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ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1

1.1 EL VINAGRE 1

1.2. LOS COMPUESTOS FENÓLICOS 2 1.2.1. Los compuestos fenólicos en el

vinagre de vino. 3 2. OBJETIVOS 6 3. MATERIAL Y MÉTODO 7 3.1. Material 7 3.1.1. Muestras 7 3.1.1.1. Materia prima 7 3.1.1.2. Proceso de elaboración de vinagres. 8 3.1.1.3. Codificación de las muestras 9 3.1.2. Reactivos 9 3.1.3. Instrumentación 11 3.2. Métodos 12 3.2.1. Índice de polifenoles totales 12 3.2.2. Determinación de antocianos totales 12 3.2.3. Determinación de compuestos fenólicos por cromatografía de líquidos. 13 3.2.4. Análisis sensorial 15 3.2.5. Análisis estadístico 16

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 17 4.1. Índice de polifenoles totales 17

4.2. Identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos. 19 4.2.1. Tratamiento estadístico de los resultados 22 4.2.1.1. Análisis cluster 23 4.2.1.2. Análisis de la varianza 28 a) Influencia del grosor de la madera 28 b) Relación: Madera‐Compuestos fenólicos. 29 c) Relación: Proceso de acetificación‐ Compuestos fenólicos. 33 4.3. Determinación de antocianos totales 37 4.4. Análisis sensorial 40 4.4.1. Prueba triangular 40 4.4.2. Análisis descriptivo 41 5. CONCLUSIÓN 43 6. BIBLIOGRAFÍA 44 7. ANEXO

Introducción

1. INTRODUCCIÓN 1.1. EL VINAGRE

La palabra vinagre procede etimológicamente del latín “vinum acre” de la que deriva la locución francesa “vin aigre” equivalente al vino agrio, pero en esta acepción su procedencia no queda relegada al vino, sino que cualquier sustrato amiláceo es susceptible de ser utilizado como materia prima.

Según la FAO/OMS (1982), “el vinagre es un líquido, apto para el

consumo humano, que es producido exclusivamente a partir de materias primas de origen agrícola, que contengan almidones y/o azúcares, por un doble proceso de fermentación alcohólica y acética”. Puede contener cantidades determinadas de ácido acético, y otros ingredientes opcionales (hierbas, especias, sal), lo que será regulado por la Comisión del Codex Alimentarius, según el tipo de ingrediente, al objeto de obtener un aroma peculiar y característico de cada tipo de vinagre.

Según la Reglamentación Técnico Sanitaria correspondiente (Presidencia

del Gobierno, 1993) con la denominación genérica de vinagre se designa: “el líquido apto para el consumo humano resultante de la doble fermentación, alcohólica y acética de productos de origen agrario que contengan azúcares o sustancia amiláceas, con una riqueza mínima de 50 g/L de acético, excepto para el vinagre de vino, que será, al menos, de 60 g/L”. Se entiende por grado de acidez de los vinagres su acidez total expresada en gramos de ácido acético por 100 mL, a 20ºC.

El vinagre de vino es un producto muy apreciado en los países tradicionalmente productores de vino, en especial los de la cuenca mediterránea, siendo Italia el principal país productor de la Unión Europea, seguido de España y Francia. En Italia diversos autores han apuntado ya la necesidad de proteger y explotar el vinagre de vino como producto alimentario típico nacional. La defensa del mismo debe fundamentarse en criterios de calidad, y es recomendable que estos se basen en medidas objetivas de constituyentes de su composición química y en criterios sensoriales de aceptación por el consumidor. La calidad del vinagre viene determinada tanto por la materia prima de partida como por los métodos y operaciones tecnológicas empleados en su

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Introducción

elaboración. Hoy día, el vinagre de vino se obtiene mediante dos métodos de acetificación que dan lugar a productos muy diferentes desde el punto de vista químico y organoléptico. Podemos hablar así de dos tipos de vinagre: los artesanales o producidos mediante un proceso lento de acetificación, con cultivo superficial (el que nos ocupa en este trabajo); y los obtenidos por acetificación rápida en biorreactores específicos, con cultivo sumergido. Es sabido que la manera en la que el vinagre es producido da como resultado productos de muy diferente calidad (Tesfaye et al., 2002a). Estos productos difieren en su perfil fenólico, compuestos aromáticos y contenido en ácidos orgánicos (Morales et al., 2001; Natera et al., 2003), siendo los más apreciados aquellos productos elaborados mediante método tradicional debido a sus extraordinarias características sensoriales (González‐Viñas et al., 1996).

Existe una variante intermedia entre los métodos anteriormente mencionados denominado método de Schützenbach. Este método emplea materia inerte (virutas de madera de haya) como medio de soporte para las bacterias acéticas. Las bacterias acéticas se encuentran adheridas al soporte de virutas y sumergidas en el líquido a acetificar, a su vez éste va recirculando hasta alcanzar el grado acético deseado. Se consigue así un aumento de la velocidad de acetificación. 1.2. LOS COMPUESTOS FENÓLICOS

Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios de las plantas, que están asociados con las características de flavor y color en los alimentos de origen vegetal (frutas, zumo, vino, etc…). Están presentes sobre todo en hojas, frutos, corteza e incluso madera de vegetales. Son un grupo muy amplio de compuestos químicos, mas de 8000, y se caracterizan por presentar todos ellos, el núcleo aromático de benceno, sustituido, como mínimo, con un grupo hidroxilo.

Los compuestos fenólicos se localizan en las partes sólidas de la uva (hollejo, raspón y pepitas) y son responsables del color, astringencia y estructura de los vinos, por lo que tienen una considerable incidencia en sus características organolépticas, y han sido extensamente estudiados.

La síntesis de los compuestos fenólicos en las plantas tiene lugar vía dos rutas metabólicas. La vía de los policétidos, minoritaria en plantas superiores, y la vía del ácido sikímico. Ambas vías pueden participar conjuntamente en la formación de fenoles complejos.

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Introducción

Podemos distinguir:

- Los fenoles simples son aquellos compuestos que tienen un anillo aromático simple con uno o más grupos hidroxilo, un claro ejemplo de ellos es el ácido cafeico.

- Los compuestos polifenólicos son aquellos cuya estructura está formada

por múltiples núcleos aromáticos con sustituyentes hidroxilo, como ejemplo de ellos tenemos a la (+)‐catequina y al ácido elágico (Waterhouse, 2002).

Entre los compuestos fenólicos existentes en los alimentos, se pueden

distinguir dos grandes familias los no flavonoides (ácidos fenólicos, estilbenos y taninos hidrolizables) y los flavonoides (flavanoles, flavonoles y antocianos, entre otros). 1.2.1. Los compuestos fenólicos en el vinagre de vino

En el vinagre de vino encontramos estos compuestos debido a su contenido natural en la uva o como resultado del contacto con la madera durante el envejecimiento.

El análisis de los compuestos fenólicos en los vinagres de vino ha sido

objeto de estudio de varios autores. La cromatografía líquida con detector de diodos es la técnica analítica más utilizada para su identificación y cuantificación. Los pioneros en la determinación de compuestos fenólicos en vinagres de vino por cromatografía líquida fueron Barroso et al. (1992). Ellos aplicaron por primera vez la cromatografía líquida (CL) al análisis de vinagres utilizando una extracción en rotación continua con acetato de etilo para extraer los compuestos fenólicos. La separación se llevó a cabo en gradiente usando metanol/agua/ácido acético y la identificación utilizando detector de fotodiodos.

García‐Parrilla et al. (1994) separaron e identificaron ácidos fenólicos en

vinagres de vino blanco y de Jerez, también por CL. Las muestras se concentraron con rotavapor, la separación en régimen isocrático y utilizaron detector de longitud de onda múltiple fijada a 280 nm. Con este método consiguieron una buena separación de la mayoría de los ácidos fenólicos y aldehídos característicos de vinagres. Identificaron 11 compuestos fenólicos: (+)‐catequina, vainillina y los ácidos gálico, pirogálico, protocatéquico, gentísico, p‐hidroxibenzoico, vainíllico, cafeico, siríngico y p‐cumárico. Más tarde, utilizando la inyección directa de las muestras analizaron vinagres de Jerez por

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Introducción

CL en fase reversa y detección de fotodiodos, identificando más de 20 compuestos algunos de los cuales no se habían descrito en vinagres de Jerez hasta entonces: HMF, furfural, tirosol, ácido caftárico, ácido p‐cumaroiltartárico e isoquercetina, entre otros (García‐Parrilla et al., 1996).

La cromatografía líquida con detección por espectrofotometría de masas

(CL‐EM) también se ha utilizado para determinar compuestos fenólicos en vinagres (Andlauer et al., 2000). Estos autores propusieron un nuevo método para la separación simultánea y cuantificación de ácidos fenólicos polares y flavonoides menos polares, en muestras de vinagre de vino producidos por cultivo sumergido. Identificaron y cuantificaron ácidos fenólicos (ácido protocatéquico y cafeico), flavanoles ((+)‐catequina y (‐)‐epicatequina), tanto en vinagres de vino blanco como tinto, y antocianos (delfinidina‐3‐glucosido, cianidina‐3‐glucosido, petunidina‐3‐glucosido, peonidina‐3‐glucosido, malvidina‐3‐glucosido, acetato de malvidina‐3‐glucosido y cumarato de malvidina‐3‐glucosido) en vinagres de vino tinto.

En general, podemos decir que se conoce bien la composición fenólica de

vinagres de vino blanco y de Jerez (García‐Parrilla et al., 1994, 1996, 1997, 1998; Tesfaye et al., 2002, 2004; Morales et al., 2001; Alonso et al., 2004), pero está poco explorada en los vinagres de vino tinto (Andalauer et al., 2000).

La diversidad de los vinagres de vino en el mercado y el incremento de

su demanda requiere su caracterización para establecer parámetros de control de calidad. Los compuestos fenólicos han demostrado ser buenos indicadores del origen y calidad de los vinagres. Los compuestos fenólicos de bajo peso molecular fueron útiles para diferenciar entre vinagres envejecidos y sin envejecer, así como entre vinagres de Jerez y aquellos que pertenecían a otras zonas de España (Gálvez et al., 1995).

García‐Parrilla et al. (1997 y 1998) confirmaron que los compuestos

fenólicos eran una herramienta útil para clasificar y predecir la pertenencia de las muestras de acuerdo con el método de elaboración utilizado o el origen geográfico del sustrato de partida. Basándose en su composición fenólica también fue posible diferenciar muestras de vinagres de Jerez con distinto periodo de envejecimiento (menos de 2 años, y más de 2 años) (García‐Parrilla et al., 1999).

Tesfaye et al. (2002b) lograron discriminar muestras de vinagres de vino

con distintos periodos de envejecimiento. Los vinagres se elaboraron en un fermentador de laboratorio (cultivo sumergido) utilizando vino de Jerez como sustrato de partida. Los vinagres obtenidos se sometieron a envejecimiento en barriles de madera de 16 L de capacidad. Consiguieron diferenciar muestras

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Introducción

que habían sido sometidas a envejecimiento de aquellas que no lo habían sido, poniendo de nuevo de manifiesto la utilidad de los compuestos fenólicos como indicadores de envejecimiento.

El envejecimiento acelerado de vinagres de vino mediante chips de

madera de roble resulta ser una buena práctica para disminuir el tiempo de envejecimiento (Tesfaye et al., 2004). A los 15 días de envejecimiento se observó un aumento de la concentración de ácido gálico y sobre todo de los aldehidos aromáticos (siringaldehido, sinapaldehido, coniferaldehido y vainillina).

En cuanto a la influencia de determinadas técnicas como la filtración sobre el contenido fenólico, López et al. (2005) demostraron que la clarificación del vinagre por microfiltración tangencial no afecta en gran medida al contenido de compuestos fenólicos de los vinagres tratados. Las resinas de intercambio iónico por el contrario, presentan afinidad por los ácidos hidroxicinamicos, (+)‐catequina y ácido gálico (Achaerandio et al., 2006).

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Objetivos

2. OBJETIVOS

Este estudio se centra en los compuestos fenólicos de vinagres de vino tinto elaborados mediante cultivo superficial.

El trabajo se encuadra dentro de las actividades programadas en el

proyecto financiado por el VI programa Marco de la UE (Programa CRAFT) denominado WINEGAR, en el que participan 4 universidades y 4 pymes. En él se pretende estudiar la influencia del uso de otras maderas (además del roble) y del grosor de las mismas en la calidad de los vinagres y la eficacia de la acetificación.

Las nuevas maderas propuestas en este trabajo son: cerezo, castaño y

acacia; en grosores de 2,5, 2 y 1,5 cm. Se han elegido maderas más porosas que el roble y barricas de menor grosor que las generalmente utilizadas en la elaboración del vino. La elección de un tamaño de poro superior y un grosor de madera inferior se fundamenta en conseguir una mayor transferencia de oxígeno, y por tanto mayor eficacia en la velocidad de acetificación.

Los objetivos del presente trabajo se centran en: - La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos presentes

en muestras de vinagre de vino tinto. - Estudiar los cambios en la composición fenólica durante el proceso de

acetificación en barricas de diferentes maderas.

- Estudiar la relación: tipo de madera‐compuestos fenólicos para diferentes clases de maderas.

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Material y Métodos

3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. MATERIAL 3.1.1. Muestras

3.1.1.1. Materia Prima

Se utilizaron dos sustratos de partida (vino tinto) diferentes: - Serie F: Procedencia Bannyuls (Francia), grado alcohólico 14,5 % v/v,

acidez total 0,9 g de ácido tartárico/100 ml vino, concentración de glucosa+fructosa 20,9g/L+ 43,4g/L, pH 3,4, 100 % variedad Garnacha.

- Serie T: Procedencia Priorat (Tarragona), grado alcohólico 13,6 % v/v,

acidez total 0,9g de ácido tartárico/100 ml vino, concentración de glucosa+fructosa 0,36g/L + 0,78g/L, pH 3,3, variedad Garnacha mayoritariamente.

Las dos series F y T se acetificaron en barricas de madera con cultivo

superficial. Se emplearon 4 tipos de maderas para la elaboración de las diferentes barricas; Cerezo (C), Castaño (S), Acacia (A) y Roble (R) de 60 L de capacidad, fabricadas ex profeso con idéntico tratamiento por la Compañía Botería Torner S.L. De cada madera se prepararon tres grosores distintos (2,5, 2 y 1,5 cm). En este estudio se han tomado dos barricas iguales de cada grosor, en total 48 barriles para la serie F y T (Figura 3.1).

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Material y Métodos

SERIE F

/SERIE T

C A S R

Figura 3.1. Esquema de las barricas empleadas. 3.1.1.2. Proceso de elaboración de vinagres

Antes de comenzar el proceso de acetificación, el vino de partida de la

serie F se diluyó hasta 11º alcohólico con agua. Posteriormente se le añadió el inóculo en proporción: 1/3 de inóculo + 2/3 de vino de partida, y se mezclaron bien. El vino de la serie T se mezcló directamente con el inóculo en la misma proporción que en la serie F. Seguidamente se llenaron todas las barricas con esa mezcla vino‐inóculo hasta un total de 40 Litros, siendo la relación superficie/volumen de 63 cm2/L. Las barricas habían sido envinadas previamente, y contenían un pequeño volumen residual. Inmediatamente después del llenado de las barricas se recogió una muestra de cada tipo de madera y grosor, y se las consideró como punto O. Estas muestras tenían 0,8º acéticos. Posteriormente, se recogieron muestras de cada una de las barricas al alcanzar distintos grados acéticos; 2º (punto I), 4º (punto H) y 6º (punto E).

2,5 cm 2 cm 1,5 cm

C = Cerezo A = Acacia S = Castaño R = Roble

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Material y Métodos

Este proceso fue idéntico para ambas series. La duración de los ciclos fue de uno a tres meses en los vinagres

obtenidos de la serie F y de cinco a nueve meses en los de la serie T. Esta duración depende de la temperatura ambiente de la bodega, siendo mayor para temperaturas más altas, ya que la velocidad óptima de crecimiento de las bacterias acéticas es del orden de 30º C.

3.1.1.3. Codificación de las muestras

Se han analizado 83 muestras de la serie F y 85 muestras de la serie T, todas ellas por duplicado. En total se analizaron 166 muestras por duplicado, que corresponden a los dos vinos de partida (serie F y T), muestras tomadas en fase de acetificación (2 y 4 º acéticos) así como vinagres acabados (6º acéticos).

La codificación de las muestras fue; en primer lugar: vino(W) o vinagre (V), en segundo lugar el origen: Francia (F) o Tarragona (T), en tercer lugar el punto de acetificación: 0,8 º acético (O), 2º acético (I), 4º acético (H) y 6º acético (E), en cuarto lugar la madera: Acacia (A), Cerezo (C), Castaño (S) y Roble (R), en quinto lugar el grosor: 25 mm (25), 20 mm (20), 15 mm (15), y por último el número de réplica: primera (1) y segunda (2). 3.1.2. Reactivos

a) Reactivos empleados para la determinación de los polifenoles totales.

- Ác. gálico (Fluka 48630) - Reactivo de Folin‐Ciocalteu (Merck UN3264) - Carbonato sódico (Panreac 141648) - Agua destilada

b) Reactivos empleados en la determinación de antocianos totales.

- Cloruro potásico 0,025 M, pH 1.0 (Panreac 141494) - Acetato sódico 0,4 M, pH 4,5 (Panreac 131633) - Cloruro sódico(Panreac 131659) - Ác. clorhídrico (Panreac 132176)

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Material y Métodos

c) Eluyentes y reactivos (CL).

- Acetonitrilo (Merck 1.14291.2500) - Trifluoro acético (Panreac 163317) - Agua Milli‐Q

d) Sustancias patrón

Se han empleado un total de 30 patrones comerciales, correspondientes a

los principales compuestos fenólicos del vino (Tabla 3.1).

Compuestos fenólicos Proveedor Referencia Ác. gálico Fluka 48630 Ác. protocatéquico Sigma P‐5630 Furfural Merck 13.4325 Ác. 4‐hidroxibenzoico Fluka 54630 Tirosol Fluka 79058 Ác. 3‐hidroxibenzoico Fluka 54610 5‐Hidroximetilfurfural Merck 13.4857 Ác. caftárico Chromadex ASB‐3028‐5 Ác. vainíllico Sigma V‐2250 Epigalocatequina Sigma E‐3768 Ác. cafeico Fluka 60020 (+)‐Catequina Sigma C‐1251 Aldehído vainíllico Merck 108510 Ác. siríngico Sigma S‐6881 Ác. p‐cumárico Fluka 28200 Ác. benzoico Fluka 12349 Galato de etilo Fluka 48640 Siringaldehído Aldrich 5760‐2 (‐)‐Epicatequina Fluka 45300 Ác. ferúlico Fluka 46278 Coniferaldehído Aldrich 38.205‐1 Ác. elágico Sigma 2250 Sinapaldehído Aldrich 38.215‐9 Rutina Sigma R‐5143 Malvidina‐3‐O‐glucósido Fluka 72813 Ác. cinámico Fluka 96340 Resveratrol Merck 554325 Quercetina Fluka 83370

Tabla 3.1. Patrones de compuestos fenólicos.

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Material y Métodos

3.1.3. Instrumentación - Equipo cromatográfico Agilent serie 1100, formado por:

Inyector automático Serie 1100 G1313A

Bomba cuaternaria Serie 1100 G1311A Compartimento de columna termostatizada Serie G1316A Desgasificador en línea Serie 1100 G1379A Detector de haz de fotodiodos Serie 1100 G1315B

- Columna Zorbax SB C18 en fase reversa, tamaño partícula 3,5 μm, 4,6 x 30 mm.

- Precolumna Zorbax SB C18 4,6 x 12,5 mm.

- Software ChemStation for LC 3D Rev. A.10.02 [1757] Copyright © Agilent

Technologies (1990‐2003).

- Espectrofotómetro Hitachi UV2800®, termostatizado con un sistema Peltier a 25 ºC y con accesorio multicubetas.

- Balanza Analítica “Mettler” con aproximación de 0,0001g.

- Agitadores magnéticos “Selecta‐P”.

- Baño Ultrasonido “Selecta‐P” con capacidad de 6L.

- pH‐metro “Crison” GLP22.

- Baño de agua termostatizado digital “BUCHI”.

- Vortex “IKA” 230V, 50/60Hz.

- Sistema de filtración de agua Milli‐Q “Millipore”.

- Filtros con un tamaño de poro de 0,45 μm “Millipore”.

- Micropipeta digital Nichipet EX “Nichiryo” de 10 a 100 μl.

- Micropipeta digital Nichipet EX “Nichiryo” de 100 a 1000 μl.

- Desecador de vidrio con gel de sílice.

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Material y Métodos

- Cubetas de vidrio de 10 mm de paso de luz.

- Estufa de desecación “P‐Selecta”. 3.2. MÉTODOS 3.2.1. Índice de polifenoles totales

La determinación de la concentración de polifenoles totales se llevó a cabo según el método de Folin‐Ciocalteu micro método (Waterhouse et al., 2001) expresada en equivalentes de ácido gálico (EAG). Disolución patrón de ácido gálico: se disuelven 0,500 g de ácido gálico, previamente desecado, en 100 ml de agua. Curva de calibrado: Se toman 0, 1, 2, 3, 5 y 10 ml de la disolución patrón, se vierten en matraces aforados de 100 ml y se diluyen con agua hasta enrase. La concentración de fenol en estas disoluciones es de 0, 50, 100, 150, 250 y 500 mg/L, respectivamente. De cada una de estas disoluciones se toma 20 μl y se vierten en la correspondiente cubeta. Se añade a cada cubeta 1,58 ml de agua. Se agita, se añaden 100 μl de Folin‐Ciocalteu y se mezcla bien de nuevo. Después de 30 segundos y antes de 8 minutos, se añaden 300 μl de solución de carbonato sódico al 20% y se agita bien. Se deja reposar las disoluciones en un baño a 40ºC durante 30 min y se determina la absorbancia de cada disolución a 765 nm. Se representa la absorbancia frente a la concentración. En el caso de los vinagres, se diluyen 50 μl de muestra en 1 ml para que la medida de absorbancia esté entre los valores de mínimo error en espectrofotometría. Se toman 20 μl de esta disolución y se procede como antes, a partir de la adición de 1,58 ml de agua. Para la preparación del blanco se toman 20 μl de agua y a partir de aquí se procede de la misma manera que en los casos anteriores. 3.2.2. Determinación de antocianos totales

La determinación de la concentración de antocianos totales se llevó a cabo según el método de antocianos monoméricos totales por diferencia de pH (Giusti et al., 2001).

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Material y Métodos

Las muestras se filtraron previamente con papel de filtro Watmann nº 1.

Se determinó el factor de dilución para el que la absorbancia de la muestra a la longitud de onda máxima (520 nm), se encuentra dentro del rango lineal del espectrofotómetro. El factor de dilución fue de 5.

Se preparan dos disoluciones de cada muestra; una con tampón de

cloruro potásico pH 1,0 y otra con tampón de acetato sódico pH 4,5. En ambos casos se toman 600 μl de muestra y se les añaden 2,4 ml de la disolución tampón correspondiente. Posteriormente, se mide la absorbancia de cada disolución a 520 y 700 nm, tomando como blanco agua destilada.

La absorbancia de la muestra diluida (A) se calcula de la siguiente

manera:

A = (Aλ vis‐max – A700)pH 1,0 – (Aλ vis‐max – A700)pH 4,5 La concentración de antocianos monoméricos en las muestras de vinagres se ha expresado en mg/L de glucósido de malvidina utilizando la siguiente fórmula:

Antocianos monoméricos (mg/L) = (A x MW x DF x 1000)/ (ε x 1) Donde: A= Absorbancia de la muestra MV = Peso molecular (528,89) FD = Factor de dilución ε = Absortividad molar (20200 L cm‐1 mol‐1) 3.2.3. Determinación de compuestos fenólicos por cromatografía de líquidos

Las muestras se filtraron previamente con Filtros Millex‐LCR de 13mm. El volumen de inyección fue de 20 μl.

El método utilizado fue el propuesto por Waterhouse et al. (2002). Su

principal ventaja es la del corto tiempo de análisis de las muestras (18 min). La principal peculiaridad es la separación usando un alto flujo de 4 ml/min y la aplicación de un microespliter que limita el flujo al detector en 1 ml/min. La fase móvil estaba compuesta por dos eluyentes A (agua, pH 1,5) y B (acetonitrilo, pH 1,5), ambos ajustados su pH con trifluoro acético (0,2%). El gradiente se muestra en la Tabla 3.2.

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Material y Métodos

Tiempo (min) Solvente A %(v/v) Solvente B % (v/v) 0 100 0 2 98 2 8 92 8 15 85 15 18 77 23

Tabla 3.2. Gradiente empleado.

Al final de las secuencias siempre se recalibraba con agua MilliQ (18 min).

La identificación se llevó a cabo por superposición de los espectros, con los de los patrones correspondientes y cuantificación por calibrado externo (Tabla 3.3).

Nombre del compuesto

Rango de concentración

(mg/L)

Ecuación de la recta

Coeficiente de regresión

Tr(min)

λ (nm)

Ác. gálico 10 ‐ 100 y = 12,8X – 9,1 0,99954 0,5 280

Ác. protocatéquico 4 ‐ 8 y = 6,3X + 2,0e‐1 0,99991 1,2 280

Furfural 3 ‐ 30 y = 59,6X + 7,4 0,99992 1,3 280 Ác. 4‐hidroxibenzoico 25 ‐ 100 y = 8,4X – 4,7 0,99988 2,2 280

Tirosol 2,5‐25 y = 3,5X – 6,7e‐3 0,99996 2,6 280

Ác. 3‐hidroxibenzoico 25 ‐ 100 y = 2,5X – 6,1 0,99832 3,0 280

5‐Hidroximetilfurfural 3 ‐ 30 y = 40,8X – 3,5 0,99995 3,1 280

Ác. caftárico 25 ‐ 200 y = 1,5X – 8,8e‐1 0,99987 3,05 320

Ác. vainíllico 1 ‐ 6 y = 8,3X – 1,0e‐1 0,99998 3,5 280

Epigalocatequina 10 ‐ 100 y = 1,9X + 1,8 0,99987 3,7 280

Ác. cafeico 2,5 ‐ 25 y = 15,7X – 8,9e‐1 0,99998 3,9 320

(+)‐Catequina 2,5 ‐ 25 y = 3,2X – 2,5e‐1 0,99972 3,9 280

Aldehído vainíllico 1 – 5 25 ‐ 100

y = 12,3X + 3,2 y = 14,7X – 32,6

0,99285 0,99873

4,7 280

Tabla 3.3. Calibrado externo.

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Material y Métodos

Nombre del compuesto

Rango de concentración

(mg/L)

Ecuación de la recta

Coeficiente de regresión

Tr(min)

λ (nm)

Ác. siríngico 0,5 ‐ 5 2,5 ‐ 25

y = 158X – 2,5e‐1 y = 31,5X – 8,3e‐1

0,99996 0,99998

4,8 280

Ác. p‐cumárico 25 ‐ 100 y = 26,8X – 4,8 0,99999 5.4 320

Ác. benzoico 25 ‐ 100 y = 1,8X – 2,5 0,99117 5,7 280

Galato de etilo 2,5‐25 y = 12,7X – 4,6e‐1 0,99999 5,5 280

Siringaldehído 1 – 10 25 ‐ 100

y = 11,4X – 3,4e‐2 y = 10,6X – 13,5

0,99997 0,99273 6,2 320

(‐)‐Epicatequina 2 ‐ 6 y = 4,0X – 3,0e‐3 0,99992 6,5 280

Ác. ferúlico 25 ‐ 100 y = 15,0X – 12,6 0,99981 7,2 320

Coniferaldehído 2 – 5 25 ‐ 100

y = 6,8X + 1,4 y = 8,8X – 3,1

0,99316 0,99993 9,5 320

Ác. elágico 3,2 ‐ 50 y = 1,2X – 3,4 0,99240 9,9 280

Sinapaldehído 2 ‐ 5 y = 3,3X + 6,1e‐1y = 5,1X – 2,1

0,99419 0,99995

11,0 320

Rutina 10 ‐ 100 y = 5,7X – 5,3 0,99960 11,5 365

Malvidina‐3‐O‐glucósido 10 ‐ 100 y = 9,6X + 18 0,99829 12,3 520

Ác. cinámico 25 ‐ 100 y = 30,4X + 69,8 0,99691 12,3 280

Resveratrol 10 ‐ 100 y = 31,8X – 13,6 0,99996 12,9 320

Quercetina 6 ‐ 8 y = 7,8e‐1X + 6,6e‐2 0,99732 16,3 365

Tabla 3.4. Continuación.

3.2.4. Análisis sensorial

a) Panel de cata

El panel de cata estaba formado por 8 personas entrenadas adecuadamente en la cata de vinagres (Tesfaye, 2001); todas ellas habían realizado previamente varios cursos de cata y además contaban con experiencia en la cata de vinagres. Las edades de los miembros del panel de cata comprendían entre 25‐49 años.

15

Material y Métodos

b) Prueba triangular

La prueba triangular se llevó a cabo, siguiendo la norma UNE 87‐006‐92, para comprobar si las muestras elaboradas en barricas de distintas maderas eran diferenciadas por los miembros del panel de cata.

c) Análisis descriptivo

Además de la prueba triangular, se realizó un análisis descriptivo (UNE87‐008‐92) de las muestras que habían sido discriminadas por el panel de cata. Las muestras problema se describieron mediante fichas con escala hedónica no estructurada (UNE87‐020‐93).

El panel de cata realizó varias sesiones para describir los nuevos aromas que se percibían en estas muestras de vinagre. Los miembros del panel escogieron los descriptores que más se ajustaban a los aromas de estos vinagres de manera independiente. Posteriormente se pusieron en común todos los descriptores y se redujo la lista por combinación de términos relativos. Por consenso entre los miembros del panel de cata se eligieron 10 atributos que describían a las muestras. El panel se sometió a entrenamiento de estos nuevos descriptores con referentes estándares.

Las muestras que se sometieron a análisis sensorial son todas vinagres acabados (punto E). El análisis sensorial de todas las muestras de este trabajo se realizó siguiendo el protocolo de cata de vinagres que los miembros de este mismo grupo han elaborado (Tesfaye et al., enviado).

Cada sesión de cata constaba de 4 muestras (análisis descriptivo) o 4 pruebas triangulares codificadas con 3 dígitos aleatorios. El orden de las muestras también era al azar. Las copas se llenaron con 15 ml de muestra y se cubrieron con vidrio de reloj. Las catas se realizaron en el área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Farmacia, en el laboratorio de prácticas a temperatura ambiente.

3.3. Análisis estadístico

Los análisis de la varianza, discriminante y cluster se realizaron con el programa Statistica® (Statsoft, 2001).

16

Resultados y Discusión

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. ÍNDICE DE POLIFENOLES TOTALES

En las tablas 1 a 16 del Anexo se muestran los valores del Índice de Polifenoles Totales (IPT) de las muestras analizadas.

Se utilizaron pruebas paramétricas de análisis de la varianza (ANOVA)

para comprobar la existencia de diferencias significativas en el IPT durante el proceso de acetificación y para cada una de las maderas de ambas series (Tabla 4.1).

Los valores máximos para este índice se encontraron en los vinagres

elaborados en barricas de castaño en ambas series. En concreto en las muestras de castaño de la serie T el IPT aumenta significativamente un 21% a lo largo del proceso.

En general el IPT no sufre variaciones importantes durante el proceso de

acetificación. Se observa una disminución significativa del IPT en acacia (7%) y cerezo (13%) de la serie F, y cerezo (13%) de la serie T.

MADERAS

O‐I

O‐H P‐level O‐E

I‐H

I‐E

H‐E

A 0,1261 0,0255 0,0451 0,3606 0,0790 0,2193 C 0,4385 0,4586 0,0130 0,9835 0,0284 0,0295 S 0,1461 0,1308 0,4708 0,5469 0,3412 0,2635

SERIE F

R 0,1880 0,0785 0,0585 0,6070 0,2785 0,3624 A 0,6781 0,4720 0,1997 0,7862 0,4369 0,5888 C 0,2354 0,6044 0,0214 0,8455 0,0275 0,0318 S 0,0169 0,0194 0,0079 0,2670 0,0429 0,7086

SERIE T

R 0,5724 0,4442 0,3670 1,0000 0,8964 0,8540 Tabla 4.1. Análisis de la varianza (ANOVA). Diferencias significativas (p‐valor< 0,05) en el IPT entre los distintos puntos del proceso de acetificación para cada madera.

17


Estudios anteriores demuestran cómo el IPT no cambia a lo largo de la acetificación con cultivo sumergido para vinagres de vino blanco (Morales et al., 2001) y en el caso del tinto disminuye hasta un 13 % (Andlauer at a., 2000).

Se analizó también, si existían diferencias significativas en el IPT entre

las muestras de vinagre acabado (E) procedentes de cada una de las maderas (Tabla 4.2): - En la serie F se observó que sólo existían diferencias significativas entre

los pares A ‐ C, C ‐ S, y S ‐ R.

- En la serie T se observaron diferencias significativas entre todas las maderas excepto entre R ‐ A.

A‐C

A‐S P‐level A‐R

C‐S

C‐R

S‐R

Serie F 0,0041 0,0729 0,1075 0,0069 0,2058 0,0298 Serie T 0,0112 0,0231 0,0875 0,0045 0,0176

0,0026

Tabla 4.2. Análisis de la varianza (ANOVA). Diferencias significativas (p‐valor< 0,05) en el IPT de las muestras de vinagres acabados (E), comparación entre las distintas maderas.

18


4.2. IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS.

En la Tabla 4.3 se muestran un total de 12 compuestos (ácidos fenólicos, flavanoles, estilbenos) identificados en las muestras.

Número de pico Nombre del compuesto

TR (min) λ (nm)

1 Ác. gálico 0,5 280

2 Ác. protocatéquico 1,2 280

3 Tirosol 2,6 280

4 Ác. caftárico 3,05 320

5 Ác. vainíllico 3,5 280

6 (+)‐Catequina 3,9 280

7 Ác. cafeico 3,9 320

8 Ác. siríngico 4,8 280

9 Galato de etilo 5,5 280

10 (‐)‐Epicatequina 6,5 280

11 Glucósido resveratrol 9,4 320

12 Ác. elágico 9.9 280

Tabla 4.3. Compuestos identificados en los vinagres de la serie F y T.

19


En las Figuras 4.1 y 4.2 se observan los cromatogramas de una muestra de vinagre acabado.

min0 5 10 15 20

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

DAD1 A, Sig=280,4 Ref=360,100 (VF060209.D)

1

8 9 3

2 5 12

Figura 4.1. Cromatograma de una muestra de vinagre acabado (VFEC), 280 nm.

min0 5 10 15 20

mAU

0

10

20

30

40

50

DAD1 B, Sig=320,16 Ref=360,100 (VF060209.D)

4

7

11

Figura 4.2. Cromatograma de una muestra de vinagre acabado (VFEC), 320 nm

En las tablas 1 a 16 del anexo se muestran las concentraciones en mg/L de los compuestos identificados en todas las muestras analizadas.

20


A modo de resumen en las Tablas 4.4 y 4.5 aparecen las concentraciones en mg/L de los compuestos fenólicos en los productos finales (punto E) de las distintas maderas de ambas series: - El ácido caftárico es el compuesto mayoritario, seguido del ácido gálico y

tirosol. Estos datos coinciden con los observados por otros autores en vinagres de Jerez elaborados mediante cultivo sumergido (Morales et al, 2001).

- El ácido gálico es el más abundante en las muestras producidas en

madera de castaño para ambas series (serie F; 51,8 mg/L, serie T; 165,5 mg/L).

- El glucósido de resveratrol sólo se detectó en las muestras de la serie F.

Acacia Cerezo

Compuestos VFEA VTEA VFEC VTEC

Ác. gálico 28,5±0,20 32,7±0,06 28,6±0,15 29,5±0,04

Ác. protocatéquico 6,7±0,38 11,3±0,08 5,1±0,25 5,8±0,02

Tirosol 16,1±0,71 19,7±0,32 16,8±0,46 20,1±0,2

Ác. vainíllico 1,1±0,08 1,3±0,02 1,2±0,05 1,8±0,01

(+)‐Catequina ‐ ‐ 2,3±0,00 ‐

Ác. siríngico 3,0±0,26 2,7±0,04 4,5±0,19 4,3±0,01

Galato de etilo 12,9±0,06 ‐ 7,8±0,53 ‐

(‐)‐Epicatequina ‐ ‐ ‐ ‐

Ác. elágico 2,8±0,28 5,3±0,6 1,5±0,10 4,1±0,03

Ác. caftárico 263,1±3,32 156,8±0,48 264,5±5,03 165,2±0,23

Ác. cafeico ‐ 52,7±0,00 5,4±0,15 6,0±0,01

Glucósido resveratrol 3,4±0,13 ‐ 3,3±0,22 ‐

(‐); Compuestos no detectables.

Tabla 4.4. Concentración en mg/L de los compuestos fenólicos en los distintos vinagres acabados. Media y desviación estándar.

21


Castaño Roble

Compuestos VFES VTES VFER VTER

Ác. gálico 77,9±0,99 162,7±0,07 30,2±0,10 34,0±0,06

Ác. protocatéquico 6,5±0,82 7,9±0,07 5,8±0,13 5,8±0,01

Tirosol 16,5±0,32 14,2±0,17 16,1±0,07 13,3±0,16

Ác. vainíllico 1,3±0,04 1,6±0,04 1,4±0,05 1,7±0,05

(+)‐Catequina 2,8±0,23 1,7±0,02 7,6±0,12 2,0±0,07

Ác. siríngico 4,4±0,59 4,1±0,01 4,9±0,10 4,2±0,01

Galato de etilo 10,7±1,07 17,9±0,11 9,3±0,51 ‐

(‐)‐Epicatequina ‐ 3,5±0,07 ‐ ‐

Ác. elágico 3,9±0,20 3,7±0,58 4,4±0,11±0,1

1 4,1±0,00

Ác. cafeiltartárico 268,8±0,58 186,2±0,11 273,5±2,22 176,6±0,24

Ác. cafeico 5,8±0,09 5,8±0,03 6,1±0,06 5,7±0,02

Glucósido resveratrol 3,4±0,13 ‐ 3,7±0,06 ‐

(‐); Compuestos no detectables. Tabla 4.5. Continuación.

4.2.1. Tratamiento estadístico de los resultados

Se ha empleado la estadística multivariante para analizar los resultados. En primer lugar se aplicó el análisis cluster para observar similitudes y agrupaciones que pudieran presentar las muestras sin que se determine previamente la pertenencia a un grupo. Posteriormente se comprobó si existían o no diferencias significativas en los compuestos fenólicos de vinagres elaborados en distintas maderas mediante análisis de la varianza. Finalmente se empleó el análisis discriminante para comprobar si existe una función que clasifique los vinagres en categorías correspondientes al tipo de madera.

22


4.2.1.1. Análisis cluster

Se ha empleado el método de Ward´s, incluyendo como variables los 12 compuestos polifenólicos determinados (Figuras 4.3 y 4.4).

Un primer subcluster agrupa la casi totalidad de las muestras de castaño

(48 % serie F y 86 % serie T) (se amplían en las Figuras 4.5 y 4.6).

0 100 200 300 400 500 600Linkage Distance

VFES20-2VFES20-1VFES25-2VFHS20-2VFHS15-2VFHS25-2VFES25-1VFHS15-1VFHS20-1VFHS25-1VFEC15-2VFIA20-2

VFEA15-2VFEA15-1VFIA20-1

VFEC20-1VFHA15-1VFEA20-2VFEA20-1VFHA20-1VFHA25-2VFER20-2VFHR20-2VFHC15-1VFHC20-2VFHC25-2VFIC25-1

VFEC25-2VFEC25-1VFHC15-2VFIC15-1

VFEC15-1VFHC25-1VFIR20-2

VFHR25-2VFOC15

VFHA15-2VFIA15-1

VFHA20-2VFIA15-2VFIA25-2

VFEA25-2VFEA25-1VFHA25-1VFER25-2VFHR25-1VFER15-1VFIR15-2VFIR25-2

VFEC20-2VFIC20-2VFIR15-1VFOC20

VFHR20-1VFHR15-1VFER25-1VFER20-1VFHC20-1VFIC20-1VFIC25-2

VFER15-2VFHR15-2VFIC15-2VFIA25-1VFIS15-2VFIS15-1VFIS20-2VFIS20-1VFIS25-2VFIS25-1VFIR25-1VFIR20-1VFOR20VFOR25VFOA15VFOA20VFOS15VFOS20VFOS25VFOR15VFOC25VFOA25

Figura 4.3. Análisis cluster serie F.

23


0 500 1000 1500 2000Linkage Distance

VTES15-2VTES20-2VTES20-1VTES15-1VTHS20-2VTHS20-1VTES25-2VTES25-1VTIS20-2VTIS20-1VTIS25-2

VTHS15-2VTHS15-1VTHS25-2VTHS25-1VTIS15-2VTIS15-1VTIS25-1

VTHA20-2VTEA25-2VTEA25-1VTEA15-1VTHA15-1VTEA15-2VTEC15-2VTIA15-1

VTEA20-2VTIC20-1VTOC15VTOC20

VTHC20-1VTHC25-2VTHC15-1VTIC15-2VTIC15-1VTIC20-2

VTHC15-2VTHC20-2VTIC25-2

VTER20-2VTER25-1VTER15-3VTER15-1VTER20-1

VTOS20VTOS25VTOR15VTOC25

VTEC15-1VTEC20-1VTEC20-2VTEC25-1

VTOA15VTHA15-2VTHA25-2VTIA25-2VTIA15-2

VTHA25-1VTEA20-1VTHA20-1VTIA20-2VTIA20-1VTIA25-1

VTEC25-2VTIR20-1VTIR25-1VTOR25

VTHC25-1VTHR15-1VTHR15-2VTIR15-2VTIR15-1

VTHR20-2VTHR20-1

VTOR20VTIR20-2

VTHR25-2VTHR25-1VTIR25-2

VTER25-2VTIC25-1VTOS15VTOA20VTOA25

Figura 4.4. Análisis cluster serie T.

24


0 100 200 300 400 500

Linkage Distance

VFES20-2

VFES20-1

VFES25-2

VFHS20-2

VFHS15-2

VFHS25-2

VFES25-1

VFHS15-1

VFHS20-1

VFHS25-1

VFEC15-2

VFIA20-2

Figura 4.5. Análisis cluster serie F. Primer subcluster.

0 50 100 150 200 250 300 350

Linkage Distance

VTES15-2VTES20-2VTES20-1VTES15-1VTHS20-2VTHS20-1VTES25-2VTES25-1VTIS20-2VTIS20-1VTIS25-2

VTHS15-2VTHS15-1VTHS25-2VTHS25-1VTIS15-2VTIS15-1VTIS25-1

Figura 4.6. Análisis cluster serie T. Primer Subcluster.

25


Un segundo subcluster en la serie F agrupa el 83% de las muestras correspondientes al punto cero y el 33% correspondientes al punto inicial de la acetificación (Figura 4.7). Esto significa que, efectivamente, a partir de un mismo sustrato y en las primeras fases de la acetificación las muestras son muy similares entre unas maderas y otras, diferenciándose con el tiempo. En la serie T aparece un segundo subcluster en el que se agrupan el 71% de las muestras de roble (Figura 4.8).

Finalmente, un tercer subcluster agrupa a la casi totalidad de las muestras finales (Figuras 4.9 y 4.10).

0 20 40 60 80 100 120

Linkage Distance

VFIS15-2VFIS15-1VFIS20-2VFIS20-1VFIS25-2VFIS25-1VFIR25-1VFIR20-1VFOR20VFOR25VFOA15VFOA20VFOS15VFOS20VFOS25VFOR15VFOC25VFOA25

Figura 4.7. Análisis cluster serie F. Segundo subcluster.

26


0 5 10 15 20 25

Linkage Distance

VTEC25-2VTIR20-1VTIR25-1VTOR25

VTHC25-1VTHR15-1VTHR15-2VTIR15-2VTIR15-1

VTHR20-2VTHR20-1

VTOR20VTIR20-2

VTHR25-2VTHR25-1VTIR25-2

VTER25-2VTIC25-1VTOS15VTOA20VTOA25

Figura 4.8. Análisis cluster serie T. Segundo subcluster.

0 20 40 60 80 100 120

Linkage Distance

VFEA15-2VFEA15-1VFIA20-1

VFEC20-1VFHA15-1VFEA20-2VFEA20-1VFHA20-1VFHA25-2VFER20-2VFHR20-2VFHC15-1VFHC20-2VFHC25-2VFIC25-1

VFEC25-2VFEC25-1VFHC15-2VFIC15-1

VFEC15-1VFHC25-1VFIR20-2

VFHR25-2VFOC15

VFHA15-2VFIA15-1

VFHA20-2VFIA15-2VFIA25-2

VFEA25-2VFEA25-1VFHA25-1VFER25-2VFHR25-1VFER15-1VFIR15-2VFIR25-2

VFEC20-2VFIC20-2VFIR15-1VFOC20

VFHR20-1VFHR15-1VFER25-1VFER20-1VFHC20-1VFIC20-1VFIC25-2

VFER15-2VFHR15-2VFIC15-2VFIA25-1

Figura 4.9. Análisis cluster serie F. Tercer subcluster.

27


0 50 100 150 200

Linkage Distance

VTHA20-2VTEA25-2VTEA25-1VTEA15-1VTHA15-1VTEA15-2VTEC15-2VTIA15-1

VTEA20-2VTIC20-1VTOC15VTOC20

VTHC20-1VTHC25-2VTHC15-1VTIC15-2VTIC15-1VTIC20-2

VTHC15-2VTHC20-2VTIC25-2

VTER20-2VTER25-1VTER15-3VTER15-1VTER20-1

VTOS20VTOS25VTOR15VTOC25

VTEC15-1VTEC20-1VTEC20-2VTEC25-1

VTOA15VTHA15-2VTHA25-2VTIA25-2VTIA15-2

VTHA25-1VTEA20-1VTHA20-1VTIA20-2VTIA20-1VTIA25-1

Figura 4.10. Análisis cluster serie T. Tercer subcluster.

4.2.1.2. Análisis de la varianza

a) Influencia del grosor de la madera

En primer lugar se observó que no existían diferencias significativas en la composición fenólica de las muestras procedentes del mismo sustrato, madera y distinto grosor. Ya se había comprobado que el grosor de la madera no tenía ninguna influencia en la eficacia de la acetificación, así pues a partir de este momento se consideran replicados de una misma muestra y así se han incluido en el estudio estadístico.

28


b) Relación: Madera ‐ Compuestos fenólicos

Para comprobar si existían diferencias significativas en la composición fenólica de las muestras en función de la madera se utilizaron pruebas paramétricas de análisis de la varianza (ANOVA). Se observó que la concentración de la mayoría de los compuestos, sobre todo de los ácidos fenólicos, presentaba diferencias significativas en relación al tipo de madera (Tabla 4.6).

COMPUESTOS

A‐C


C‐S

C‐R

S‐R

Ác. Gálico 0.55730 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.0000 Ác. Protocatéquico 0.00000 0.00000 0.25987 0.00000 0.00000 0.49498 Tirosol 0.00539 0.00547 0.72457 0.71660 0.00752 0.00983 Ác. Vainíllico 0.00012 0.00000 0.00000 0.03805 0.22799 0.15447 (+)‐Catequina 0.80685 0.01804 0.01355 0.01272 0.01397 0.34781 Ác. Siríngico 0.01128 0.00001 0.00000 0.01424 0.00467 0.23475 Galato de Etilo 0.01009 0.00020 0.00011 0.02050 0.02292 0.55462 Ác. Caftárico 0.86506 0.14649 0.02716 0.19750 0.03802 0.00402

Tabla 4.6. Análisis de la varianza (ANOVA) de las muestras de la serie F. Diferencias

significativas (p‐valor < 0,05) entre las distintas maderas.

COMPUESTOS

A‐C


C‐S

C‐R

S‐R

Ác. Gálico 0.06369 0.00000 0.15472 0.00000 0.00000 0.00000

Ác. Protocatéquico 0.00000 0.00099 0.00000 0.00000 0.03132 0.00003

Tirosol 0.42413 0.00000 0.00965 0.00002 0.06642 0.00992

Ác. Vainíllico 0.00000 0.01266 0.00000 0.00000 0.00001 0.00000

(+)‐Catequina 0,15460 0,00001 0,00000 0,00000 0,00000 0,08724

Ác. Siríngico 0.02043 0.00000 0.00000 0.00012 0.00001 0.00568

Galato de Etilo 0.00001 0.00000 ‐ 0.00000 ‐ ‐

Ác. Caftárico 0.09328 0.00000 0.00003 0.00000 0.00013 0.00047

Tabla 4.7. Análisis de la varianza (ANOVA) de las muestras de la serie T. Diferencias

significativas (p‐valor < 0,05) entre las distintas maderas.

29


Se realizó un análisis discriminante al objeto de clasificar las muestras por tipo de madera. Sólo se incluyeron muestras en proceso de acetificación y vinagres acabados, es decir, que habían tenido contacto con la madera.

La función se construyó con el método estándar y las variables

anteriormente citadas (Tablas 4.6 y 4.7). La función de clasificación obtenida presenta los coeficientes recogidos en las Tablas 4.8 y 4.9, para las series F y T respectivamente. Con estas funciones las muestras se clasifican con un 98,6% de aciertos en la serie F y un 100% en la serie T (Tablas 4.10 y 4.11). La muestra mal clasificada de la serie F correspondía al punto I (2º acéticos).

COMPUESTOS A C S R

Ác. Gálico 84,28 78,88 78,12 85,99 Ác. Protocatéquico 8,97 14,08 14,41 10,41 Tirosol ‐22,72 ‐19,90 ‐20,04 ‐19,75 Ác. Vainíllico ‐4,26 ‐4,30 ‐3,84 ‐3,56 (+)‐Catequina 17,34 31,65 33,88 33,77 Ác. Siríngico ‐4,93 ‐3,44 ‐3,05 ‐3,53 Galato de Etilo 17,55 16,81 16,63 17,49 Ác. Caftárico ‐2599,76 ‐2533,76 ‐2538,48 ‐2698,33 Constante 84,28 78,88 78,12 85,99

Tabla 4.8. Función de clasificación de las muestras de la serie F.

COMPUESTOS A C S R Ác. Gálico ‐0,348 ‐0,429 ‐0,947 ‐0,176 Ác. Protocatéquico 14,750 11,788 12,048 11,627 Tirosol 2,199 1,567 0,356 1,891 Ác. Vainíllico 17,243 21,269 9,462 21,608 (+)‐Catequina 5,655 3,828 8,468 15,482 Ác. siringico 17,311 24,960 37,110 24,532 Galato de Etilo 0,763 2,576 17,397 0,800 Ác. Cafeiltartárico 3,133 3,171 3,527 3,311 Constante ‐381,994 ‐386,289 ‐548,521 ‐432,075

Tabla 4.9. Función de clasificación de las muestras de la serie T.

30


MADERAS Porcentaje A C S R

A 94,4 17 1 0 0

C 100,0 0 18 0 0

S 100,0 0 0 18 0

R 100,0 0 0 0 18

Total 98,6 17 19 18 18

Tabla 4.10. Matriz de clasificación de las muestras de la serie F.

MADERAS Porcentaje A C S R

A 100,0 18 0 0 0

C 100,0 0 18 0 0

S 100,0 0 0 18 0

R 100,0 0 0 0 18

Total 100,0 18 18 18 18

Tabla 4.11. Matriz de clasificación de las muestras de la serie T.

Al representar las raíces de las funciones en el espacio (Figuras 4.11 y 4.12) existe cierto grado de agrupación en función del tipo de madera. Como se puede observar para la serie T (Figura 4.12), son las muestras elaboradas en castaño las que aparecen más separadas del resto, coincidiendo con los resultados obtenidos en el análisis cluster (Figura 4.6). Por el contrario las pertenecientes a maderas de acacia y cerezo son las más difíciles de diferenciar.

Los coeficientes normalizados de las funciones discriminantes se

muestran en las Tablas 4.12 y 4.13.

31


A C S R-20 -15 -10 -5 0 5 10

Raíz 1

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

Raí

z 2

Figura 4.11. Coordenadas de las muestras de la serie F en el espacio discriminante.

A C S R-20 -15 -10 -5 0 5 10

Raíz 1

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

Raí

z 2

Figura 4.12. Coordenadas de las muestras de la serie T en el espacio discriminante.

32


COMPUESTOS Raíz 1 Raíz 2

Ác. gálico 0,812074 ‐0,763296 Ác. protocatéquico ‐0,449887 0,716488 Tirosol 0,358631 ‐0,196963 Ác. vainíllico 0,068234 0,062642 (+)‐Catequina 0,159148 0,359058 Ác. siríngico 0,801889 0,607419 Galato de etilo 0,739266 0,245257 Ác. caftárico ‐0,503260 0,458453 Autovalor 9,772040 3,878752 Acumul. % 0,629776 0,879749

Tabla 4.12. Coeficientes normalizados de las variables canónicas de las muestras de la

serie F.

COMPUESTOS Raíz 1 Raíz 2

Ác. gálico 0,82175 ‐0,86989 Ác. protocatéquico 0,08202 0,49817 Tirosol 0,31043 0,00339 Ác. vainíllico 0,88783 ‐1,07275 (+)‐Catequina ‐0,02658 ‐0,86578 Ác. siríngico ‐1,16126 ‐0,74598 Galato de etilo ‐2,36692 0,81353 Ác. caftárico ‐0,16210 ‐0,15985 Autovalor 45,86047 5,75267 Acumul. % 0,84336 0,94915

Tabla 4.13. Coeficientes normalizados de las variables canónicas de las muestras de la

serie T.

c) Relación: Proceso de acetificación‐Compuestos fenólicos

Los ácidos fenólicos tanto benzoicos como hidroxicinámicos no modifican su concentración a lo largo del proceso en concordancia con estudios previos de acetificación de vinos de Jerez en cultivo sumergido (Morales et al., 2001).

33


Las concentraciones de (+)‐catequina y glucósido de resveratrol disminuyen significativamente a medida que avanza el proceso (Figuras 4.13 y 4.14). No se puede asegurar si la pérdida se produce por polimerización (Escribano‐Bailón et al., 1996, Saucier et al., 1997), precipitación o por oxidación.

O I H E

PROCESO

0

2

4

6

8

10

12

14

16(+

)-Cat

equi

na

Figura 4.13. Análisis de la varianza (ANOVA) serie F. Disminución de la concentración

de (+)‐Catequina a medida que avanza el proceso de acetificación.

O I H E

PROCESO

3,1

3,2

3,3

3,4

3,5

3,6

3,7

3,8

3,9

4,0

4,1

4,2

4,3

4,4

Glu

cósi

do d

e re

sver

atro

l

Figura 4.14. Análisis de la varianza (ANOVA) serie F. Disminución de la concentración

del glucósido de resveratrol a medida que avanza el proceso de acetificación.

34


El ácido gálico y el galato de etilo aumentan su concentración a lo largo del proceso de acetificación en las muestras producidas en madera de castaño para ambas series (Figuras 4.15 y 4.16). Esta tendencia sólo se observa para esta madera.

Todas las muestras pertenecientes al punto O de las diferentes maderas

parten de una concentración similar de ácido gálico (29‐30 mg/L). Sin embargo, en las muestras de castaño se produce un aumento significativo a medida que avanza el proceso (serie F: 30‐77,9 mg/L; serie T: 31‐162,7 mg/L), mientras que en el resto de las maderas permanecen prácticamente invariables.

Esto coincide con los resultados presentados por Salatgoity‐Auguste et

al. (1986). Ellos observaron que en medio ácido (pH 2) los extractos de taninos hidrolizables procedentes de la madera de castaño contenían mayor proporción de ácido gálico que aquellos que procedían de la madera de roble. El ácido gálico procede de la hidrólisis de los galotaninos de la madera. Por tanto, el aumento de este compuesto durante el proceso de acetificación se produce por la cesión de la madera en el medio ácido del vinagre. Como consecuencia de una alta concentración de ácido gálico y etanol en el medio se favorece la formación del galato de etilo.

O I H E

PROCESO

20

30

40

50

60

70

80

90

Ácid

o ga

lico

Figura 4.15. Análisis de la varianza (ANOVA) serie F. Aumento del ácido gálico en las

muestras acetificadas en madera de castaño durante el proceso de acetificación.

35


O I H E

PROCESO

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Aci

do g

alic

o

Figura 4.16. Análisis de la varianza (ANOVA) serie T. Aumento del ácido gálico en las

muestras acetificadas en madera de castaño durante el proceso de acetificación.

La madera contiene elagitaninos, galotaninos y lignina que se pueden

extraer al medio de contacto. Estos compuestos tienen una cinética de extracción diferente. Los elagitaninos se extraen fácilmente de la madera (Peng et al., 1991) y simultáneamente van sufriendo un proceso de degradación a ácido elágico. La solubilización de los fragmentos de lignina requieren de rotura de enlaces covalentes y en comparación con el proceso anterior, éste es más lento (Haslam, 1998). Como consecuencia de la oxidación de estos fragmentos de lignina se forman vainillina y siringaldehído.

En experiencias previas (Tesfaye at al., 2002b) se han detectado aldehído

vainíllico (0,01 ‐ 9,5 mg/L), siringaldehído (0,43 ‐ 15,1) y coniferaldehído (0,41 ‐ 26,8 mg/L), y ausencia de ácido elágico, en vinagres envejecidos en botas de roble. En este trabajo las barricas que se usaron eran reutilizadas, por lo que probablemente estaban ya en la segunda fase de extracción. Además, estas barricas tenían una relación superficie/volumen de 252 cm2/L y sufrieron pérdidas por evaporación, lo que supuso la concentración de estos compuestos y una mayor facilidad para su detección. Sin embargo, en nuestro trabajo las barricas eran nuevas y fabricadas exclusivamente para este proyecto, no habían sufrido aún ningún proceso de degradación. La relación superficie/volumen de las barricas era de 63 cm2/L, 4 veces menor que la del estudio anterior. Teniendo

36


en cuenta todo esto y que el tiempo de contacto con la madera fue de tan sólo 1,5 meses en la mayoría de las muestras, la presencia de ácido elágico y la ausencia de aldehídos podrían explicar que nos encontramos en la primera fase de degradación de los compuestos de la madera, donde los compuestos que se extraen con mayor facilidad son los elagitaninos.

4.3. DETERMINACIÓN DE ANTOCIANOS TOTALES

En las tablas 1 a 16 del Anexo se muestran las concentraciones, expresadas en mg/L de 3glucósido de malvidina (antociano mayoritario), de los antocianos monoméricos de las muestras analizadas.

Los valores de antocianos totales determinados para los vinos de partida

varían entre 1,20 mg/L en la serie F y 0,47 mg/L en la serie T. Estos datos contrastan con los obtenidos por otros autores, donde los valores de antocianos totales en vinos tinto estimados por el método de diferencia de pH, variaban entre 50 y 170 mg/L (Sánchez‐Moreno et al., 2003). Así pues podemos asumir que se tratan de vinos atípicos con una concentración de antocianos muy baja, probablemente debido a un alto grado de evolución y calentamiento.

Tras aplicar el análisis estadístico de la varianza (ANOVA) se

observaron, en ambas series, diferencias significativas en la concentración de antocianos monoméricos a lo largo del proceso de acetificación para cada una de las maderas (Tabla 4.14). Existe una disminución significativa de la concentración de antocianos monoméricos a medida que avanza el proceso de acetificación. En el caso de la serie F se produce una disminución media del 56% (Figura 4.17), y en la Serie T del 51,6% (Figura 4.18). Estos datos coinciden con los obtenidos por Andlauer et al. (2000) donde los antocianos disminuyen un 50% en vinagres de vino tinto obtenidos por cultivo sumergido.

37


MADERAS

O‐I

O‐H P‐level O‐E

I‐H

I‐E

H‐E

A 0,0091 0,0003 0,0014 0,0062 0,0145 0,8642 C 0,0160 0,0033 0,0006 0,0140 0,0003 0,0005 S 0,0118 0,0022 0,0008 0,0897 0,0146

SERIE F

R 0,1406 0,0180 0,0094 0,0347 0,0096 0,0821 0,2316

A 0,0607 0,0776 0,0036 0,7756 0,0039 0,0159 C 0,0450 0,0891 0,0003 0,6848 0,0020 0,0124 S 0,0456 0,0671 0,0295 0,5248 0,1073

SERIE T

R 0,0188 0,1207 0,0032 0,6261 0,0093 0,2481 0,0131

Tabla 4.14. Análisis de la varianza (ANOVA). Diferencias significativas (p‐valor< 0,05) en la concentración de antocianos monoméricos entre los distintos puntos del proceso

de acetificación para cada madera.

O I H E

PROCESO

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Anto

cian

os to

tale

s

Figura 4.17. Análisis de la varianza (ANOVA) serie F. Evolución de la concentración de los antocinanos monoméricos durante el proceso de acetificación, de las muestras

elaboradas en las barricas de cerezo.

38


O I H E

PROCESO

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Ant

ocia

nos

tota

les

Figura 4.18. Análisis de la varianza (ANOVA) serie T. Evolución de la concentración de

los antocinanos monoméricos durante el proceso de acetificación, de las muestras elaboradas en las barricas de cerezo.

En la serie F, además, se encontraron diferencias significativas entre las

muestras de vinagres acabados (E) producidos en unas maderas y otras (Tabla 14).

En la serie T no se observaron diferencias significativas entre los vinagres

acabados de unas maderas y otras (Tabla 14).

A‐C


C‐S

C‐R

S‐R

Serie F 0,0102 0,0803 0,2995 0,0430 0,0039 0,0477 Serie T 0,0846 0,6474 0,7606 0,2386 0,1028 0,7658 Tabla 14. Análisis de la varianza (ANOVA). Diferencias significativas (p‐valor< 0,05) en la concentración de antocianos monoméricos de las muestras de vinagres acabados

(E), entre las distintas maderas.

39


4. 4. ANÁLISIS SENSORIAL 4.4.1. Prueba triangular

Los resultados obtenidos de las pruebas triangulares (Tablas 4.15 y 4.16) indican que los miembros del panel son capaces de discriminar la mayoría de las muestras elaboradas en las distintas maderas con distinto nivel de significación. El panel de cata no fue capaz de diferenciar aquellas muestras de la serie T elaboradas en maderas de acacia de aquellas elaboradas en cerezo.

VFEA VFEC VFER VFES

VFEA ‐ 5% 0,1% 0,1%

VFEC ‐ 0,1% 0,1%

VFER ‐ 0,1%

VFES ‐

Tabla 4.15. Niveles de significación de la prueba triangular para las muestras de la

serie F.

VTEA VTEC VTER VTES

VTEA ‐ n.s. 0,1% 0,1%

VTEC ‐ 0,1% 1%

VTER ‐ 0,1%

VTES ‐

Tabla 4.16. Niveles de significación de la prueba triangular para las muestras de la

serie T.

40


4.4.2. Análisis descriptivo

Se realizó el análisis descriptivo de las muestras de vinagre para definir el perfil sensorial de las mismas en función de la madera en la que se acetificó. Se evaluaron mediante 10 atributos: acetato de etilo, sensación punzante, carácter vinoso, madera, frutas rojas, dulzón, almendra amarga, vainilla, pasas e impresión general. Se utilizó la ficha de cata descrita en material y métodos. Los puntos de las rectas correspondientes se transformaron en valores numéricos y a partir de ellos se construyen las gráficas de araña para cada serie (Figuras 4.19 y 4.20). De las puntuaciones de la impresión general se observa que las muestras más valoradas son aquellas acetificadas en maderas de roble y cerezo.

0

1

2

3

4

5

6

Acetato de Etilo

Sensacion Punzante

Carácter Vinoso

Olor a Madera

Fruta Roja

Aroma Dulce

Almendra Amarga

Vainillina

Pasa

Impresión General VFEA VFEC

VFER

VFES

Figura 4.19. Perfil aromático para los vinagres de la serie F.

41


0

1

2

3

4

5

6

Acetato de Etilo

Sensacion Punzante

Carácter Vinoso

Olor a Madera

Fruta Roja

Aroma Dulce

Almendra Amarga

Vainillina

Pasa

Impresión General

VTEA

VTEC

VTER

VTES

Figura 4.20. Perfil aromático para los vinagres de la serie.

42

Conclusiones

5. CONCLUSIONES

1. El IPT no sufre variaciones importantes durante el proceso de acetificación con cultivo superficial en maderas de acacia, cerezo, castaño y roble. Sin embargo, sí se encuentran diferencias significativas en el IPT entre muestras de vinagres elaborados en las diferentes maderas.

2. Se han identificado en las muestras un total de 12 compuestos fenólicos (ácidos

fenólicos, flavanoles, estilbenos). El ácido Caftárico fue el compuesto mayoritario, seguido del ácido gálico y tirosol.

3. Se observó que la concentración de la mayoría de los compuestos, sobre

todo de ácidos fenólicos (ácido gálico, protocatéquico, vainíllico, siríngico, caftárico y galato de etilo), tirosol y (+)‐catequina, presentaba diferencias significativas en relación al tipo de madera. Las funciones de clasificación construidas con estas variables clasificaron las muestras con un 98,6 % de aciertos en la serie F y un 100% en la serie T.

4. Los ácidos fenólicos tanto benzoicos como hidroxicinámicos no

modificaron su concentración a lo largo del proceso de acetificación. Por el contrario, las concentraciones de (+)‐catequina y glucósido de resveratrol disminuyen significativamente a medida que avanza el proceso.

5. El ácido gálico y el galato de etilo aumentaron su concentración durante

la acetificación en las muestras producidas en madera de castaño.

6. Se observó una disminución significativa de la concentración de antocianos monoméricos a medida que avanza el proceso de acetificación del 56 % para las muestras de la serie F y del 51,6 % para las de la serie T.

7. Los resultados obtenidos de las pruebas triangulares en el análisis

sensorial, indicaron que los miembros del panel de cata eran capaces de discriminar la mayoría de las muestras elaboradas en las distintas maderas. Las muestras más valoradas en el análisis descriptivo fueron aquellas acetificadas en maderas de roble y cerezo.

43

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47

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WATERHOUSE, A. L. (2002). Wine Phenolics. Ann. N. Y. Acad. Sci. 957, 21‐36.

48

Anexo

1

(‐) Compuestos no detectables. a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.

Tabla 1. Evolución del IPT, antocianos totales (AT) y de los compuestos fenólicos en el sustrato de acacia (mg/L). Muestras serie T.

MUESTRAS IPT AT Ác. gálico Ác. protocatéquico Tirosol Ác. vainíllico (+)‐Catequina Ác. siríngico

VTOA25 1460,0±167,13 0,47±0,00 31,69±0,02 7,14±0,01 20,19±0,10 1,67±0,00 1,73±0,01a 3,81±0,00 VTIA25‐1 31,72±0,10 7,61±0,02 20,11±0,05 1,53±0,01 ‐ 2,98±0,07 VTIA25‐2

1323,6±102,85 0,35±0,01 31,82±0,11 7,51±0,02 20,50±0,23 1,58±0,01 ‐ 2,77±0,03

VTHA25‐1 31,52±0,11 8,51±0,06 21,30±0,35 1,47±0,01 ‐ 3,00±0,23 VTHA25‐2

1460,0±38,57 0,32±0,05 31,59±0,05 8,29±0,06 21,51±0,44 1,51±0,04 ‐ 3,23±0,05

VTEA25‐1 30,61±0,04 11,99±0,08 19,85±0,37 1,40±0,03 ‐b 2,93±0,03 VTEA25‐2

1437,1±40,41 0,22±0,02 30,48±0,03 11,21±0,23 19,14±0,78 1,42±0,01 ‐ b 2,89±0,08

VTOA20 1423,6±115,71 0,38±0,00 31,38±0,00 7,14±0,00 20,90±0,00 1,63±0,00 1,71±0,00 a 4,02±0,00 VTIA20‐1 31,86±0,01 9,05±0,03 20,90±0,26 1,27±0,01 ‐ 2,76±0,03 VTIA20‐2

1441,8±64,28 0,36±0,03 31,52±0,00 7,72±0,00 20,91±0,00 1,60±0,00 ‐ 3,03±0,00

VTHA20‐1 31,26±0,08 9,57±0,04 21,52±0,04 1,18±0,01 ‐ 2,47±0,10 VTHA20‐2

1360,0±102,85 0,31±0,01 31,33±0,00 8,28±0,03 20,89±0,12 1,50±0,03 ‐ 2,88±0,06

VTEA20‐1 28,82±0,12 12,26±0,03 20,69±0,25 1,07±0,03 ‐ b 2,35±0,05 VTEA20‐2

1472,9±111,12 0,19±0,04 30,96±0,01 11,24±0,02 19,41±0,09 1,30±0,03 ‐ b 2,84±0,02

VTOA15 1296,4±115,71 0,41±0,00 31,24±0,00 6,07±0,66 20,02±0,11 1,61±0,02 ‐ 3,78±0,02 VTIA15‐1 31,99±0,06 7,50±0,03 20,59±0,19 1,57±0,04 ‐ 2,83±0,02 VTIA15‐2

1514,5±64,28 0,32±0,07 32,12±0,09 7,38±0,03 21,59±0,09 1,59±0,05 ‐ 3,31±0,03

VTHA15‐1 30,81±0,04 7,69±0,17 20,23±0,27 1,46±0,05 ‐ 2,50±0,06 VTHA15‐2

1523,6±192,42 0,38±0,00 31,13±0,01 7,92±0,07 21,24±0,54 1,49±0,00 ‐ 3,23±0,03

VTEA15‐1 29,73±0,06 10,23±0,33 19,66±0,52 1,32±0,03 ‐ 1,94±0,28 VTEA15‐2

1530,0±70,71 0,25±0,05 48,91±0,71 10,92±0,06 19,69±0,33 1,38±0,01 ‐ 3,25±0,01

Anexo

2


Tabla 2. (Continuación).

MUESTRAS Galato de etilo (‐)‐Epicatequina Ác. elágico Ác. caftárico Ác. cafeico

VTOA25 ‐ ‐ 1,76±0,01 180,99±0,02 6,31±0,00 VTIA25‐1 ‐ ‐ 3,27±0,00 178,28±0,18 ‐ VTIA25‐2 ‐ ‐ 3,21±0,75 168,48±0,14 ‐ VTHA25‐1 ‐ ‐ ‐ 174,13±0,03 ‐ VTHA25‐2 ‐ ‐ ‐ 168,79±0,34 ‐ VTEA25‐1 ‐ ‐ ‐ 163,17±0,33 53,87±0,00 VTEA25‐2 ‐ ‐ 5,29±0,59 149,66±0,00 51,52±0,00 VTOA20 ‐ ‐ 1,69±0,00 184,34±0,00 6,19±0,00 VTIA20‐1 ‐ ‐ ‐ 177,74±0,06 ‐ VTIA20‐2 ‐ ‐ ‐ 179,54±0,00 ‐ VTHA20‐1 ‐ ‐ ‐ 179,89±0,19 ‐ VTHA20‐2 ‐ ‐ ‐ 173,21±0,17 35,94±0,00 VTEA20‐1 ‐ ‐ ‐ 176,56±1,33 ‐ VTEA20‐2 ‐ ‐ ‐ 161,38±3,22 ‐ VTOA15 ‐ ‐ 2,09±0,50 171,29±0,76 7,36±0,02 VTIA15‐1 ‐ ‐ 2,47±0,00 149,37±3,16 ‐ VTIA15‐2 ‐ ‐ 2,50±0,00 172,99±0,86 ‐ VTHA15‐1 ‐ ‐ ‐ 146,43±0,12 ‐ VTHA15‐2 ‐ ‐ ‐ 169,05±0,78 ‐ VTEA15‐1 ‐ ‐ ‐ 136,69±1,80 ‐ VTEA15‐2 ‐ ‐ ‐ 156,19±1,24 ‐

Anexo

3


VTOC25 1396,4±25,71 0,45±0,00 30,12±0,04 4,98±0,05 20,38±0,01 1,85±0,05 ‐ 4,21±0,09 VTIC25‐1 31,02±0,02 5,43±0,04 20,71±0,12 1,76±0,02 ‐ 4,19±0,04 VTIC25‐2

1378,2±0,00 0,35±0,06 30,61±0,03 4,47±0,02 19,86±0,28 6,87±0,08 ‐ ‐

VTHC25‐1 31,51±0,01 6,31±0,07 20,21±0,08 1,75±0,01 ‐ 3,99±0,01 VTHC25‐2

1287,3±179,99 0,29±0,03 30,49±0,05 3,54±0,05 20,58±0,02 7,23±0,03 ‐ ‐

VTEC25‐1 29,30±0,02 6,02±0,02 19,68±0,23 1,96±0,00 ‐ 4,27±0,01 VTEC25‐2

872,9±10,10 0,20±0,02 28,53±0,01 5,79±0,05 19,28±0,25 1,74±0,06 ‐ 4,29±0,04

VTOC20 1432,7±179,99 0,41±0,00 30,67±0,07 5,97±0,01 20,59±0,14 6,66±0,09 ‐ ‐ VTIC20‐1 30,40±0,03 4,47±0,03 20,35±0,00 7,01±0,06 ‐ ‐ VTIC20‐2

1350,9±38,57 0,32±0,01 30,60±0,15 4,26±0,02 20,65±0,26 7,09±0,02 ‐ ‐

VTHC20‐1 30,21±0,00 3,66±0,09 20,16±0,51 7,13±0,16 ‐ ‐ VTHC20‐2

1378,2±51,43 0,31±0,03 30,11±0,00 3,55±0,02 20,19±0,06 7,10±0,02 ‐ ‐

VTEC20‐1 29,48±0,13 5,91±0,00 20,01±0,06 1,85±0,05 ‐ 4,17±0,02 VTEC20‐2

937,1±40,41 0,14±0,02 29,93±0,02 5,93±0,03 20,48±0,22 1,78±0,05 ‐ 4,26±0,02

VTOC15 1350,9±12,86 0,41±0,00 30,54±0,08 6,17±0,09 20,90±0,17 6,81±0,13 ‐ ‐ VTIC15‐1 30,91±0,08 4,30±0,01 20,97±0,09 7,02±0,11 ‐ ‐ VTIC15‐2

1341,8±51,43 0,39±0,01 31,16±0,06 4,21±0,00 20,85±0,61 7,47±0,02 ‐ ‐

VTHC15‐1 30,68±0,05 3,54±0,01 20,88±0,09 7,02±0,00 ‐ ‐ VTHC15‐2

1432,7±102,85 0,40±0,04 30,86±0,02 3,56±0,01 20,65±0,21 7,22±0,13 ‐ ‐

VTEC15‐1 30,04±0,05 5,54±0,04 20,87±0,12 1,65±0,02 ‐ 4,42±0,00 VTEC15‐2

1208,6±20,20 0,15±0,02 29,84±0,08 5,60±0,04 20,22±0,24 1,70±0,01 ‐ 4,44±0,01


Tabla 3. Evolución del IPT, antocianos totales (AT) y de los compuestos fenólicos en el sustrato de cerezo (mg/L). Muestras serie T.

Anexo

4

MUESTRAS Galato de etilo (‐)‐ Epicatequina Ác. elágico Ác. caftárico Ác. cafeico

VTOC25 ‐ ‐ 4,60±0,00 175,14±1,30 5,58±0,04 VTIC25‐1 ‐ ‐ 1,40±0,15 179,26±1,69 5,62±0,00 VTIC25‐2 7,31±0,05 ‐ ‐ 169,66±0,17 6,26±0,00 VTHC25‐1 ‐ ‐ 1,91±0,16 184,05±0,16 6,10±0,02 VTHC25‐2 7,31±0,01 ‐ ‐ 175,46±0,00 6,26±0,00 VTEC25‐1 ‐ ‐ ‐ 168,83±0,20 5,48±0,02 VTEC25‐2 ‐ ‐ ‐ 162,72±0,69 5,47±0,03 VTOC20 6,97±0,03 ‐ ‐ 175,93±0,37 6,33±0,02 VTIC20‐1 7,19±0,08 ‐ ‐ 172,66±0,17 5,95±0,01 VTIC20‐2 7,27±0,05 ‐ ‐ 172,70±0,48 6,01±0,02 VTHC20‐1 6,99±0,04 ‐ ‐ 173,89±0,61 5,95±0,01 VTHC20‐2 6,96±0,01 ‐ ‐ 170,71±0,29 5,90±0,01 VTEC20‐1 ‐ ‐ 3,69±0,02 166,30±0,66 6,99±0,00 VTEC20‐2 ‐ ‐ 4,50±0,04 169,16±0,06 7,35±0,03 VTOC15 7,14±0,01 ‐ ‐ 179,21±0,19 4,70±0,02 VTIC15‐1 7,50±0,03 ‐ ‐ 171,70±0,32 6,05±0,01 VTIC15‐2 7,49±0,03 ‐ ‐ 167,43±0,00 6,13±0,01 VTHC15‐1 7,36±0,06 ‐ ‐ 171,55±0,48 5,99±0,02 VTHC15‐2 7,51±0,01 ‐ ‐ 170,63±0,71 6,00±0,02 VTEC15‐1 ‐ ‐ ‐ 163,76±0,09 5,56±0,01 VTEC15‐2 ‐ ‐ ‐ 160,34±0,31 5,45±0,05



Anexo

5


VTOS25 1241,8±12,86 0,43±0,00 31,58±0,13 a 6,99±0,02 20,65±0,17 1,41±0,21 ‐ 3,84±0,17 VTIS25‐1 79,54±0,07 7,65±0,09 12,15±0,21 1,48±0,01 1,75±0,01 3,79±0,04 VTIS25‐2

1541,8±25,71 0,36±0,07 78,11±0,02 6,61±1,31 12,00±0,53 1,58±0,02 1,96±0,04 3,85±0,08

VTHS25‐1 107,79±0,36 7,47±0,06 12,47±0,08 1,54±0,01 2,05±0,03 3,91±0,00 VTHS25‐2

1687,3±0,00 0,29±0,08 106,44±0,18 5,48±0,09 11,99±0,28 1,67±0,03 2,40±0,00 3,96±0,03

VTES25‐1 134,89±0,01 b 8,23±0,04 10,91±0,15 1,65±0,04 1,75±0,04 3,91±0,03 VTES25‐2

1630,0±111,12 0,23±0,04 132,85±0,27 b 6,33±0,05 11,57±0,14 1,67±0,07 1,69±0,01 3,94±0,00

VTOS20 1369,1±38,57 0,48±0,00 33,60±0,08 a 7,32±0,00 11,83±0,36 1,60±0,05 2,87±0,19 a 3,73±0,00 VTIS20‐1 95,03±0,27 6,26±0,06 12,19±0,26 1,55±0,06 2,84±0,23 3,88±0,05 VTIS20‐2

1523,6±25,71 0,41±0,02 94,29±5,45 7,37±0,11 12,02±0,15 1,46±0,04 1,97±0,05 3,89±0,03

VTHS20‐1 132,96±0,03 5,82±0,05 11,83±0,37 1,48±0,11 2,43±0,08 3,99±0,01 VTHS20‐2

1569,1±90,00 035±0,01 126,55±0,02 7,23±0,05 12,24±0,21 1,41±0,06 2,38±0,10 3,99±0,04

VTES20‐1 216,00±0,29 b 8,92±0,04 17,69±0,49 1,65±0,03 ‐ b 4,34±0,04 VTES20‐2

1658,6±30,30 0,37±0,00 195,07±0,13 b 10,22±0,06 17,47±0,47 1,34±0,02 ‐ b 4,32±0,05

VTOS15 1405,5±64,28 0,55±0,00 32,68±0,10 a 7,01±0,05 20,31±0,01 1,68±0,01 2,04±0,07 a 3,82±0,01 VTIS15‐1 75,75±0,10 5,50±0,04 20,65±0,00 1,60±0,06 1,63±0,00 3,94±0,00 VTIS15‐2

1541,8±51,43 0,39±0,05 79,85±0,03 5,30±0,00 20,79±0,20 1,69±0,05 ‐ 3,85±0,02

VTHS15‐1 101,05±0,05 5,47±0,25 20,83±0,21 1,63±0,01 2,02±0,04 4,03±0,01 VTHS15‐2

1532,7±64,28 0,43±0,06 105,60±0,00 5,19±0,20 20,84±0,27 1,65±0,04 2,17±0,01 4,04±0,02

VTES15‐1 145,36±0,08 b 7,04±0,06 10,70±0,01 1,49±0,06 ‐ b 4,06±0,00

VTES15‐2 1565,7±60,61 0,16±0,07

169,15±0,01 b 7,34±0,23 19,48±0,32 1,56±0,07 ‐ b 4,31±0,03 (‐) Compuestos no detectables. a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.

Tabla 5. Evolución del IPT, antocianos totales (AT) y de los compuestos fenólicos en el sustrato de castaño (mg/L). Muestras serie T.

Anexo

6


VTOS25 ‐ a 4,18±0,23 1,42±0,00 176,72±13,06 5,91±0,39 VTIS25‐1 14,03±0,018 N.Q. 5,11±0,00 187,48±0,52 5,58±0,02 VTIS25‐2 14,93±1,31 2,03±0,00 ‐ 185,38±2,09 5,55±0,01 VTHS25‐1 15,54±0,31 N.Q. ‐ 187,81±0,14 5,59±0,00 VTHS25‐2 14,79±0,35 N.Q. ‐ 187,88±0,20 5,60±0,03 VTES25‐1 15,08±0,02 b 2,07±0,10 ‐ 187,30±0,11 5,44±0,01 VTES25‐2 14,85±0,12 b N.Q. ‐ 186,33±0,01 5,44±0,01 VTOS20 ‐ a ‐ 2,47±0,19 181,53±0,00 5,87±0,02 VTIS20‐1 17,53±0,01 N.Q. ‐ 183,19±0,13 5,43±0,01 VTIS20‐2 16,83±0,43 ‐ ‐ 184,91±0,45 5,48±0,01 VTHS20‐1 20,27±0,11 2,71±0,55 ‐ 184,93±0,01 5,50±0,01 VTHS20‐2 18,32±0,35 N.Q. ‐ 191,40±0,40 5,60±0,02 VTES20‐1 23,41±0,24 b 4,53±0,18 11,55±1,04 183,17±0,00 7,10±0,00 VTES20‐2 20,87±0,41 b 3,16±0,45 2,60±0,33 187,03±0,11 5,63±0,17 VTOS15 ‐ a ‐ 1,70±0,00 180,93±0,43 6,03±0,06 VTIS15‐1 14,65±0,05 N.Q. 3,45±00 181,96±0,45 5,46±0,00 VTIS15‐2 14,75±0,84 ‐ ‐ 182,89±0,12 5,57±0,22 VTHS15‐1 16,96±0,15 2,17±0,00 ‐ 184,69±0,11 5,59±0,01 VTHS15‐2 16,39±0,33 N.Q. ‐ 187,46±0,05 5,63±0,02 VTES15‐1 16,80±0,02 b 4,34±0,01 2,30±0,00 183,06±0,19 5,46±0,05

VTES15‐2 17,70±0,51 b 4,28±0,02 2,57±0,00 190,23±0,68 5,63±0,03 (‐); Compuestos no detectables. N.Q.; Compuestos no cuantificables a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.


Anexo

7


VTOR25 1405,5±38,57 0,41±0,00 31,35±0,08 6,18±0,01 20,51±0,22 1,61±0,00 ‐ 4,03±0,01 VTIR25‐1 33,94±0,07 5,51±0,04 20,61±0,40 1,67±0,03 1,81±0,04 4,26±0,10 VTIR25‐2

1505,5±77,14 0,37±0,05 33,42±0,01 5,75±0,05 19,86±0,27 1,67±0,03 2,21±0,01 4,14±0,01

VTHR25‐1 34,04±0,03 5,22±0,05 19,49±0,11 1,79±0,02 2,34±0,13 4,23±0,02 VTHR25‐2

1478,2±141,42 0,39±0,03 33,59±0,21 5,36±0,07 19,15±0,37 1,69±0,06 2,30±0,15 4,18±0,04

VTER25‐1 34,66±0,08 5,98±0,03 16,16±0,56 1,65±0,05 1,91±0,08 4,13±0,00 VTER25‐2

1437,1±121,22 0,28±0,00 33,89±0,04 6,42±0,01 18,62±0,13 1,66±0,08 2,32±0,00 4,56±0,01 VTOR20 1350,9±38,57 0,41±0,00 31,53±0,01 5,28±0,08 19,75±0,05 1,65±0,01 2,40±0,06 3,86±0,00 VTIR20‐1 33,64±0,08 5,32±0,05 20,01±0,01 1,78±0,00 1,80±0,00 4,16±0,03 VTIR20‐2

1396,4±0,00 0,37±0,04 33,07±0,05 5,11±0,04 20,59±0,13 1,76±0,02 1,89±0,04 4,08±0,02

VTHR20‐1 33,62±0,02 4,99±0,01 20,08±0,10 1,89±0,02 2,16±0,03 4,25±0,01 VTHR20‐2

1378,2±25,71 0,40±0,05 33,19±0,06 4,94±0,01 20,52±0,04 1,82±0,03 2,19±0,15 4,29±0,01

VTER2O‐1 34,43±0,03 5,88±0,00 12,27±0,19 1,76±0,05 2,05±0,09 4,27±0,01 VTER20‐2

1387,1±10,10 0,20±0,07 33,38±0,10 5,63±0,02 11,44±0,35 1,73±0,08 1,78±0,05 4,11±0,02

VTOR15 1405,5±64,28 0,45±0,00 31,27±0,01 6,32±0,00 20,33±0,20 1,58±0,01 1,71±0,00 4,05±0,01 VTIR15‐1 32,83±0,05 5,14±0,02 19,97±0,02 1,71±0,03 1,65±0,02 4,39±0,00 VTIR15‐2

1350,9±64,28 0,35±0,01 33,13±0,02 5,18±0,00 20,75±0,01 1,72±0,03 1,78±0,10 4,31±0,01

VTHR15‐1 33,05±0,01 4,76±0,02 20,56±0,04 1,74±0,01 1,83±0,09 4,41±0,00 VTHR15‐2

1396,4±25,71 0,33±0,01 33,46±0,05 4,80±0,01 20,39±0,23 1,72±0,01 2,14±0,01 4,15±0,02

VTER15‐1 33,65±0,14 5,61±0,04 11,43±0,06 1,64±0,02 2,27±0,48 4,12±0,01 VTER15‐3

1408,6±40,41 0,21±0,03 33,85±0,05 5,31±0,00 11,47±0,05 1,63±0,04 1,94±0,01 4,08±0,04


Tabla 7. Evolución del IPT, antocianos totales (AT) y de los compuestos fenólicos en el sustrato de roble (mg/L). Muestras serie T.

Anexo

8


VTOR25 ‐ ‐ 2,09±0,27 185,87±0,15 6,16±0,02 VTIR25‐1 ‐ ‐ 3,84±0,31 187,70±3,38 5,81±0,02 VTIR25‐2 ‐ ‐ 3,88±0,43 182,94±0,11 5,88±0,01 VTHR25‐1 ‐ ‐ 4,41±0,18 183,04±0,05 5,87±0,01 VTHR25‐2 ‐ ‐ 4,97±0,00 182,56±0,43 5,88±0,02 VTER25‐1 ‐ ‐ ‐ 174,04±0,25 5,58±0,02 VTER25‐2 ‐ ‐ ‐ 177,95±0,45 5,80±0,03 VTOR20 ‐ ‐ 1,91±0,02 182,47±0,25 6,18±0,00 VTIR20‐1 ‐ ‐ 2,67±0,17 185,08±0,41 5,85±0,02 VTIR20‐2 ‐ ‐ 3,50±0,08 183,34±0,30 5,77±0,02 VTHR20‐1 ‐ ‐ 3,78±0,27 180,77±0,18 5,90±0,01 VTHR20‐2 ‐ ‐ 4,42±0,00 180,89±0,80 5,93±0,00 VTER2O‐1 ‐ ‐ 4,70±0,00 179,59±0,17 5,83±0,01 VTER20‐2 ‐ ‐ ‐ 172,85±0,33 5,73±0,01 VTOR15 ‐ ‐ 1,79±0,07 174,30±0,57 6,04±0,01 VTIR15‐1 ‐ ‐ 2,53±0,06 181,84±0,30 5,71±0,01 VTIR15‐2 ‐ ‐ 2,74±0,00 181,79±0,07 5,65±0,01 VTHR15‐1 ‐ ‐ 2,91±0,00 182,40±0,60 5,72±0,01 VTHR15‐2 ‐ ‐ 3,31±0,39 181,75±0,41 5,61±0,02 VTER15‐1 ‐ ‐ 3,38±0,00 177,25±0,08 5,56±0,03

VTER15‐3 ‐ ‐ 4,31±0,00 178,09±0,45 5,51±0,02 (‐) Compuestos no detectables. a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.


Anexo

9


VFOA25 1960,0±154,28 1,30±0,00 28,90±0,14 5,01±0,16 14,69±0,03 1,01±0,00 10,85±1,52a 3,83±0,59 VFIA25‐1 29,34±0,23 5,33±0,18 16,46±0,27 1,17±0,10 2,18±0,24 2,73±0,02 VFIA25‐2

1841,8±38,57 1,01±0,08 28,62±0,61 4,68±0,59 16,76±0,34 N.Q. ‐ 3,05±0,00

VFHA25‐1 29,05±0,13 6,70±0,07 16,88±0,03 1,09±0,00 ‐ 2,29±0,04 VFHA25‐2

1805,5±12,86 0,80±0,04 29,15±0,00 6,33±0,00 17,02±0,00 1,25±0,00 ‐ 1,92±0,00

VFEA25‐1 28,34±0,21 6,80±0,42 16,24±1,41 1,00±0,00 ‐ b 2,22±0,21 VFEA25‐2

1787,3±90,00 0,66±0,18 28,73±0,26 6,59±0,50 16,27±1,24 1,01±0,00 ‐ b 2,92±0,00

VFOA20 1950,20±12,86 1,35±0,00 29,98±0,84 5,39±0,32 16,67±0,05 1,14±0,00 11,16±0,80 a 4,27±0,10 VFIA20‐1 28,77±0,14 5,05±0,12 16,93±0,10 1,08±0,02 ‐ 3,40±0,19 VFIA20‐2

1887,3±77,14 1,01±0,10 28,46±0,29 4,98±0,15 16,99±0,24 1,15±0,00 ‐ 3,58±0,28

VFHA20‐1 28,50±0,26 5,69±0,27 15,39±0,99 N.Q. ‐ 3,31±0,31 VFHA20‐2

1814,5±25,71 0,65±0,13 28,65±0,04 6,13±0,55 15,68±1,43 1,08±0,05 ‐ 3,17±0,22

VFEA20‐1 28,04±0,91 6,65±0,35 16,06±0,47 1,22±0,00 ‐ b 3,43±0,41 VFEA20‐2

1850,9±51,43 0,86±0,14 28,78±0,05 6,91±0,35 15,63±0,87 1,11±0,00 ‐ b 3,30±0,17

VFOA15 1860±38,57 1,26±0,00 29,56±0,38 5,48±0,28 16,27±0,59 1,18±0,00 12,54±0,95 a 4,99±0,65 VFIA15‐1 28,74±0,01 4,79±0,05 15,53±0,15 1,04±0,05 2,64±0,42 4,83±0,82 VFIA15‐2

1832,7±0,00 1,15±0,05 28,39±0,38 5,08±0,17 15,67±0,44 1,11±0,00 2,64±0,31 3,96±0,16

VFHA15‐1 28,17±0,06 5,86±0,17 15,67±1,03 1,00±0,00 ‐ 3,32±0,61 VFHA15‐2

1741,8±102,85 0,75±0,08 29,23±0,14 6,11±0,06 15,90±0,83 1,05±0,08 ‐ 3,69±0,05

VFEA15‐1 28,64±0,24 6,75±0,25 15,33±0,93 1,04±0,04 ‐ b 3,20±0,25

VFEA15‐2 1814,5±0,00 0,64±0,00

28,56±0,09 6,54±0,51 16,78±0,20 1,11±0,15 ‐ b 3,35±0,32 (‐) Compuestos no detectables. N.Q.; Compuestos no cuantificables a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.

Tabla 9. Evolución del IPT, antocianos totales (AT) y de los compuestos fenólicos en el sustrato de acacia (mg/L). Muestras serie F.

Anexo

10

MUESTRAS Galato de etilo (‐)‐ Epicatequina Ác. elágico Ác. caftárico Ác. cafeico Glucósido resveratrol

VFOA25 11,42±1,80 N.Q. 5,84±0,23 277,80±1,36 6,29±0,03 4,13±0,11 a VFIA25‐1 12,35±0,10 ‐ 3,14±0,15 272,20±1,97 11,26±0,13 3,92±0,03 VFIA25‐2 ‐ ‐ 2,99±0,09 274,16±0,00 14,85±0,00 4,05±0,00 VFHA25‐1 12,76±0,05 ‐ 2,76±0,03 264,08±4,51 ‐ 3,59±0,04 VFHA25‐2 ‐ ‐ 4,54±0,44 265,58±0,00 ‐ 3,69±0,00 VFEA25‐1 13,33±0,06 ‐ 3,59±0,99 265,93±4,22 ‐ 3,42±0,07b VFEA25‐2 12,64±0,00 N.Q. 4,10±0,20 267,98±1,36 ‐ 3,45±0,15 b VFOA20 ‐ N.Q. 5,50±0,16 270,41±0,72 5,68±0,14 3,91±0,30 a VFIA20‐1 ‐ ‐ 3,11±0,13 259,80±7,96 ‐ 3,66±0,31 VFIA20‐2 ‐ ‐ 6,28±0,02 260,60±0,00 ‐ 3,58±0,00 VFHA20‐1 ‐ ‐ 3,24±0,11 263,75±0,71 ‐ 3,43±0,20 VFHA20‐2 ‐ ‐ 3,82±0,50 260,35±7,45 22,88±0,00 3,47±0,19 VFEA20‐1 ‐ N.Q. 3,46±0,50 260,61±2,41 ‐ 3,49±0,09 b VFEA20‐2 ‐ N.Q. 3,89±0,11 261,83±4,03 ‐ 3,43±0,09 b VFOA15 ‐ N.Q. 4,73±0,07 268,43±5,77 6,04±0,24 3,96±0,25 a VFIA15‐1 ‐ ‐ 5,98±0,28 268,69±1,72 11,19±0,16 4,09±0,03 VFIA15‐2 ‐ ‐ 6,52±0,42 274,02±2,53 10,83±0,00 4,05±0,23 VFHA15‐1 ‐ ‐ 1,78±0,16 254,33±2,50 ‐ 3,52±0,13 VFHA15‐2 ‐ ‐ 2,18±0,55 263,61±5,09 15,71±0,00 3,70±0,25 VFEA15‐1 ‐ N.Q. 1,59±0,26 260,72±3,48 ‐ 3,33±0,22 b

VFEA15‐2 ‐ ‐ 1,59±0,16 261,78±6,90 ‐ 3,50±0,30 b (‐); Compuestos no detectables. N.Q.; Compuestos no cuantificables a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.


Anexo

11


VFOC25 1796,4±25,71 1,36±0,00 28,60±0,86 5,09±0,52 15,86±0,98 1,25±0,14 13,01±1,19 a 4,01±0,46 VFIC25‐1 28,26±0,36 3,71±0,45 16,48±0,24 1,13±0,08 4,69±0,30 4,38±0,30 VFIC25‐2

1796,4±0,00 0,93±0,02 28,39±0,50 4,03±0,07 16,82±0,43 1,12±0,13 ‐ 4,57±0,15

VFHC25‐1 28,72±0,12 5,00±0,22 16,54±0,68 1,17±0,09 2,70±0,01 4,53±0,02 VFHC25‐2

1746,4±61,88 0,72±0,06 28,63±0,22 4,74±0,50 16,84±0,33 1,21±0,06 2,64±0,00 4,56±0,31

VFEC25‐1 28,15±0,13 5,21±0,17 16,61±0,66 1,20±0,01 ‐ b 4,22±0,32 VFEC25‐2

1532,7±38,57 0,38±0,06 28,37±0,24 5,37±0,28 17,25±0,17 1,07±0,05 ‐ b 4,37±0,12

VFOC20 1823,6±12,86 1,27±0,00 29,64±0,26 5,31±0,23 15,34±0,28 1,04±0,00 ‐ 4,34±0,42 VFIC20‐1 28,62±0,42 4,02±0,28 17,27±0,10 1,07±0,06 ‐ 4,49±0,00 VFIC20‐2

1687,3±179,99 086±0,19 28,73±0,29 4,03±0,25 16,88±0,37 1,16±0,00 3,63±0,00 4,14±0,38

VFHC20‐1 29,30±0,13 4,78±0,45 16,80±0,58 1,09±0,11 3,84±0,00 4,86±0,00 VFHC20‐2

1800,9±108,46 0,70±0,06 29,73±0,13 4,46±0,46 16,68±0,72 1,28±0,01 4,41±0,00 5,06±0,51

VFEC20‐1 28,56±0,10 5,35±0,34 16,32±0,67 1,22±0,00 ‐ 4,58±0,00 VFEC20‐2

1578,2±179,99 0,43±0,04 29,30±0,45 4,65±0,58 17,04±0,44 1,27±0,00 3,75±0,00 4,55±0,29

VFOC15 1723,6±25,71 1,07±0,00 29,45±0,20 4,84±0,41 16,46±0,06 1,16±0,02 13,02±0,00 a 4,33±0,24 VFIC15‐1 29,17±0,52 3,96±0,44 16,54±0,28 1,17±0,02 2,46±0,00 3,92±0,38 VFIC15‐2

1747,9±100,14 0,80±0,18 29,59±0,07 4,39±0,16 16,69±0,20 1,18±0,03 4,06±3,00 4,39±0,26

VFHC15‐1 29,81±0,50 4,71±0,34 16,73±0,26 1,20±0,19 4,56±0,00 4,51±0,44 VFHC15‐2

1687,3±39,28 0,65±0,09 29,32±0,57 4,67±0,31 16,57±0,27 1,15±0,21 3,63±0,00 4,73±0,00

VFEC15‐1 28,50±0,16 4,96±0,21 17,03±0,60 1,24±0,09 2,04±0,00 b 4,56±0,32

VFEC15‐2 1650,9±0,00 0,35±0,18

28,67±0,06 4,93±0,12 16,70±0,49 1,33±0,12 1,70±0,00 b 4,67±0,06 (‐) Compuestos no detectables. a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.

Tabla 11. Evolución del IPT, antocianos totales (AT) y de los compuestos fenólicos en el sustrato de cerezo (mg/L). Muestras serie F.

Anexo

12

MUESTRAS Galato de etilo (‐)‐ Epicatequina Ác. elágico Ác. caftárico Ác. cafeico Glucósido resveratrol

VFOC25 8,79±1,21 N.Q. 4,49±0,04 271,51±3,79 5,78±0,19 4,08±0,19 a VFIC25‐1 8,62±1,22 ‐ 4,09±0,10 265,47±9,23 5,24±0,51 3,69±0,46 VFIC25‐2 9,05±1,19 ‐ 3,76±0,54 269,46±3,56 5,56±0,24 3,81±0,15 VFHC25‐1 7,50±0,00 ‐ 1,83±0,17 266,51±2,46 5,52±0,27 3,32±0,48 VFHC25‐2 7,82±0,44 ‐ 1,77±0,31 266,78±4,93 5,65±0,32 3,44±0,25 VFEC25‐1 7,47±0,94 ‐ 1,53±0,25 261,86±3,27 5,46±0,07 3,15±0,18 b VFEC25‐2 7,79±0,00 N.Q. 1,42±0,13 262,29±2,63 5,52±0,05 2,97±0,16 b VFOC20 9,17±0,66 ‐ 4,75±0,25 274,78±6,84 5,45±0,17 4,06±0,32 a VFIC20‐1 8,61±0,76 ‐ 3,26±0,61 270,11±6,00 5,24±0,14 3,86±0,33 VFIC20‐2 8,48±0,65 ‐ 4,06±0,20 271,29±4,74 5,12±0,25 3,78±0,36 VFHC20‐1 7,96±0,83 ‐ 2,01±0,03 268,43±4,14 5,48±0,13 3,62±0,17 VFHC20‐2 8,31±0,64 ‐ 1,54±0,06 266,30±5,83 5,42±0,16 3,59±0,33 VFEC20‐1 ‐ ‐ 1,32±0,00 256,50±11,60 5,23±0,31 3,01±0,27 b VFEC20‐2 7,68±0,91 ‐ 1,81±0,19 266,35±7,90 5,34±0,27 3,51±0,30 b VFOC15 ‐ N.Q. 4,43±0,37 270,09±7,98 4,93±0,26 4,12±0,18 a VFIC15‐1 9,34±0,00 ‐ 1,66±0,17 265,37±5,89 5,14±0,29 3,79±0,22 VFIC15‐2 9,47±0,19 N.Q. 1,62±0,16 271,05±2,09 5,36±0,01 4,06±0,15 VFHC15‐1 8,34±1,26 ‐ 1,58±0,26 266,70±6,95 5,19±0,36 3,62±0,40 VFHC15‐2 9,16±0,00 ‐ 1,57±0,10 266,51±3,76 5,25±0,16 3,70±0,20 VFEC15‐1 7,61±0,00 ‐ 1,39±0,02 268,44±4,10 5,32±0,23 3,57±0,21 b

VFEC15‐2 8,61±0,17 ‐ 1,86±0,00 271,97±0,00 5,51±0,00 3,71±0,00 b (‐); Compuestos no detectables. N.Q.; Compuestos no cuantificables a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.


Anexo

13


VFOS25 1950,9±38,57 1,27±0,00 31,87±0,14a 5,81±0,14 16,88±0,45 1,18±0,13 13,81±0,70 a 4,57±0,13 VFIS25‐1 45,06±1,51 4,83±0,01 16,90±0,15 1,11±0,12 5,74±0,70 4,52±0,27

VFIS25‐2 1905,5±51,43 0,78±0,19

45,28±0,80 4,49±0,54 16,41±0,04 1,15±0,20 5,57±0,03 4,43±0,64

VFHS25‐1 62,61±0,44 5,81±0,30 16,65±0,53 1,15±0,03 3,11±0,66 4,32±0,30

VFHS25‐2 1814,5±25,71 0,65±0,16

67,08±0,81 5,56±0,40 16,32±0,82 1,19±0,02 2,96±0,44 4,58±0,20 VFES25‐1 70,01±0,82 b 6,39±0,67 16,57±0,73 1,21±0,01 2,66±0,00 b 4,44±0,44 VFES25‐2

1887,3±51,43 0,49±0,07 75,25±1,00 b 6,11±1,01 16,57±0,07 1,37±0,04 ‐ b 4,44±0,59

VFOS20 1923,6±77,14 1,28±0,00 30,47±0,65 a 5,55±0,56 16,52±0,05 1,22±0,14 12,72±0,32 a 4,25±0,60

VFIS20‐1 46,19±0,50 5,07±0,28 16,57±0,29 1,16±0,19 6,34±0,42 4,64±0,39

VFIS20‐2 1787,3±90,00 0,99±0,03

47,10±0,15 4,59±0,60 16,51±0,21 1,15±0,16 5,89±0,79 4,46±0,41 VFHS20‐1 65,16±0,92 6,02±0,79 16,63±0,31 1,18±0,16 3,39±0,16 4,59±0,39 VFHS20‐2

1855,5±45,45 0,63±0,07 70,29±0,46 6,31±0,34 16,51±0,52 1,12±0,12 2,89±0,06 4,23±0,45

VFES20‐1 79,64±0,78 b 7,07±0,59 16,28±0,52 1,29±0,11 ‐ b 4,45±0,63

VFES20‐2 1878,2±90,00 0,48±0,06

87,57±1,48 b 6,65±1,13 16,69±0,40 1,20±0,05 2,80±0,23 b 4,43±0,71

VFOS15 1860,0±141,42 1,15±0,00 30,80±0,17 a 5,85±0,12 16,90±0,16 1,33±0,04 10,88±0,16 a 4,84±0,01 VFIS15‐1 43,76±0,00 5,37±0,05 16,86±0,16 1,37±0,04 5,03±0,18 4,81±0,07 VFIS15‐2

1760,0±25,71 0,94±0,04 43,82±0,08 5,36±0,04 16,69±0,08 1,35±0,03 5,55±0,27 4,69±0,08

VFHS15‐1 64,04±0,10 6,34±0,04 16,79±0,21 1,34±0,02 4,21±0,01 b 4,73±0,00

VFHS15‐2 1878,2±12,86 0,83±0,05

70,00±0,07 6,40±0,03 16,16±0,30 1,35±0,02 4,60±0,08 b 4,71±0,00 (‐) Compuestos no detectables. a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.

Tabla 13. Evolución del IPT, antocianos totales (AT) y de los compuestos fenólicos en el sustrato de castaño (mg/L). Muestras serie F.

Anexo

14

MUESTRAS Galato de etilo (‐)‐ Epicatequina Ác. elágico Ác. caftárico Ác. Cafeico Glucósido resveratrol

VFOS25 ‐ a 2,21±0,00 5,64±0,13 276,51±2,35 5,83±0,23 4,18±0,11 a VFIS25‐1 10,50±0,68 N.Q. 6,44±0,38 270,14±6,62 5,54±0,36 3,82±0,32

VFIS25‐2 10,56±1,46 N.Q. 5,95±0,06 270,15±2,15 5,47±0,20 3,82±0,23

VFHS25‐1 9,73±0,62 ‐ ‐ 267,67±3,50 5,79±0,29 3,52±0,26

VFHS25‐2 10,89±0,89 N.Q. ‐ 272,27±1,80 5,83±0,22 3,67±0,14 VFES25‐1 10,49±0,31 b N.Q. 3,93±0,39 268,52±3,50 5,71±0,04 3,41±0,23 b VFES25‐2 10,07±1,33 b ‐ 5,07±0,00 269,28±0,59 5,66±0,11 3,37±0,08 b

VFOS20 ‐ a N.Q. 8,96±0,40 273,85±3,21 5,80±0,22 4,09±0,25 a

VFIS20‐1 10,72±1,43 N.Q. 9,64±0,22 271,59±3,18 5,47±0,29 4,00±0,20

VFIS20‐2 10,56±1,21 N.Q. 8,79±0,44 266,79±3,14 5,71±0,18 3,91±0,24 VFHS20‐1 11,08±1,59 ‐ ‐ 268,67±2,63 5,76±0,09 3,69±0,13 VFHS20‐2 11,49±1,48 ‐ ‐ 262,72±0,72 6,00±0,12 3,62±0,13

VFES20‐1 10,67±2,00 b ‐ ‐ 269,41±2,04 5,70±0,08 3,47±0,15 b

VFES20‐2 11,79±1,55 b ‐ 2,89±0,00 270,49±0,45 6,12±0,15 3,61±0,13 b

VFOS15 ‐ a N.Q. 6,10±0,03 276,15±0,98 5,73±0,08 4,24±0,05 a VFIS15‐1 11,57±0,29 N.Q. 5,43±0,26 267,42±1,27 5,99±0,00 4,02±0,00 VFIS15‐2 11,53±0,06 N.Q. 5,84±0,17 267,88±0,30 5,95±0,03 4,04±0,01

VFHS15‐1 13,04±0,13 N.Q. 0,35±0,00 266,68±0,33 6,15±0,01 3,88±0,02

VFHS15‐2 14,08±0,30 N.Q. ‐ 270,48±0,83 6,19±0,01 3,89±0,02 (‐); Compuestos no detectables. N.Q.; Compuestos no cuantificables a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.


Anexo

15


VFOR25 1860,0±12,86 1,27±0,00 30,34±0,42 6,21±0,00 16,35±0,25 1,28±0,07 25,53±0,04 a 4,84±0,02 VFIR25‐1 29,88±0,40 5,08±0,12 16,46±0,38 1,22±0,10 19,05±0,13 5,00±0,10 VFIR25‐2

1741,8±72,73 0,91±0,23 29,87±0,01 5,59±0,03 16,82±0,03 1,26±0,03 13,63±0,10 4,92±0,01

VFHR25‐1 31,79±0,03 5,77±0,03 16,87±0,03 1,52±0,02 8,08±0,56 5,13±0,02 VFHR25‐2

1805,5±167,13 0,75±0,21 30,37±0,01 6,07±0,03 14,86±0,05 1,14±0,00 6,21±0,06 4,73±0,05

VFER25‐1 30,04±0,10 5,83±0,32 16,75±0,13 1,25±0,23 ‐ b 4,85±0,38 VFER25‐2

‐ 0,68±0,00 29,81±0,02 5,69±0,01 16,45±0,02 1,51±0,01 8,75±0,06 b 5,26±0,00

VFOR20 1869,1±25,71 1,41±0,00 29,58±0,03 5,85±0,05 16,66±0,07 1,27±0,02 23,19±2,92 a 4,82±0,00 VFIR20‐1 29,05±0,07 4,69±0,01 16,83±0,17 1,27±0,00 21,18±0,05 4,81±0,11 VFIR20‐2

1832,7±51,43 1,10±0,16 29,76±0,04 5,33±0,02 15,02±0,20 1,19±0,01 10,37±0,29 4,60±0,03

VFHR20‐1 30,48±0,05 5,71±0,06 16,74±0,03 1,31±0,10 ‐ 5,14±0,07 VFHR20‐2

1723,6±25,71 0,77±0,02 30,19±0,06 5,84±0,05 14,63±0,13 1,20±0,01 7,86±2,74 4,73±0,02

VFER2O‐1 29,43±0,61 5,83±0,53 16,60±0,15 1,41±0,02 ‐ b 4,53±0,75 VFER20‐2

1714,5±38,57 0,57±0,08 30,14±0,01 6,60±0,02 14,51±0,02 1,19±0,03 4,32±0,05 b 4,88±0,00

VFOR15 1814,5±102,85 0,99±0,18 29,86±0,07 5,82±0,11 14,78±0,33 1,34±0,01 15,55±0,25 a 4,58±0,02 VFIR15‐1 28,96±0,00 4,71±0,00 16,79±0,00 1,25±0,00 14,16±0,00 4,25±0,00 VFIR15‐2

1814,5±102,85 0,90±0,13 29,87±0,10 5,55±0,04 15,53±0,22 1,32±0,01 10,52±0,28 4,74±0,06

VFHR15‐1 30,34±0,26 5,47±0,39 16,38±0,72 1,33±0,12 13,70±0,00 4,63±0,45 VFHR15‐2

1796,4±51,43 0,61±0,23 30,82±0,10 5,88±0,05 15,75±0,51 1,31±0,00 6,27±0,67 4,72±0,01

VFER15‐1 30,92±0,15 5,42±0,26 16,87±0,15 1,51±0,04 12,11±0,79 b 4,91±0,49 VFER15‐2

‐ 0,64±0,00 31,19±0,63 5,36±0,51 15,57±0,10 1,34±0,19 7,31±0,08 b 5,29±0,35


Tabla 15. Evolución del IPT, antocianos totales (AT) y de los compuestos fenólicos en el sustrato de roble (mg/L). Muestras serie F.

Anexo

16

MUESTRAS Galato de etilo (‐)‐Epicatequina Ác. elágico Ác. caftárico Ác. cafeico Glucósido resveratrol

VFOR25 10,79±0,00 2,29±0,21 5,14±0,00 281,95±1,45 ‐ 4,23±0,00 a VFIR25‐1 10,11±0,01 2,34±0,03 8,38±1,14 274,31±8,69 ‐ 4,08±0,08 VFIR25‐2 10,91±0,10 N.Q. 5,48±0,54 279,70±0,07 5,95±0,02 4,06±0,02 VFHR25‐1 10,31±0,00 ‐ 3,17±0,16 277,09±0,06 6,10±0,05 3,77±0,04 VFHR25‐2 10,60±0,00 N.Q. 2,59±0,03 269,11±0,64 5,89±0,10 3,82±0,01 VFER25‐1 9,04±0,69 ‐ 4,55±0,30 274,36±0,46 6,31±0,00 3,70±0,15 b VFER25‐2 ‐ N.Q. ‐ 277,12±0,34 5,86±0,00 3,75±0,01 b VFOR20 10,99±0,08 3,11±0,25 10,41±0,07 285,56±3,68 ‐ 4,22±0,09 a VFIR20‐1 10,83±0,09 2,46±0,16 6,16±0,19 285,98±3,45 ‐ 4,21±0,07 VFIR20‐2 11,07±0,00 N.Q. 2,77±0,52 265,06±0,32 6,04±0,01 4,13±0,01 VFHR20‐1 9,94±0,16 ‐ 4,73±0,25 274,94±0,22 ‐ 3,83±0,07 VFHR20‐2 10,74±0,00 ‐ 2,94±0,16 264,27±5,59 6,30±0,02 3,90±0,03 VFER2O‐1 8,83±0,88 ‐ 5,01±0,02 270,19±3,23 5,75±0,00 3,62±0,07 b VFER20‐2 10,32±0,08 ‐ 3,36±0,07 263,78±5,95 6,32±0,04 3,72±0,02 b VFOR15 11,50±0,00 N.Q. 7,82±0,78 274,67±0,67 6,13±0,25 3,76±0,54 a VFIR15‐1 9,57±0,00 N.Q. ‐ 275,01±0,00 5,73±0,00 4,06±0,00 VFIR15‐2 11,41±0,05 N.Q. 6,48±0,29 277,48±0,86 6,31±0,19 4,37±0,30 VFHR15‐1 9,16±1,12 ‐ 4,14±0,19 273,74±4,76 5,64±0,00 3,88±0,11 VFHR15‐2 10,75±0,00 N.Q. 2,73±0,20 269,76±0,14 6,47±0,12 3,92±0,03 VFER15‐1 8,23±01,30 ‐ 5,10±0,16 284,55±5,95 6,30±0,43 3,77±0,13 b VFER15‐2 10,24±0,00 N.Q. 4,43±0,30 271,62±6,67 6,35±0,45 3,81±0,10 b

(‐); Compuestos no detectables. N.Q.; Compuestos no cuantificables a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA) para P< 0,05.


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