requiere el anlisis de muestras de gran tamao. De

cualquier manera los resultados obtenidos son, sin duda, la manifestacin de

las alteraciones producidas por este compuesto en el material gentico, tanto

in vivo como in vitro, demostrando claramente la capacidad de la lnea

celular RTG-2, tanto para metabolizar este conocido promutgeno, como para

predecir los efectos genotxicos que se observaran en los individuos

expuestos.

Con este trabajo, slo hemos pretendido apuntar la capacidad

metodolgica del sistema desarrollado y, es evidente que para poder llegar a

conclusiones ms fiables que permitan transferir dichos resultados in vitro a

los sistemas in vivo, son necesarios estudios ms completos y ambiciosos


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que exceden de los objetivos de este trabajo.


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Discusin. 49

4. DISCUSIN

Uno de los objetivos de la ecotoxicologa, es proporcionar metodologas

sensibles y realistas que permitan acometer las valoraciones de riesgo con

mayor grado de seguridad. Actualmente, en los foros de consenso internacional

sobre seguridad de sustancias qumicas para el medio acutico (Convenio

OSPAR, Convenio de Londres y de Barcelona) , se est planteando la poltica

de eliminacin de la contaminacin en su origen, recomendando la adopcin

del concepto de sustitucin de las sustancias qumicas ms peligrosas, o bien

reduciendo sus niveles de emisin a cero. Esta poltica, que acarrear una gran

controversia en particular por parte de la industria, se debe en gran medida a la

ausencia de metodologas prcticas capaces de predecir efectos a largo plazo

sobre las poblaciones expuestas. El desarrollo de nuevos mtodos, que

contribuyan a la monitorizacin de los efectos que producen los compuestos

qumicos de relevancia medioambiental sobre los organismos y poblaciones

expuestas, es hoy en da, por tanto, una prioridad en ecotoxicologa.

Las tcnicas moleculares que permiten la obtencin de la huella gentica

o patrn de bandas especfico del sistema biolgico utilizado, pueden aportar

nuevas herramientas en la deteccin de efectos genotxicos sobre los

individuos y poblaciones expuestas.

La aparicin a principios de los noventa de este tipo de tcnicas, que no

requeran el conocimiento de la secuencia de ADN, supuso una autnticarevolucin en el campo de la ecotoxicologa gentica, pues permiten obtener


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Discusin. 50

huellas genticas especieespecficas, poblacinespecficas e incluso

individuoespecficas. Esta es una de las razones por las cuales la literatura

cientfica que se puede encontrar sobre el tema, sea prcticamente coincidente

en el tiempo y se deba en su mayora a los trabajos de tres o cuatro equipos de

investigacin en todo el mundo que hemos trabajado simultneamente.

La obtencin de un patrn de bandas especifico de un determinado ADN

permite detectar cambios en dicha molcula tras ser expuesta a diferentes

factores de estrs, como son los contaminantes fsicos o qumicos (Kubota et

al., 1992,1995). Con estas tcnicas, la huella gentica se obtiene mediante una

PCR que utiliza primers cortos y de secuencia arbitraria. Se han desarrollado

tres protocolos diferentes, de los cuales el de AP-PCR y particularmente el de

RAPD han sido los que se han aplicado de forma mayoritaria.

Los primeros trabajos aplicaron la tcnica de AP-PCR. Su protocolo

utiliza altas temperaturas de hibridacin, permitiendo aumentar la especificidad

cebador-molde y obtener un nmero reducido de fragmentos finales. Por el

contrario, la tcnica de RAPD, debido a las bajas temperaturas que utiliza (34-

39 C), permite multiplicar los lugares de unin cebadorADN molde y por tanto

aumentar el nmero de bandas o productos finales. Sin embargo, la falta de

especificidad de muchas de estas uniones, hace que ligeras variaciones en

algunos de los parmetros que intervienen en la reaccin, alteren la intensidad

e incluso el nmero de los productos amplificados. Todo ello ha contribuido a

cuestionar la reproducibilidad de sus resultados y en definitiva, la idoneidad de

esta tcnica (Abed et al., 1995; Bassam et al., 1992; Ellsmorth et al., 1993;


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Discusin. 51

Meunir and Grimont 1993; Park and Kohel, 1994; Penner et al., 1993; Regli et

al., 1995).

Nuestra hiptesis inicial parti de la base de que si los diferentes

parmetros que intervienen en la reaccin eran minuciosamente

estandarizados, los resultados llegaran a ser altamente repetitivos y por tanto

la tcnica podra ser aplicada satisfactoriamente en ecotoxicologa. Ello ha

supuesto que el trabajo realizado en esta tesis haya sido eminentemente

metodolgico.

Uno de los factores a controlar es la integridad del ADN utilizado como

molde. Durante la fase de hibridacin, el cebador busca o explora a lo largo de

todo el genoma, secuencias complementarias a las que unirse. Slo si existen

lugares de unin en ambas cadenas del ADN y a distancias adecuadas, el

fragmento comprendido entre ambos ser amplificado. Si el ADN ha sufrido

roturas durante el proceso de extraccin o conservacin, algunos de los

lugares de unin pueden verse daados y por tanto, afectar a la

reproducibilidad de los resultados finales. De la gran cantidad de mtodos de

extraccin, incluyendo kits comerciales, de que se dispone en la actualidad,

slo pueden utilizarse aquellos que no rompan la molcula de ADN (Black,

1993; Cheng et al., 1995). Segn nuestros resultados, la extraccin con fenol

cloroformo proporciona un ADN de alta eficiencia que puede ser almacenado

durante varios meses a 4 C sin alterarse, lo que le convierte en un mtodo

ptimo.


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Discusin. 52

Adems, en la reaccin de amplificacin propiamente dicha, intervienen

un gran nmero de variables que cada equipo de investigacin ha

protocolizado a su eleccin. Algunas de ellas estn condicionadas por el tipo de

polimerasa y el ciclo de temperaturas elegido (Roehrdanz y col., 1993; Penner

y col., 1993; Meunier and Grimont 1993). La Taq polimerasa fue empleada por

Williams y colaboradores en 1990 en el desarrollo del mtodo, pero en la

actualidad el fragmento Stoffel de la Taq polimerasa esta siendo

preferentemente utilizado, pues a bajas temperaturas de hibridacin

proporciona resultados ms reproducibles y presenta una actividad ptima

dentro de un rango ms amplio de concentraciones de iones magnesio (Nicol et

al., 1998; Schiliro et al., 2001; Aljanabi et al., 1999; Lawyer et al., 1993).

Algo semejante ha sucedido con el ciclo de temperaturas. La unin

cebadorADN molde es directamente dependiente de la temperatura de

hibridacin y pequeas variaciones en ella pueden modificar los lugares de

unin y, por tanto, los productos finalmente amplificados. Penner y col., (1993)

en un estudio comparativo, comprobaron que la diferencia en los resultados

finales entre distintos laboratorios, era debida a las diferencias de temperaturas

conseguidas por los termocicladores en el interior de los tubos de amplificacin,

a pesar de estar igualmente programados. Williams, y col., (1990) al desarrollar

el mtodo sugirieron la imposibilidad de utilizar temperaturas superiores a 40

cuando se trabajaba con primers cortos de 10 pares de bases. Posteriormente,

sin embargo, se han desarrollado protocolos para la deteccin de mutaciones

en el intervalo de temperaturas que va desde 35C (Conte et al., 1998) a 50C

(Atienzar et al., 2000b). En nuestro caso la temperatura ptima se ha fijado en


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Discusin. 53

36 C.

La concentracin de ADN molde y primer son factores que afectan en la

obtencin de un patrn de bandas constante. Aunque existen diferentes

opiniones sobre su influencia (Van Belkum 1994; Welsk and McClelland 1990,

Muralidharan and Wekeland 1993; Davin-Regli et al., 1995), en nuestros

estudios han resultado ser de gran importancia para la obtencin de resultados

repetitivos y para eliminar la presencia de bandas errticas. No obstante,

hemos podido comprobar que cada cebador, en funcin del nmero de bandas

que amplifica, presenta concentraciones ptimas de trabajo, lo que

posiblemente sea la causa de las diferentes opiniones al respecto. Adems, la

concentracin de ADN molde fue decisiva para la deteccin de diferencias en el

ADN de clulas control y expuestas a compuestos genotxicos, y su

optimizacin ha permitido aumentar la sensibilidad, eliminando la presencia

falsos positivos. El ADN de las clulas expuestas, en funcin de las

concentraciones y tiempos de exposicin utilizados, permanece intacto en un

cierto nmero de copias. Cuando se utilizan concentraciones de ADN altas (20

ng / 25 l), el nmero de copias inalteradas es suficiente para que el primer (4

pM) pueda encontrar secuencias donde hibridar y dar lugar, finalmente, a

patrones de bandas no alterados. Sin embargo, cuando la concentracin de

ADN es menor, (5 ng / 25 ul) y a pesar de que en trminos relativos la

proporcin de copias intactas sea la misma, el numero absoluto es mas bajo e

insuficiente, incrementando as la probabilidad de mostrar secuencias

alteradas.


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Discusin. 54

El ajuste de la concentracin de ADN a cantidades tan bajas, requiere

una gran precisin para la cuantificacin de los extractos, en este sentido, una

lectura adicional a 320 nm permite eliminar las interferencias debidas a otros

componentes presentes en el medio, evitando la sobrevaloracin de la medida.

Adems de las variables consideradas, la obtencin de un patrn de

bandas especfico y adecuado para la deteccin de genotoxicidad requiere una

meticulosa seleccin de los primers. Del total de los mismos y sus

combinaciones binarias inicialmente probadas, slo se seleccionaron 8,

siguiendo como criterio que las bandas amplificadas sean constantes y bien

definidas, y que se encuentren dentro de un amplio rango de pesos

moleculares. La necesidad de una buena reproducibilidad del patrn resulta

obvia, y la obtencin de bandas de diferentes pesos moleculares, incrementa la

sensibilidad en la deteccin de dao al ADN. (Atienzar, et al., 2001)

Por lo que respecta a la aplicacin de la tcnica de RAPD para el estudio

de alteraciones genticas in vivo, existen ciertas complicaciones. Los

individuos pertenecientes a una misma especie, presentan diferencias

individuales que se manifiestan como bandas polimrficas. Este hecho, que es

de gran inters para estudios de diversidad, es un grave inconveniente cuando

se aplica a la deteccin de genotoxicidad, pues la presencia o ausencia de

bandas entre los individuos expuestos y no expuestos, puede ser debida tanto

a la presencia de polimorfismos propios de la especie, como a la accin de

sustancias genotxicas, lo que implica, para evitar incertidumbre, la utilizacin

de muestras de gran tamao, encareciendo y complicando el estudio


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Discusin. 55

(Theodorakis, et al., 1997; 1998; Krane et al., 1998; Bickham et al., 2000). La

utilizacin de individuos genticamente homogneos, tales como clones de

Daphnia magna (Atienzar et al., 1999; 2001) o clulas pertenecientes a una

misma lnea celular, permite detectar fcilmente tales cambios, tras comparar

los patrones de bandas de individuos controles y expuestos.

La utilizacin de cultivos celulares en la deteccin de efectos

genotxicos simplifica muchos de los problemas asociados al uso de sistemas

in vivo, y pueden resultar de gran utilidad en los procedimientos de prediccin

/ valoracin de riesgo, siempre y cuando se haya constatado el grado de

similitud entre ambos sistemas. Hay que tener en cuenta que las lneas

celulares establecidas pueden poseer caractersticas genticas diferentes de

las clulas originales y, adems, muchas especies de peces presentan una

gran variabilidad en su dotacin gentica. Por ejemplo, en trucha arcoiris se

han descrito individuos con dotaciones diplides, tetraplides e incluso

aneuplides. (Al-Sabty, 1991). Por ello es imprescindible comparar ambos

patrones de bandas (in vivo/in vitro) y establecer su grado de similaridad,

mediante la deteccin de bandas comunes y / o exclusivas de cada uno de los

sistemas, con objeto de acotar mejor la extrapolacin de resultados.

La comparacin de los patrones de bandas de diferentes individuos de

trucha arcoiris y de la lnea celular RTG-2 utilizando los 8 primers

seleccionados, revel una gran concordancia, pues el 73% de las bandas que

componen el patrn de la lnea celular RTG-2 estn presentes en todos los

individuos de trucha arcoiris estudiados. La lnea celular presenta un numero


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Discusin. 56

menor de bandas que el sistema in vivo, como consecuencia de su carcter

homocigtico (Theodorakis, et al., 1997). Debido a que el numero de loci que

pueden ser analizados por esta tcnica es tericamente ilimitado (Lynch and

Milligan, 1994), aproximadamente el 50% de las bandas obtenidas in vivo

resultaron ser polimrficas, mostrando la variabilidad gentica de las

poblaciones estudiadas.

A pesar de que la tcnica de RAPD es relativamente nueva y hay una

informacin limitada de valores de referencia, el ndice de similaridad

interpoblacional in vivo/in vitro obtenido (0,931) es considerablemente mayor

al mostrado por otros autores entre poblaciones pisccolas dentro de una

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