INDUCCIÓN DE PLASMIDOS EN UN MEDIO ADVERSO Y AISLAMIENTO DE SU ADN EN

BACTERIAS E. Coli O157:H7

QFB. José Eduardo Hernández Torres

QFB. Renato Augusto Morales Flores

QFB. Emanuel Barreto Flores

QFB. Pedro Domínguez Barenca

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INDICE

RESUMEN ESTRUCTURADO INTRODUCCION MARCO TEORICO PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA JUSTIFICACIÓN HIPÓTESIS OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

CRONOGRAMA APÉNDICE

BIBLIOGRAFIA

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Resumen estructurado

Antecedentes Los plásmidos o también llamados plasmidios son mol éculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. La resistencia antibiótica es la capacidad de un microorganismo para resistir los efectos de u n medicamento. La resistencia se produce naturalmente por selección n atural a través de mutaciones producidas por azar, pero también puede inducirse artificialmente mediante la aplicación de una presión selectiva a u na población. Una vez que se genera la información genética, las bacterias pu eden trasmitirse los nuevos genes a través de trasferencia horizontal (entre in dividuos) por intercambio de plásmidos. Hoy en día los plásmidos son estudiados de manera a mplia y minuciosa en la rama de la microbiología para lograr un profundo co nocimiento acerca de las propiedades que pueden otorgarle a las células hosp edadoras. Es de especial interés para la medicina y microbiología la capacidad de resistencia a los antibióticos conferida por plásmidos a bacteria s como es el caso de l a Escherichia coli O157:H7, uno de los muchos grupos de bacterias que viven en los intestinos de los humanos sanos y en la mayoría de los animales de sangre caliente. Esta bacteria ayuda a mantener el equilibrio de la flora intestinal normal (flora bacteriana) contra las bacterias noci vas y sintetiza o produce algunas vitaminas. Sin embargo también es una de las principales bacterias que pueden adquirir capacidad es diferentes a las usuales por contener plasmidos.

Objetivos y Metodología El objetivo central de esta investigación es aislam iento del ADN del plásmido de E. coli O157:H7 Durante el desarrollo del presente proyecto se establecerá, a partir del manejo con sepas de E. coli O157:H7 , una ruta para el adecuado aislamiento e identificación de bacter ias que presentan una capacidad de resistencia a antibióticos las cuales contienen un plásmido que les otorga dicha resistencia. Así de una colonia qu e presente dicha capacidad podrán ser aislados sus plásmidos con la técnica de Desnaturalización Alcalina. La técnica mencionada permite observar y conocer as pectos importantes de la desnaturalización y naturalización del ADN plasmídi co y sus diferencias con el ADN cromosómico. Para demostrar que efectivamente l as bacterias contienen un plásmido que les otorga resistencia se empleara un aislamiento y reproducción en medios de cultivo específicos para cepas de E. coli. Posteriormente se cultivan en medios “adversos” y se extraen aquellas colonias capaces de reproducirse en presencia del antibiótico (cloranfn icol). La extracción del ADN plasmídico se lleva a cabo e n condiciones alcalinas, utilizando principalmente Duodecil Sulfato de Sodio (SDS). En estas condiciones y con un pH de aproximadamente 11 los A DN se desnaturalizan. Así el ADN cromosómico que es menos compacto que el pla smídico se desnaturaliza más rápido. Este ADN desnaturalizado entra en conta cto con con el SDS y junto con otras proteínas bacterianas precipita. Quedando así el ADN plasmídico aun libre en la solución. Al separar las fases por centrifugación el ADN plas mídico es posteriormente extraído y precipitado por contacto directo con Eta nol .La extracción completa del ADN plasmídico expuesta en el presente proyecto nos conduce a una eficaz herramienta para el estudio del desarrollo, crecimi ento, contaminación de los plásmidos, así como un profundo conocimiento de su ADN y de lo que este es capaz de otorgar al Hospedador.

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INTRODUCCION Dentro del proceso de la inducción y aislamiento de plasmidos en el ámbito de la microbiología, existen diversos mét odos de aislamiento así como bacterias, las cuales se pued en estudiar. La bacteria de uso más común para contener los plás midos o vectores a utilizar en el laboratorio es conocida c omo Escherichia coli . Esta bacteria es un huésped común del tracto digestivo de mamíferos, por lo tanto el riesgo de i nfección por manipulación es bajo si es manipulada adecuadamente . Las técnicas de aislamiento y purificación de plásm idos han tenido gran desarrollo hoy en día lo que permite ob tener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que s on la base de la mayoría de los protocolos en biología molecular. Uno de los métodos más utilizados es el de desnaturalización a lcalina en presencia del detergente duodecil sulfato de sodio (SDS). Este método, que utilizaremos en la investigación, se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de desnaturalización y renaturalización del ADN de pla smìdico versus el ADN cromosomal. Los plásmidos al tener un tamaño menor, pueden ser separados fácilmente de las moléc ulas de ADN cromosomal que son grandes y precipitan más rápidam ente. El primer paso consiste en crear un ambiente osmótico hostil para la bacteria y lograr así su lisis y consecuente lib eración del material genético.

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MARCO TEORICO PLASMIDO Los plásmidos (también llamados plasmidios) son mol éculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. El término plásmido fue presentado por primera vez por el biólogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952. 1 Las moléculas de ADN plásmidico, adoptan una confor mación tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas, aunqu e, por definición, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrad o plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosoma l, los plásmidos no tienen proteínas asociadas. 2

En la mayoría de los casos se considera genético di spensable. Sin embargo, posee información genética importante para las bacterias. Por ejemplo, los genes que codifican para las proteínas que las hace resistentes a los antibióticos están, frecuentement e, en los plásmidos. Hay algunos plásmidos integrativos, es decir, que t ienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rom pen momentáneamente el cromosoma y se sitúan en su interior, con lo cua l, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el plásmido . Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de epi soma. Un episoma es un plásmido que puede integrarse por sí mismo al ADN cromosomal del organismo huésped. Por esta razón, p uede mantenerse en contacto por un largo tiempo, ser duplicado en cada división celular del huésped y volverse parte básica de su mapa gené tico. Este término no se usa más en plásmidos, debido a que ahora está claro que una región homologa con el cromosoma elabora un plásmid o dentro de un episoma. 2 Los plásmidos usados en ingeniería genética son lla mados “vectores”. Estos son usados para transferir genes desde un org anismo a otro y típicamente contienen un marcador genético confirie ndo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. La mayoría también contienen un polivinculador o sitio de clonado múlt iple (MCS), el cual es una pequeña región que contiene los sitios de re stricción más comúnmente usados, permitiendo una fácil inserción de fragmentos de ADN en ese lugar. Tipos de plasmidos

• Plásmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-g enes, ellos son capaces de conjugarse.

• Plásmidos de resistencia: los cuales contienen gene s que pueden constituir resistencia contra antibióticos o venenos. Históricamente conocidos como Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plásmidos.

• Col-plásmidos: los cuales contienen genes que codif ican (determinan la producción de) colinas y proteínas q ue pueden matar a otra bacteria.

• Plásmidos degradativos: los cuales habilitan la dig estión de sustancias inusuales como tolueno o ácido salicí lico.

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• Plásmidos virulentos: los cuales convierten la bact eria en un patógeno.

Aplicaciones Los plásmidos sirven como una importante herramient a en laboratorios de genética e ingeniería bioquímica, donde son comú nmente usados para multiplicar (hacer muchas copias de) o como genes p articulares expresos. Muchos plásmidos están disponibles comerc ialmente para dichos usos. El gen a ser replicado se inserta en copias de un p lásmido el cual contiene genes que hacen células resistentes a un a ntibiótico en particular. En el paso siguiente el plásmido es ins ertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transforma ción. Luego, la bacteria es expuesta a un antibiótico particular. S olo la bacteria que toma copias del plásmido sobrevive al antibiótico d ebido a que el plásmido lo hace resistente. En particular, los gen es protectores son expresados (usados para hacer proteína) y la proteí na expresada evita la acción del antibiótico. De esta forma, los antib ióticos actúan como un filtro que seleccionan únicamente la bacteria mo dificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en largas can tidades, cosechadas y el plásmido de interés puede ser aislado 3.

Figura 1 . Representación de un plasmido en una célula bacte riana.

E. COLI La Escherichia coli O157:H7 (o simplemente E. coli O157:H7) es uno de los muchos grupos de bacterias que viven en los int estinos de los humanos sanos y en la mayoría de los animales de sa ngre caliente. Esta bacteria ayuda a mantener el equilibrio de la flora intestinal normal (flora bacteriana) contra las bacterias nocivas y s intetiza o produce algunas vitaminas. 4 No obstante, existen cientos de tipos o cepas de ba cterias E-coli. Las distintas cepas de E. coli tienen diferentes caract erísticas distintivas. Una cepa de E. coli en particular, conocida como E. coli O157:H7, causa una grave infección intestinal en los humanos . Es la cepa más común que causa enfermedades en las personas. Se pu ede diferenciar de otras E. coli por la producción de una potente toxi na que daña el revestimiento de la pared intestinal y causa diarre a con sangre. También se conoce como infección enterohemorrágica por E. coli.

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La E. coli O157:H7 se encuentra en los intestinos del ganado saludable, cabras, ciervos y ovejas. De acuerdo con los CDC, la transmisión de estas bacterias a los humanos puede ocurrir de la siguiente manera: La carne, como la de vaca, se puede contaminar cuan do los organismos se mezclan accidentalmente con ella, especialmente cuando es picada (triturada). La carne contaminada con E. coli O157:H7 no huele mal y se ve normal. Es importante cocinar muy bien la car ne. La infección puede ocurrir después de nadar o beber agua contaminada con E. coli O157:H. El contacto familiar de persona a persona y los cen tros de atención a niños, u otros centros de atención institucional, t ambién son lugares donde puede ocurrir la transmisión de la bacteria. Se confirmó que la leche y los jugos, como la sidra de manzana, sin pasteurizar también pueden causar la infección. Siete tipos diferentes de plásmidos han sido encont rados en la E. Coli. Pero normalmente plásmidos relacionados son incom patibles, en el sentido de que solo una de ellos sobrevive en la lí nea celular, debido a la regulación de las funciones vitales de los plá smidos. Por lo tanto, los plásmidos pueden ser diferenciados de ac uerdo a grupos de compatibilidad. 4 Uno de lo medios para cultivar la E. coli es en el medio denominado agar de McConkey, debido a la especificidad de la b acteria para con este medio, ya que provoca fácilmente su adaptación y reproducción.

Evolución de Escherichia O157:H7 Escherichia, Salmonella y Shigella, los microorganismos facultativos del tracto intestinal mejor conocidos, son agentes causales de enfermedad humana. Estudios filogenéticos basados e n la secuenciación de las subunidades 16S y 5S del rRNA indican que Escherichia spp. y Salmonella spp. Se diferenciaron a partir de un ancestro común, h ace aproximadamente 120-160 millones de años, coincidie ndo con la aparición de los mamíferos, mientras que Shigella sp se diferenció de E. coli hace 80 millones de años, coincidiendo con la evol ución de los primates. Las cepas comensales de E. coli colonizan el colon, mientras que las cepas patógenas ocupan fundamentalmente nic hos extra-colon. Salmonella spp. parasita reptiles, pájaros y mamíferos, y Shigella spp solo primates. El ancestro de las bacterias entéric as fue probablemente una cepa de E. coli que tuvo que competir con mas de 500 especies normales del intestino. La inserción de la isla de patogenicidad LEE en el cromosoma de la bacteria co mensal dio lugar a la aparición del clon de E. coli enteropatógeno (EPEC), fermentador del sorbitol (SOR+) y con actividad de b-glucuronid asa (GUD+). El modelo evolutivo de Whittman (1998) hipotetiza sobr e la aparición de E. coli O157:H7 a partir del ancestro EPEC por adquisición del gen para la toxina Shiga 2 (Stx2) por transducción, pos terior inserción del gen rfbO157 y adquisición del plásmido EHEC que codifica las hemolisinas, y mas recientemente el gen stx1, con p érdida de la capacidad de fermentación del sorbitol (SOR-) y la actividad de b-glucuronidasa (GUD-) 5. Manifestaciones clínicas La infección por STEC puede causar casos esporádico s o brotes de diarrea, colitis hemorrágica (CH) o síndrome urémic o hemolítico (SUH). Además, puede mimetizar desórdenes no infecciosos c omo intususcepción, apendicitis, diverticulosis, colitis isquémica y ul cerativa, como así también colitis infecciosas causadas por Salmonella , Shigella, Campylobacter, Clostridium difficile, Yersinia ente rocolítica o

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Entamoeba histolytica. El cuadro clínico de la infe cción por STEC incluye un período de 1 a 2 días de vómitos, fiebre baja o ausente, dolores abdominales severos, diarrea sin sangre y e videncia de edema de la mucosa colónica como síntomas iniciales, segu idos por diarrea sanguinolenta o colitis hemorrágica durante 4 a 6 d ías. Aunque en la mayoría de los casos la diarrea por STEC es autolim itada, aproximadamente 5 al 10 % de los niños infectados e volucionan a SUH, para el cual no existe un tratamiento específico, s ino de sostén. Los niños constituyen el grupo más vulnerable, con una mayor incidencia de infecciones sintomáticas por STEC y riesgo alto de evolución a SUH 5. Reservorio y vías de transmisión Escherichia coli O157:H7 es endémico tanto en ganado de carne como lechero. La prevalencia es variable, de menos del 0 ,5 a más del 2,0% en campo y a nivel de playa de faena. La bacteria n o es patógena para el ganado, la colonización es de menos de 2 meses d e duración, y la portación fecal, que no es prolongada, es mas frecu ente en el ganado joven (2 a 24 meses) que en el ganado adulto. La pr evalencia en el ganado joven es similar a la encontrada en el ganad o alimentado a grano (“feedlot”), y está relacionada con una mayor susceptibilidad de estos animales a ser colonizados por cepas transien tes de E. coli, con dosis menores a 250 unidades formadoras de colonias (UFC). Los animales con una alimentación reciente en “feedlot” tienen una prevalencia tres veces superior a la de los animale s alimentados por meses en “feedlot”. Esta mayor susceptibilidad posi blemente esté relacionada con alteraciones de la flora normal, el pH y la concentración de ácidos grasos. La alimentación jue ga un papel importante por las grandes cantidades de alimento i ngeridas diariamente por los animales y por la habilidad de E. coli de multiplicarse en el alimento sobre todo cuando tien en una humedad aumentada. El agua, especialmente con sedimentos, p uede constituir un hábitat crítico para la sobreviva y multiplicación de E. coli O157:H7, sobre todo durante los meses de invierno. La capaci dad de colonización de E. coli O157:H7 en el ganado es función de la dosis infect iva y la susceptibilidad 5.

Figura 2 . E. coli vista en un microscopio por barrido

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Pruebas de identificación bioquímica de la E.coli O157:H7

Citrato de Simmons El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, u n compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolit os del ciclo de Krebs, algunas bacterias obtienen energía por vía a lterna de la fermentación de los hidratos de carbono a través de la utilización del citrato, como fuente única de carbono. La utilizaci ón del citrato por una bacteria se detecta por la formación de product os alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un aniòn, como únic a fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato, también pueden extraer el nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoniaco llevando a la alcalinización del medio por la conversión del NH3+ en hidróxido de am onio (NH4OH). El azul de bromotimol es amarillo a pH mayor de 7.6 el cual es el indicador 5. Indol El indol es uno de los productos de degradación del metabolismo del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofano produciendo endol, ácido pirúvico y amoniaco (NH3). El indol puede detectarse en un medio de prueba con triptofano obs ervando la aparicion de color rojo luego de agregar una soluci ón que contiene p-dimetilaminobenzaldehido (reactivo de Kovacs) 5. Sulfuro, indol, movilidad (SIM) Fundamento: - Permite detectar la producción del sulfuro de hid rógeno por ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro ferroso. - Permite detectar la producción de indol, producto de la degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y des aminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. El indol desdoblado de la molécula de triptofano puede ser detectado cuando reacciona con el grupo aldehído del para-dim etilamino benzaldehído del reactivo revelador (reactivo de Ko vacs), formándose un complejo de color rojo. - Determina si el microorganismo es móvil por migra ción a partir del lugar de siembra y se disemina en el medio provocan do turbidez. Movilidad, indol, ornitina (MIO) Fundamento: - Determina si el microorganismo es móvil por migra ción a partir del lugar de siembra y se disemina en el medio provocan do turbidez. - Permite detectar la producción de indol, producto de la degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y des aminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. El indol desdoblado de la molécula de triptofano puede ser detectado cuando reacciona con el grupo aldehído del para-dim etilamino benzaldehído del reactivo revelador (reactivo de Ko vacs), formándose un complejo de color rojo. - Detecta la capacidad de un microorganismo de deca rboxilar la ornitna. Las decarboxilasas son un grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos carboxilo de los aminoácidos produ ciendo aminas, de

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reacción alcalina. Cada una de las decarboxilasas e s específica para un aminoácido. La ornitina puede ser decarboxilada transformándose en putrescina. Esto produce un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la decarboxi lación sólo tiene lugar en medio ácido (Ph inferior a 6), es necesari o que se produzca previamente la acidificación del medio de cultivo, por fermentación de la glucosa. Por este motivo este medio de cultivo s ólo debe utilizarse para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no producen ornitina - decarbox ilasa pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje del medio al amarillo. La incubación por 24 h produce una alcalinización e n la superficie del medio de cultivo y consecuentemente un viraje del p ico del medio al color violeta. Lisina, Hierro, Agar (LIA) Fumdamento: - Detecta la capacidad de un microorganismo de deca rboxilar la lisina. Las decarboxilasas son un grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos carboxilo de los aminoácidos produciendo ami nas, de reacción alcalina. Cada una de las decarboxilasas es específ ica para un aminoácido. La lisina puede ser decarboxilada trans formándose en cadaverina. Esto produce un viraje del indicador pú rpura de bromocresol al violeta. Como la decarboxilación sól o tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6), es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de cultivo, por fermentación de la glucosa. Por este motivo este medio de cultivo s ólo debe utilizarse para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilas a pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje del medio al amarillo. La incubación de 24 h ocasiona una alcalinización e n la superficie del medio de cultivo y consecuentemente un viraje del p ico al color violeta. Las cepas Proteus y Providencia, con excep ción de algunas cepas de Morganella morganii, desaminan la lisina y producen ácido alfa-ceto-carbónico. Este último, con la sal de hierro y por la influenc ia de oxígeno forma combinaciones pardo-rojizas en la región superficia l del medio de cultivo. - Permite detectar la producción del sulfuro de hid rógeno por ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro ferroso. Agar triple azúcar El principio de la fermentación de hidratos de carb ono se basa en los estudio de Pasteur en bacterias y levaduras, que af irman que la acción de muchas especies de microorganismos sobre su sust rato de hidrato de carbono da como resultado la acidificación del medi o. En la practica, microorganismos que son capaces de fermentar glucos a por lo común se detectan por las reacciones que producen en el agar –Hierro- triple azúcar. Una reacción de pico de flauta alcalino / p rofundidad alcalina (no cambio) en este medio indica ausencia de produc ción ácida y una incapacidad del microorganismo para fermentar la gl ucosa y otros hidratos de carbono presentes. Esta reacción sola e s suficiente para excluir un microorganismo de la familia Enterobacte riacea 5.

FENÓMENO DE RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS La resistencia antibiótica es la capacidad de un mi croorganismo para resistir los efectos de un antibiótico. La resisten cia se produce naturalmente por selección natural a través de muta ciones producidas por azar, pero también puede inducirse artificialme nte mediante la

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aplicación de una presión selectiva a una población . Una vez que se genera la información genética, las bacterias puede n trasmitirse los nuevos genes a través de trasferencia horizontal (e ntre individuos) por intercambio de plásmidos. Desarrollo de nuevos antibióticos Hasta recientemente, los esfuerzos de investigación y desarrollo (I+D) han proporcionado a tiempo nuevos medicamentos para tratar a las bacterias que se han hecho resistentes a los antibi óticos antiguos. Esto actualmente ya no es así. La potencial crisis es el resultado de la disminución de los presupuestos de I+D en la ind ustria, la inactividad del gobierno y el incremento de la prev alencia de las bacterias resistentes. Los médicos que tratan las e nfermedades infecciosas está preocupados por la perspectiva de no disponer de antibióticos eficaces para tratar a pacientes grave mente enfermos en un futuro próximo. 6 La investigación en nuevos antibióticos está casi p arada. Las principales empresas farmacéuticas están perdiendo interés en los antibióticos porque no dan tantos beneficos como lo s medicamentos que tratan las enfermedades crónicas (de larga duración ) y las relacionadas con el estilo de vida. 6 El problema de la resistencia demanda que se haga u n renovado esfuerzo para buscar agentes antibacteriales efectivos contr a las bacterias patógenas resistentes a los antibióticos actuales. Una de las posibles estrategias hacia este objetivo es una búsqueda rac ional de fitoquímicos bioactivos. Las plantas tienen una hab ilidad casi sin límites de sintetizar sustancias aromáticas, la may oría de las cuales son fenoles, o sus derivados por sustitución del ox ígeno tales como taninos. La mayoría son metabolitos secundarios, de los cuales se han aislado al menos 12.000, un número que se estima qu e es menor al 10% del total. En muchos casos, estas sustancias le sir ven a la planta como mecanismos de defensa contra la predación por parte de microorganismos, insectos y herbívoros. Muchas de l as hierbas y especias usadas por los humanos para sazonar la com ida contienen componentes medicinales, incluyendo algunos que tie nen actividad antibacteriana. 6 Disminución de la permeabilidad celular hacia el an tibiótico Modificación de una barrera preexistente Como ya sabemos, la membrana externa de Gram-negati vas supone una barrera natural que hace que muchas bacterias de es te grupo sean insensibles a varios antibióticos (p. ej., la vanco micina y la bacitracina no pueden atravesar las porinas) 7. No todas las bacterias Gram-negativas son igualment e impermeables a los mismos antibióticos:

• Entre las menos impermeables están Haemophilus y Ne isseria, que dejan pasar a numerosos ß-lactámicos.

• Las Enterobacterias suelen ser intermedias. • Las bacterias del gén. Pseudomonas son insensibles a la mayoría

de antibióticos ß-lactámicos, porque no pueden pasa r a través de la membrana externa. Se han aislado mutantes que se han vuelto resistentes a los ß-lactámicos de última generación : el cambio

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ha afectado a una determinada porina que ahora no d eja pasar a estos nuevos antibióticos.

En otros casos, la resistencia se debe a alteracion es en la cápsula: algunos neumococos resistentes a estreptomicina y e ritromicina dependen de este tipo de mecanismo. Mecanismo de extrusión activa del antibiótico El ejemplo más típico estriba en la resistencia a l as tetraciclinas desarrollada por muchas bacterias. Como sabemos, el efecto inhibidor de las tetraciclinas depende de la acumulación acti va de este tipo de antibióticos por parte de las bacterias. Pues bien, ciertos plásmidos R poseen transposones (como el Tn10 o el Tn1721) qu e codifican un sistema para "bombear" tetraciclina desde el interi or bacteriano hacia el exterior, en contra del gradiente de concentraci ón7. Igualmente se conocen resistencias a sulfamidas dep endientes de un mecanismo específico de impermeabilidad. Alteración del mecanismo de transporte del antibiót ico Cuando el antibiótico accede al interior bacteriano por algún mecanismo de transporte específico, una mutación qu e afecte a dicho sistema de transporte supondrá una mayor resistenci a al antibiótico. Por ejemplo, en E. coli la cicloserina entra aprove chando el sistema de transporte de la valina o la glicocola. Determin ados mutantes incapaces de transportar estos aminoácidos son resi stentes a la cicloserina 7. Resistencia al cloranfenicol La resistencia al cloranfenicol suele deberse a una enzima inactivante de dicho antibiótico, denominada cloranfenicol-acet iltransferasa (CAT), que normalmente está codificada por genes pl asmídicos. Uno de los genes de CAT de Gram-negativas más estudiados f orma parte del transposón Tn9. La CAT convierte el cloranfenicol en su derivado 3- acetoxi, usando el acetil-CoA; a continuación una reacción química (no catalizada por enzima) hace que el grupo acetoxi pase a la posició n 1; finalmente ocurre una segunda acetilación catalizada enzimátic amente, que genera el producto final, 1,3-diacetoxi-cloranfenicol. Los derivados mono o diacetilados del cloranfenicol son inactivos como a ntibióticos 7. Conjugación La conjugación bacteriana es el proceso de transfer encia de información genética desde una célula donadora a ot ra receptora, promovido por determinados tipos de plásmidos, y qu e requiere contactos directos entre ambas, con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específ icas. En resumen se puede aclarar que la bacteria E.coli podrá sobrevivir al antibiótico a través del proceso de conjugación, a través de plasmidos, tal como se muestra en la figura 3 y 4. En donde el plasmido dará al célula receptora la cualidad de so brevivir al medio adverso, si este plasmido en dado caso sea recombin ado en el ADN receptor, por consiguiente se formara una cepa de a lta frecuencia de recombinación (Hfr).

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Figura 3 . Proceso de transferencia de plasmidos.

Figura 4. Proceso en donde el plasmido donador es recombinado con el ADN del receptor.

EXTRACCIÓN DEL ADN PLASMÍDICO Como se comentaba anteriormente, los plásmidos son usados a menudo para purificar una secuencia específica, debido a q ue ellos pueden ser fácilmente purificados del resto del genoma. Para s u uso como vectores

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y como clonadores moleculares, a menudo los plásmid os necesitan ser aislados. Hay muchos métodos de aislar ADN plasmídico de una bacteria, los arquetipos de los cuales son el miniprep y el maxip rep. El miniprep se suele usar desde una perspectiva analítica. El resu ltado es una cantidad de ADN plasmídico (10-30 µg), el cual es suficiente para análisis usando digestión restrictiva, para secuenc iación o para algunas técnicas de ingeniería genética 10. En el maxiprep, se cultivan volúmenes mucho más gra ndes de bacterias en suspensión. Esencialmente este es un escalado de la preparación mini-prep, el cual es seguido por una purificación adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 - 1 mg) de ADN plásmido muy puro. En los últimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la extracción plasmídica a varias escalas, pureza y niveles de automatización. Método de desnaturalización alcalina fundamento Uno de los métodos mas usados para extraer plasmido s es la desnaturalización alcalina del DNA seguida por la r enaturalización del plásmido. El método se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de desnaturalización y renaturalización de l ADN de plásmido contra el ADN cromosomal. 8 Los plásmidos al tener un tamaño menor, pueden ser separados fácilmente de las moléculas de ADN cromosomal que s on grandes y precipitan más rápidamente. 9 El metodo consiste en que, las bacterias son puesta s en contacto con una solución de alta concentración de sales, gl ucosa y ácido etilendiamino tetracético (EDTA). Este último es un agente quelante de calcio (el calcio es un ión estabilizador de las membranas bacterianas). Posteriormente se agrega una solución con una alta concentración de SDS e hidróxido de sodio: en condi ciones alcalinas (pH 11) el ADN se desnaturaliza. Sin embargo, el AD N cromosomal al no ser tan compacto se desnaturaliza más rápidamente q ue el ADN de plásmido . Cuando a esta solución se le agrega acet ato de potasio, el ADN desnaturalizado (cromosomal) forma un agregado junto con el SDS y las proteínas bacterianas, el cual precipita, mient ras que el ADN del plásmido se mantiene en solución. La separación de la fracción soluble de la insoluble se logra mediante centrifugación. F inalmente, el ADN del plásmido es concentrado por precipitación con e tanol. Debido a que este procedimiento no garantiza una alta pureza, es posible que la muestra final contenga trazas de ADNasas bacteriana s que se acarrean durante el proceso de extracción. Para evitar la de gradación de las moléculas de ADN por estas enzimas, se aconseja tra bajar de forma rápida y con soluciones a baja temperatura. Recuerd e además que usted también es portador de ADNasas en sus manos, saliva , lágrimas que pueden contaminar su muestra y dar al traste con la purificación. 10

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Existen plasmidos que pueden conferir ventajas sele ctivas al organismo que lo posee, como por ejemplo la resistencia a age ntes antimicrobianos. La presión selectiva que se induce al aplicar un antibiótico no específico para el tratamiento de un a infección en particular genera en algunos casos un resultado con traproducente al aplicar por ejemplo un antibiótico para el cual las bacterias poseen un plásmido que les confiere resistencia al mismo, se está seleccionando precisamente por una población bacter iana que sobrevive al tratamiento en este caso la E.coli O157:H7 que eventualmente puede contraatacar causando una infección más difícil de controlar. A su vez, al ser los plásmidos transmisibles entre poblaciones, las bacterias resistentes pueden transmitir esta inform ación genética a su progenie o a bacterias vecinas las cuales también s e tornan resistentes. JUSTIFICACION El porque de esta investigación radica en el hecho del fenómeno de resistencia a los antibióticos por parte de las bac terias; ya que esto es un problema causado por el mal uso de los mismos tanto en el campo de la salud humana y la veterinaria. Esto a su vez se traduce en un reto más exigente pa ra la industria farmacológica, la cual debe generar antibióticos co n formulaciones novedosas en períodos de tiempo cada vez más cortos . Se espera que con esta investigación se ayude a la compresión de la importancia biológica de los plasmidos de resistenc ia, así como de su obtención y dando pauta a que otros investigadores sigan estudiando este fenómeno. OBJETIVO GENERAL Aislamiento de ADN plasmìdico de E. coli O157:H7 mediante el método de lisis alcalina. OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Conocer la importancia biológica de los plásmidos d e la bacteria E. Coli O157:H7 con respecto a la resistencia a los antibióticos.

• Apreciar el comportamiento de las bacterias E. coli O157:H7 en un medio adverso, y su adaptación a este medio a ba se de plasmidos.

• Aplicar la técnica de lisis alcalina. • Comprobar la existencia del plasmido por electrofor esis.

HIPÓTESIS

• De un medio adverso algunas bacterias de E. coli O157:H7 podrán sobrevivir a través de la producción de plasmidos.

• De las bacterias E. coli O157:H7 sobrevivientes al medio adverso se les podrán extraer el ADN de sus plasmidos.

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METODOLOGÍA Obtención e identificación de E.coli O157:H7 en alimentos 1. Obtención de muestras Las muestras fueron tomadas específicamente de las tripas de res; cabe señalar que estas serán adquiridas en una carnicerí a local. Las muestras tomadas fueron inmediatamente examinadas e n el laboratorio 4. 2. Preparación de la zona estéril para trabajo micr obiológico Se lavo con agua y jabón la superficie de la mesa d e laboratorio, se dejo secar y se desinfecto con una solución de hipo clorito al 10% o con benzal diluido 1:10. Un vez que seco, se coloco un mechero encendido y se trabajo en una área aproximada a est e de 20 cm . 3. Cultivo de la muestra en el medio McConkey La muestra se diluyo en agua y fue depositada en un frasco, se agito vigorosamente por inversión. Por otro lado se uso u n tubo de ensaye que previamente se rotulo y se desinfecto. A este t ubo se le adiciono 1 ml de la muestra y se agito unas 5 veces utilizan do un tapón de algodón, procurando que este no se mojara. Cabe señ alar que se hicieron 3 muestras 4. 4. Siembra de la muestra en el medio McConkey Dentro de la zona estéril se humedecio solamente la punta del algodón de un hisopo estéril con la muestra y se descargo s u contenido en forma circular cerca de un borde de una caja de aga r macones estéril. Se esterilizo el asa bacteriológica calentándola al rojo vivo en la flama del mechero, y para enfriarla, se sumergio di cha asa en el borde del agar durante unos segundos, una vez fría se pro cedio a estriar el inoculo en el primer cuadrante de la caja de petri, seguido de los demás cuadrantes, por ultimo se esterilizp el asa ( tal como se muestra en la figura 5) . Las cajas se guardaron con la ta pa hacia abajo en la estufa a una temperatura de 37º C durante 24 hor as 10.

Figura 5. Técnica de siembra en estría cruzada

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5. Selección de la colonia de E. coli O157:H7 desarrollada en el agar McConkey

De acuerdo a las características de la E.coli O157:H7 en este medio de cultivo, esta bacteria no pudo ser aislada, así que se adquirieron cepas de E. coli que no estabas identificadas, y se procedió a realizar las pruebas bioquímicas para corroborar su presencia. El cultivo puro de E.coli O157:H7 se resembro en el agar McConkey con la técnica antes descrita. En total fueron 6 cajas de petri, es decir 7 muestras. PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE E.coli O157:H7 Para la identificación de la bacteria E.coli O157:H7 se utilizaron las siguientes pruebas bioquímicas. Se utilizaron para estas pruebas bioquímicas 2 de las 7 muestras antes mencionadas.

1. Citrato de simmons Se inoculo la superficie de el asa con estría y el fondo por punción, y se incubará a 37º C durante 48 horas 5; para la interpretación de resultados, se tomo en cuenta lo siguiente: • Prueba positiva: desarrollo de color azul • Prueba negativa: el medio conserva el color verde original y hay ausencia de desarrollo bacteriano. 2. Sulfuro, indol, movilidad (SIM) Se sembro por punción única en la región central de l tubo, utilizando una aguja recta hasta una profundidad de 2/3 del me dio y se incubo a 37º C durante 18-24 h. Se agrego también de 2 ó 3 gotas del reactivo de Ko vacs para detección del indol 5. Para la interpretación se tomo en cuenta lo sigui ente: Sulfuro de hidrógeno: • Prueba positiva: Se observa ennegrecimiento del m edio. Indol: • Prueba positiva: color rojo fucsia en la interfas e del reactivo y el medio. • Prueba negativa: no hay modificación del color en la interfase del reactivo y el medio. Movilidad: • Prueba positiva: Se visualiza turbidez parcial o total del medio. • Prueba negativa: Hay crecimiento bacteriano solam ente en la línea de siembra. 3. Agar triple azúcar Se inoculo la superficie del pico de flauta con est ría y el fondo por punción, y se incubo a 37º C; la lectura se hizo lu ego de 18-24 h de incubación 5. Para la interpretación se tomo en cuenta lo sigui ente: Fermentación de azúcares: Las reacciones que pueden observarse son: • Pico alcalino (rojo) / fondo alcalino (rojo). No hay fermentación de azúcares.

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• Pico alcalino (rojo) / fondo ácido (amarillo). Gl ucosa fermentada. Lactosa y sacarosa no fermentadas. • Pico ácido (amarillo) / fondo ácido (amarillo). G lucosa fermentada. Lactosa y/o sacarosa fermentadas. Producción de gas: • Se evidencia por la aparición de burbujas o fragm entación del medio. Sulfuro de hidrógeno: • Se evidencia por el ennegrecimiento del medio. 4. Movilidad, indol, ornitina (MIO) Técnica: - Se sembro por punción en el centro del medio de c ultivo hasta el fondo del tubo. - Se incubo a 37ºC durante 18-24 h. - Se agregaron 2 ó 3 gotas del reactivo de Kovacs p ara la lectura del indol. Interpretación: Movilidad: • Prueba positiva: Se visualiza turbidez parcial o total del medio. • Prueba negativa: Hay crecimiento bacteriano solam ente en la línea de siembra. Indol: • Prueba positiva: color rojo fucsia en la interfas e del reactivo y el caldo. • Prueba negativa: no hay modificación del color en la interfase del reactivo y el caldo. Ornitina: • Prueba positiva: Pico violeta / fondo violeta • Prueba negativa: Pico violeta / fondo amarillo 5. Lisina, Hierro, Agar (LIA) Técnica: - Inocular la superficie del pico de flauta con est ría y el fondo por punción. - Incubar a 37ºC durante 18-24 h. Interpretación: Decarboxilación de la lisina: • Prueba positiva: pico violeta / fondo violeta • Prueba negativa: pico violeta / fondo amarillo En la figura siguiente se muestran los resultados y métodos bioquímicos estándares de estas pruebas aplicadas a la identificación de E. Coli O157:H7 5

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Figura 6. El dato entre paréntesis indica % de cepas positiv as (+): positivo; (-): negativo.

PREPARACIÓN DEL MEDIO ADVERSO Se utilizo el método de difusión en agar por discos (antibiograma) según la técnica de Kirby - Bauer. El medio usado e s agar Mueller Hinton (MH), controlado a pH 7,2-7,4. Cada placa fu e preparada con 25 a 30 ml del agar fundido y enfriado a 50-55° C, par a obtener una capa de 4 mm de espesor. Las placas se secaron a 35-37° C durante 30-60 minutos para eliminar la humedad superficial; asimi smo los discos fueron de antibiótico cloranfenicol. El antibiogram a se realizo a partir de los cultivos de E. coli O157:H7 puros antes descritos. El inoculo se realizo preparando una suspensión de esa s colonias. En primera estancia se secaron las placas de MH a 3 7 º C durante 30-60 minutos y se colocaron los discos con antibióticos a temperatura ambiente antes de usarlos. Los discos se conservaro n en un refrigerador a 4 º C. Posterior a esto se preparo l a suspensión bacteriana que se utilizo como inóculo en el antibi ograma. A partir del inoculo se tomo con una asa de aguja colonias a isladas del cultivo a ensayar y se resuspendio en 2 ml de solución sali na y se dejo secar, para luego adicionarla al medio 5. Con hisopo estéril previamente embebido con el inóc ulo y escurrido en las paredes del tubo, se procedio a estriar las pla cas de MH en tres direcciones y se dejo estabilizar las placas hisopa das a temperatura

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ambiente por 5 minutos. Concluido este paso, se tom o con pinzas y se coloco sobre la placa hisopada los discos con antib iótico.(se colocaron 5 discos por placa); por ultimo se incubo en estufa de cultivo a 37 º C por 18-24 h 5. OBTENCIÓN DE ADN PLASMIDICO Preparación de las Células Las bacterias sobrevivientes al medio adverso, fuer on cultivadas en el medio McConkey obteniendo 6 muestras y fueron incub adas durante medio día a 37 º C y se impondrá con agitación vigorosa. Del medio de cultivo donde crecieron las bacterias se hicieron alícuotas las cuales se centrifugaron y se aspiro e l medio quedando en el precipitado las bacterias 10. Las muestras se redujeron a 3, en donde una de ellas era la referencia para comprobar la ex istencia del plasmido por electroforesis. Lisis celular Para cada muestras se resuspendió el precipitado de bacterias en 100 µl de la solución I (50 mM Tris.HCl, pH 8, 10 mM EDT A, 20 mM glucosa) previamente enfriada. Se agito vigorosamente para e vitar que las células se mantengan en grumos. Se agregaron 200 µl de la solución II (200 mM NaOH, 1% SDS(duodecil sulfato de sodio)) (Lisis) preparada recientemente a cada suspensión de bacterias. Se cerraron los tubos y se homogenizo invirtiendo el tubo rápidamente alrededor de 5 veces. Para preveni r ruptura del ADN cromosomal y por tanto la contaminación del ADN del plásmido con el mismo, se agito invirtiendo el tubo suavemente. Se incubo el tubo por 5 minutos exactos en hielo. Se agrego 150 µl de la solución III (3 M Acetato de potasio)(Neutralización) previamente enfriada. Se c erraron los tubos y se homogenizo invirtiendo el tubo varias veces. El tubo se incubo 5 minutos en hielo. Posteriormente se centrifugo el lisado de bacterias a máxima velocidad por 5 minutos a 4º C. Se tomo el sobrenadante obten ido luego de la centrifugación y se paso a un tubo limpio 10. Recuperación del Plásmido Para precipitar los ácidos nucleicos del sobrenadan te se agregaron 2 ml de etanol al 70% a temperatura ambiente. La solu ción se agito suavemente por inversión y se dejo reposar por dos minutos a temperatura ambiente. Para colectar el precipitado de ácidos nucleicos se centrifugo a máxima velocidad, a 4º C por 30 min utos. Terminado esto se removio el sobrenadante por aspir ación con la micropipeta hasta que se observe el precipitado sec o. Para eliminar restos de sales, se agrego 1 ml de etanol 70% e inv ertio el tubo varias veces hasta disolver el precipitado. Se descarto el sobrenadante y se resuspendio el pre cipitado en un volumen adecuado (50 µl) de amortiguador TE (Amortiguador de Tris y EDTA) 10. Las dos muestras fueron dispuestas para leerse en e lectroforesis y asi comprobar la existencia del plasmido.

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RESULTADOS

1.- Obtención de Muestras

No se pudo obtener satisfactoriamente la cepa E.coli O157:H7 de las tripas de res.

Se obtuvieron cepas de E. coli no identificadas, de las cuales se trato nuevamente de identificarla E.coli O157:H7 a través de la pruebas bioquímicas.

2.- Pruebas de identificación Bioquímica de E.coli O157:H7

Se observaron lo siguientes resultados.

Fig 7. Pruebas bioquímicas resultantes

a) Agar Triple Azúcar

Glucosa, Sacarosa y Lactosa Fermentadas.- Pico Acid o Amarillo y Fondo Acido Amarillo. ---- Prueba Positiva

Producción de gas.- Se evidencio la formación de bu rbujas y fragmentación del medio. ---- Prueba Positiva

b) Citrato de Simons

El medio conservo su color verde original y se pres ento ausencia de desarrollo bacteriano. ---- Prueba Negativa

c) Sulfuro, Indol, Movilidad (SIM)

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Indol: Color rojo fucsia en la interfase del reacti vo y el medio ---- Prueba Positiva

Sulfuro de Hidrogeno: Se observo ennegrecimiento de l medio ---- Prueba Positiva

d) Agar Lisina Hierro

La muestra presento un pico violeta / fondo amarill o ----- Prueba Negativa

e) Movilidad, Indol, Ornitina

La muestra presento de acuerdo con la ornitina

Ornitina: • Prueba negativa: Pico violeta / fondo amarillo 3.- Crecimiento en Medio Adverso

Se resembraron nuevas muestras en agar Mueller Hint on (MH) apartir de

la cepas de E. coli no identificadas.

Figura 8. Agar Mueller Hinton (MH) con discos de antibiótico.

Se obtuvieron resultados positivos, ya que se obser vo un crecimiento bacteriano en algunos discos de antibió tico, tal y como se muestra en la figura 8.

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Figura 9. Agar Mueller Hinton (MH) con Sensi-Discos de Cloranfenicol

Fue de aquellas zonas con crecimiento bacteriano ce rcanas a los discos de cloranfenicol de donde se tomaron nuevas muestras y se sembraron en cinco Agares Mc. Conkey.

Figura 10. Siembra de bacterias resistentes en medi o McConkey

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4.- Obtención del Plásmido

Se resuspendieron las bacterias con 1 ml de solució n salina para evitar la lisis celular y se tomaron alícuotas, tra tando de extraer la máxima cantidad de dicho resuspendido. Cuando se so metieron a centrifugación los tres tubos que se obtuvieron con bacterias se noto una clara separación de fases de las cuales se dist inguían 3 claramente.

La fase del fondo corresponde al agar, seguida de l a fase bacteriana de considerable volumen y hasta arriba la fase corr espondiente a los líquidos del medio.

Posteriormente se extrajo de los tubos el sobrenada nte y se resuspendierón las bacterias en la solución 1 (con Tris.HCL, EDTA y glucosa), esto con el fin de ajustar el pH del medi o y preparar a las células para su lisis. Se agitaron perfectamente lo s tubos para dispersar adecuadamente las bacterias.

Al agregar los 200 µl de la solución 2 (con Duodeci l Sulfato de Sodio e Hidroxido de Sodio)se homogenizo lentamente para evitar la ruptura del DNA cromosómico e impedir que se mezcle con el DNA plasmidico .Se observo en esta etapa un cambio en la estructura de los componentes ya que adquirió un color amarillento y una consistenci a espesa.

Se continúo con la adición de 150 µl de la solución 3 (con Acetato de Potasio) a cada tubo para neutralizar el medio y se sometieron enfriamiento con hielo durante 5 min. Así las muest ras quedaron listas para una nueva centrifugación. De esta ultima centr ifugación de extrajo el sobrenadante en el cual se encontraban i nmersos los Ácidos Nucleícos.

Al agregar un volumen de etanol al 70 % volvió a ca mbiar la conformación de las muestras tornándose turbias. De spués de un reposo de 2 minutos se centrifugo nuevamente y se extrajo el sobrenadante quedando el precipitado seco.

Fig. 9. Este precipitado representa al Ácido Nucleí co del plasmido.

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DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES De acuerdo a nuestro objetivos e hipótesis se pude finalizar que se conoció la importancia biológica de los plásmidos d e la bacteria E. Coli aunque no específicamente de la E. coli O157:H7 con respecto a la resistencia a los antibióticos ya que varias E. coli sobrevivieron a tal medio adverso. El porque de no poder obtener la E. coli O157:H7, radico en que no se supo manejar adecuadamente las tripas para obtener las muestras; por lo que gracias a otro grupo de investigación se nos proporciono cepas de E. coli aunque no específicamente la E. coli O157:H7, a pesar de que se le busco a través de las pruebas bioquímicas especificas para la E. coli O157:H7. Desafortunadamente en la lectur a de dos pruebas bioquímicas (Agar Lisina Hierro) y (Movilidad, Indo l, Ornitina) se obtuvieron resultados negativos para con la identif icación de la E. coli O157:H7. También nuestra cepa genero Ácido Sul fidrico observándose un ennegrecimiento de medio. De tal f orma se decidió continuar con la investigación a partir de estas E. coli no identificadas. Se aprecio de igual manera el comportamiento de las bacterias E. coli en un medio adverso, y su adaptación a este medio a base de plasmidos. Se aplico la técnica de lisis alcalina para obtener el plasmido, que en teoría y de acuerdo a la metodología se obtuvo, pero desgraciadamente no se pudo comprobar por medios cu alitativos, es, decir, no se pudo comprobar por electroforesis.

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APÉNDICE Medios de cultivo • Agar MacConkey sorbitol (SMAC) Medio selectivo y diferencial empleado para el aisl amiento de Escherichia coli O157:H7 Composición: Para 1000 ml Peptona 20 g Sorbitol 10 g Sales biliares Nº3 1,5 g Cloruro de sodio 5 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 0,001 g Agar 15 g pH final a 25 ºC 7,1 ± 0,2 Preparación: 1. Resuspender 51,5 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu tos. 3. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50ºC 4. Mezclar para homogenizar el medio 5. Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por ca da placa. 6. Conservar a 4ºC 7. Secar el agar en un área estéril, antes de usar. Recomendación: No calentar el medio a ebullición antes de autoclav ar. El calentamiento excesivo destruye el sorbitol. • Medio agar hierro tres azúcares (TSI) Composición: Para 1000 ml: Peptona 20 g Cloruro de sodio 5 g Lactosa 10 g Sacarosa 10 g Glucosa 1 g Sulfato amónico ferroso 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g Rojo de fenol 0,025 g Agar 13 g pH final a 25 ºC 7,3 ± 0,2 Preparación: 1. Resuspender 65 g del polvo en un litro de agua d estilada. 2. Calentar a ebullición hasta disolución completa. 3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 co n tapa bacteriológica. 4. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu tos. 5. Solidificar en forma de pico de flauta para obte ner 2 cámaras de reacción: fondo de 1 cm (anaerobiosis); pico (aerobiosis). • Agar citrato de Simmons

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Composición: Para 1000 ml Fosfato diácido de amonio 1 g Fosfato dipotásico 1 g Cloruro de sodio 5 g Sulfato de magnesio 0,2 g Agar 15 g Azul de bromotimol 0,08 g Citrato de sodio 5 g pH final a 25 ºC 6,8 ± 0,2 Preparación: 1. Resuspender 24,2 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Calentar a ebullición hasta disolución completa. 3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 co n tapa bacteriológica. 4. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu tos. 5. Solidificar en forma de pico de flauta permitien do la formación de una base profunda • Medio para sulfuro, indol, movilidad (SIM) Composición: Para 1000 ml Tripteína 20 g Peptona 6,1 g Sulfato de hierro y amonio 0,2 g Tiosulfato sódico 0,2 g Agar 3,5 g pH final a 25 ºC 7,3 ± 0,2 Preparación: 1. Resuspender 30 g del polvo en un litro de agua d estilada. 2. Calentar a ebullición hasta disolución completa. 3. Fraccionar 4 o 5 ml del medio en tubos 13/100 co n tapa bacteriológica. 4. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu tos. 5. Solidificar en posición vertical. • Reactivo de Kovac

Composición Alcohol amílico o iso-amílico puro 150 ml p-dimetilamino benzaldehído 10 g HCl concentrado 50 ml Disolver el aldehído en el alcohol y agregar lentam ente el ácido. Técnica - Inocular el caldo con el cultivo a investigar. - Incubar a 37 ºC durante 48 horas. - Añadir 0,5 ml de reactivo de Kovac. Interpretación - Prueba positiva: presencia de indol, color rojo f ucsia en la interfase del reactivo y el caldo - Prueba negativa: ausencia de indol, no hay modifi cación del color. • AGAR MUELLER HINTON (MH) Composición Infusión de carne 300 g

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Casaminoácidos 17,5 g Almidón 1,5 g Agar 17 g AD 1000 ml pH final a 25 ºC 7,2 ± 0,2 Preparación: 1. Resuspender 38 g del polvo en un litro de agua d estilada. 2. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu tos. 3. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50ºC 4. Dispensar 25 ml del medio por cada placa para ob tener una capa de 4 mm de espesor. 5. Conservar a 4ºC. Las placas así conservadas pued en utilizarse hasta 4 días después de su preparación.

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